CN103983670B - 基于超级三明治DNAzyme的电化学细胞传感器的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了基于超级三明治DNAzyme的电化学细胞传感器的制备方法，包括S1/S2-Fe3O4复合物的制备，超级三明治DNAzyme结构的形成，本发明还提供一种基于超级三明治DNAzyme的电化学传感器检测癌细胞的方法；本发明的有益效果是，超级三明治DNAzyme结构，利用其催化性能成功的实现对癌细胞的检测，并获得满意的结果，因此本发明的电化学细胞传感器可以应用于癌症的前期诊断方面。

Description

基于超级三明治DNAzyme的电化学细胞传感器的制备方法
技术领域
本发明涉及电化学传感器及其应用，尤其涉及基于超级三明治DNAzyme的电化学细胞传感器的制备方法。
背景技术
早期准确地检测癌症细胞对于临床诊断以及检测癌症相关过程的监测具有非常重要的作用。当前有许多检测方法，如流式细胞术、聚合酶链反应、免疫组织化学、荧光检测以及场效应晶体管等，然而这些方法存在花费高、耗时长或者需要复杂的仪器等缺点。电化学方法，由于其响应快、成本低以及易于操作等优点，吸引了广大科学家，是一种癌症监测的理想方法。然而，目前的电化学细胞传感器很少，这是由于细胞膜的不导电性极大限制了氧化还原物质与目标细胞之间的相互作用。为了解决这一难题，媒介转换法或许是细胞检测的理想方法。众所周知，适配体与目标物之间的结合力比互补链之间结合力大的多，因此靶细胞的加入能够取代互补链，这样就将适体-细胞之间的作用转化为基于DNA的信号放大策略。
G-四联体DNAzyme，由hemin及富G碱基的DNA序列组成，是一种有效放大检测分析物的催化工具。由于其相比于HRP的显著优势，目前被广泛地用于各类生化反应中。目前，基于G-四联体DNAzyme发展了一种双功能的电化学传感器。然而，这种放大模式在催化性能方面存在缺陷，因为每一个目标DNA只能形成一个G-四联体DNAzyme。
发明内容
针对上述现有技术，本发明提供一种基于超级三明治DNAzyme的电化学细胞传感器的制备方法，制备的电化学细胞传感器能够有效放大检测分析物，每一个靶DNA能够捕获包含若干超级三明治DNAzyme结构DNA纳米线，因此能够获得比传统三明治结构更大的电化学信号。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种基于超级三明治DNAzyme的电化学细胞传感器的制备方法，包括如下步骤：
1)制备S1/S2-Fe3O4复合物：
首先将10～200μL10mg/mL的羧基化磁珠用100～800μL10mM的咪唑-盐酸溶液清洗三次，加入0.1～1.0mM1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺/0.1～1.0mM N-羟基琥珀酰亚胺于37℃孵化30分钟激活磁珠表面的羧基，随后用100mM pH8.0的PBS缓冲液清洗；之后，加入10～100μL0.1～5.0μM K562适配体S1，37℃，反应16～24小时，并轻微的震动，将形成的S1-Fe3O4复合物用磁铁分离，并用PBS缓冲液清洗；最后，加入10～100μL0.1～5.0μM的互补探针S2，37℃反应1～3小时，形成S1/S2-Fe3O4复合物，并将复合物于4℃下保存以待后续使用；
所述K562适配体S1的序列为：5'-ATCCAGAGTGACGCAGCAGATCAGTCTATCTTCTCCTGATGGGTTCCTATTTATAGGTGAAGCTGGACACGGTGGCTTAGT-(CH2)6-NH2-3'，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；互补探针S2的序列为：5'-TGCGTCACTCTGGATACTAAAAGGGTCTGAGGG-3'，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
2)基于超级三明治DNAzyme的电化学细胞传感器的制备
