CN1945327A - 纳米CaCO3固定生物分子制备生物传感器的方法 - Google Patents

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薛怀国
朱明娟
单丹
王善霞
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Abstract

纳米CaCO3固定生物分子制备生物传感器的方法，属于以无机材料纳米CaCO3为载体固定蛋白质等生物分子制备生物传感器的方法。将纳米CaCO3用二次蒸馏水配成胶体溶液，再将生物分子加入到胶体溶液中形成混合液，然后将混合液滴涂于基底电极表面，待溶剂80～95％被蒸发后，用戊二醛蒸气交联方法制备出纳米CaCO3－生物分子复合生物膜，即制得所述的生物传感器。采用本发明方法制备出的生物传感器稳定性好、灵敏度高、重现性好，而所需的生物分子的量少，可广泛用于医学、食品、环境等领域，具有较高的经济效益。

Description

纳米CaCO3固定生物分子制备生物传感器的方法
技术领域
本发明属于以无机材料纳米CaCO3为载体固定蛋白质等生物分子制备生物传感器的方法。
背景技术
生物传感器是由固定化的生物材料(包括酶，抗体，微生物等生物活性物质)与适当的转换器件密切接触而构成的分析工具或系统。它利用的是生物活性物质的亲和性，如酶-底物，酶-辅基，抗原-抗体，激素-受体等的分子识别功能，可以有选择地测量另一方，这种敏感元件又称分子识别元件。由于生物活性物质具有专一识别功能，使得生物传感器具有较高的选择性，能直接应用于复杂样品进行检测。生物传感器以灵敏度高，选择性高，分离过程和检测技术合为一体，不需要样品制备等特点而受到广泛重视，目前发展很快，已应用于临床医学检测、工业过程控制、环境检测、化学物质安全性评价以及食品、制药等许多领域。
现有的固定酶等生物活性分子的方法主要有吸附、交联、共价键合、包埋等，固定材料有无机材料、高分子材料、各种复合材料等，这些方法和固定材料都各有其优缺点。因此寻找新的载体材料来提高生物传感器测量的准确度、灵敏度、操作稳定性、使用寿命、选择性等是科研工作者的主要目标之一。
纳米CaCO3是一种非常重要的无机材料，也是纳米材料的一种，因其具有原料易得、价格便宜成本低、优良的化学和物理性质等众多优点，而被广泛应用于橡胶、塑料、医药等工业应用中，而且纳米CaCO3表现出远胜于普通碳酸钙的特性，已经引起了广泛的研究兴趣。纳米CaCO3在工业上的广泛应用，表现出较好的补强性、优异的分散性及特殊的透明性。同时纳米CaCO3具有较好的生物相容性和很高的比表面积，这对生物分子的固定有着非常有利的条件，但至今纳米CaCO3还从来没有在生物传感器方面有过实验和应用，若将纳米CaCO3用于生物传感器的制备中可望构筑性能优良的生物活性膜和高稳定、高灵敏度的生物传感器。
发明内容
本发明的目的是提供一种稳定性好、灵敏度高的无机纳米材料纳米CaCO3固定蛋白质等生物分子制备生物传感器的新方法。
本发明的技术方案是：将纳米CaCO3用二次蒸馏水配成胶体溶液，再将生物分子加入到胶体溶液中形成混合液，然后将混合液滴涂于基底电极表面，待溶剂80～95％被蒸发后，用戊二醛蒸气交联方法制备出纳米CaCO3-生物分子复合生物膜，即制得所述的生物传感器。
采用本发明方法制备出的生物传感器稳定性好、灵敏度高、重现性好，而所需的生物分子的量少。由于制作方法也较为简单，所以投入市场的可能性较大。用同一固定材料可制备不同功能的生物传感器，适合多种物质的检测，可广泛用于医学、食品、环境等领域，具有较高的经济效益。
本发明所采用的电极为本领域公知的各种基底电极。
上述胶体溶液的浓度为2～5mg/ml。合适的胶体浓度目的是：有利于控制修饰膜厚度，使传感器具有高灵敏度和快速响应。
混合液中，生物分子与纳米CaCO3的质量比为1∶1～3∶1。合适的质量比目的是：使传感器具有最高的响应。
滴涂在电极表面的生物分子和纳米CaCO3混合溶的体积为20～50μl。滴涂量过少传感器的灵敏度将降低。滴涂量过大，传感器响应时间将延长，膜的渗透性将降低。
为了使纳米CaCO3既具有较大的比表面积，同时防止其团聚，本发明选用的纳米CaCO3的粒径为5～100nm。
所述生物分子为含有可变价金属的蛋白质或酶。
酶可以为葡萄糖氧化酶、黄嘌呤氧化酶、多酚氧化酶、酪氨酸酶、半乳糖氧化酶、脲酸酶、过氧化物酶、胆碱氧化酶、乙酰胆碱脂酶、谷氨酸氧化酶、胆固醇氧化酶、丙酮酸氧化酶、抗坏血酸氧化酶、肌氨酸氧化酶、乙醇脱氢酶、乙醇氧化酶、乳酸脱氢酶、乳酸氧化酶、超氧化物歧化酶、脲酶、赖氨酸氧化酶、亚硫酸盐氧化酶、漆酶、脂肪酶、异柠檬酸脱氢酶中的任何一种。
本发明所述戊二醛交联方法是将电极置于戊二醛的饱和蒸气中交联15分钟，再放在冰箱中冷藏。
