CN105675678B - 基于电化学适体dna生物传感器的乙醇胺检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种基于电化学适体DNA生物传感器的乙醇胺检测方法，通过将对乙醇胺特异性作用的DNA序列组装于金电极表面，制备了可以检测乙醇胺的电化学适体DNA生物传感器。乙醇胺与电极表面DNA特异性的作用，使电极表面DNA构象发光变化，导致电化学阻抗信号的变化，从而实现了对乙醇胺的检测。该电化学适体生物传感器制备简单、检测周期短，对乙醇胺具有高灵敏度、高选择性的优点，可用于实际环境水样中乙醇胺的检测。

Description

基于电化学适体DNA生物传感器的乙醇胺检测方法
技术领域
本发明属于分析化学和电化学传感技术领域，具体地说，涉及一种基于电化学适体DNA生物传感器的乙醇胺检测方法。
背景技术
环境体系中胺类化合物是一类普遍存在的具有较强毒性的有机污染物。研究表明，胺类化合物在体内酶代谢过程中产生的高活性、强亲电性的中间体——氨基羟基化的活化产物(Cohen,Boobis et al.2006,Gamage,Barnett et al.2006)，这些活性中间体可与DNA的碱基之间发生作用生成DNA结合物，从而导致不同类型的DNA损伤并在DNA复制、转录过程中诱发突变，最终引发癌变(Vaidyanathan and Cho 2012)，因而具有较强的致癌性。
乙醇胺是一种结构上非常简单的脂肪胺，在工业、医药、环境、生物等领域均具有重要作用。通常用作化学试剂、农药合成中间体、杀虫剂、医药、溶剂、染料中间体、橡胶促进剂、腐蚀抑制剂，表面活性剂，乳化剂、印染增白剂、织物防蛀剂、油墨助剂、石油添加剂等。研究表明乙醇胺对皮肤、呼吸道等产生刺激和伤害作用，进入体内后亦会对神经系统产生抑制作用。同时，乙醇胺与人类的一些疾病，如精神分裂症、老年痴呆症等亦存在较为密切的关系，因此乙醇胺化合物是具有潜在致癌性的污染物(Heilkenbrinker et al.2015)。目前，检测乙醇胺的方法主要采用高效液相色谱法，但是该方法仍然存在一些不足之处，如操作相对复杂、仪器设备昂贵、测试费用高、需专业人员进行操作、样品需进行前处理等等。因此，建立一种快速、简单、灵敏的乙醇胺检测方法具有重要的研究价值。
DNA生物传感技术具有分析快速、操作简单、价格廉价、可离线分析等优点，而DNA分子结构简单、易合成、可反复使用和长期保存，因此，DNA生物传感器作为一种新型的检测技术被广泛用于芳香胺污染物的检测。如Prabhakar等应用天然小牛胸腺DNA修饰的聚吡咯-聚氯乙烯磺酸盐/氧化铟膜电极传感器，用循环伏安法对芳香族化合物2-氨基蒽进行了检测。Chiti等采用天然DNA和含人工合成的含23个碱基的DNA片段修饰的丝网石墨印刷电极传感器，对芳香胺2-氨基萘、2-氨基蒽、1,2-二氨基蒽醌、吖啶黄等化合物进行了检测。Wang等应用天然小牛胸腺DNA修饰的碳糊电极生物传感器，实现了对2-氨基萘、1-氨基蒽、2-氨基蒽、9,10-二氨基菲、1-氨基吡等芳香胺类污染物的检测。然而，以DNA作为分子识别主体构建的电化学DNA生物传感器虽然可以实现芳香胺类污染物快速、高灵敏的分析，但其不足之处是选择性非常差。这也是目前采用电化学DNA生物传感器检测环境有机污染物面临的共同难题。
DNA适体是一种通过体外筛选技术得到的对靶分子具有选择性作用DNA序列，因此该适体DNA分子具备对靶分子高亲合力和特异性的优点。将适体DNA用于生物传感分析领域检测目标污染物倍受科研工作者青睐。Heilkenbrinker等通过体外筛选得到了可以识别乙醇胺分子的有效DNA系列，并在此基础上，建立了基于荧光DNA生物传感器检测乙醇胺的检测方法。但是该方法中采用了荧光信号分子标记的DNA，使得DNA的合成费用增加，进而提高了传感器的检测成本。同时，以荧光作为检测信号对乙醇胺进行测定，很容易受检测体系中其它物质的干扰，容易造成假阳性结果。电化学分析方法具有操作简单、灵敏、高效、抗干扰能力强等优点，特别是采用表面电化学技术作为研究方法具有DNA样品用量少的特点，因而电化学DNA生物传感器越来越受到人们的关注。因此，电化学适体DNA生物传感技术有望实现对乙醇胺的快速、灵敏、选择性检测。目前采用电化学DNA生物传感器检测乙醇胺方面的研究尚未见报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于电化学适体DNA生物传感器的乙醇胺检测方法。
