CN105039299B - 一种固定化辣根过氧化物酶载体及其制备、应用方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及了一种固定化辣根过氧化物酶载体及其制备、应用方法，其中固定化辣根过氧化物酶载体是通过葡萄糖水热碳化制备得到的纳米碳球，然后将其进行氨基化修饰、戊二醛活化获得；将本发明的固定化辣根过氧化物酶载体与辣根过氧化物酶溶液混合振荡，离心，洗涤冻干，即获得固定化辣根过氧化物酶。本发明提供了一种绿色、经济、高效制备固定辣根过氧化物酶的方法，该方法所得的固定化辣根过氧化物酶成本低廉，操作简单，物理、化学性能稳定，尤其在极端环境条件下依然能够保持较高的催化活性。

Description

一种固定化辣根过氧化物酶载体及其制备、应用方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种固定化辣根过氧化物酶载体的制备方法。

背景技术

辣根过氧化物酶是由糖蛋白和铁卟啉辅基结合而成的酶，能够催化降解苯酚、苯胺及其取代物，具有较广泛的底物专一性。因而在废水处理、生物传感器、环境监测、免疫测定和临床化学等领域具有深远的应用潜力。但由于天然辣根过氧化物酶的稳定性包括热稳定性、酸碱稳定性、有机相稳定性和储存稳定性等都较差。在37℃时其半衰期为10个小时左右，在65℃时活性半衰期仅为5分钟左右，在一些中强极性的有机溶剂与水溶剂混合体系中稳定性更差，且在水中游离酶不可回收也不能长期保存，所以极大的限制了辣根过氧化物酶在工业中的广泛应用。因此进一步开拓辣根过氧化物酶的应用水平，提高其稳定性具有重要的意义。

随着酶固定化技术的兴起，实现了酶的更高效应用，易于底物和产物的回收、易于纯化，更在一定程度上改进了生物催化剂的性能。这一技术为辣根过氧化物酶的应用开拓了更为广阔的应用前景。酶的固定化方法可概括分成吸附、交联、包埋和共价偶联四种。其中前三种是以酶与载体间较弱的相互作用力进行固定化的物理方法，亲和性不高、结合不牢靠，酶易从载体上脱落，酶损失比较严重，从而造成环境污染、成本增加。

用于酶的固定化材料是制备出高效生物催化剂的关键。载体材料的结构和性能对固定化酶的性能有着巨大的影响。与其他固定化酶载体材料制备相比，利用葡萄糖水热碳化法制备碳球反应绿色温和，成本低廉，所得碳球粒径均一，表面富集多种活性官能团如—OH和—C＝O等，不仅能够大大提高碳基材料的亲水性以及分散在水体系中的稳定性，更重要的是官能团经过活化后，能为生物大分子提供附着位点。因此，碳球有望成为固定化酶的优良材料。

发明内容

本发明的目的在于提供一种绿色、简单、经济的固定化辣根过氧化物酶载体的制备方法，即葡萄糖通过水热碳化法制备纳米碳球材料，利用表面富含的大量羧基和羟基等官能团，通过化学键的作用共价键合制得与载体结合牢固的固定化酶。本发明的另一个目的是提供一种新型的性能稳定、成本低廉的固定化辣根过氧化物酶。

本发明解决技术问题，采用如下技术方案：

本发明提供的固定化辣根过氧化物酶载体的制备方法，其特点在于：将纳米碳球进行氨基化修饰、戊二醛活化，即得到所述固定化辣根过氧化物酶载体。

其中所述碳球的粒径为180～220纳米。所述纳米碳球通过葡萄糖水热碳化法制备获得。

具体的，本发明的制备方法是按如下步骤进行：

(1)通过葡萄糖水热碳化法制备纳米碳球：

将葡萄糖溶于蒸馏水中并搅拌至澄清，然后转移至高压反应釜中，180℃反应8小时，冷却至室温，离心，所得沉淀用蒸馏水和乙醇交替洗涤数次，最后冷冻干燥，即得纳米碳球；

所述葡萄糖和蒸馏水的用量比为4～8克:80毫升，优选为8克:80毫升；

(2)对纳米碳球进行氨基化修饰：

将所述纳米碳球加入蒸馏水中并搅拌分散1小时，然后缓慢滴加氨水并继续搅拌2小时，离心，所得沉淀用蒸馏水洗涤数次，最后冷冻干燥，获得氨基化修饰碳球。

所述纳米碳球、水和氨水的用量比为100毫克：20毫升：2～8毫摩尔；优选为100毫克：20毫升：4毫摩尔；

(3)对氨基化修饰碳球进行戊二醛活化：

将所述氨基化修饰碳球加入戊二醛中，室温下反应30分钟，离心，所得沉淀用蒸馏水洗涤数次除去未反应的戊二醛，最后冷冻干燥，即获得述固定化辣根过氧化物酶载体；

所述氨基化修饰碳球和戊二醛的用量比为100毫克：20毫升；戊二醛的体积浓度为1％～4％，优选2％。

本发明进一步提供了固定化辣根过氧化物酶的制备方法，是将上述的固定化辣根过氧化物酶载体与辣根过氧化物酶加入到0.1摩尔/升、pH＝6～9的磷酸盐缓冲液中，在15～35℃振荡1～24小时，离心，所得沉淀分别用0.1摩尔/升、pH＝6～9的磷酸盐缓冲液反复冲洗，直至淋洗液中没有游离酶，最后冷冻干燥，即获得固定化辣根过氧化物酶。

