CN105274194A - 一种基于多重放大技术的肿瘤标志物let7a检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明描述了一种基于多重放大技术的肿瘤标志物let7a的检测方法。利用磁珠连接的脱氧核酶与目标物let7a杂交后，可以切断let7a；利用切断后的产物，进行两次剪切聚合的循环，实现信号的放大；利用剪切聚合后的产物进行环介导放大反应，嵌插荧光试剂进行荧光检测，可以计算let7a的浓度。该方法选择性好，灵敏度高，是检测肿瘤标志物let7a的理想方法。

Description

一种基于多重放大技术的肿瘤标志物let7a检测方法

技术领域

本发明涉及剪切聚合反应和环介导反应，是一种基于多重放大技术的肿瘤标志物let7a的检测方法。

背景技术

癌症是全球性的医学难题，卫生部报告：我国每年新发癌症病例220万，因癌死亡160万，防治癌症的任务异常艰巨。防治癌症的最好办法是早期诊断、早期治疗。但是目前所使用的检测方法存在特异性和灵敏度不够高，容易导致假阳性和假阴性结果。因此迫切需要构建高灵敏的检测方法，进行关键技术的攻关创新。

肿瘤标志物是反映肿瘤存在和生长的化学物质，临床上通过对这些化学物质的检测，可以对相应肿瘤作早期诊断、疗效评估和预后判定。目前，有多种肿瘤标志物应用于临床，但大多数标志物仍然缺乏足够的组织特异性和肿瘤特异性。

微小核糖核酸（microRNA)是近年来发现的一种内生的、非蛋白编码的核糖核酸，长度约为22个核苷酸左右，可通过转录后调控靶基因的信使核糖核酸（mRNA）的翻译，在基因表达调节方面扮演着重要的角色。随着microRNA研究的深入，大量文献报道microRNA与肿瘤的发生发展有着密切关系，所以microRNA作为一种有潜力的肿瘤标志物，可以用来进行癌症的早期诊断。MicroRNA的检测不仅对于microRNA的生物功能的研究，而且对于临床诊断都具有重要的意义。let7a作为较早被发现的let7microRNA家族中的一种已被证实参与多种肿瘤的细胞增殖、凋亡、侵袭等生物学行为，包括肺癌、卵巢癌和淋巴瘤等。

目前，let7a的检测方法主要有：RNA印迹法、微阵列法、纳米粒子标记法、生物荧光法、电化学方法等。这些方法普遍存在的问题是，灵敏度不高，特异性不够高，因为let7a存在同源的多种microRNA，如let7b、let7c、let7d等，它们的结构与let7a只差一个或者几个碱基，不容易区分。本方法利用脱氧核酶剪切，解决特异性的问题；利用多重放大技术，解决灵敏度的问题。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于多重放大技术的肿瘤标志物let7a的检测方法，该方法具有选择性好、灵敏度高等特点，适用于肿瘤标志物let7a的检测。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为，操作如下：

（1）磁珠连接的脱氧核酶（DNAzyme）与let7a杂交。在一定条件下，let7a被剪断。一段进入溶液，剩余的杂交的let7a部分，可以在聚合酶和剪切酶的作用下进行剪切聚合反应，产生大量的单链脱氧核糖核酸1（S1）；

