CN101581692A

CN101581692A - 一种快速检测果蔬表面微量农药残留的基于阵列电极的生物传感器

Info

Publication number: CN101581692A
Application number: CNA2009100858948A
Authority: CN
Inventors: 潘立刚; 向玲; 韩平; 陆安祥; 王纪华
Original assignee: BEIJING RESEARCH CENTER OF AGRIFOOD AND FARMLAND MONITORING CHIAN
Current assignee: BEIJING RESEARCH CENTER OF AGRIFOOD AND FARMLAND MONITORING CHIAN
Priority date: 2009-06-03
Filing date: 2009-06-03
Publication date: 2009-11-18
Anticipated expiration: 2029-06-03
Also published as: CN101581692B

Abstract

本发明涉及一种基于阵列电极的生物传感器。本发明所述的生物传感器含有绝缘介质，参比电极、辅助电极和多个工作电极，所述多个工作电极形成阵列；所述生物传感器的表面具有由高分子聚合材料层和所吸附的缓冲液形成的缓冲液膜。与现有的生物传感器相比，主要优点为：1.检测结果可靠、准确：阵列工作电极并联，可以通过工作电极阵列提高电信号的捕捉概率，从而提高检测的可靠性，降低了电极之间差异或单个电极失效所带来的副作用；2.自带检测环境，所测样品无需进行前处理，实现快速、无损检测；3.阵列工作电极并联，改善了测试体系的信噪比，提高了检测灵敏度。同时响应电流增大，使用普通的、微型化及便携式检测器即可，适合野外现场检测。

Description

一种快速检测果蔬表面微量农药残留的基于阵列电极的生物传感器

技术领域

本发明涉及农药残留快速检测领域，特别是涉及一种检测果蔬表面微量农药残留的生物传感器及其阵列电极。

背景技术

农药在农业生产中的广泛应用对作物的增产增收发挥了重要作用，然而，长期大量使用农药也引起了土壤、农产品中农药残留超标，对生态环境和人类健康造成了危害。农药残留问题涉及到农产品安全，这已经成为一个广泛关注的公共卫生问题。由于国内农产品的生产、运输非常分散，菜农等可直接将产品运至市场销售，这种现状使农产品的安全、快速检测显得尤为重要。

实验室检测果蔬中农药残留通常采用气相色谱法和液相色谱法，结果准确，但耗时往往长达10个多小时，步骤繁琐且仪器昂贵，只适合对少量样品的检测。

电化学生物传感器结合了酶的分子识别和选择性催化功能，同时具有电化学电极响应快、操作简便的特点，因此在传感领域发展最早，研究最深入，且电化学生物传感器的灵敏度高、易于自动化，非常适合于大批量农药残留的初步筛查，已经成为农药残留检测重要研究方向。另外，由于丝网印刷电极具有微型化、成本低廉，可批量生产、可一次性使用等特点，已经成为快速检测农药残留的主要电极。

在实际应用中，农产品中的农药残留是微量甚至痕量的，单个电极响应电流小，需要特殊的电流检测仪器才能达到精度要求，不利于仪器的微型化，同时微弱的信号响应易引起噪声干扰和基线偏移，降低了仪器的灵敏度。

因此，针对上述问题有必要提出基于丝网电极的一种检测果蔬表面农药残留的新型电化学生物传感器。

发明内容

本发明的目的是提供一种结构简单、操作方便、成本低且检测灵敏度高，结果准确可靠的基于阵列电极的生物传感器。

为增加电极的响应电流，本发明在现有的生物传感器的基础上增加了工作电极的个数，并通过在传感器上附加检测环境改进了该生物传感器的实用性。

所述的基于阵列电极的生物传感器含有绝缘介质，参比电极、辅助电极和多个工作电极，多个工作电极并联形成阵列，其数量和分布根据检测对象来决定，如表面积、表面形状等。

该生物传感器的主要原理是：果蔬表面农药残留物与阵列工作电极上的特异性酶发生生物化学反应，通过电极将化学反应产生的物质变化转化为电信号，在化学工作站上进行信号处理，从而实现对某类农药残留物的快速检测。

为便于检测果蔬表面的农药残留，使阵列电极能够很好的与果蔬表面接触，所述绝缘介质优选具有一定弹性的绝缘材料或绝缘涂料，如聚氯乙烯，聚碳酸酯，聚苯乙烯等，使制备好的生物传感器阵列电极能贴于果蔬表面进行检测；