首先将白血病细胞K562离心并用100mM PBS缓冲液水洗，得K562的细胞悬浮液，并将S1/S2-Fe3O4复合物加入系列浓度的细胞悬浮液中，于37℃反应2～3小时；加入离心后的K562细胞时，适体S1与细胞强作用力迫使S1/S2双联结构打开，将S2释放到溶液中，磁性分离后，将修饰捕获探针S3的金电极浸入到S2溶液中，37℃反应1～3h以形成S3/S2双联；随后，在0.1～5.0μM S4、S5混合液中孵化2～4小时，并在0.2mM hemin及0.5mM MB溶液中浸泡2～4小时，得到基于超级三明治DNAzyme的电化学细胞传感器；
所述捕获探针S3的序列为：5'-ATCCAGAGTGACGCATAACACCGGTGG-(CH2)6-SH-3'，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；信号探针S4的序列为：5'-TACTCCCCCAGGTGCCCCTCAGACCCTTTTAGTGGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTG G-3'，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，其中下划线部分能够形成G-四联体DNAzyme；辅助探针S5的序列为：5'-GCACCTGGGGGAGTAACTAAAAGGGTCTGAGGG-3'，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
优选地，步骤(2)所述白血病细胞K562离心速度为1000rmp。
步骤(2)所述细胞悬浮液的系列浓度为2.3，23，230，2300，23000cells/mL。
本发明还提供一种利用上述方法制备的基于超级三明治DNAzyme的电化学细胞传感器。
本发明的有益效果为，超级三明治DNAzyme结构，利用其催化性能成功的实现对癌细胞的检测，并获得满意的结果，因此本发明的电化学细胞传感器可以应用于癌症的前期诊断方面。
附图说明
图1为电化学超级三明治DNAzyme检测癌细胞的原理示意图；
图2为修饰电极对1mM H2O2的DPV响应图，其中，(a)为S2/S3修饰电极，(b)为S3修饰电极探针，并进一步与S4、S5及hemin、MB混合溶液反应；
图3为修饰电极与癌细胞反应后，对1mM H2O2的DPV响应图；
图4为细胞浓度的log值与DPV峰电流之间的关系图，其中细胞浓度分别为2.3，23，230，2300，23000cells/mL。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明。本发明所用1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺(EDC)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、三(2-羧乙基)膦(TCEP)、6-巯基-1-己醇(MCH)和hemin都购自Sigma Aldrich，羧基化磁珠(Fe3O4，20nM)购自杭州纳晶科技有限公司，DNA寡核苷酸由上海生工合成并纯化。
一种基于超级三明治DNAzyme的电化学细胞传感器的制备方法，包括如下步骤：
1)制备S1/S2-Fe3O4复合物：
首先将100μL10mg/mL的羧基修饰的磁珠用400μL10mM的咪唑-盐酸溶液清洗三次，加入0.5mM EDC/0.5mM NHS于37℃孵化30分钟激活磁珠表面的羧基，随后用100mM pH8.0的PBS缓冲液清洗；之后，加入50μL1μM K562适配体S1，37℃，静置16小时，并轻微的震动，将形成的S1-Fe3O4复合物用磁铁分离，并用PBS缓冲液清洗；最后，加入50μL1μM的互补探针S2，37℃反应1小时，形成S1/S2-Fe3O4复合物，并于4℃下保存以待后续使用；
所述K562适配体S1的序列为：5'-ATCCAGAGTGACGCAGCAGATCAGTCTATCTTCTCCTGATGGGTTCCTATTTATAGGTGAAGCTGGACACGGTGGCTTAGT-(CH2)6-NH2-3'；互补探针S2的序列为：5'-TGCGTCACTCTGGATACTAAAAGGGTCTGAGGG-3'；
