CN101643725A - 一种磁性中空复合微结构固定化酶及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种磁性中空复合微结构固定化酶及其制备方法。该固定化酶，包括酶和用于固定所述酶的载体，其中，所述载体是磁性中空多聚糖微球，所述磁性中空多聚糖微球由核和壳组成，所述壳包覆于所述核的外表面，所述壳由铁酸盐组成，所述核为中空多聚糖微球，所述中空多聚糖微球按照如下方法制备：在恒温条件下，将酵母在液体中进行碳化，得到中空多聚糖微球；所述恒温的温度选自150－240℃之间的任一温度。本发明还公开了该固定化酶的制备方法。本发明的磁性中空复合微结构固定化酶的酶蛋白负载量高、酶活性高、酶的稳定性和操作稳定性强，且在外加磁场条件下该固定化酶易于回收。
Description
技术领域
本发明涉及一种磁性中空复合微结构固定化酶及其制备方法。
背景技术
酶是一种在许多领域都有重要应用价值的生物催化剂，具有催化速率高、反应专一性强、催化条件温和、能耗低以及不产生污染等优点。传统的游离酶存在一些缺点，如本身结构易受外界环境影响，出现失活现象；使用后分离回收困难，难以实现连续利用。酶的固定化技术是解决这些问题的有效措施之一。固定化酶不仅保留了酶的催化特性，可以提高酶的贮存稳定性和操作稳定性，同时还可以实现酶的回收和连续利用，从而减低了生产中酶制剂的投入成本，并且简化了产品的后续提纯工艺。微米级的中空球形结构，因其极高的比表面积和可容纳大量客体分子的内部空间，在酶固定化领域具有巨大的应用潜力。特别是磁性中空微结构，在具备上述优点的同时，由于其本身的磁性，在外加磁场的作用下可以很容易地从反应体系中分离出来而得到回收利用，因此是一种潜在的优良的酶固定化载体。
发明内容
本发明的目的是提供一种磁性中空复合微结构固定化酶及其制备方法。
本发明所提供的磁性中空复合微结构固定化酶，包括酶和用于固定所述酶的载体。其中，所述载体是磁性中空多聚糖微球，所述磁性中空多聚糖微球由核和壳组成，所述壳包覆于所述核的外表面，所述壳由铁酸盐组成，所述核为中空多聚糖微球，所述中空多聚糖微球按照如下方法制备：在恒温条件下，将酵母在液体中进行碳化，得到中空多聚糖微球；所述恒温的温度选自150-240℃之间的任一温度。
上述磁性中空复合微结构固定化酶中的酶具体可为水解酶，如淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶、过氧化物酶、脱氢酶、氧化酶或漆酶等。所述铁酸盐为四氧化三铁、铁酸锰、铁酸钴或铁酸锌。
所述中空多聚糖微球的制备中所述酵母在液体中的浓度为10-200g/L。所述恒温的时间为10-24小时。所述液体可以为水，也可以是水溶液，所述水溶液的溶质选自如下10种化合物中的至少一种：盐酸、硫酸、硝酸、醋酸、氯化钠、氯化钾、醋酸钾、乙醇、乙醛或戊二醛，所述水溶液中溶质的终浓度可为0.01-0.1mol/L。所述酵母为球形或椭球形，酵母可以是死的，也可以是活的。当所述液体为水溶液时，不同的溶质，制备出的中空多聚糖微球可以有不同的形状，如球形或苹果形或坛子形，还可以是球壁完整的中空微球或球壁上有一个孔的中空微球。
所述磁性中空多聚糖微球可以按照如下方法制备：
a)向所述中空多聚糖微球悬浮液(中空多聚糖微球浓度为10～50g/L)中先后加入铁、钴、锰或/和锌的无机盐，使其终浓度分别为0.01～0.1mol/L，再加入乙二醇作为还原剂；
b)将步骤a)的悬浮液在恒温下加热6～24h得到磁性中空多聚糖微球，所述恒温的温度选自160～250℃中的任一温度。