为了实现本发明目的，本发明提供的基于电化学适体DNA生物传感器的乙醇胺检测方法，通过乙醇胺与修饰于电极表面的适体DNA发生作用诱导DNA产生构型的变化，导致电极表面的电化学阻抗变大，从而实现了乙醇胺的检测。所述方法包括以下步骤：
1)电极的活化处理：
将1～5mm直径的金电极在抛光布(如鹿皮抛光布)上依次用粒径为1μm、0.3μm、0.05μm的γ-Al2O3泥浆抛光5～10min，然后分别在乙醇和超纯水中超声清洗；将处理后的电极在0.5～1M的H2SO4溶液中经循环伏安扫描2～20次，最后用超纯水清洗，氮气吹干，得到活化处理的金电极备用；
2)DNA溶液的配制：
将适体DNA粉末溶解于适量10mM pH值7.4的Tris-HCl缓冲液中，用漩涡振荡器混匀，并置于70～90℃的水浴锅中加热活化处理1～10min，然后自然冷却至室温；将上述DNA溶液用含EDTA、NaCl和三(2-羧乙基)膦盐酸盐的10mM pH值8.0的Tris-HCl缓冲液稀释至2μM，于室温孵育5～50min；
3)适体DNA修饰电极的制备：
取2μL上述步骤2)配制的2μM DNA溶液，滴加到步骤1)活化处理的金电极表面，保持一定的湿度，室温孵育2～48h；取出电极，用10mM pH值7.4的Tris-HCl缓冲液淋洗，氮气吹干，然后将上述电极置于1～10mM 6-巯基己醇的水溶液中，孵育1～12h；取出电极，用10mM pH值7.4的Tris-HCl缓冲液淋洗，氮气吹干，得到适体DNA修饰电极备用；
4)乙醇胺的电化学检测：
配制含NaCl、KCl、MgCl2、CaCl2和Tween-20的20mM pH值7.6的Tris-HCl缓冲液，并用此溶液配制一定浓度的乙醇胺溶液，备用；
将步骤3)制备的适体DNA修饰电极作为工作电极置于1～10mM K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6]溶液的电化学测定池中，并以铂丝电极为对电极，Ag/AgCl为参比电极，构建三电极测定体系，进行电化学阻抗测量；取出上述工作电极后用10mM pH值7.4的Tris-HCl缓冲液淋洗，氮气吹干，并置于上述配制的乙醇胺溶液中孵育10～200min，然后再次进行电化学阻抗测定，从而实现对乙醇胺的电化学阻抗测定。
本发明适体DNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
前述的方法，步骤2)中DNA溶液用含1～100mM EDTA、10～1000mM NaCl和1～50mM三(2-羧乙基)膦盐酸盐的10mM pH值8.0的Tris-HCl缓冲液稀释至2μM。
前述的方法，步骤4)中配制含1～100mM NaCl、1～50mM KCl、2～60mM MgCl2、1～50mM CaCl2和0.01～10v/v％Tween-20的20mM pH值7.6的Tris-HCl缓冲液，并用此溶液配制一定浓度的乙醇胺溶液。
基于上述检测方法，本发明提供一种适体DNA修饰电极，所述适体DNA修饰电极的制备方法包括以下步骤：
(1)将1mm直径的金电极在抛光布上依次用粒径为1μm、0.3μm、0.05μm的γ-Al2O3泥浆抛光5～10min，然后分别在乙醇和超纯水中超声清洗；将处理后的电极在0.5～1M的H2SO4溶液中经循环伏安扫描2～20次，最后用超纯水清洗，氮气吹干，得到活化处理的金电极备用；
(2)将适体DNA粉末溶解于适量10mM pH值7.4的Tris-HCl缓冲液中，用漩涡振荡器混匀，并置于70～90℃的水浴锅中加热活化处理1～10min，然后自然冷却至室温；将上述DNA溶液用含1～100mM EDTA、10～1000mM NaCl和1～50mM三(2-羧乙基)膦盐酸盐的10mMpH值8.0的Tris-HCl缓冲液稀释至2μM，于室温孵育5～50min；
(3)取2μL上述步骤(2)配制的2μM DNA溶液，滴加到步骤(1)活化处理的金电极表面，保持一定的湿度，室温孵育2～48h；取出电极，用10mM pH值7.4的Tris-HCl缓冲液淋洗，氮气吹干，然后将上述电极置于1～10mM 6-巯基己醇的水溶液中，孵育1～12h；取出电极，用10mM pH值7.4的Tris-HCl缓冲液淋洗，氮气吹干，得到适体DNA修饰电极备用；
