CN102443579A - 应用双亲性多孔中空碳微球制备固定化酶的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种应用双亲性多孔中空碳微球制备固定化酶的方法。本发明提供的方法，包括如下步骤：将双亲性中空碳微球和待固定酶的溶液混合，4-45℃反应0.5-24h，得到固定化酶；双亲性中空碳微球按照如下方法制备：180-240℃下，将酵母在水溶液或水中进行碳化，得到双亲性中空碳微球。本发明的方法具有以下优点：①酶的封装包埋和载体制备分开进行，避免酶的失活；②酶与载体之间为非共价作用，无需对载体表面基团进行修饰，方法简单；③能有效防止强烈搅拌等外界因素对酶的损害，提高固定化酶的操作稳定性；④传质阻力小；⑤中空碳微球的双亲性为其用于有机介质体系提供了可能；⑥具有普适性；⑦载酶量高，稳定性强。
Description
技术领域
本发明涉及一种应用双亲性多孔中空碳微球制备固定化酶的方法。
背景技术
酶是一类具有催化活性的蛋白质，能够在温和的反应条件下高效、高选择性的催化复杂的化学反应。但是天然酶稳定性差、易失活、以及难回收再利用的缺陷阻碍了酶催化的发展和应用，而且在反应体系中分离和提纯酶也增加了其作为催化剂的成本。如果能够实现酶的固定化，将水溶性酶蛋白变为不溶性固体催化剂，不仅可以在一定程度上提高酶的稳定性、活性和专一性等性能，更重要的是能够轻易实现酶的回收再利用以及产物的分离提纯，保证酶催化在工业应用中的经济可行。
酶固定化方法一般可粗分为4大类：吸附法、共价结合法、交联法和包埋法。包埋法固定化酶是在载体制备过程中将酶包埋在里面，适用于小分子量的酶的固定化，存在酶易泄漏，传质阻力等缺陷。共价结合法固定化酶使得酶与载体的结合很牢固，稳定性好，但是固定化成本高，操作过程繁琐复杂。
发明内容
本发明的目的是提供一种应用双亲性多孔中空碳微球制备固定化酶的方法。
本发明提供的制备固定化酶的方法，包括如下步骤：将双亲性中空碳微球和待固定酶的溶液混合，4-45℃(如4℃-25℃、25℃-30℃、30℃-45℃)反应0.5-24h(如0.5h-2h、2h-6h、6h-12h、12h-24h)，得到固定化酶；所述双亲性中空碳微球按照如下方法制备：在恒温条件下，将酵母在水溶液或水中进行碳化，得到双亲性中空碳微球；所述恒温的温度为180-240℃之间的任一温度(如180℃-200℃或200℃-240℃)。
所述恒温的时间可为8-14小时(8小时-10小时或10小时-14小时)。
所述酵母可为啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，具体可为安琪酵母股份有限公司生产的耐高温高活性啤酒酵母。
所述水溶液可为己二醛水溶液、NaOH水溶液或HNO3水溶液。所述酵母与所述水溶液的配比可为10-200g酵母∶1L水溶液，优选为200g酵母∶1L水溶液。所述己二醛水溶液具体可为0.01mol/L己二醛水溶液。所述NaOH水溶液具体可为1g/100mLNaOH水溶液。所述HNO3水溶液具体可为1g/100mL HNO3水溶液。
所述待固定酶可为水解酶、氧化还原酶、脱氢酶或异构酶等；所述水解酶可为脂肪酶、β-葡萄糖苷酶、蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶等；所述氧化还原酶可为过氧化氢酶、葡萄糖氧化酶等；所述脱氢酶可为乙醇脱氢酶等。所述异构酶可为葡萄糖异构酶等。
所述固定化酶具体可为固定化脂肪酶；所述待固定酶的溶液由游离脂肪酶和0.02mol/L pH6.0的醋酸-醋酸钠缓冲液组成，脂肪酶浓度为4mg/mL；所述双亲性中空碳微球与所述待固定酶的溶液的配比为0.05g∶2mL；所述反应的参数为：4-25℃，振荡(100rpm)反应12h。
所述固定化酶具体可为固定化过氧化氢酶；所述待固定酶的溶液由游离过氧化氢酶和0.05mol/L pH7.0的NaH2PO3-Na2HPO3缓冲液组成，过氧化氢酶浓度为20-50mg/mL；所述双亲性中空碳微球与所述待固定酶的溶液的配比为0.05g∶4mL；所述反应的参数为：4-25℃，振荡(100rpm)反应0.5-24h。