另外，所述生物传感器的表面具有由高分子聚合材料层和所吸附的缓冲液形成的缓冲液膜；所述高分子聚合材料可以选用本领域常用的材料，如聚乙烯，聚丙烯，丙烯酸树脂；所述缓冲液选择磷酸或醋酸缓冲液，优选磷酸缓冲液；

所述缓冲液膜优选由丙烯酸树脂与吸附在丙烯酸树脂中20-50μl的0.05～0.1M磷酸缓冲溶液(pH 7.0)构成。

上述缓冲液膜在受到被测物的挤压时，能够在在被测物表面与传感器之间形成连续液膜，为生物传感器提供化学反应环境。

其中所述工作电极由基底电极、基底电极上的电化学催化剂层，以及位于电化学催化剂层上的酶层组成；

或者，所述工作电极由基底电极、基底电极上的电化学催化剂与酶的复合层组成；

所述基底电极使用本领域常用的方法制备，如可选用碳材料或者金属材料制成。本发明所述的生物传感器的参比电极和所述辅助电极可选择本领域常用的电极，为印刷电极方便，可选择银/氯化银电极为参比电极；可选择碳膜电极为辅助电极。

多个工作电极是指2个及2个以上工作电极，优选2-20个。

所述电化学催化剂是碳纳米材料、或碳纳米材料与选自醌类化合物(如四氰基对苯醌二甲烷)中的一种或多种复合物；

所述酶是农药特异性酶或者蛋白；其中所述农药特异性酶是指能与被检测的特定农药发生生化催化反应，并产生一定电流信号的酶，包括催化待测物质水解的水解酶和催化水解产物氧化的氧化酶等，如针对有机磷和氨基甲酸酯类农药的乙酰胆碱酯酶，丁酰胆碱酯酶等；

所述基于阵列电极的生物传感器可采用印刷电极法制备，在绝缘介质上按一定阵列印刷多个工作电极，参比电极，辅助电极和接线端子等形成检测电路。使用时通过接线端与外围设备相连，将电信号传递给电化学工作站等外围设备采集数据。

本发明对以往生物传感器酶电极测定农药残留的方法做了进一步改进，将单个电极检测改进为多个工作电极阵列，与参比电极和辅助电极一起进行检测。与现有的测定农药残留的生物传感器相比，主要有以下优点：

1、检测结果可靠、准确。阵列工作电极并联，可以通过传感器阵列以提高检测的捕捉概率，从而提高检测的可靠性和灵敏度；对于果蔬表面非均匀农药残留的测试，阵列工作电极具有加和及补偿作用，提高了检测的准确性。例如：如果Rm(t)为N个传感器中平均的传感器可靠性(可靠性定义为在时间点t正常工作的传感器的数量除以总的传感器的数量)，那么一个由这些并行运行传感器阵列的可靠性为Ra(t)＝1-[1-Rm(t)]^N。对于8个工作电极构成的传感器，假设每个电极的可靠性为0.75，整个阵列的可靠性为1-(1-0.75)⁸，几乎接近于1。

2、无损检测。阵列电极生物传感器测定果蔬表面农药残留，所检测样品无需进行前处理，实现无损检测；

3、可以实现便携、快速。阵列工作电极并联，响应电流具有加和性，在相同的溶液电位差和相似数量级的时间常数条件下，响应电流增大，在很大程度上改善了测试体系的信噪比，提高了检测灵敏度。同时响应电流增大，使用普通的、微型化及便携式检测器即可，适合野外现场检测。

附图说明

图1为本发明方法中丝网印刷阵列电极的示意图；其中：1、接口；2、工作电极；3、对电极；4、参比电极；5、电路；6、绝缘基质。

图2为本发明方法实施例1中辛硫磷浓度与乙酰胆碱酯酶抑制率标准曲线。

图3为本发明方法实施例2中马拉硫磷浓度与乙酰胆碱酯酶抑制率标准曲线。

图4为本发明方法实施例3中克百威浓度与丁酰胆碱酯酶抑制率标准曲线。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1

阵列电极生物传感器快速测定苹果表面有机磷类农药残留

1、阵列电极生物传感器的制备

在电极薄膜基片上，先用丝网印刷技术印制导电银浆，形成电极连线和参比电极，再印制上导电碳浆，覆盖接线端子，形成工作电极和对电极。接线端子、工作电极、对电极、参比电极是裸露的导电材料，裸露的其余部分印制一层绝缘油墨。用绝缘薄膜制作的其上用导电材料印制8个工作电极，中心一个环状参比电极和一个圆盘辅助对电极，除全部工作电极、对电极、参比电极和接线端子外，其余部分印制绝缘油墨覆盖。