(4)将步骤(3)制备的适体DNA修饰电极作为工作电极置于1～10mM K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6]溶液的电化学测定池中，并与铂丝对电极和Ag/AgCl参比电极构建成三电极测定体系，进行电化学阻抗测定。
本发明还提供所述的适体DNA修饰电极在环境水样中乙醇胺检测中的应用。
检测时，将适体DNA修饰电极作为工作电极，铂丝电极为对电极，Ag/AgCl为参比电极，并连接电化学工作站，通过电化学工作站电化学阻抗法检测阻抗，再将电化学阻抗数据换算为浓度数据(图1)。本发明进一步提供一种电化学适体DNA生物传感器，所述传感器包括电化学工作站以及所述修饰适体DNA的工作电极，铂丝电极对电极，Ag/AgCl参比电极，电化学工作站与上述三个电极之间通过导线连接。
本发明通过将对乙醇胺特异性作用的DNA序列组装于金电极表面，制备了可以检测乙醇胺的电化学适体DNA生物传感器。乙醇胺与电极表面DNA特异性的作用，使电极表面DNA构象发光变化，导致电化学阻抗信号的变化，从而实现了对乙醇胺的检测。该电化学适体生物传感器制备简单、检测周期短，对乙醇胺具有高灵敏度、高选择性的优点，可用于实际环境水样中乙醇胺的检测。具体优点如下：
(一)本发明采用的适体DNA分子可以特异性识别乙醇胺分子；
(二)本发明采用的巯基修饰的DNA分子在金电极表面成膜方法简单易行，其膜的稳定性好；
(三)本发明制备的适体DNA电极及其生物传感器具有成本低、抗干扰性高的优点；
(四)本发明采用的电化学阻抗技术对乙醇胺的检测具有响应速度快、灵敏度高且操作简单等特点；
(五)本发明所制备的电化学适体DNA传感器具备检测周期短、重现性高等特点；
(六)本发明提供的基于电化学适体DNA生物传感器的乙醇胺检测方法，在环境综合防治，特别是在乙醇胺污染物应急监测及突发性事件方面可以发挥重要的作用，在环境监测技术领域应用前景广阔。
附图说明
图1为本发明电化学适体DNA生物传感器的工作示意图。
图2为本发明实施例2中适体DNA电极与浓度为1.6mM的乙醇胺作用前后的阻抗谱图；其中，DNA膜(○)，与乙醇胺作用后(●)；横坐标代表电化学阻抗的实部(电阻)，单位为Ω·cm2，纵坐标代表电化学阻抗的虚部(电容)，单位为Ω·cm2。
图3为本发明实施例4中适体DNA电极分别与浓度均为16nM的乙醇胺、乙醇、乙二醇、异丙醇、异丙醇胺作用后的电化学阻抗变化结果。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
以下实施例中使用的电化学工作站购自上海辰华仪器公司，型号CHI 666D。
实施例1适体DNA修饰电极及其生物传感器的制备
本实施例提供的适体DNA修饰电极，其制备方法包括以下步骤：
(1)将1mm直径的金电极在鹿皮抛光布上依次用粒径为1μm、0.3μm、0.05μm的γ-Al2O3泥浆抛光10min，然后分别在乙醇和超纯水中超声清洗；将处理后的电极在1M的H2SO4溶液中经循环伏安扫描20次，最后用超纯水清洗，氮气吹干，得到活化处理的金电极备用；
(2)将适体DNA粉末溶解于适量10mM pH值7.4的Tris-HCl缓冲液中，用漩涡振荡器混匀，并置于80℃的水浴锅中加热活化处理1～10min，然后自然冷却至室温；将上述DNA溶液用含1mM EDTA、1mM NaCl和1mM三(2-羧乙基)膦盐酸盐的10mM pH值8.0的Tris-HCl缓冲液稀释至2μM，于室温孵育30min；
(3)取2μL上述步骤(2)配制的2μM DNA溶液，滴加到步骤(1)活化处理的金电极表面，保持一定的湿度，室温孵育24h；取出电极，用10mM pH值7.4的Tris-HCl缓冲液淋洗，氮气吹干，然后将上述电极置于1～10mM 6-巯基己醇的水溶液中，孵育10h；取出电极，用10mMpH值7.4的Tris-HCl缓冲液淋洗，氮气吹干，得到适体DNA修饰电极备用；
(4)将步骤(3)制备的适体DNA修饰电极作为工作电极置于1～10mM K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6]溶液的电化学测定池中，并与铂丝电极对电极和Ag/AgCl参比电极构建成三电极测定体系。
检测时，用电化学工作站连接工作电极、参比电极、对电极，通过电化学工作站电化学阻抗法检测阻抗，再将电化学阻抗数据换算为浓度数据。(图1)
