CN102680549B - 一种基于电化学hairpin DNA生物传感器的9-羟基芴测定方法 - Google Patents
一种基于电化学hairpin DNA生物传感器的9-羟基芴测定方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于基于hairpin？DNA修饰的金电极传感器检测9-羟基芴的电化学检测和化学传感器技术领域，涉及一种对9-羟基芴有电化学响应的hairpin？DNA修饰的金电极的制备以及运用此电极进行9-羟基芴的检测。具体的以人工合成的巯基修饰的hairpin？DNA为原料，通过金-硫键作用自组装到金电极表面制备DNA修饰电极。此固定化DNA电极对9-羟基芴有较高的响应，根据其电化学响应阻抗的变化可以进行9-羟基芴的检测。该DNA传感器制备条件温和，操作简单，稳定性好并具有较的灵敏度等优点。
Description
技术领域
本发明属于电化学检测和化学传感器技术领域，涉及一种基于hairpinDNA生物传感器的制备及将所制备的传感器用于检测9-羟基芴。
背景技术
羟基芳香烃类化合物作为芳烃类化合物的衍生物，因具有较强的生物毒性和环境危害性而备受人们关注，一些芳香酚类污染物已被列入优先监测黑名单中。由于其用途极为广泛，在许多工业领域诸如煤气、焦化、炼油、冶金、机械制造、玻璃、石油化工、木材纤维、化学有机合成工业、塑料、医药、农药、油漆等工业排出的废水中均含有羟基酚，因此预防其污染的工作也很困难，如直接排放则可污染大气、水、土壤和食品，因此对其在环境中的监测具有重要意义。
应用传统的检测手段，如气相色谱、液相色谱、液-质色谱联用、荧光光谱法等可以实现对羟基酚类污染物的离线分析，但是具有设备昂贵、测试费时等缺点。近年来，随着电化学技术的迅速发展，采用电化学DNA生物传感方法对环境污染物的检测已成为研究热点之一。应用DNA生物传感器具有能够特异性识别小分子的特点，可以实现对羟基酚类物质的检测，此外还具有性能稳定、受环境干扰和限制少、操作简单且灵敏度等优点，诸多优势使得电化学DNA生物传感器作为一种新型的检测技术被应用于环境监测领域。Marrazza等采用天然小牛胸腺DNA修饰的石墨丝网印刷电极生物传感器，采用计时溶出伏安法实现了对双酚进行的测定，研究发现采用单链DNA制备的传感器作用的响应信号要比和双链DNA传感器作用的信号强。Prabhakar等应用天然小牛胸腺DNA修饰的聚吡咯-聚氯乙烯磺酸盐/氧化铟膜修饰电极的传感器实现了对3-氯酚的检测，鸟嘌呤氧化峰电流与浓度具有较好的线性关系，检测限达到亚微摩尔。Yang等采用酸变性的天然小牛胸腺DNA修饰的氧化玻碳电极(GCE(OX))传感器实现了对1-萘酚的检测，检测限达到5nM。Zheng等结合纳米技术，将天然鲱鱼精DNA修饰到多壁碳纳米管(MCNTs)修饰的玻碳电极(GCE)表面制备成DNA/MWNTs/GCE传感器，实现了对苯酚，甲基酚，儿茶酚等酚类污染物的测定，检测限达到微摩尔数量级，此传感器不足之处是对酚类化合物不具有选择性。
目前，利用电化学DNA生物传感器对羟基芳香烃类化合物的检测还比较少，且主要是应用天然的DNA序列，虽然这些DNA传感器具有高灵敏性，但是对酚类化合物不具有选择性，且通过吸附作用修饰到电极表面的DNA膜均一性和稳定性较差。到目前为止，应用人工合成的硫修饰的DNA传感器对羟基酚类化合物的检测还未见报道，含硫修饰的DNA通过金-硫键作用自组装修饰到金电极表面，DNA膜结构高度有序，稳定性好，且人工合成的DNA可以对碱基进行调整，设计专一性、灵敏性较高的DNA生物传感器，有利于实现对混合体系中目标物的选择性分析检测，因而开发出一种能对某一种羟基化合物具有特殊选择性的DNA传感检测技术，在完善我国现有检测技术手段具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于通过金-硫键自组装到金电极表面的hairpinDNA传感器从而能快速检测9-羟基芴的方法。本发明所提供的电极的制备方法条件温和，操作简单，稳定性好，且运用此法制备的hairpinDNA电极对9-羟基芴的检测具有高灵敏性，选择性的优点。
本发明的第一方面，涉及一种hairpinDNA修饰的金电极的制备方法，具体包括下列步骤：
1)电极的预处理与活化：