本发明的另一个目的是提供一种磁性中空复合微结构固定化酶的制备方法。
本发明所提供的磁性中空复合微结构固定化酶的制备方法，包括如下步骤：
1)在碱性条件下，将所述载体用环氧氯丙烷水溶液处理，使所述载体表面带有环氧基；
2)将步骤1)得到的载体用氨水进行处理使其表面带有氨基；
3)将步骤2)中得到的载体用戊二醛水溶液处理；
4)将步骤3)得到的载体与所述酶溶液混合，使所述酶与所述载体形成固定化酶。
其中，所述环氧氯丙烷水溶液的体积百分比浓度为1-50％。所述氨水的浓度为0.01-2.0mol/L。所述戊二醛水溶液的体积百分比浓度为0.1-20％。
本发明的磁性中空复合微结构固定化酶的酶蛋白负载量高、酶活性高、酶的稳定性和操作稳定性强，且在外加磁场条件下该固定化酶易于回收。
本发明的磁性中空复合微结构固定化酶的制备方法中制备载体的原料来源广泛，载体制备、表面修饰和酶的固定化技术简单易行，且制备出的载体具有高比表面积、大内部空间、丰富的表面官能团以及良好的生物相容性等特点。本发明的磁性中空复合微结构固定化酶的方法适合于各种水解酶。
具体实施方式
实施例1、磁性中空复合微结构固定化酶
a)称椭球形啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)5g，分散于100ml去离子水中，制成酵母悬浮液，然后将酵母悬浮液转移到反应釜中，置于恒温箱中在180℃下加热18h，反应结束后，收集沉淀，将得到的沉淀用去离子水洗涤，然后在20℃下干燥24h。干燥后，即得到中空多聚糖微球。用扫描电镜观察中空多聚糖微球，并用对中空多聚糖微球进行红外表征。
扫描电镜下中空多聚糖微球的结构为直径2-3微米的中空微球，红外表征结果表明中空多聚糖微球表面含有的-OH，-C＝O等功能团，具有良好的生物相容性。
b)称取a)中球形中空多聚糖微球3.0g，分散于50ml去离子水中，加入氯化铁，使其浓度保持在0.01mol/L，然后加入醋酸钠，使其浓度保持在10g/L，最后加入乙二醇50ml，搅拌60分钟后，将上述液体转移到反应釜中，反应釜置于恒温箱中，在190℃下放置12h，然后收集沉淀，将得到的沉淀用去离子水洗涤，最后沉淀在20℃下干燥24h，即可得到固定化酶的载体。场发射扫描电镜(FE-SEM)和X射线衍射仪(XRD)检测固定化酶的载体。
XRD结果表明四氧化三铁成功包覆于中空多聚糖微球的外表面，场发射扫描电镜(FE-SEM)的结果表明四氧化三铁颗粒均匀、致密地包覆。上述结果说明该载体均一性很好。
c)取步骤b)的载体0.1g，均匀分散到4mL 0.06％的β-葡萄糖苷酶溶液中，28℃振荡10小时，外加磁场分离沉淀后，用醋酸缓冲液洗去沉淀上非共价结合的酶蛋白，获得磁性中空复合微结构固定化酶。
以水杨素为底物测定磁性中空复合微结构固定化酶的酶活力，酶活力的测定方法如下：将25mg磁性中空复合微结构固定化酶和1mL经过预热的5g/100ml的水杨素溶液(由pH4.8醋酸缓冲液配制)混合，振荡条件下50℃水浴保温30分钟后在外加磁场作用下分离，向分离得的上清液中加入1mL DNS(3，5-二硝基水杨酸)试剂，煮沸5分钟，冷至室温后，在540nm下测定其吸光度。1个单位酶活(IU)指每分钟水解得到1微摩尔葡萄糖所需的酶量。
酶活力测定结果表明，磁性中空复合微结构固定化酶的酶活力为4.9U/g载体。
实施例2、磁性中空复合微结构固定化酶
