CN103421878A

CN103421878A - 基于多酚氧化酶生物传感器的制备及对农药残留的检测

Info

Publication number: CN103421878A
Application number: CN2013103193533A
Authority: CN
Inventors: 蔡健荣; 周立娜; 韩恩; 孙力
Original assignee: Jiangsu University
Current assignee: Jiangsu University
Priority date: 2013-07-26
Filing date: 2013-07-26
Publication date: 2013-12-04
Anticipated expiration: 2033-07-26
Also published as: CN103421878B

Abstract

采用碳纳米球包埋多酚氧化酶修饰玻碳电极制备多酚氧化酶传感器，并将其用于农药残留的检测，多酚氧化酶是一类来源极广的金属蛋白酶，相比于乙酰胆碱酯酶、丁酰胆碱酯酶与有机磷水解酶等具有来源广、价格低等优点。本发明采用碳纳米球包埋多酚氧化酶，碳纳米球具有良好的生物相容性、较高的机械强度及较大的比表面积，用它包埋多酚氧化酶提高了电极表面酶的固定量和最大程度保持了多酚氧化酶的生物活性，从而提高了酶的生物催化效率和生物传感器的分析检测性能。这种方法制备的多酚氧化酶传感器对草甘磷有较低的检测限和良好的线性范围，并对样品检测具有良好的回收率，而且这种方法制备的传感器具有良好的重复性、重现性与稳定性，可用于对农药残留进行检测。

Description

基于多酚氧化酶生物传感器的制备及对农药残留的检测

技术领域

本发明涉及一种多酚氧化酶生物传感器的制备及其在农药残留检测方面的应用。

背景技术

近年来，农药被广泛使用在农作物杀虫、除草以及增产等方面。农药使用后，一些农药原体以及降解物等残留在植物体及土壤中，严重危害着环境安全及人类健康。因此，农药残留检测备受关注。目前，对农药残留的检测方法主要有液相色谱法、毛细管电泳色谱法和气相色谱-质谱联用法等。虽然这些传统方法可以定量检测农药残留，但是，这些方法都存在前处理方法繁琐、分析周期长，设备昂贵，对分析人员的专业的操作水平有很高的要求等问题，不适合在现场检测中应用。因此，探索一种快敏检测农药残留的方法具有重要的理论与实践意义。

运用生物传感器检测环境和食品中的农药残留是一项新兴技术。主要是基于酶、抗体及微生物等，对待测物进行识别，将产生的信号转化电信号或光信号，从而定量检测待测物。具有灵敏度高、检测效率高、构造简单、成本低廉等特点，因此成为近来农药残留检测的研究热点。报道较多的是基于乙酰胆碱酯酶生物传感器检测农药残留，该类传感器的工作原理是基于农药对乙酰胆碱酯酶的抑制作用。抑制前后传感器的响应电流发生变化，抑制作用大小与农药含量呈对应关系。基于二氧化锆纳米粒子固定乙酰胆碱酯酶的甲基对硫磷传感器.一文报道一种基于金电极表面沉积二氧化锆纳米粒子固定乙酰胆碱酯酶，制备的安培型生物传感器。以该传感器为工作电极，对甲基对硫磷进行检测。在5.0×10^-7-5.0×10^-4g/L浓度范围内对甲基对硫磷有线性响应，检出限为1.0×10^-7g/L。农药残留对多酚氧化酶类，如单酚氧化酶（酪氨酸酶tyrosinase,EC.1.14.18.10）和漆酶（laccase,EC.1.10.3.1）也具有抑制作用（传感技术学报.2009（5），刘淑娟等.）。一种新型的检测阿特拉津的酪氨酸酶传感器的研制.一文介绍采用半胱氨酸与纳米银层层自组装修饰金电极，然后固定酪氨酸酶制备酪氨酸酶生物传感器，用于检测阿特拉津农药残留（化学传感器.2010(9)，张智慧等.）。阿特拉津在8.7×10^-7-8.2×10^-5mol/L范围内，电流与浓度有良好的线性关系检出限为5.4×10^-7mol/L。相比于乙酰胆碱酯酶，多酚氧化酶价格低廉，检测灵敏度高，因此，具有良好应用前景。