其中，所述磷酸盐缓冲液的pH优选为7；所述振荡的温度优选为25℃；时间优选为18小时。所述固定化辣根过氧化物酶载体、辣根过氧化物酶及磷酸盐缓冲液的用量比优选为100毫克：10毫克：10毫升。

本发明克服了游离辣根过氧化物酶在实际应用中的不足，提供了一种固定化辣根过氧化物酶载体，该载体是通过葡萄糖水热碳化制备的纳米碳球，经过氨基化修饰，戊二醛活化后，与辣根过氧化物酶共价键合。本发明的优点在于：

(1)本发明提供的固定化辣根过氧化物酶载体，制备绿色温和，成本低廉；本发明利用葡萄糖水热碳化法在绿色温和的条件下制备出纳米碳球材料，其具有均匀的球形结构和粒径、良好的分散性，且表面富含大量的羧基和羟基等官能团；

(2)本发明提供的固定化辣根过氧化酶是通过化学键的作用共价键合将辣根过氧化物酶与载体牢固结合，不会因为过高浓度的底物或盐类的存在等原因而使酶分子从载体上脱落，克服了酶链接不紧密，生物相容性差等缺点，提高了固定化酶的操作稳定性。

(3)本发明提供的固定化辣根过氧化物酶是将天然辣根过氧化物酶固定在纳米碳球上，从而改变了游离酶的微环境或构象，使得酶的三维结构、物理、化学性能更稳定，活性更高，较之游离酶更加耐受温度、pH和有机溶剂等极端环境，水溶液储存稳定性也得到了很大的提高。

附图说明

图1为葡萄糖水热碳化制备的纳米碳球的傅里叶红外光谱(FT-IR)照片；

图2为固定化辣根过氧化物酶载体的透射电镜(TEM)照片。

具体实施方式

实施例1、固定化辣根过氧化物酶的制备

1)制备固定化辣根过氧化物酶载体：

先将8克葡萄糖溶于80毫升蒸馏水中并搅拌至澄清，然后转移至100毫升高压反应釜中，180℃反应8小时，冷却至室温，离心(8000转/分钟，10分钟)，沉淀用蒸馏水和乙醇交替洗涤数次后冷冻干燥，获得纳米碳球；

图1为葡萄糖水热碳化制备的纳米碳球的傅里叶红外光谱(FT-IR)照片，可以看出纳米碳球出现了明显的吸收峰，3417cm^-1为O-H的拉伸振动，1625cm-¹为来自羧基的C＝O拉伸振动。表明纳米碳富含大量的羧基和羟基等官能团。

取上述纳米碳球100毫克加入20毫升蒸馏水中并搅拌分散1小时，然后缓慢滴加4毫摩尔氨水并继续搅拌2小时，离心(8000转/分钟，10分钟)，沉淀用蒸馏水洗涤数次，最后冷冻干燥，获得氨基化修饰碳球。

取上述氨基化修饰碳球100毫克加入到20毫升2％(v/v)戊二醛中，在室温下反应30分钟后离心(8000转/分钟，10分钟)，沉淀用蒸馏水洗涤数次除去未反应的戊二醛，冷冻干燥，得到固定化辣根过氧化物酶载体。

图2为所得固定化辣根过氧化物酶载体透射电镜(TEM)照片，可以看出其具有均匀的球形结构，粒径均一，分散性好。

2)固定化辣根过氧化物酶

称取100毫克所得固定化辣根过氧化物酶载体和10毫克辣根过氧化物酶加入10毫升磷酸盐缓冲液(0.1摩尔/升，pH 7)混合，25℃振荡18小时，用磷酸盐缓冲液(0.1摩尔/升，pH 7)反复冲洗，直至淋洗液中没有游离酶，得到固定化辣根过氧化物酶。经测定，该样品的酶的固载量为3.302毫克/克，固定化辣根过氧化物酶的酶活达到548.6U/克，酶活性回收率为72.2％。