2)基于超级三明治DNAzyme的电化学细胞传感器的制备
首先将白血病细胞K562在1000rmp的条件下离心并用100mM PBS缓冲液水洗，得K562的细胞悬浮液，并将S1/S2-Fe3O4复合物加入系列浓度的细胞悬浮液中，于37℃反应2小时，所述系列浓度为2.3，23，230，2300，23000cells/mL；加入离心后的K562细胞时，适体S1与细胞强作用力迫使S1/S2双联结构打开，将S2释放到溶液中，磁性分离后，将修饰捕获探针S3的金电极浸入到S2溶液中，37℃反应1h以形成S3/S2双联；随后，在1.0μM S4、S5混合液中孵化2小时，并在0.2mM hemin及0.5mM MB溶液中浸泡2小时，得到基于超级三明治DNAzyme的电化学细胞传感器；
所述捕获探针S3的序列为：5'-ATCCAGAGTGACGCATAACACCGGTGG-(CH2)6-SH-3'；信号探针S4的序列为：5'-TACTCCCCCAGGTGCCCCTCAGACCCTTTTAGTGGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG-3'，其中下划线部分能够形成G-四联体DNAzyme；辅助探针S5的序列为：5'-GCACCTGGGGGAGTAACTAAAAGGGTCTGAGGG-3'。
超级三明治放大策略检测癌细胞的原理如图1所示，首先利用酰胺反应将氨基修饰的K562适配体S1连接到羧基化的磁珠上，随后将S2DNA序列(与细胞适配体21个碱基互补)通过碱基互补配对原则形成双联，加入目标细胞K562后，由于适配体S1与细胞间作用力更强，因此将S2序列释放出来，并且，细胞浓度与释放的S2序列浓度成正比，因此，通过检测S2代替细胞。随后，释放的S2与固定在电极表面的S3杂交，在超级三明治反应中，S2的一段可与捕获探针S3杂交而另一端与信号探针S4杂交；加入辅助DNAS5后，S4、S5会自发进行一系列的杂交连锁反应，因此最终在电极表面形成自组装DNA纳米线；将该修饰电极浸泡在hemin及MB溶液中就会形成超级三明治结构，至此超级三明治DNAzyme放大检测癌细胞的策略构建成功。其中，MB作为电子媒介体，能够通过静电作用插入到形成的DNA双联沟槽中，在MB的帮助下，G-四联体DNAzyme能够进一步催化还原H2O2，催化性能得到进一步提高。
如图2所示，S3修饰电极在无S2(a)和有S2(b)存在下，并且分别与S4、S5混合物以及hemin、MB混合物反应，以形成超级三明治DNAzyme结构，如曲线a所示，无S2时即使加入大量S4、S5，电化学信号仍然很小，为10.2μA，这表明电极表面未形成超级三明治结构；如曲线b所示，修饰电极与S2反应2h，并分别与S4、S5以及hemin、MB反应若干时间，会得到一个明显增强的电化学信号，为84.8μA，说明超级三明治结构已形成。
将本发明用于癌症细胞的检测，如图3所示，首先，将S1/S2-Fe3O4复合物与癌细胞反应1小时后磁铁分离，并将S3修饰电极与一定量的上清液反应，随后，将修饰电极分别与S4、S5以及hemin、MB反应若干时间，最后检测该修饰电极在1mM H2O2中的电化学响应，加入K562细胞上清液后，该修饰电极获得了较强的电化学信号，因此该方法可成功地用于癌症细胞检测。
不同浓度细胞与DPV响应之间的关系，如图4所示，随着细胞浓度增加，DPV峰电流越大，并且细胞浓度的log值与DPV峰电流呈线性关系，线性方程为：I(μA)＝-5.57-10.04Log(C/cell.mL-1)，|R|＝0.9952，线性范围为2.3-230000cells/mL，检测限为2.3cells/mL。
实施例2
一种基于超级三明治DNAzyme的电化学细胞传感器的制备方法，包括如下步骤：
1)制备S1/S2-Fe3O4复合物：