所述固定化酶具体可为固定化葡萄糖氧化酶；所述待固定酶的溶液由游离葡萄糖氧化酶和0.05mol/L pH5.5的NaH2PO3-Na2HPO3缓冲液组成；葡萄糖氧化酶浓度为20mg/mL；所述双亲性中空碳微球与所述待固定酶的溶液的配比为0.05g∶2mL；所述反应的参数为：30℃，振荡(100rpm)反应6h。
所述固定化酶具体可为固定化β-葡萄糖苷酶；所述待固定酶的溶液由游离β-葡萄糖苷酶和0.05mol/L pH4.8的HAc-NaAC缓冲液组成，β-葡萄糖苷酶浓度为1mg/mL；所述双亲性中空碳微球与所述待固定酶的溶液的配比为0.05g∶1mL；所述反应的参数为：45℃，振荡(100rpm)反应2h。
以上任一所述方法制备得到的固定化酶也属于本发明的保护范围。
本发明利用由酵母碳化得到的中空碳微球为固定化载体，利用吸附法将不同大小和类型的酶封装包埋在中空碳微球的空腔里，实现酶的固定化。将中空碳微球作为固定化载体，具有如下优点：原料来源广泛、成本低廉；表面具有大量的羟基、醛基和羧基等亲水官能团，同时也存在着呋喃环、芳香族和脂肪族碳链等疏水性基团，利用载体表面的基团与酶分子基团之间的键合实现酶的固定化。该中空碳微球具有高比表面积、大的内部空腔、丰富的表面官能团、以及良好的生物相容性和双亲性(能够均匀地分散在极性及非极性溶剂中)等优点，可以获得高载酶量、高酶活和高操作稳定性的固定化酶，并且可以适用于水相和有机相的酶催化体系，具有一定的普适性。
与常规的固定化方法相比，本发明提供的制备固定化酶的方法具有以下优点：①酶的封装包埋和载体制备过程是分开进行的，避免了酶的失活；②酶与载体之间为非共价作用，无需对载体表面基团进行修饰，方法简单；③载体对酶蛋白起到保护作用，能有效防止强烈搅拌等外界因素对酶的损害，提高固定化酶的操作稳定性；④壳壁上的孔道可以轻易让底物和产物进出，传质阻力小；⑤中空碳微球的双亲性为其用于有机介质体系提供了可能；⑥大多数的酶都可以采用这种固定化方法，具有一定的普适性；⑦载酶量高，稳定性强。
附图说明
图1为双亲性多孔中空碳微球的扫描电镜(SEM)形貌照片。
图2为荧光脂肪酶示踪的激光聚焦照片。
图3为固定化脂肪酶和等蛋白量游离脂肪酶催化转酯化曲线
图4为固定化脂肪酶的重复操作稳定性。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。下述实施例中的％，如无特殊说明，均为质量百分含量。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。蛋白载量(mg/g)＝(原溶液中的蛋白量-固定化后溶液中的蛋白量)/双亲性中空碳微球的质量；蛋白含量利用考马斯亮蓝法(Bradford法)测定，以mg计；双亲性中空碳微球的质量为加入的质量，以g计。
实施例1应用双亲性中空碳微球固定脂肪酶
(1)双亲性中空碳微球的制备
称20g啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)(商品名称为耐高温高活性啤酒酵母，购自安琪酵母股份有限公司，商品目录号80000012)，分散于100ml的0.01mol/L己二醛水溶液中，然后转移到反应釜置于恒温箱中在180℃下加热14h，反应结束后，收集沉淀，将得到的沉淀用去离子水洗涤，然后在20℃下干燥24h，即得到双亲性中空碳微球。双亲性中空碳微球的扫描电镜(SEM)形貌照片见图1，粒径为2-4微米，孔径＞50nm。
(2)固定化脂肪酶的制备
游离脂肪酶(蛋白)：商品名称为Lipozyme TL，购自Sigma公司，型号为L0777。
取50mg步骤(1)制备的双亲性中空碳微球，均匀分散到2mL脂肪酶溶液(由游离脂肪酶和0.02mol/L pH6.0的醋酸-醋酸钠缓冲液组成；脂肪酶浓度为4mg/mL)中，25℃、100rpm振荡12h，离心分离，用10mL 0.02mol/L pH6.0的醋酸-醋酸钠缓冲液冲洗负载有脂肪酶的碳微球2-3次，即得蛋白载量为8.22mg/g的固定化脂肪酶。