a)称椭球形啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)5g，分散于100ml去离子水中，制成酵母悬浮液，然后向酵母悬浮液中加入稀盐酸，使其终浓度为0.1mol/L，在将上述悬浮液转移到反应釜中，置于恒温箱中在150℃下加热24h，反应结束后，收集沉淀，将得到的沉淀用去离子水洗涤，然后在20℃下干燥24h。干燥后，即得到中空多聚糖微球。用扫描电镜观察中空多聚糖微球。中空多聚糖微球为直径2-3微米的坛子状。
b)称取a)中坛子形中空多聚糖微球3.0g，分散于50ml去离子水中，加入氯化铁，使其浓度保持在0.01mol/L，再加入氯化锰，使其浓度保持在0.005mol/L，然后加入醋酸钠，使其浓度保持在10g/L，最后加入乙二醇50ml，搅拌60分钟后，将上述液体转移到反应釜中，反应釜置于恒温箱中，在190℃下放置12h，然后收集沉淀，将得到的沉淀用去离子水洗涤，最后沉淀在20℃下干燥24h，即可得到固定化酶的载体。场发射扫描电镜(FE-SEM)和X射线衍射仪(XRD)检测固定化酶的载体。
XRD结果表明铁酸锰包覆于中空多聚糖微球的外表面，场发射扫描电镜(FE-SEM)的结果表明铁酸锰颗粒均匀、致密地包覆。上述结果说明该载体均一性很好。
c)取步骤b)的载体0.1g，均匀分散到4mL 0.06％的β-葡萄糖苷酶溶液中，28℃振荡10小时，外加磁场分离后用醋酸缓冲液洗去载体上非共价结合的酶蛋白，获得磁性中空复合微结构固定化酶。
以水杨素为底物测定磁性中空复合微结构固定化酶的酶活力，酶活力的测定方法同实施例1。
酶活力的测定结果表明，磁性中空复合微结构固定化酶的酶活力为6.3U/g载体。
实施例3、磁性中空复合微结构固定化酶
a)称椭球形啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)5g，分散于100ml去离子水中，制成酵母悬浮液，然后向酵母悬浮液中加入氯化钠，使其终浓度为0.01mol/L，在将上述悬浮液转移到反应釜中，置于恒温箱中在150℃下加热24h，反应结束后，收集沉淀，将得到的沉淀用去离子水洗涤，然后在20℃下干燥24h。干燥后，即得到中空多聚糖微球，用扫描电镜观察中空多聚糖微球，中空多聚糖微球为直径2-3微米的球形。
b)称取a)中球形中空多聚糖微球3.0g，分散于50ml去离子水中，加入氯化铁，使其浓度保持在0.01mol/L，再加入硫酸钴，使其浓度保持在0.005mol/L，然后加入醋酸钠，使其浓度保持在10g/L，最后加入乙二醇50ml，搅拌60分钟后，将上述液体转移到反应釜中，反应釜置于恒温箱中，在190℃下放置12h，然后收集沉淀，将得到的沉淀用去离子水洗涤，最后沉淀在20℃下干燥24h，即可得到固定化酶的载体。场发射扫描电镜(FE-SEM)和X射线衍射仪(XRD)检测固定化酶的载体。
XRD结果表明铁酸钴包覆于中空多聚糖微球的外表面，场发射扫描电镜(FE-SEM)的结果表明铁酸钴颗粒均匀、致密地包覆。上述结果说明该载体均一性很好。
c)取步骤b)的载体1g，分散于100mL 10％环氧氯丙烷的碱性溶液中，振荡6小时后用去离子水彻底洗净残留的环氧氯丙烷；将洗后的载体用0.25M氨水处理9小时，处理后离心分离沉淀，再用1％戊二醛处理沉淀1小时，得到的载体用去离子水洗净后，取0.1g，均匀分散到4mL 0.06％的β-葡萄糖苷酶溶液中，28℃振荡10小时，外加磁场分离沉淀，用醋酸缓冲液洗去沉淀上非共价结合的酶蛋白，获得磁性中空复合微结构固定化酶。
以水杨素为底物测定磁性中空复合微结构固定化酶的酶活力，酶活力的测定方法同实施例1.