首先将10μL10mg/mL的羧基化磁珠用100μL10mM的咪唑-盐酸溶液清洗三次，加入0.1mM1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺/0.1mM N-羟基琥珀酰亚胺于37℃孵化30分钟激活磁珠表面的羧基，随后用100mM pH8.0的PBS缓冲液清洗；之后，加入10μL0.1μM K562适配体S1，37℃，反应20小时，并轻微的震动，将形成的S1-Fe3O4复合物用磁铁分离，并用PBS缓冲液清洗；最后，加入10μL0.1μM的互补探针S2，37℃反应1小时，形成S1/S2-Fe3O4复合物，并将复合物于4℃下保存以待后续使用；
所述K562适配体S1的序列为：5'-ATCCAGAGTGACGCAGCAGATCAGTCTATCTTCTCCTGATGGGTTCCTATTTATAGGTGAAGCTGGACACGGTGGCTTAGT-(CH2)6-NH2-3'；互补探针S2的序列为：5'-TGCGTCACTCTGGATACTAAAAGGGTCTGAGGG-3'；
2)基于超级三明治DNAzyme的电化学细胞传感器的制备
首先将白血病细胞K562在1000rmp的条件下离心并用100mM PBS缓冲液水洗，得K562的细胞悬浮液，并将S1/S2-Fe3O4复合物加入系列浓度的细胞悬浮液中，于37℃反应2小时，所述系列浓度为2.3，23，230，2300，23000cells/mL；加入离心后的K562细胞时，适体S1与细胞强作用力迫使S1/S2双联结构打开，将S2释放到溶液中，磁性分离后，将修饰捕获探针S3的金电极浸入到S2溶液中，37℃反应1h以形成S3/S2双联；随后，在0.1μM S4、S5混合液中孵化2小时，并在0.2mM hemin及0.5mM MB溶液中浸泡2小时，得到基于超级三明治DNAzyme的电化学细胞传感器；
所述捕获探针S3的序列为：5'-ATCCAGAGTGACGCATAACACCGGTGG-(CH2)6-SH-3'；信号探针S4的序列为：5'-TACTCCCCCAGGTGCCCCTCAGACCCTTTTAGTGGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTG G-3'，其中下划线部分能够形成G-四联体DNAzyme；辅助探针S5的序列为：5'-GCACCTGGGGGAGTAACTAAAAGGGTCTGAGGG-3'。
实施例3：
一种基于超级三明治DNAzyme的电化学细胞传感器的制备方法，包括如下步骤：
1)制备S1/S2-Fe3O4复合物：
首先将200μL10mg/mL的羧基化磁珠用800μL10mM的咪唑-盐酸溶液清洗三次，加入1.0mM1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺/1.0mM N-羟基琥珀酰亚胺于37℃孵化30分钟激活磁珠表面的羧基，随后用100mM pH8.0的PBS缓冲液清洗；之后，加入100μL5.0μM K562适配体S1，37℃，反应24小时，并轻微的震动，将形成的S1-Fe3O4复合物用磁铁分离，并用PBS缓冲液清洗；最后，加入100μL5.0μM的互补探针S2，37℃反应3小时，形成S1/S2-Fe3O4复合物，并将复合物于4℃下保存以待后续使用；
所述K562适配体S1的序列为：5'-ATCCAGAGTGACGCAGCAGATCAGTCTATCTTCTCCTGATGGGTTCCTATTTATAGGTGAAGCTGGACACGGTGGCTTAGT-(CH2)6-NH2-3'；互补探针S2的序列为：5'-TGCGTCACTCTGGATACTAAAAGGGTCTGAGGG-3'；
2)基于超级三明治DNAzyme的电化学细胞传感器的制备
首先将白血病细胞K562在1000rmp的条件下离心并用100mM PBS缓冲液水洗，得K562的细胞悬浮液，并将S1/S2-Fe3O4复合物加入系列浓度的细胞悬浮液中，于37℃反应3小时，所述系列浓度为2.3，23，230，2300，23000cells/mL；加入离心后的K562细胞时，适体S1与细胞强作用力迫使S1/S2双联结构打开，将S2释放到溶液中，磁性分离后，将修饰捕获探针S3的金电极浸入到S2溶液中，37℃反应3h以形成S3/S2双联；随后，在5.0μM S4、S5混合液中孵化4小时，并在0.2mM hemin及0.5mM MB溶液中浸泡4小时，得到基于超级三明治DNAzyme的电化学细胞传感器。
