CN101699277A - 一种电化学传感器对微量赭曲霉毒素a进行检测的方法 - Google Patents

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一种电化学传感器对微量赭曲霉毒素A进行检测的方法，属于电化学传感器技术领域。本发明对波碳电极进行修饰，做成适配体电化学传感器，对赭曲霉毒素A标准品进行检测，建立标准曲线，以达到对含赭曲霉毒素A样品进行定量检测的目的；本发明旨在发明一种基于适配体的电化学传感器，在波碳电极表面修饰上单链DNA，并通过碱基配对将适体、金纳米粒子修饰的单链DNA修饰到电极表面，进而建立赭曲霉毒素A定量检测的标准曲线。本发明旨在建立灵敏度高、可操作性强的赭曲霉毒素A定量检测方法。

Description

一种电化学传感器对微量赭曲霉毒素A进行检测的方法
技术领域
本发明涉及利用电化学传感器对赭曲霉毒素A进行检测，特别强调适体的应用、金纳米粒子在电化学中对电子传递的促进作用，以及该检测方法的高灵敏度及易操作性，属于电化学传感器技术领域。
背景技术
电化学传感器是一种集具高灵敏度、可靠、方便于一体的检测手段，生物传感器是指各种生物体成分(酶、抗原、抗体、激素等)或生物体本身(细胞、细胞器、组织等)作为敏感元件的传感器。电化学生物传感器则是指由生物材料作为敏感元件，电极作为转换元件，以电势、电流或电阻为特征检测信号的传感器。本发明把适配体应用于电化学传感器，并于电极表面修饰上可以促进电子传递的金纳米粒子，大大提高了传感器的灵敏度，该传感器以波碳电极作为工作电极，甘汞电极为参比电极，铂电极为对电极，以亚甲基蓝的循环伏安图谱为检测信号，通过对不同浓度赭曲霉毒素A标准品检测，建立标准曲线，达到对含赭曲霉毒素A样品进行定量检测的目的。
发明内容
(一)要解决的技术问题
本发明旨在发明一种基于适配体的电化学传感器，在波碳电极表面修饰上单链DNA，并通过碱基配对将适体、金纳米粒子修饰的单链DNA修饰到电极表面，进而建立赭曲霉毒素A检测的标准曲线。本发明旨在建立灵敏度高、可操作性强的赭曲霉毒素A定量检测方法。
(二)技术解决方案：
一种电化学传感器对微量赭曲霉毒素A进行检测的方法：对波碳电极进行修饰，做成适配体电化学传感器，对赭曲霉毒素A标准品进行检测，建立标准曲线，以达到对含赭曲霉毒素A样品进行定量检测的目的；步骤为
(1)波碳电极的抛光处理：将波碳电极依次用1μm、0.3μm、0.05μm的氧化铝粉末进行打磨处理；然后置于1∶1乙醇水溶液中超声5min；
(2)金纳米粒子修饰的DNA的制备：将1mL浓度约为2×10-9mol/L的金纳米粒子溶液以10000r/min离心15min，去掉上清液，将金纳米粒子再重新分散于50μL双蒸水中，将重分散后的金纳米粒子以10μL/管分装3管，于3管金纳米粒子溶液中分别加入10μL、20μL、30μL巯基修饰的单链DNA(购于上海生工生物工程技术服务有限公司)，混合均匀，室温反应12h后，加入1μL 2mol/L的NaCl溶液，混合均匀，继续室温反应12h；然后将反应好的溶液跑电泳确定反应效果，没有反应上的金纳米粒子遇到电泳液中的盐会在胶孔中聚沉，呈蓝色，而与DNA反应的金纳米粒子不会聚沉；
(3)波碳电极的修饰：将抛光处理好的波碳电极作为工作电极在浓度为20mmol/L的对氨基苯磺酸溶液中，在0.01v/s下进行循环伏安扫描，对氨基苯磺酸基被修饰到电极表面；
将扫描完的电极置于40m mol/L PCl5溶液中30min，进行活化；
(4)适配体电化学传感器的制备：将于上海生工生物工程技术服务有限公司购得的氨基修饰的单链DNA 6μL滴加于已完成活化的电极表面，待反应2h后，将电极放于清水中清洗5min，再将其置于5μmol/L适体溶液(购于上海生工生物工程技术服务有限公司)中反应12h，清洗电极，最后置于金纳米粒子修饰的DNA中反应12h，即制备得该电化学传感器。
(5)对赭曲霉毒素A标准品进行检测，建立标准曲线：将修饰好的电化学传感器置于赭曲霉毒素A标准品溶液中反应，标准品溶液浓度依次为0ng/mL、0.1ng/mL、1ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL，每个浓度分别反应15min后，将电化学传感器置于8×10-5mol/L亚甲基蓝溶液中反应10min。反应完成后，将电化学传感器作为工作电极，在0.1mol/L Tris-HCl中扫描循环伏安图谱。扫描完成后用超纯水洗涤1min，再进行下一个浓度的反应，进行扫描高电位为0.4v，低电位为0v，扫描速度为0.1v/s。根据扫描循环伏安图谱的氧化还原峰的电流值与对应的赭曲霉毒素A标准品浓度建立标准曲线；
(6)对含赭曲霉毒素A样品进行定量检测：将修饰好的电化学传感器置于含赭曲霉毒素A的待测样品中反应，反应15min后，将电化学传感器置于8×10-5mol/L亚甲基蓝溶液中反应10min，反应完成后，将电化学传感器作为工作电极，在0.1mol/L Tris-HCl中扫描循环伏安图谱；扫描完成后用超纯水洗涤1min，进行扫描高电位为0.4v，低电位为0v，扫描速度为0.1v/s；根据扫描循环伏安图谱的氧化还原峰的电流值从标准曲线中求得对应的赭曲霉毒素A的浓度。