(3)催化性能
将200mg硝基苯棕榈酸酯(p-NPP)溶于8mL 1g/100mL正丁醇的正庚烷溶液中，然后加入50mg步骤(2)制备的固定化脂肪酶(或与固定化脂肪酶等蛋白量的游离脂肪酶)，于40℃，150rpm水浴震荡反应，分别于反应后0.5h、1h、1.5h、2h、3h、5h、7h取样，通过气相色谱测定反应前后正丁醇浓度的变化，计算转酯化率。
气相色谱相关参数：气相色谱仪为GC-2000；色谱柱：柱长1.5m、内径2mm，不锈钢柱；填充物为5％SE-30 chromsorbm，AW.DMCS担体，60-80目；载气为高纯氮气，流速为30mL/min；柱箱温度90℃，进样器温度150℃，检测器温度150℃，进样量3μL。
转酯化率＝(反应前反应体系中正丁醇的含量-反应后反应体系中正丁醇的含量)/反应前反应体系中正丁醇的含量×100％。
固定化脂肪酶和游离脂肪酶的转酯化率如图3所示。当反应0.5h时，固定化脂肪酶的催化的转酯化率为27％，是等量游离酶的4.3倍。反应7h后，固定化酶的转酯化率达到64.4％，而游离酶的转酯化率在反应3h后基本上趋于平衡，维持在41.3％。
(4)操作稳定性
操作稳定性用反应周期的次数对固定化脂肪酶催化性能的影响来表征。
将100mg硝基苯棕榈酸酯(p-NPP)溶于8mL 0.5g/100mL正丁醇的正庚烷溶液中，然后加入50mg步骤(2)制备的固定化脂肪酶，于40℃，150rpm水浴震荡反应1h，即为一个反应周期；每个反应周期结束后取样通过气相色谱测定反应前后正丁醇浓度的变化，计算转酯化率，并将固定化脂肪酶从反应液中离心分离，用正庚烷清洗两次，然后进行下一个反应周期的操作；共进行30个反应周期。
将第一个周期固定化脂肪酶的转酯化率定义为100％，其余每个周期的转酯化率与第一个周期的转酯化率的比值作为活力保留率。结果见图4。固定化酶连续使用30次后，转酯化率未出现明显下降，具有良好的操作稳定性。
(5)储藏稳定性
取步骤(2)制备的固定化脂肪酶室温干燥储藏130天，分别于储藏前和储藏后检测的转酯化率，转酯化率的测定方法同步骤(4)中的第一个反应周期。将储藏前固定化脂肪酶的转酯化率定义为100％，储藏后的转酯化率与储藏前的转酯化率的比值作为活力保留率。室温干燥储藏130d后，活力保留率为94％，结果表明，固定化脂肪酶具有良好的储藏稳定性。
(6)脂肪酶在载体中的封装效果
用荧光脂肪酶(异硫氰酸荧光素标记的Lipozyme TL)代替步骤(2)中的脂肪酶，其它同步骤(2)，得到荧光标记的固定化脂肪酶(装载了荧光脂肪酶的两亲性多孔中空碳微球)。使用激光共聚焦显微镜对固定化脂肪酶进行观察，荧光脂肪酶示踪的激光共聚焦照片见图2。通过照片可以直观地观察到脂肪酶富集在两亲性多孔中空碳微球的内部空腔，即实现了酶的封装固定化。
实施例2应用双亲性中空碳微球固定脂肪酶
(1)双亲性中空碳微球的制备
同实施例1的步骤(1)。
(2)固定化脂肪酶的制备
游离脂肪酶(蛋白)：购自Sigma公司，型号为L3126。
取50mg步骤(1)制备的双亲性中空碳微球，均匀分散到2mL脂肪酶溶液(由游离脂肪酶和0.02mol/L pH6.0的醋酸-醋酸钠缓冲液组成；脂肪酶浓度为4mg/mL)中，4℃、100rpm振荡12h，离心分离，用10mL 0.02mol/L pH6.0的醋酸-醋酸钠缓冲液冲洗负载有脂肪酶的碳微球2-3次，即得蛋白载量为15.89mg/g的固定化脂肪酶。
(3)催化性能
将200mg硝基苯棕榈酸酯(p-NPP)溶于8mL 1g/100mL正丁醇的正庚烷溶液中，然后加入50mg步骤(2)制备的固定化脂肪酶(或与固定化脂肪酶等蛋白量的游离脂肪酶)，于40℃，150rpm水浴震荡反应，于反应0.5h取样，通过气相色谱测定反应前后正丁醇浓度的变化，计算转酯化率。
固定化酶的转酯化率为游离酶的3倍。
实施例3、应用双亲性中空碳微球固定过氧化氢酶
(1)双亲性中空碳微球的制备