将金电极在鹿皮抛光布上用0.05μm的α-Al2O3粉末抛光至镜面，抛光后先洗去表面污物，并依次在乙醇和去离子水中超声清洗，每次2～3min，重复三次；然后在0.5mol/LH2SO4溶液中经循环伏安扫描至稳定，最后用去离子水冲洗干净，氮气吹干，即可得到表面干净的金电极；
2)HairpinDNA溶液的配制：
将固体hairpinDNA用pH＝7.4的高离子强度Tris-NaClO4缓冲溶液(Tris浓度为20mM，NaClO4浓度为300mM)溶解并稀释到一定浓度，并用漩涡振荡器混匀，于室温下静置12h，备用；
3)HairpinDNA修饰电极的制备
将上述步骤1)活化处理的金电极浸泡在上述步骤2)配制的hairpinDNA溶液中，于室温下静置4-5天。巯基修饰的hairpinDNA通过Au-S键作用自组装于金电极表面，即得到hairpinDNA修饰电极。
优选地，上述步骤2)中Tris-NaClO4缓冲溶液中Tris浓度为20mM，NaClO4浓度为300mM。
优选地，上述步骤2)中所述的hairpinDNA为5′端双巯基修饰的含40个碱基的hairpinDNA序列，其中共包含三部分：hairpinDNA序列靠近5′端的前9个碱基胸腺嘧啶为柔性间隔基团，用以保持hairpin结构的双链部分以及hairpinDNA结构的“环”状部分。
优选地，上述步骤2)中所述hairpinDNA的“环”部分碱基为富含鸟嘌呤和胞嘧啶碱基序列。
优选地，上述步骤2)中所述hairpinDNA双链部分匹配碱基数为5对。
优选地，上述步骤2)中所述hairpinDNA的浓度为5μM，体积为70～90μL。
本发明中，所使用的hairpinDNA结构是本领域人员所熟悉的，其获得可以通过供应商获得。
本发明的另一方面，涉及应用如上述制备方法得到的hairpinDNA修饰电极对羟基芴检测的方法，其具体检测方法为：将上述制备的hairpinDNA修饰的金电极为工作电极，以饱和KCl溶液中的Ag/AgC为参比电极，铂电极为对电极构筑三电极体系，先将hairpinDNA修饰电极在2mMK3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6]溶液中进行电化学阻抗测量，测完后用缓冲溶液淋洗，然后置于以pH值为7.4的0.02mol/L的Tris-NaClO4缓冲溶液配制的一定浓度的9-羟基芴溶液中，反应30min，然后再进行电化学阻抗测定，比较作用前后阻抗值的变化。
与现有技术相比本专利技术具有以下优点：
1.本发明所采用的DNA序列为人工合成的hairpinDNA序列，碱基的序列可以根据实验需要进行调整；
2.本发明所采用的hairpinDNA序列的“环”部分的碱基为富鸟嘌呤及胞嘧啶碱基，对9-羟基芴具有较高的亲和性作用；
3.本发明是通过金-硫键作用将hairpinDNA自组装于金电极表面，该方法得到的DNA膜表面结构高度有序，稳定性好，受环境干扰和限制少，方法简单易行；
4.本发明所制备的hairpinDNA修饰电极对9-羟基芴的检测具有实时、响应速度快、成本较低等特点，而对其它羟基芴化合物如2-羟基芴无电化学响应；
5.本发明所采用的电化学交流阻抗法是研究电极界面现象的一种重要手段，可灵敏的表征电极表面hairpinDNA修饰膜的变化情况，具有高灵敏度性。
附图说明
图1为金电极及hairpinDNA修饰电极的阻抗谱图；
图2为使用本发明的hairpinDNA修饰电极与9-羟基芴作用前后的尼奎斯特阻抗谱图：DNA膜(□)，与9-羟基芴作用；其中，横坐标代表电化学阻抗的实部(电阻)，单位为Ω·cm2，纵坐标代表电化学阻抗的虚部(电容)，单位为Ω·cm2；
图3为使用本发明的hairpinDNA修饰电极与2-羟基芴作用前后的尼奎斯特阻抗谱图：DNA膜(□)，与2-羟基芴作用；其中，横坐标代表电化学阻抗的实部(电阻)，单位为Ω·cm2，纵坐标代表电化学阻抗的虚部(电容)，单位为Ω·cm2；
图4为使用本发明的hairpinDNA修饰电极测定的电荷传递电阻的变化值(ΔRCT)与9-羟基芴浓度关系曲线，为空白对照；其中，横坐标代表9-羟基芴浓度，单位为nM，纵坐标代表电荷传递电阻的变化值，单位为Ω·cm2；
具体实施方式
以下实施实例对本发明做更详细的描述，但所述实施不构成对本发明的限制。
实施例1