发明内容

发明的目：提供一种成本低廉、制作简单、灵敏度高、检测效率高的多酚氧化酶生物传感器，并将其成功应用于蔬菜中农药残留的检测。

技术方案：构造生物传感器的两个要点，一是采用新型材料修饰电极。纳米材料是一类具有极大潜力的新型材料，如金属纳米材料、碳纳米材料、氧化物纳米材料以及多功能纳米杂化材料等。二是酶的高效固定化。常用的酶的固定化方法有共价键交联发，诱捕法，包埋法以及吸附法等。采用好的固定化方法能够使酶尽可能固定在电极表面，并保持良好酶活性。本发明采用碳纳米球包埋酶制备生物传感器，碳纳米球具有良好生物相容性较高的机械强度及大的比表面积，在电极表面包埋更多的酶，提高酶的催化效率。

本发明采用碳纳米球包埋多酚氧化酶修饰玻碳电极制备多酚氧化酶生物传感器，并将其用于草甘磷含量的检测。

本发明的上述技术方案中，通过采用碳纳米球包埋多酚氧化酶修饰玻碳电极。碳纳米球具有大的比表面积和良好的生物相容性。因而，利用碳纳米球可大幅提高子电极表面酶的固定量和最大程度的保持酶的生物活性，提高对蔬菜中草甘磷农药残留的分析检测灵敏度。

本发明提供了上述基于碳纳米球包埋多酚氧化酶修饰电极的多酚氧化酶生物传感器的制备方法，包括以下步骤：

（1）碳纳米球的制备：用电子天平称取6g葡萄糖放入50ml反应釜内衬中，用移液管准确移取35ml去离子水加入上述反应釜中，用玻璃棒搅拌溶液，使葡萄糖全部溶解，然后装入反应釜中，用扳手拧紧反应釜，放入烘箱中。设定反应条件为：温度180℃，反应时间4-12h。待反应结束后，降至室温，取出反应釜，将釜内黑褐色溶液抽滤（220nm抽滤膜），并及时清洗反应釜内衬，抽滤时用去离子水和95%乙醇清洗至滤液为无色。将样品用滤纸包好放入干燥箱中70℃干燥4h。收集样品。

（2）碳纳米球溶液配制：称取20mg上述干燥后的纳米球，溶于20mL去离子水。制得1mg/ml的碳纳米球溶液。

（3）多酚氧化酶溶液配制：称取1mg多酚氧化酶溶于1ml去离子水中，制得1mg/ml的多酚氧化酶溶液。

（4）碳纳米球与多酚氧化酶的混合溶液：取一定体积的步骤（2）中制得的碳纳米球溶液与一定体积的步骤（3）中制备的多酚氧化酶溶液混合。

（5）酶溶液滴涂：取一定体积上述步骤（4）中制备的碳纳米球与多酚氧化酶的混合溶液滴涂到电极表面，置于4℃冰箱中24h，待干燥。

（6）酶的固定化：将上述步骤（5）制备电极在戊二醛氛围下熏蒸15min。使多酚氧化酶和碳纳米球牢固的固定在电极表面。

上述制备方法步骤（4）中，多酚氧化酶溶液与碳纳米球溶液的体积比优选为2：1。

上述制备方法步骤（5）中，滴涂在电极表面多酚氧化酶与碳纳米球混合溶液的体积优化为5ul。

本发明的上述制备方法制作简单，成本低廉，而且可以使多酚氧化酶与碳纳米球牢固的固定在电极表面，并保持多酚氧化酶的高活性。

作为一个总的技术构思，本发明还提供了上述多酚氧化酶生物传感器在农药残留检测中的应用。检测时的具体步骤如下：以上述多酚氧化酶修饰电极作为工作电极，铂丝电极作为对电极，饱和干汞电极作为参比电极，建立三电极系统，将所述三电极系统与电化学工作站连接。将三电极体系置于儿茶酚溶液中，多酚氧化酶催化氧化儿茶酚生成邻醌，邻醌具有电化学活性，在电极上能被还原为儿茶酚。通过电化学工作站检测出溶液中进行电化学反应时的还原电流大小，记为抑制前电流I₀。然后将多酚氧化酶修饰电极浸入到含一定浓度的草甘磷溶液中抑制一段时间。经农药抑制后，将酶电极放入上述同浓度的儿茶酚溶液中，测定还原电流大小，记为抑制后电流I。电流抑制率与农药含量在一定范围内线性相关。然后根据抑制率与农药含量的线性回归方程，即可定量的测定农药残留含量。