本实施例提供的生物传感器包括电化学工作站以及所述修饰适体DNA的工作电极，铂丝电极对电极，Ag/AgCl参比电极，电化学工作站与上述三个电极之间通过导线连接。
实施例2基于电化学适体DNA生物传感器的乙醇胺检测方法
用超纯水配制含100mM NaCl、5mM KCl、2mM MgCl2、1mM CaCl2和0.02v/v％Tween-20的20mM pH值7.6的Tris-HCl缓冲液，并用此溶液配制不同浓度的乙醇胺溶液，备用。
将实施例1中制备的适体DNA修饰电极分别浸泡在上述不同浓度的乙醇胺溶液中，孵育2h，连接电化学工作站进行电化学阻抗测定，电化学阻抗变化结果见表1。
表1适体DNA电极与不同浓度乙醇胺作用后电化学阻抗变化(ΔRCT)
适体DNA电极与浓度为1.6mM的乙醇胺作用前后的阻抗谱图见图2。
实施例3利用适体DNA修饰电极实现对环境水样中乙醇胺的检测
以取自环境体系中湖水代替实施例2的超纯水，配制不同浓度的乙醇胺溶液。采用与实施例2相同的电化学测定方法分别进行电化学阻抗测定，结果见表2。
表2适体DNA电极与湖水配制的乙醇胺作用后电化学阻抗变化(ΔRCT)
实施例4乙醇胺的选择性研究
将实施例1中制备的适体DNA修饰电极分别与浓度均为16nM的乙醇胺、乙醇、乙二醇、异丙醇、异丙醇胺作用后的电化学阻抗变化ΔRCT结果见图3。
从图3可以看出，乙醇胺与适体DNA修饰电极作用后引起较大的电化学阻抗变化，而其它几种化合物电化学阻抗变化较小，表明该电化学适体DNA传感器对乙醇胺具有选择性检测的作用。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
参考文献
1.S.M.Cohen,A.R.Boobis,M.E.Meek,R.J.Preston and D.B.McGregor."4-Aminobiphenyl and DNA reactivity:case study within the context of the2006IPCS human relevance framework for analysis of a cancer mode of actionfor humans."Crit.Rev.Toxicol.2006,36(10):803-819.
2.N.Gamage,A.Barnett,N.Hempel,R.G.Duggleby,K.F.Windmill,J.L.Martinand M.E.McManus."Human sulfotransferases and their role in chemicalmetabolism."Toxicol.Sci.2006,90(1):5-22.
3.V.G.Vaidyanathan and B.P.Cho."Sequence Effects on TranslesionSynthesis of an Aminofluorene–DNA Adduct:Conformational,Thermodynamic,andPrimer Extension Kinetic Studies."Biochemistry 2012,51(9):1983-1995.
4.A.Heilkenbrinker,C.Reinemann,R.Stoltenburg,J.G.Walter,A.Jochums,F.Stahl,S.Zimmermann,B.Strehlitz and T.Scheper."Identification of the targetbinding site of ethanolamine binding aptamers and its exploitation forethanolamine detection."2015,Anal.Chem.87:677-685.
5.N.Prabhakar,K.Arora,S.Singh,M.Pandey,H.Singh and B.Malhotra."Polypyrrole-polyvinyl sulphonate film based disposable nucleic acidbiosensor."Anal.Chim.Acta 2007,589(1):6-13.
6.G.Chiti,G.Marrazza and M.Mascini."Electrochemical DNA biosensor forenvironmental monitoring."Anal.Chim.Acta 2001,427(2):155-164.