金纳米粒子粒径为25nm。
所述的修饰氨基修饰的单链DNA是在循环伏安电流作用下，对氨基苯磺酸反应到工作电极表面，氨基修饰的单链DNA通过酰胺作用反应到电极表面。
所述的适体DNA为对赭曲霉毒素A有特异性反应的单链DNA。
所述的金纳米粒子修饰的单链DNA是与适体DNA的一端互补配对，且用巯基修饰的DNA，金纳米粒子与巯基修饰的DNA通过金巯键相结合。
所述的建立赭曲霉素A检测的标准曲线是指该传感器在与不同浓度的赭曲霉毒素A进行反应后，再与亚甲基蓝进行反应，并扫得其循环伏安图谱，根据不同浓度下氧化峰电流值做得标准曲线。
(三)有益效果：
(1)本发明采用适配体做传感器，提高了检测的灵敏度。
(2)本发明把纳米粒子修饰到电极表面，有利于电子的传递，进一步提高了其灵敏度。
(3)本发明采用电化学作为检测手段，方便快捷。
(4)本发明方法大大降低了小分子毒素检测成本。
附图说明
(1)金纳米粒子与DNA的偶联电泳图。1、金纳米粒子；2、金纳米粒子与DNA体积比1∶1反应；3、金纳米粒子与DNA体积比1∶2反应；4、金纳米粒子与DNA体积比1∶3反应。
(2)与不同浓度赭曲霉毒素A反应后的循环伏安扫描图。图上由上而下依次为在标准品0ng/mL、0.1ng/mL、1ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL反应后的循环伏安扫描图。
(3)赭曲霉毒素A检测标准曲线。
(4)实际样品检测循环伏安图谱。
具体实施方式
实施例1：电化学传感器的制备
(1)波碳电极的抛光处理
将波碳电极依次用1μm、0.3μm、0.05μm的氧化铝粉末进行打磨处理。然后置于1∶1乙醇水溶液中超声5min。
(2)金纳米粒子修饰的DNA的制备
将1mL浓度约为2×10-9mol/L的金纳米粒子溶液以10000r/min离心15min，去掉上清液，将金纳米粒子再重新分散于50μL双蒸水中。将重分散后的金纳米粒子以10μL/管分装3管，于3管金纳米粒子溶液中分别加入10μL、20μL、30μL巯基修饰的单链DNA(购于上海生工生物工程技术服务有限公司)，混合均匀，室温反应12h后，加入1μL 2mol/L的NaCl溶液，混合均匀，继续室温反应12h。然后将反应好的溶液跑电泳确定反应效果，没有反应上的金纳米粒子遇到电泳液中的盐会在胶孔中聚沉，呈蓝色，而与DNA反应的金纳米粒子不会聚沉。
(3)波碳电极的修饰
将抛光处理好的波碳电极作为工作电极在浓度为20m mol/L的对氨基苯磺酸溶液中，在0.01v/s下进行循环伏安扫描，对氨基苯磺酸基被修饰到电极表面。
将扫描完的电极置于40m mol/L PCl5溶液中30min，进行活化。
将于上海生工生物工程技术服务有限公司购得的氨基修饰的单链DNA 6μL滴加于已完成活化的电极表面，待反应2h后，将电极放于清水中清洗5min，再将其置于5μmol/L适体溶液(购于上海生工生物工程技术服务有限公司)中反应12h，清洗电极，最后置于金纳米粒子修饰的DNA中反应12h，这样该电化学传感器即制备好。
实施例2：赭曲霉毒素A检测标准曲线的建立及实际样品检测
将修饰好的电化学传感器置于赭曲霉毒素A标准品溶液中反应，标准品溶液浓度依次为0ng/mL、0.1ng/mL、1ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL，每个浓度反应15min后，将传感器置于8×10-5mol/L亚甲基蓝溶液中反应10min。反应完成后，将传感器作为工作电极，在0.1mol/L Tris-HCl中扫描循环伏安图谱。扫描完成后用超纯水洗涤1min，再进行下一个浓度的反应。进行扫描高电位为0.4v，低电位为0v，扫描速度为0.1v/s。
待6个浓度都扫描完成后，进行数据整理，绘制曲线。
氧化峰值电流值与对应浓度值如下表所示：
  赭曲霉毒素A标准品浓度(ng/mL)   氧化峰电流值(A)
  0   9.895E-06
  赭曲霉毒素A标准品浓度(ng/mL)   氧化峰电流值(A)
  0.1   9.705E-06
  1   9.503E-06
  5   8.147E-06
  10   6.697E-06
  20   4.639E-06
样品预处理：采用液液萃取法对葡萄酒样品进行预处理。在50mL酒样中加入50mL正己烷，振荡10min。待静置分层后，弃去上层的正己烷，再用25mL正己烷重复提取。收集下层，用25mL超纯水和25mL三氯甲烷，振荡10min，静置分层后，收集下层溶液，上层用25mL三氯甲烷再次振荡10min，合并三氯甲烷提取液，在旋转蒸发仪上，于40℃下进行浓缩，快干时加入2mL甲醇，溶解超声并用0.45μm滤膜过滤，用氮气吹干，再用1mL 30％(V/V)的甲醇水溶液进溶解，然后进行检测。检测得到的实际样品的循环伏安图谱的氧化峰电流值为6.299E-06A，代入标准曲线得到该葡萄酒提取液中的赭曲霉毒素A的浓度为12.34ng/mL。