为了测定中空复合微结构固定化酶的稳定性，中空复合微结构固定化酶通过磁场分离回收后连续使用500次，取连续使用一定次数的中空复合微结构固定化酶，测定其酶活，酶活测定方法同上。实验重复3次。
酶活力和酶的稳定性测定的结果表明，中空复合微结构固定化酶的酶活力为10.6U/g载体，中空复合微结构固定化酶通过磁场分离回收的回收率为95％，连续使用500次后酶活力未出现明显下降。
实施例4、磁性中空复合微结构固定化酶
a)称椭球形啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)5g，分散于100ml去离子水中，制成酵母悬浮液，然后向酵母悬浮液中加入戊二醛，使其终浓度为0.05mol/L，在将上述悬浮液转移到反应釜中，置于恒温箱中在240℃下加热10h，反应结束后，收集沉淀，将得到的沉淀用去离子水洗涤，然后在20℃下干燥24h。干燥后，即得到中空多聚糖微球。用扫描电镜观察生物相容性中空多聚糖微球，中空多聚糖微球为直径3-5微米的苹果形。
b)称取a)中苹果形中空多聚糖微球3.0g，分散于50ml去离子水中，加入氯化铁，使其浓度保持在0.01mol/L，再加入硫酸锌，使其浓度保持在0.005mol/L，然后加入醋酸钠，使其浓度保持在10g/L，最后加入乙二醇50ml，搅拌60分钟后，将上述液体转移到反应釜中，反应釜置于恒温箱中，在190℃下放置12h，然后收集沉淀，将得到的沉淀用去离子水洗涤，最后沉淀在20℃下干燥24h，即可得到固定化酶的载体。场发射扫描电镜(FE-SEM)和X射线衍射仪(XRD)检测固定化酶的载体。
XRD结果表明铁酸锌包覆于中空多聚糖微球的外表面，场发射扫描电镜(FE-SEM)的结果表明铁酸锌颗粒均匀、致密地包覆。上述结果说明该载体均一性很好。
c)取步骤b)的载体1g，分散于100mL 10％环氧氯丙烷的碱性溶液中，振荡6小时后用去离子水彻底洗净残留的环氧氯丙烷；将洗后的球形磁性中空复合微结构用0.25M氨水处理9小时，处理后离心分离沉淀，再用1％戊二醛处理沉淀1小时，得到的磁性中空复合微结构用去离子水洗净后，取0.1g，均匀分散到4mL 0.06％的β-葡萄糖苷酶溶液中，28℃振荡10小时，外加磁场分离沉淀后，用醋酸缓冲液洗去沉淀上非共价结合的酶蛋白，获得磁性中空复合微结构固定化酶。
以水杨素为底物测定磁性中空复合微结构固定化酶的酶活力，酶活力的测定方法同实施例1。
为了测定中空复合微结构固定化酶的稳定性，中空复合微结构固定化酶通过磁场分离回收后连续使用500次，取连续使用一定次数的中空复合微结构固定化酶，测定其酶活，酶活测定方法同上。实验重复3次。
酶活力和酶的稳定性测定的结果表明，中空复合微结构固定化酶的酶活力为14.2U/g载体，中空复合微结构固定化酶通过磁场分离回收的回收率为95％，连续使用500次后酶活力未出现明显下降。
Claims (10)
1、一种固定化酶，包括酶和用于固定所述酶的载体，其特征在于：所述载体是磁性中空多聚糖微球，所述磁性中空多聚糖微球由核和壳组成，所述壳包覆于所述核的外表面，所述壳由铁酸盐组成，所述核为中空多聚糖微球，所述中空多聚糖微球按照如下方法制备：在恒温条件下，将酵母在液体中进行碳化，得到中空多聚糖微球；所述恒温的温度选自150-240℃之间的任一温度。
2、根据权利要求1所述的固定化酶，其特征在于：所述酶为水解酶。
3、根据权利要求1或2所述的固定化酶，其特征在于：所述铁酸盐为四氧化三铁、铁酸锰、铁酸钴或铁酸锌。
4、根据权利要求3所述的固定化酶，其特征在于：所述酵母在液体中的浓度为10-200g/L。
5、根据权利要求4所述的固定化酶，其特征在于：所述恒温的时间为10-24小时。
6、根据权利要求5所述的固定化酶，其特征在于：所述液体为水或水溶液；所述水溶液中的溶质选自下述10种物质中的至少一种：盐酸、硫酸、硝酸、醋酸、氯化钠、氯化钾、醋酸钾、乙醇、乙醛和戊二醛；所述水溶液中溶质的终浓度为0.01-0.1mol/L。
7、根据权利要求6所述的固定化酶，其特征在于：所述酵母为球形或椭球形；所述酵母为死的或活的。
8、根据权利要求7所述的固定化酶，其特征在于：所述中空多聚糖微球为球形或苹果形或坛子形；所述中空多聚糖微球为球壁完整的中空微球或球壁上有一个孔的中空微球。
9、权利要求1至8中任一所述的固定化酶的制备方法，包括如下步骤：
1)在碱性条件下，将所述载体用环氧氯丙烷水溶液处理，使所述载体表面带有环氧基；
2)将步骤1)得到的载体用氨水进行处理使其表面带有氨基；
3)将步骤2)中得到的载体用戊二醛水溶液处理；
4)将步骤3)得到的载体与所述酶溶液混合，使所述酶与所述载体形成固定化酶。
10、根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述环氧氯丙烷水溶液的体体积百分比浓度为1-50％；所述氨水的浓度为0.01-2.0mol/L；所述戊二醛水溶液的体积百分比浓度为0.1-20％。
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