上述的应用中，所采用儿茶酚溶液的浓度优选为0.2mM。

上述的应用中，将酶电极浸入到不同浓度草甘磷溶液中，草甘磷浓度变化范围选为5nM～500nM。

上述的应用中，酶电极在草甘磷溶液中的抑制时间优选为5min。

所述抑制率Inhibition Rate（IR%）=I₀-I/I₀×100(1)

式（1）中，I₀为抑制前电流，单位为uA，I为抑制后电流，单位为uA,IR%为抑制率大小。

所述草甘磷浓度大小与抑制率变化的线性回归方程优选为：

Y=0.76431X-0.21064（2）

式(2）中，Y为不同浓度草甘磷对多酚氧化酶的抑制率，X为草甘磷浓度，单位为nM；式（2）中，相关系数为R²=0.99855，检测下限为3.53ng/ml。对草甘磷的线性检测范围为5ng/ml-60ng/ml。

上述的应用中，所述的传感器对草甘磷检测时用到的溶液的响应电流较大且较稳定。

有益效果：

1、本发明基于碳纳米球包埋多酚氧化酶修饰玻碳电极制备多酚氧化酶生物传感器成本低廉，制备过程简单，制得的传感器酶固定效率高并且保持较高酶活力。

2、将碳纳米球溶液与多酚氧化酶溶液混合后滴涂到玻碳电极表面，待干燥后采用戊二醛交联。碳纳米球具有高密度、高强度以及大的比表面积，将多酚氧化酶与碳纳米球共同固定在电极表面，大大增大了电极表面酶的固定量，提高酶催化效率。

3、本发明将制备的多酚氧化酶传感器用于农药残留的检测，与以往乙酰胆碱酯酶及丁酰胆碱酯酶等酶传感器相比，具有高的检测灵敏度、理想的线性检测范围和检出限。同时还具有酶来源范围广，价格低廉等优点。

4、对草甘磷的线性检测范围5ng/ml-60ng/ml，检出限3.53ng/ml。效果好于一些乙酰胆碱酯酶传感器及一些免疫传感器。因此，在可测定的浓度范围内，测定结果比较理想。

5、用于蔬菜样品检测的回收率在88.5%-110.6%之间。与传统高效液相色谱相比，成本低廉，操作简单，响应速度快等优点。

附图说明

图1为本发明实施例的多酚氧化酶生物传感器在制作过程中各种中间体的电化学阻抗图谱。

图2为本发明实施例应用中检测草甘磷含量时的DPV图。

图3为本发明实施例应用中不同含量草甘磷的抑制曲线图。

图4为草甘磷的线性检测曲线。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例对本发明做进一步描述。

实施例1：

本发明基于碳纳米球包埋多酚氧化酶修饰电极的多酚氧化酶传感器，该传感器包括玻碳电极，玻碳电极的检测端表面修饰碳纳米球和多酚氧化酶，戊二醛氛围熏蒸使酶牢固固定在玻碳电极表面。

本实施例的基于碳纳米球包埋多酚氧化酶修饰电极的多酚氧化酶生物传感器的制备方法，包括以下步骤：

1.碳纳米球的制备：用电子天平称取6g葡萄糖放入50ml反应釜内衬中，用移液管准确移取35ml去离子水加入上述反应釜中，用玻璃棒搅拌溶液，使葡萄糖全部溶解，然后装入反应釜中，用扳手拧紧反应釜，放入烘箱中。设定反应条件为：温度180℃，反应时间4-12h。待反应结束后，降至室温，取出反应釜，将釜内黑褐色溶液抽滤（220nm抽滤膜），并及时清洗反应釜内衬，抽滤时用去离子水和95%乙醇清洗至滤液为无色。将样品用滤纸包好放入干燥箱中70℃干燥4h。收集样品。