Claims (2)

1.一种电化学传感器对微量赭曲霉毒素A进行检测的方法，其特征在于：对波碳电极进行修饰，做成适配体电化学传感器，对赭曲霉毒素A标准品进行检测，建立标准曲线，以达到对含赭曲霉毒素A样品进行定量检测的目的；步骤为
(1)波碳电极的抛光处理：将波碳电极依次用1μm、0.3μm、0.05μm的氧化铝粉末进行打磨处理；然后置于1∶1乙醇水溶液中超声5min；
(2)金纳米粒子修饰的DNA的制备：将1mL浓度为2×10-9mol/L的金纳米粒子溶液以10000r/min离心15min，去掉上清液，将金纳米粒子再重新分散于50μL双蒸水中，将重分散后的金纳米粒子以10μL/管分装3管，于3管金纳米粒子溶液中分别加入10μL、20μL、30μL巯基修饰的单链DNA，混合均匀，室温反应12h后，加入1μL 2mol/L的NaCl溶液，混合均匀，继续室温反应12h；然后将反应好的溶液跑电泳确定反应效果，没有反应上的金纳米粒子遇到电泳液中的盐会在胶孔中聚沉，呈蓝色，而与DNA反应的金纳米粒子不会聚沉；
(3)波碳电极的修饰：将抛光处理好的波碳电极作为工作电极在浓度为20mmol/L的对氨基苯磺酸溶液中，在0.01v/s下进行循环伏安扫描，对氨基苯磺酸基被修饰到电极表面；
将扫描后的电极置于40m mol/L PCl5溶液中30min，进行活化；
(4)适配体电化学传感器的制备：将氨基修饰的单链DNA 6μL滴加于已完成活化的电极表面，待反应2h后，将电极放于清水中清洗5min，再将其置于5μmol/L适配体溶液中反应12h，清洗电极，最后置于金纳米粒子修饰的DNA中反应12h，即制得电化学传感器；
(5)对赭曲霉毒素A标准品进行检测，建立标准曲线：将修饰好的电化学传感器置于赭曲霉毒素A标准品溶液中反应，标准品溶液浓度依次为0ng/mL、0.1ng/mL、1ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL，每个浓度分别反应15min后，将电化学传感器置于8×10-5mol/L亚甲基蓝溶液中反应10min，反应完成后，将电化学传感器作为工作电极，在0.1mol/L Tris-HCl中扫描循环伏安图谱；扫描完成后用超纯水洗涤1min，再进行下一个浓度的反应，进行扫描高电位为0.4v，低电位为0v，扫描速度为0.1v/s；根据扫描循环伏安图谱的氧化峰的电流值与对应的赭曲霉毒素A标准品浓度建立标准曲线；
(6)对含赭曲霉毒素A样品进行定量检测：将修饰好的电化学传感器置于含赭曲霉毒素A的待测样品中反应，反应15min后，将电化学传感器置于8×10-5mol/L亚甲基蓝溶液中反应10min，反应完成后，将电化学传感器作为工作电极，在0.1mol/L Tris-HCl中扫描循环伏安图谱；扫描完成后用超纯水洗涤1min，进行扫描高电位为0.4v，低电位为0v，扫描速度为0.1v/s；根据扫描循环伏安图谱的氧化峰的电流值从标准曲线中求得对应的赭曲霉毒素A的浓度。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：金纳米粒子粒径为25nm。
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