实施例2、固定化辣根过氧化物酶的极端环境中的稳定性

1)分别将实施例1制备所得固定化辣根过氧化物酶与游离辣根过氧化物酶置于5～55℃的水浴中保温2小时，取样检测其酶活性。

结果表明，固定化辣根过氧化物酶的最适温度为25℃，与游离酶最适温度相当，但在极端温度环境下，特别是5℃和55℃时，固定化辣根过氧化物酶保留酶活仍能分别达到45.1％和11.2％，而游离辣根过氧化物酶酶活仅为16.9％和1.5％，表明固定化辣根过氧物酶具有更广泛的温度适应范围。因此，与游离辣根过氧化物酶相比，本实施例制得的固定化辣根过氧物酶更有利于适应于实际应用时温度变化的复杂环境。

2)取适量实施例1制备所得固定化辣根过氧化物酶与游离辣根过氧化物酶，分别悬浮于不同pH值的磷酸盐缓冲液(0.1摩尔/升)中，取样检测其酶活性。

结果表明，在pH5.0～10.0范围内，固定化辣根过氧化酶受溶液pH值的影响不显著，在强碱环境下pH＝10.0固定化辣根过氧化物酶保留酶活在75％左右，而游离辣根过氧化物酶的酶活性受pH影响较大，酶活损失42％。因此，与游离辣根过氧化物酶相比，本实施例制得的固定化辣根过氧化酶具有较好的pH值适应范围。

3)取适量实施例1制备所得固定化辣根过氧化物酶与游离辣根过氧化物酶，分别分散于20％(v/v)甲醇、乙腈和四氢呋喃(体积比为1:1:1)的水溶液中，30分钟后取样测定酶的活性。

结果表明，游离辣根过氧化物酶剩余活性为初始的47.1％，而固定化辣根过氧化物酶保留酶活高达84.7％。因此，与游离辣根过氧化物酶相比，本实施例制得的固定化辣根过氧化酶受有机溶剂影响较小，更为耐受有机溶剂，在工业废水综合处理中具有深远意义。

4)固定化辣根过氧化物酶水溶液的储存稳定性

取适量实施例1制备所得固定化辣根过氧化物酶与游离辣根过氧化物酶，分别保存在0.1摩尔/升、pH＝7.0磷酸盐缓冲液中，放置4℃冰箱中，每隔一周取样检测其酶活。

结果表明，在相同的储存条件下，固定化辣根过氧化物酶酶活力下降速度远远低于游离酶，在第四个星期，固定化辣根过氧化物酶保留酶活在85％以上，而游离辣根过氧化物酶溶液的酶活酶活损失超过65％。

Claims (4)

1.一种固定化辣根过氧化物酶载体的制备方法，其特征在于：将纳米碳球进行氨基化修饰、戊二醛活化，即得到所述固定化辣根过氧化物酶载体；

所述纳米碳球的粒径为180～220纳米；所述纳米碳球通过葡萄糖水热碳化法制备获得；

所述制备方法是按如下步骤进行：

(1)通过葡萄糖水热碳化法制备纳米碳球：

将葡萄糖溶于蒸馏水中并搅拌至澄清，然后转移至高压反应釜中，180℃反应8小时，冷却至室温，离心，所得沉淀用蒸馏水和乙醇交替洗涤数次，最后冷冻干燥，即得纳米碳球；

所述葡萄糖和蒸馏水的用量比为8克:80毫升；

(2)对纳米碳球进行氨基化修饰：

将所述纳米碳球加入蒸馏水中并搅拌分散1小时，然后缓慢滴加氨水并继续搅拌2小时，离心，所得沉淀用蒸馏水洗涤数次，最后冷冻干燥，获得氨基化修饰碳球；

所述纳米碳球、水和氨水的用量比为100毫克：20毫升：4毫摩尔；

(3)对氨基化修饰碳球进行戊二醛活化：

将所述氨基化修饰碳球加入戊二醛中，室温下反应30分钟，离心，所得沉淀用蒸馏水洗涤数次除去未反应的戊二醛，最后冷冻干燥，即获得所述固定化辣根过氧化物酶载体；

所述氨基化修饰碳球和戊二醛的用量比为100毫克：20毫升；戊二醛的体积浓度为2％。

2.权利要求1所述制备方法制备得到的固定化辣根过氧化物酶载体。

3.一种固定化辣根过氧化物酶的制备方法，其特征在于：将权利要求2所述的固定化辣根过氧化物酶载体与辣根过氧化物酶加入到0.1摩尔/升、pH＝6～9的磷酸盐缓冲液中，在15～35℃振荡18小时，离心，所得沉淀用0.1摩尔/升、pH＝6～9的磷酸盐缓冲液反复冲洗，直至淋洗液中没有游离酶，最后冷冻干燥，即获得固定化辣根过氧化物酶；

所述固定化辣根过氧化物酶载体、辣根过氧化物酶及磷酸盐缓冲液的用量比为100毫克：10毫克：10毫升。

4.一种由权利要求3所述制备方法所获得的固定化辣根过氧化物酶。