所述捕获探针S3的序列为：5'-ATCCAGAGTGACGCATAACACCGGTGG-(CH2)6-SH-3'；信号探针S4的序列为：5'-TACTCCCCCAGGTGCCCCTCAGACCCTTTTAGTGGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTG G-3'，其中下划线部分能够形成G-四联体DNAzyme；辅助探针S5的序列为：5'-GCACCTGGGGGAGTAACTAAAAGGGTCTGAGGG-3'。
上述虽然结合附图对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。

Claims (2)

1.一种基于超级三明治DNAzyme的电化学细胞传感器的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)制备S1/S2-Fe3O4复合物：
首先将10～200μL 10mg/mL的羧基化磁珠用100～800μL 10mM的咪唑-盐酸溶液清洗三次，加入0.1～1.0mM 1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺/0.1～1.0mM N-羟基琥珀酰亚胺于37℃孵化30分钟激活磁珠表面的羧基，随后用100mM pH 8.0的PBS缓冲液清洗；之后，加入10～100μL 0.1～5.0μM K562适配体S1，37℃，反应16～24小时，并轻微的震动，将形成的S1-Fe3O4复合物用磁铁分离，并用PBS缓冲液清洗；最后，加入10～100μL 0.1～5.0μM的互补探针S2，37℃反应1～3小时，形成S1/S2-Fe3O4复合物，并将复合物于4℃下保存以待后续使用；
所述K562适配体S1的序列为：5'-ATCCAGAGTGACGCAGCAGATCAGTCTATCTTCTCCTGATGGGTTCCTATTTATAGGTGAAGCTGGACACGGTGGCTTAGT-(CH2)6-NH2-3'；互补探针S2的序列为：5'-TGCGTCACTCTGGATACTAAAAGGGTCTGAGGG-3'；
2)基于超级三明治DNAzyme的电化学细胞传感器的制备
首先将白血病细胞K562离心并用100mM PBS缓冲液水洗，得K562的细胞悬浮液，并将S1/S2-Fe3O4复合物加入系列浓度的细胞悬浮液中，于37℃反应2～3小时；加入离心后的K562细胞时，适体S1与细胞强作用力迫使S1/S2双联结构打开，将S2释放到溶液中，磁性分离后，将修饰捕获探针S3的金电极浸入到S2溶液中，37℃反应1～3h以形成S3/S2双联；随后，在0.1～5.0μM S4、S5混合液中孵化2～4小时，并在0.2mM hemin及0.5mM MB溶液中浸泡2～4小时，以形成超级三明治DNAzyme，得到基于超级三明治DNAzyme的电化学细胞传感器；
所述捕获探针S3的序列为：5'-ATCCAGAGTGACGCATAACACCGGTGG-(CH2)6-SH-3'；信号探针S4的序列为：5'-TACTCCCCCAGGTGCCCCTCAGACCCTTTTAGTGGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTG G-3'，其中下划线部分能够形成G-四联体DNAzyme；辅助探针S5的序列为：5'-GCACCTGGGGGAGTAACTAAAAGGGTCTGAGGG-3'；
步骤(2)所述白血病细胞K562离心速度为1000rmp；
步骤(2)所述细胞悬浮液的系列浓度为2.3，23，230，2300，23000cells/mL。
2.如权利要求1所述的方法制备的一种基于超级三明治DNAzyme的电化学细胞传感器。
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