Claims (7)

1.基于电化学适体DNA生物传感器的乙醇胺检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)电极的活化处理：
将1～5mm直径的金电极在抛光布上依次用粒径为1μm、0.3μm、0.05μm的γ-Al2O3泥浆抛光5～10min，然后分别在乙醇和超纯水中超声清洗；将处理后的电极在0.5～1M的H2SO4溶液中经循环伏安扫描2～20次，最后用超纯水清洗，氮气吹干，得到活化处理的金电极备用；
2)DNA溶液的配制：
将适体DNA粉末溶解于适量10mM pH值7.4的Tris-HCl缓冲液中，用漩涡振荡器混匀，并置于70～90℃的水浴锅中加热活化处理1～10min，然后自然冷却至室温；将上述DNA溶液用含EDTA、NaCl和三(2-羧乙基)膦盐酸盐的10mM pH值8.0的Tris-HCl缓冲液稀释至2μM，于室温孵育5～50min；
3)适体DNA修饰电极的制备：
取2μL上述步骤2)配制的2μM DNA溶液，滴加到步骤1)活化处理的金电极表面，保持一定的湿度，室温孵育2～48h；取出电极，用10mM pH值7.4的Tris-HCl缓冲液淋洗，氮气吹干，然后将上述电极置于1～10mM 6-巯基己醇的水溶液中，孵育1～12h；取出电极，用10mM pH值7.4的Tris-HCl缓冲液淋洗，氮气吹干，得到适体DNA修饰电极备用；
4)乙醇胺的电化学检测：
配制含NaCl、KCl、MgCl2、CaCl2和Tween-20的20mM pH值7.6的Tris-HCl缓冲液，并用此溶液配制一定浓度的乙醇胺溶液，备用；
将步骤3)制备的适体DNA修饰电极作为工作电极置于1～10mM K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6]溶液的电化学测定池中，并以铂丝电极为对电极，Ag/AgCl为参比电极，构建三电极测定体系，进行电化学阻抗测量；取出上述电极后用10mM pH值7.4的Tris-HCl缓冲液淋洗，氮气吹干，并置于上述配制的乙醇胺溶液中孵育10～200min，然后再次进行电化学阻抗测定，从而实现对乙醇胺的电化学阻抗测定。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)所述适体DNA的核苷酸序列如SEQID NO:1所示。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中DNA溶液用含1～100mM EDTA、10～1000mM NaCl和1～50mM三(2-羧乙基)膦盐酸盐的10mM pH值8.0的Tris-HCl缓冲液稀释至2μM。
4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，步骤4)中配制含1～100mM NaCl、1～50mM KCl、2～60mM MgCl2、1～50mM CaCl2和0.01～10v/v％Tween-20的20mM pH值7.6的Tris-HCl缓冲液，并用此溶液配制一定浓度的乙醇胺溶液。
5.适体DNA修饰电极，其特征在于，所述适体DNA修饰电极的制备方法包括以下步骤：
(1)将1mm直径的金电极在抛光布上依次用粒径为1μm、0.3μm、0.05μm的γ-Al2O3泥浆抛光5～10min，然后分别在乙醇和超纯水中超声清洗；将处理后的电极在0.5～1M的H2SO4溶液中经循环伏安扫描2～20次，最后用超纯水清洗，氮气吹干，得到活化处理的金电极备用；
(2)将适体DNA粉末溶解于适量10mM pH值7.4的Tris-HCl缓冲液中，用漩涡振荡器混匀，并置于70～90℃的水浴锅中加热活化处理1～10min，然后自然冷却至室温；将上述DNA溶液用含1～100mM EDTA、10～1000mM NaCl和1～50mM三(2-羧乙基)膦盐酸盐的10mM pH值8.0的Tris-HCl缓冲液稀释至2μM，于室温孵育5～50min；
(3)取2μL上述步骤(2)配制的2μM DNA溶液，滴加到步骤(1)活化处理的金电极表面，保持一定的湿度，室温孵育2～48h；取出电极，用10mM pH值7.4的Tris-HCl缓冲液淋洗，氮气吹干，然后将上述电极置于1～10mM 6-巯基己醇的水溶液中，孵育1～12h；取出电极，用10mM pH值7.4的Tris-HCl缓冲液淋洗，氮气吹干，得到适体DNA修饰电极备用；
(4)将步骤(3)制备的适体DNA修饰电极作为工作电极置于1～10mM K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6]溶液的电化学测定池中，并与铂丝对电极和Ag/AgCl参比电极构建成三电极测定体系，进行电化学阻抗测定。
6.电化学适体DNA生物传感器，其特征在于，所述传感器包括电化学工作站以及权利要求5所述适体DNA修饰电极、铂丝电极对电极和Ag/AgCl参比电极，电化学工作站与上述三个电极之间通过导线连接。
7.权利要求5所述适体DNA修饰电极或权利要求6所述电化学适体DNA生物传感器在环境水样中乙醇胺检测中的应用。
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