（2）在（1）的基础上产生的S1可以与另一连接磁珠的单链脱氧核糖核酸2（S2）杂交，进行下一个剪切聚合的循环，产生大量的单链脱氧核糖核酸3（S3）；

（3）在（2）的基础上产生的S3，55-60℃下，加入单链脱氧核糖核酸4（S4）、模板（S5）和聚合酶可以引发环介导反应，产生大量的带茎环结构的DNA；

（4）加入荧光试剂SYBR-I，嵌插入（3）中产物中，可以进行荧光检测。

本发明的优点：

1、本发明选择与let7a杂交的脱氧核酶，可以实现高的选择性，let7a同源家族的microRNA很难剪断，避免干扰。

2、将磁珠引入步骤（1）（2）中，方便进行磁分离。

3、采用多重放大技术，let7a的检测限可低至10^-18mol/L。

附图说明

图1为检测let7a的原理图。图中，S3是两次聚合剪切得到产物，用来作为环介导反应的引物1，S4是另外加入的环介导反应的引物2。环介导反应的温度是55-60℃。

具体实施方式

以下为实施本发明的具体示例，其作用在于进一步阐明本发明的内容，使阅读者更容易理解，但不构成对本发明要求的保护范围的限定或限制。

实验条件：

荧光分光光度计，磁珠，荧光试剂SYBRI，phi29DNA聚合酶、BST聚合酶，Tris-HCl缓冲液、DEPC处理的水等。

具体操作过程：磁珠接DNA:磁珠1接let7a脱氧核酶，磁珠2接S2。

羧基化的磁珠，用缓冲液洗三次，加入imidazol-HCl和EDC活化磁珠的羧基，37℃，30min；用PBSbuffer洗三次，重新悬浮，加入氨基化的DNA，37℃过夜；用PBSbuffer洗三次，重新悬浮在PBSbuffer中，4℃贮存待用。

37℃，在PBS缓冲液中，实现接let7a脱氧核酶与let7a的杂交，实现let7a链的剪切，从剪切处开始聚合反应，开始实现剪切聚合的重复反应，产生大量的S1；

如图1所示，产生的S1会和接磁珠的S2杂交，加入DNA聚合酶，进一步发生剪切聚合反应，产物是S3

55℃下，体系中加入两端带茎环结构的模板，Bst聚合酶，dNTPs，缓冲液，S3会沿着模板进行链取代，然后加入另一引物S4，会持续不断的引发链取代反应，产生大量的带由单链折叠而成的双链结构的DNA。加入荧光染料SYBRGreenI。这是一种结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料。在游离状态下，SYBRGreenI发出微弱的荧光，但一旦与双链DNA结合后，荧光大大增强。可以根据荧光信号检测出体系存在的双链DNA数量。SYBRGreenI的最大吸收波长约为497nm，发射波长最大约为520nm。

Let7aDNAzyme：5'-GCCAACAGCGACCCTCAGCTACTATACAAGGCTAGCTACAACGCCTACTACCTCATTC-NH2-3'

Let7a：5'-UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU-3'

ssDNA(S1)：5'-TGAGGGTCGCTGTTGGC-3'

ssDNA(S2)：5'-GTAATAGCGAAGAGGCCCGCACAAAAAGGGTTTTCCCAGTCACGACCCTCAGCCAACAGCGACCCTCA-NH2-3'

ssDNA(S3)：5'-TGAGGGTCGTGACTGGGAAAACCCTTTTTGTGCGGGCCTCTTCGCTATTAC-3′

ssDNA(S4)：5'-TGAGGGTCGTGACTGGGAAAACCCTTTTTGTGCGGGCCTCTTCGCTATTAC-3′

ssDNA(S5)：5'-CGACTCTAGAGGATCCCCGGGTACTTTTTGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTTTGAGGGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTTACCCAACTTAATCGGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACAAAAAGGGTTTTCCCAGTCACGACCCTCA-3′

Claims (4)

1.一种基于多重放大技术的肿瘤标志物let7a检测方法，其特征在于：

（1）磁珠连接的脱氧核酶，能够特异性的切断与之杂交的靶let7a，避免同源微小核糖核酸的干扰；

（2）在（1）的基础上进行剪切聚合循环，产生大量的单链脱氧核糖核酸；

（3）在（2）的基础上，引发环介导反应，产生大量带茎环结构脱氧核糖核酸；

（4）在（3）的基础上，嵌插荧光试剂，进行荧光信号的检测。

2.按照权利要求1所述基于多重放大技术的肿瘤标志物let7a的检测方法，其特征在于：采用磁珠连接脱氧核酶和单链脱氧核糖核酸进行剪切聚合的循环，方便进行分离。

3.按照权利要求1所述基于多重放大技术的肿瘤标志物let7a的检测方法，其特征在于：剪切聚合反应的温度为37℃，环介导反应的温度在55-60℃。

4.按照权利要求1所述基于多重放大技术的肿瘤标志物let7a的检测方法，其特征在于：嵌插的荧光试剂为核酸染料SYBRGreenI。