所得的丝网印刷电极基片长20mm、宽15mm、厚0.125mm；每个接线端子长5mm、宽0.5mm；电极连线宽0.35mm；每个工作电极直径均为2mm；辅助电极直径为2mm；参比电极为内直径为3mm、外直径为4mm的圆环；两条平行电极连线之间的间距为0.65mm，两条平行接线端子之间的间距为0.5mm，阵列工作电极所在圆直径为10mm，辅助电极、参比电极与阵列工作电极所在圆为同心圆，辅助电极圆心与接线端子底部距离为21mm，接线端子位于丝网印刷电极基片的窄边低端，最外端接线端子与电极基片长边为2mm(见图1)。

(1)选择碳纳米管作为电化学催化剂，将10μl浓度为1mg/mL碳纳米管(分散剂为N，N-二甲基甲酰胺)滴涂于阵列的工作电极上，红外灯下烘干；

(2)将10μl浓度为5U/ml乙酰胆碱酯酶溶液(PBS缓冲液溶解)涂敷于电化学催化剂层上，并滴加1％的戊二醛溶液5-10μl，干燥；

(3)使用微量体积(约50μl)的0.1M磷酸缓冲溶液(pH 7.0)吸附在PE高分子聚合材料，在生物传感器上形成电化学反应所需缓冲液膜，然后将吸附缓冲溶液的PE高分子聚合材料附着在制备好的生物传感器上。

2、有机磷农药生物传感器阵列电极测定苹果表面的辛硫磷

(1)建立辛硫磷溶液浓度与乙酰胆碱酯酶抑制率之间的标准曲线

在干净的苹果表面均匀喷洒不同梯度辛硫磷标准溶液，待表面自然风干后，将制备好的生物传感器阵列电极附着于苹果表面，采用CHI1000A型多通道恒位电位仪测定电信号响应值。建立辛硫磷溶液浓度与乙酰胆碱酯酶抑制率之间的标准曲线(图2)。

(2)实际测定

在施用辛硫磷农药的苹果果园分喷施农药1天，5天，以及安全间隔期(11天)后采集苹果样本。使用有机磷农药生物传感器阵列电极，并根据模型估测苹果表面积，测定果实表面农药残留；同时，使用气相色谱法测定每个处理苹果表面农药残留(表1)。气相色谱法样品前处理：使用50ml乙腈洗脱苹果表面辛硫磷残留物，浓缩定容至10ml，检测待用。

表1生物传感器阵列电极测定苹果表面辛硫磷残留

注：“Vg”表示高效液相色谱测定辛硫磷浓度值；“Vb”表示阵列电极生物传感器测定数值；“n.d.”表示没有检测到，“*”有信号响应，低于仪器检测下限

实施例2

阵列电极生物传感器快速测定苹果表面有机磷类农药残留

1、阵列电极生物传感器制备

采用实施例1制备的丝网电极作为基底电极：

(1)将碳纳米管、戊二醛和乙酰胆碱酯酶分散到乙醇中，使浓度均为10mg/ml，在碳纳米管和戊二醛共同作用下将乙酰胆碱酯酶固定在工作电极表面，形成碳纳米管和乙酰胆碱酯酶的复合层；

(2)在上述复合层的表面涂敷一层乳状丙烯酸树脂，阴干；

(3)使用微量体积的0.05～0.1M磷酸缓冲溶液(pH 7.0)滴加在丙烯酸树脂的表面，在生物传感器上形成电化学反应所需缓冲液膜。

2、有机磷农药生物传感器阵列电极测定苹果表面的马拉硫磷

(1)建立马拉硫磷溶液浓度与乙酰胆碱酯酶抑制率之间的标准曲线(图3)

在干净苹果表面均匀喷洒不同梯度马拉硫磷标准溶液，待表面自然风干后，将制备好的生物传感器阵列电极附着于苹果表面，采用CHI1000A型多通道恒位电位仪测定电信号响应值。建立马拉硫磷溶液浓度与乙酰胆碱酯酶抑制率之间的标准曲线。

(2)实际测定

在施用马拉硫磷农药的苹果果园分喷施农药1天，5天，以及安全间隔期(10天)后采集苹果样本。使用有机磷农药生物传感器阵列电极，并根据模型估测苹果表面积，测定果实表面农药残留；同时，使用气相色谱法测定每个处理苹果表面农药残留(表1)。气相色谱法样品前处理：使用50ml乙腈洗脱苹果表面马拉硫磷残留物，浓缩定容至10ml，检测待用。