2.多酚氧化酶溶液配制

称取1mg多酚氧化酶溶于1mL去离子水中，制得1mg/mL的多酚氧化酶溶液。

3.碳纳米球与多酚氧化酶的混合溶液

取5μL1mg/ml的碳纳米球溶液与10μL1mg/mL的多酚氧化酶溶液混合。

4.酶溶液滴涂

取5μL上述制备的碳纳米球与多酚氧化酶的混合溶液滴涂到电极表面，置于4℃冰箱中24h，待干燥

5.酶膜固定化

将上述干燥后的电极从冰箱中取出，静置在室温下15min，然后在戊二醛氛围下熏蒸15min，制得多酚氧化酶生物传感器。保存于4℃条件下备用。

6.用电化学阻抗图谱法分别表征上述制备过程中玻碳电极（GCE）、碳纳米球修饰玻碳电极（CNS/GCE）、多酚氧化酶修饰玻碳电极（PPO/GCE）和碳纳米球-多酚氧化酶修饰玻碳电极（PPO/CNS/GCE）。其结果如图1所示：

由以上制备过程及表征图谱数据可见，本实施例的多酚氧化酶生物传感器制备方法成本低廉、工艺简单、制作快速、酶活性高，多酚氧化酶不经过任何化学修饰而只是借助戊二醛交联将酶固定到电极表面，使多酚氧化酶固定的更稳定，保持更高酶活性。

本发明的上述固定化方法也适用于其他具有类似性质的酶生物传感器的固定化。

实施例2：

多酚氧化酶生物传感器检测农药残留

本发明实施例1的多酚氧化酶传感器作为工作电极，铂丝电极作为对电极，饱和干汞电极作为参比电极，建立三电极体系，将三电极体系与电化学工作站连接，检测草甘磷含量。

工作条件：使用的缓冲液为0.1M磷酸盐缓冲溶液（PBS），在pH5.0～8.0范围内传感器对相同浓度儿茶酚溶液的电流响应值。选定pH=6.0为最佳值。在此条件下电流值大且稳定。

抑制时间：将多酚氧化酶传感器浸入到草甘磷溶液中孵育一段时间，酶活性被抑制。抑制率的大小与抑制时间有关。当酶与农药接触时间不够长时，酶活性没有完全被抑制；而当酶与农药接触时间过长时，酶的结构和性质就会发生改变。因此需要对抑制时间进行优化。分别抑制2min～15min，测定抑制后的响应电流。在抑制时间2min～5min内随着抑制时间增加，抑制率增大，5min～15min内随抑制时间延长，抑制率趋于平稳。选定抑制时间5min为最佳值。

本发明多酚氧化酶传感器对农药检测原理：多酚氧化酶能够催化儿茶酚氧化生成邻醌，邻醌是电化学活性物质，又能够被还原为儿茶酚，产生还原电流。酶传感器暴露于草甘磷等农药溶液中后，酶活性被抑制，催化能力降低，进而导致儿茶酚溶液的响应电流降低。在一定浓度范围内，农药含量越高，对酶活性的抑制作用越强，从而对相同浓度儿茶酚溶液响应电流的测定值也越低。根据农药对儿茶酚还原电流的抑制率定量分析草甘磷含量。抑制率

IR%=I₀-I/I₀×100 （1）

式(1)中I₀是传感器在农药抑制前对儿茶酚溶液测得的响应电流，I是指经农药抑制后对相同浓度儿茶酚溶液测得的响应电流。

分别利用经过不同浓度草甘磷溶液抑制后的传感器测定相同浓度儿茶酚溶液的响应电流。如图2所示，随着草甘磷浓度增大，对传感器抑制作用增强，相应电流逐渐降低。

由图4可见，草甘磷含量与抑制率的线性回归方程优选为：

Y=0.76431X-0.21064 （2）

式(2）中，Y为不同草甘磷浓度对多酚氧化酶的抑制率，X为草甘磷浓度，单位为nM；式（2）中，相关系数为R²=0.99855，检测下限为3.53ng/ml。对草甘磷的线性检测范围为5ng/ml～60ng/ml。