具体实施方式
实施例一：固定血红蛋白制备H2O2传感器
步骤1：将基底电极在蘸有三氧化二铝水溶液的纱布上打磨至镜面，再用二次蒸馏水超声洗涤5分钟，烘干。
步骤2：用二次蒸馏水配制浓度为5mg/ml的纳米CaCO3胶体溶液。纳米CaCO3粒径为5～100nm。
步骤3：用0.01mol/l的磷酸缓冲溶液配制15mg/ml的血红蛋白溶液。
步骤4：将胶体溶液和血红蛋白溶液等体积混合(血红蛋白与纳米CaCO3的质量比为3∶1)，轻轻摇匀，形成混合液。
步骤5：在混合液中加入浓度为2mg/ml壳聚糖溶液，壳聚糖溶液与混合液体积比为1∶6。取15μl该混合溶液均匀滴涂于面积为10mm2的玻碳电极表面，在室温下干燥约3小时，测定溶剂80～95％已被蒸发，将电极置于戊二醛的饱和蒸气中交联15分钟，然后放入4℃的冰箱中冷藏待用。
固定的血红蛋白体现了其直接电化学行为，并具有较好的可逆性。该生物电极对过氧化氢的还原具有电催化作用，可用于过氧化氢的检测。该生物传感器检测过氧化氢的下限为8.3μM；测量过氧化氢的线性范围为8.3μM～2.08mM，电极使用寿命为两个月。
实施例二：制备葡萄糖氧化酶传感器
步骤1：将圆盘铂电极(面积为3mm2)在蘸有三氧化二铝水溶液的纱布上打磨至镜面，再用二次蒸馏水超声洗涤5分钟，烘干。
步骤2：用二次蒸馏水配制浓度为2mg/ml的纳米CaCO3胶体溶液。纳米CaCO3粒径为5～100nm。
步骤3：制备浓度为2mg/ml的葡萄糖氧化酶溶液。
步骤4：以葡萄糖氧化酶和纳米CaCO3的质量比为2∶1混合，形成混合液。
步骤5：取45μl该混合液均匀滴涂于圆盘铂电极表面，待溶剂约90％被蒸发后，将电极置于戊二醛的饱和蒸气中交联15分钟，然后放在冰箱中冷藏，即形成了基于纳米CaCO3-葡萄糖氧化酶复合物生物膜的葡萄糖传感器。
该生物传感器对葡萄糖溶液的响应时间小于6秒；测量葡萄糖溶液的线性范围为1μM～12mM；使用寿命为四个多月；检测下限为0.1μM；电极制备的重现性好(7支酶电极同时制备，用于同一测量的相对标准偏差为5.56％)；传感器具有较高的操作稳定性，传感器在1mM葡萄糖溶液中连续测量140次后，响应电流基本保持不变，相对标准偏差(RSD)仅为3.0％。
实施例三：制备多酚氧化酶传感器
步骤1：用二次蒸馏水配制2mg/ml的纳米CaCO3胶体溶液。纳米CaCO3粒径为5～100nm。
步骤2：制备浓度为4mg/ml的多酚氧化酶溶液。
步骤3：将圆盘玻碳电极(面积为7mm2)在蘸有三氧化二铝水溶液的纱布上打磨至镜面，再用二次蒸馏水超声洗涤5分钟，烘干。
步骤4：以多酚氧化酶和纳米CaCO3的质量比为1∶1混合，形成混合液。
步骤5：取20μl混合液均匀滴涂于圆盘玻碳电极表面，待溶剂约85％被蒸发后，将电极置于戊二醛的饱和蒸气中交联15分钟，然后放在冰箱中冷藏，即形成了基于纳米CaCO3-多酚氧化酶复合物生物膜的酚传感器。
该生物传感器可测定儿茶酚、苯酚等物质，生物传感器对儿茶酚溶液的响应时间为8秒；测量儿茶酚溶液的线性范围为6～20000nM；使用寿命为两个多月；检测下限为0.6nM。电极制备的重现性好(7支酶电极同时制备，用于同一测量的相对标准偏差为5.63％)；传感器具有好的操作稳定性，传感器在5μM儿茶酚溶液中连续测量44次后，响应电流基本保持不变。
实施例四：制备黄嘌呤氧化酶传感器
步骤1：用二次蒸馏水配制2mg/ml的纳米CaCO3胶体溶液。纳米CaCO3粒径为5～100nm。
步骤2：制备浓度为4mg/ml的黄嘌呤氧化酶溶液。
步骤3：将圆盘铂电极(面积为20mm2)在蘸有三氧化二铝水溶液的纱布上打磨至镜面，再用二次蒸馏水超声洗涤5分钟，烘干。
步骤4：以黄嘌呤氧化酶和纳米CaCO3的质量比为1∶1混合，形成混合液。
步骤5：取50μl混合液均匀滴涂于圆盘铂电极表面，待溶剂约90％被蒸发后，将电极置于戊二醛的饱和蒸气中交联15分钟，然后放在冰箱中冷藏，即形成了基于纳米CaCO3-黄嘌呤氧化酶复合物生物膜的黄嘌呤氧化酶传感器。
该生物传感器可测定黄嘌呤、次黄嘌呤等物质，生物传感器对黄嘌呤溶液的响应时间为6秒；测量黄嘌呤溶液的线性范围为1～200μM；使用寿命为一个多月；检测下限为0.1μM。电极制备的重现性好(9支酶电极同时制备，用于同一测量的相对标准偏差为3.38％)；传感器具有较好的操作稳定性，传感器在200μM黄嘌呤溶液中连续测量70次后，响应电流基本保持不变。
采用类同的方法，可分别制备成酪氨酸酶、半乳糖氧化酶、脲酸酶、过氧化物酶、胆碱氧化酶、谷氨酸氧化酶、胆固醇氧化酶、丙酮酸氧化酶、抗坏血酸氧化酶、肌氨酸氧化酶、乙醇脱氢酶、乙醇氧化酶、乳酸脱氢酶、乳酸氧化酶、超氧化物歧化酶、脲酶、赖氨酸氧化酶、亚硫酸盐氧化酶、漆酶、脂肪酶、异柠檬酸脱氢酶传感器，用于相应底物的测定。