1)将金电极在鹿皮抛光布上用0.05μm的α-Al2O3粉末抛光至镜面，抛光后先洗去表面污物，并依次在乙醇和去离子水中超声清洗，每次2～3min，重复三次；然后在1mol/LH2SO4溶液中经循环伏安扫描至稳定，最后用去离子水冲洗干净，氮气吹干，即可得到表面干净的金电极；
2)以pH＝7.4的高离子强度Tris-NaClO4缓冲溶液将固体hairpinDNA溶解，其中Tris浓度为20mM，NaClO4浓度为300mM，用漩涡振荡器混匀，并静置于室温下12h，在此条件下形成hairpinDNA结构；
3)将活化处理的金电极浸泡在预先配制的5μM的hairpinDNA溶液中，静置于室温下4-5天，即得到hairpinDNA修饰电极；
4)以此制备的hairpinDNA修饰电极作为工作电极，以Ag/AgCl(饱和KCl溶液)电极为参比电极，铂电极为对电极构筑三电极体系，电解液为pH值7.4的20mmol/LTris-NaClO4缓冲溶液配制的浓度分别为1nmol/L、5.5nmol/L、27.5nmol/L、55nmol/L、110nmol/L、275nmol/L及550nmol/L的9-羟基芴溶液中，应用PARSTAT2273电化学综合测试系统进行电化学阻抗测定，实验表明，此hairpinDNA修饰电极具有优异的性能，响应时间快，灵敏度高，对9-羟基芴的检测线性范围：1～275nmol/L。
表1hairpinDNA修饰电极与9-羟基芴作用后的电化学阻抗变化(ΔRCT)
实施例2
以275nmol/L的2-羟基芴溶液来代替实施例1中的9-羟基芴溶液，其他条件同实施例1，实验表明，此hairpinDNA修饰电极对2-羟基芴无响应。
Claims (4)
1.一种hairpinDNA修饰的金电极的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
1)电极的预处理与活化：
将金电极在鹿皮抛光布上用0.05μm的α-Al2O3粉末抛光至镜面，抛光后先洗去表面污物，并依次在乙醇和去离子水中超声清洗，每次2～3min，重复三次；然后在0.5mol/LH2SO4溶液中经循环伏安扫描至稳定，最后用去离子水冲洗干净，氮气吹干，得到表面干净的金电极；
2)HairpinDNA溶液的配制：
将固体hairpinDNA药品用pH＝7.4的高离子强度Tris-NaClO4缓冲溶液溶解并稀释到一定浓度，并用漩涡振荡器混匀，于室温下静置12h以备用；
3)HairpinDNA修饰电极的制备：
将上述步骤1)活化处理的金电极浸泡在上述步骤2)配制的hairpinDNA溶液中，于室温下静置4-5天，其中巯基修饰的hairpinDNA通过Au-S键作用自组装于金电极表面从而得到hairpinDNA修饰电极；
所述的hairpinDNA为5′端双巯基修饰的含40个碱基的hairpinDNA序列，其中共包含三部分：hairpinDNA序列靠近5′端的前9个碱基胸腺嘧啶为柔性间隔基团，用以保持hairpin结构的双链部分及hairpinDNA结构的“环”状部分；所述的hairpinDNA的“环”状部分碱基为富含鸟嘌呤和胞嘧啶碱基序列；hairpinDNA用以保持hairpin结构的双链部分碱基数为5对。
2.根据权利要求1所述的hairpinDNA修饰的金电极的制备方法，其特征在于：所述Tris-NaClO4缓冲溶液中Tris浓度为20mM，NaClO4浓度为300mM。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述hairpinDNA的浓度为5μM，体积为70～90μL。
4.一种应用如权利要求1所述制备方法得到的hairpinDNA修饰电极对9-羟基芴检测的方法，其特征在于具体步骤为：将制备的hairpinDNA修饰电极为工作电极，以饱和KCl溶液中的Ag/AgCl为参比电极，铂电极为对电极构筑三电极体系，先将hairpinDNA修饰电极在2mMK3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6]溶液中进行电化学阻抗测量，测完后用缓冲溶液淋洗，然后置于以pH值为7.4的0.02mol/L的Tris-NaClO4缓冲溶液配制的一定浓度的9-羟基芴溶液中，反应30min，然后再进行电化学阻抗测定，比较作用前后阻抗值的变化。
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