表2生物传感器阵列电极测定苹果表面马拉硫磷残留

注：“Vg”表示高效液相色谱测定马拉硫磷浓度值；“Vb”表示阵列电极生物传感器测定数值；“n d.”表示没有检测到“*”有信号响应，低于仪器检测下限

实施例3

阵列电极生物传感器快速测定蔬菜叶表面氨基甲酸酯类农药残留

1、阵列电极生物传感器的制备

采用实施例1制备的丝网电极作为基底电极：

(1)将浓度为1mg/mL碳纳米材料(使用乙醇作为分散剂)5μl滴涂于多个阵列工作电极上，红外灯下烘干；

(2)使用浓度为2U/ml丁酰胆碱酯酶溶液(PBS缓冲液溶解)5μl涂敷于电化学催化剂层上，并滴加1％的戊二醛溶液5μl，干燥；

(3)使用微量体积(40μl)的0.1M磷酸缓冲溶液(pH 7.0)和适量烷基苯磺酸盐(表面活性剂)所形成的液体，吸附在PE高分子聚合材料，在生物传感器上形成电化学反应所需缓冲液膜。

将上述电极弯曲成波浪状，固定在蔬菜菜叶一侧，并与外围设备相连。

2、氨基甲酸酯类农药生物传感器阵列电极测定蔬菜叶表面的克百威

(1)建立克百威溶液浓度与丁酰胆碱酯酶抑制率之间的标准曲线

在干净的蔬菜叶表面均匀喷洒不同梯度克百威标准溶液，待表面自然风干后，将菜叶经过制备好的生物传感器阵列电极，采用CHI1000A型多通道恒位电位仪测定电信号响应值。建立克百威溶液浓度与丁酰胆碱酯酶抑制率之间的标准曲线(图4)。

(2)实际测定

在施用克百威农药的菜地分喷施农药1天，5天，以及安全间隔期(25天)后采集样本。使用氨基甲酸酯农药生物传感器阵列电极，并根据模型估测表面积，测定菜叶表面农药残留；同时，使用高效液相色谱法测定每一份(100g)蔬菜菜叶的表面农药残留(表1)。高效液相色谱法样品前处理：使用50ml乙腈洗脱蔬菜菜叶表面的克百威残留物，浓缩定容至10ml，检测待用。

表3生物传感器阵列电极测定蔬菜菜叶表面克百威残留

注：“Vh”表示高效液相色谱测定克百威浓度值；“Vb”表示阵列电极生物传感器测定数值；“n.d.”表示没有检测到“*”有信号响应，低于仪器检测下限

Claims

1、一种基于阵列电极的生物传感器，其特征在于，含有绝缘介质，参比电极、辅助电极和多个工作电极，所述多个工作电极并联形成阵列。

2、如权利要求1所述的生物传感器，其特征在于，所述生物传感器的表面具有由高分子聚合材料层和所吸附的缓冲液形成的缓冲液膜。

3、如权利要求1或2所述的生物传感器，其特征在于，所述工作电极由基底电极、基底电极上的电化学催化剂层，以及位于电化学催化剂层上的酶层组成。

4、如权利要求1或2所述的生物传感器，其特征在于，所述工作电极由基底电极、基底电极上的电化学催化剂与酶的复合层组成。

5、如权利要求3或4所述的生物传感器，其特征在于，所述电化学催化剂是碳纳米材料、或碳纳米材料与选自醌类化合物中的一种或多种的复合物。

6、如权利要求3或4所述的生物传感器，其特征在于，所述酶是农药特异性酶或蛋白；其中所述农药特异性酶或蛋白是能够催化待测农药水解的水解酶、催化水解产物氧化的氧化酶及相应的蛋白。

7、如权利要求6所述的生物传感器，其特征在于，所述酶为乙酰胆碱酯酶或丁酰胆碱酯酶。

8、如权利要求1所述的生物传感器，其特征在于，所述绝缘介质为有弹性的绝缘材料或绝缘涂料。

9、如权利要求2所述的生物传感器，其特征在于，所述缓冲液膜是丙烯酸树脂与吸附在丙烯酸树脂中20-50μl的0.05～0.1M磷酸缓冲溶液构成的。

10、如权利要求1所述的生物传感器，其特征在于，多个工作电极是指2个及2个以上工作电极，优选2-20个。