Claims (8)

1、纳米CaCO3固定生物分子制备生物传感器的方法，其特征在于：将纳米CaCO3用二次蒸馏水配成胶体溶液，再将生物分子溶液加入到胶体溶液中形成混合液，然后将混合液滴涂于基底电极表面，待溶剂80～95％被蒸发后，用戊二醛蒸气交联方法制备生物传感器。
2、根据权利要求1所述纳米CaCO3固定生物分子制备生物传感器的方法，其特征在于：胶体溶液的浓度为2～5mg/ml。
3、根据权利要求1所述纳米CaCO3固定生物分子制备生物传感器的方法，其特征在于：生物分子与纳米CaCO3的质量比为1∶1～3∶1。
4、根据权利要求1所述纳米CaCO3固定生物分子制备生物传感器的方法，其特征在于：滴涂在电极表面的生物分子和纳米CaCO3混合液的体积为20～50μl。
5、根据权利要求1所述纳米CaCO3固定生物分子制备生物传感器的方法，其特征在于：所述纳米CaCO3的粒径为5～100nm。
6、根据权利要求1所述纳米CaCO3固定生物分子制备生物传感器的方法，其特征在于：所述生物分子为含有可变价金属的蛋白质或酶。
7、根据权利要求7所述纳米CaCO3固定生物分子制备生物传感器的方法，其特征在于：所述酶为葡萄糖氧化酶、黄嘌呤氧化酶、多酚氧化酶、酪氨酸酶、半乳糖氧化酶、脲酸酶、过氧化物酶、胆碱氧化酶、乙酰胆碱脂酶、谷氨酸氧化酶、胆固醇氧化酶、丙酮酸氧化酶、抗坏血酸氧化酶、肌氨酸氧化酶、乙醇脱氢酶、乙醇氧化酶、乳酸脱氢酶、乳酸氧化酶、超氧化物歧化酶、脲酶、赖氨酸氧化酶、亚硫酸盐氧化酶、漆酶、脂肪酶、异柠檬酸脱氢酶中的任何一种。
8、根据权利要求1所述纳米CaCO3固定生物分子制备生物传感器的方法，其特征在于：所述戊二醛交联方法是将电极置于戊二醛的饱和蒸气中交联15分钟，再放在冰箱中冷藏。
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CN101776634A (zh) * 2010-02-10 2010-07-14 中国科学院长春应用化学研究所 一种黄嘌呤传感器及其制备方法
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