将本实施例的多酚氧化酶传感器用于实际蔬菜样品的检测，检测结果如下表1所示，从回收率可以看出，本发明的传感器在可测定的浓度范围内，回收率基本在88.5%～110.6之间，测定结果理想。与传统农药残留检测方法相比，该方法操作简单，响应信号好，检测速度快。

表1多酚氧化酶测定蔬菜样品中草甘磷含量

重复性、重现性和稳定性：对同一根电极进行多次测试，获得重复性；采用六根电极测定相同浓度农药，测得组间相对标准偏差，获得重现性4.88%。将电极保存在4℃冰箱中，每隔一段时间测试一次，经过一个月后仍保持其最初酶活性的86.69%。

综上所述,本发明制备的多酚氧化酶传感器能够快速灵敏检测环境和食品中的农药残留,具有响应快、灵敏度高、重复性和长期稳定性好的特点，具有良好的实际应用价值。

以上显示和说明书中描述的只是本发明的原理和主要特征和本发明的优点，本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims

1.一种多酚氧化酶传感器，包括铂丝电极作为对电极，饱和干汞电极作为参比电极，其特征在于，还包括多酚氧化酶修饰电极作为工作电极，建立三电极系统，将所述三电极系统与电化学工作站连接；玻碳电极，玻碳电极的检测端表面修饰碳纳米球和多酚氧化酶，酶牢固固定在玻碳电极表面。

2.权利要求1多酚氧化酶传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）碳纳米球的制备：将葡萄糖放入反应釜内衬中，用移液管取定量去离子水加入上述反应釜中，用玻璃棒搅拌溶液，使葡萄糖全部溶解，然后装入反应釜中，用扳手拧紧反应釜，放入烘箱中；待反应结束后，降至室温，取出反应釜，将釜内黑褐色溶液抽滤，并及时清洗反应釜内衬，抽滤时用去离子水和95%乙醇清洗至滤液为无色；将样品用滤纸包好放入干燥箱中70℃干燥4h；收集样品；

（2）碳纳米球溶液配制：称取一定量上述干燥后的纳米球，溶于去离子水。制得一定浓度的碳纳米球溶液。

（3）多酚氧化酶溶液配制：称取多酚氧化酶溶于去离子水中，制得一定浓度的多酚氧化酶溶液。

（6）酶的固定化：将多酚氧化酶和碳纳米球牢固的固定在电极表面。

3.根据权利要求2所述的多酚氧化酶传感器的制备方法，其特征在于：步骤（4）中多酚氧化酶与碳纳米球溶液的质量比为2：1，滴涂5μL多酚氧化酶与碳纳米球混合溶液在玻碳电极表面。

4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：碳纳米球包埋多酚氧化酶，碳纳米球以其较高强度及较大的比表面积增加酶的负载量。

5.根据权利要求2所述多酚氧化酶传感器的制备方法，其特征在于：步骤（6）不经过其他化学过程直接经戊二醛熏蒸将多酚氧化酶固定在电极表面，能够极大程度保持酶的高活性。

6.权利要求1在农药残留检测中的应用，其特征在于，其检测步骤如下：

将三电极体系置于儿茶酚溶液中，多酚氧化酶催化氧化儿茶酚生成邻醌，通过电化学工作站检测出溶液中进行电化学反应时的还原电流大小，记为抑制前电流I₀；然后将多酚氧化酶修饰电极浸入到含一定浓度的草甘磷溶液中抑制一段时间；经农药抑制后，将酶电极放入上述同浓度的儿茶酚溶液中，测定还原电流大小，记为抑制后电流I；电流抑制率与农药含量在一定范围内线性相关；然后根据抑制率与农药含量的线性回归方程，即可定量的测定农药残留含量。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所采用儿茶酚溶液的浓度优选为0.2mM。

8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，草甘磷浓度变化范围选为5nM～500nM。

9.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，酶电极在草甘磷溶液中的抑制时间优选为5min。10.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述草甘磷浓度大小与抑制率变化的线性回归方程优选为：

Y=0.76431X-0.21064（2）

式(2）中，Y为不同浓度草甘磷对多酚氧化酶的抑制率，X为草甘磷浓度，单位为nM；式（2）中，相关系数为R²=0.99855，检测下限为3.53ng/ml；对草甘磷的线性检测范围为5ng/ml-60ng/ml。