称20g啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)(商品名称为耐高温高活性啤酒酵母，购自安琪酵母股份有限公司，商品目录号80000012)，分散于100ml的0.01mol/L己二醛水溶液中，然后转移到反应釜置于恒温箱中在240℃下加热8h，反应结束后，收集沉淀，将得到的沉淀用去离子水洗涤，然后在20℃下干燥24h，即得到双亲性中空碳微球(粒径为2-4微米，孔径＞50nm)。
(2)固定化过氧化氢酶的制备
游离过氧化氢酶(蛋白)：固体粉末，购于美国Sigma公司，产品号为C9322。
取50mg步骤(1)制备的双亲性中空碳微球，均匀分散到4mL过氧化氢酶溶液(由游离过氧化氢酶和0.05mol/L pH7.0的NaH2PO3-Na2HPO3缓冲液组成；过氧化氢酶浓度为20mg/mL)中，4℃、100rpm振荡0.5h，离心分离，用10mL 0.05mol/L pH7.0的NaH2PO3-Na2HPO3缓冲液冲洗负载有过氧化氢酶的碳微球2-3次，即得蛋白载量为3.23mg/g的固定化过氧化氢酶。
(3)催化性能
将50mg固定化过氧化氢酶(或与固定化过氧化氢酶等蛋白量的游离过氧化氢酶)分散在1mL 0.05mol/L pH7.0的NaH2PO3-Na2HPO3缓冲液中，25℃预热5min，加入5mL2.87mol·L-1过氧化氢水溶液(或0.22mol·L-1过氧化氢水溶液)，120rpm反应10h，离心终止反应，过滤，在240nm下测定上清液的吸光值，根据过氧化氢标准曲线求得上清液中的过氧化氢的浓度，同时与不加过氧化氢酶的空白样比较，计算过氧化氢的分解率。
底物浓度对过氧化氢酶催化效率的影响见表1。
表1底物浓度对过氧化氢酶催化效率的影响
a指固定化酶催化过氧化氢分解率/游离酶催化过氧化氢分解率。
当过氧化氢浓度为0.22mol·L-1时，固定化酶催化过氧化氢的分解率12.14％，为游离酶的3.15倍，过氧化氢浓度增加到2.87mol·L-1，固定化酶对过氧化氢的分解率为9.32％，相当于游离酶的3.12倍。固定化过氧化氢酶更能耐受高浓度底物的毒害作用。
实施例4、应用双亲性中空碳微球固定过氧化氢酶
(1)双亲性中空碳微球的制备
同实施例1的步骤(1)。
(2)固定化过氧化氢酶的制备
游离过氧化氢酶(蛋白)：固体粉末，购于美国Sigma公司，产品号为C9322。
取50mg步骤(1)制备的双亲性中空碳微球，均匀分散到4mL过氧化氢酶溶液(由游离过氧化氢酶和0.05mol/L pH7.0的NaH2PO3-Na2HPO3缓冲液组成；过氧化氢酶浓度为50mg/mL)中，25℃、100rpm振荡24h，离心分离，用10mL 0.05mol/L pH7.0的NaH2PO3-Na2HPO3缓冲液冲洗负载有过氧化氢酶的碳微球2-3次，即得蛋白载量为8mg/g的固定化过氧化氢酶。
(3)催化性能
将30mg固定化过氧化氢酶(或与固定化过氧化氢酶等蛋白量的游离过氧化氢酶)分散在1mL 0.05mol/L pH7.0的NaH2PO3-Na2HPO3缓冲液中，25℃预热5min，加入5mL0.22mol·L-1过氧化氢水溶液，120rpm反应10h，离心终止反应，过滤，在240nm下测定上清液的吸光值，根据过氧化氢标准曲线求得上清液中的过氧化氢的浓度，同时与不加过氧化氢酶的空白样比较，计算过氧化氢的分解率。
研究表明固定化酶对过氧化氢的分解率为游离酶的6倍。
实施例5、应用双亲性中空碳微球固定葡萄糖氧化酶
(1)双亲性中空碳微球的制备
称20g啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)(商品名称为耐高温高活性啤酒酵母，购自安琪酵母股份有限公司，商品目录号80000012)，分散于100ml的1g/100mLNaOH水溶液中，然后转移到反应釜置于恒温箱中在180℃下加热10h，反应结束后，收集沉淀，将得到的沉淀用去离子水洗涤，然后在20℃下干燥24h，即得到双亲性中空碳微球(粒径为2-4微米，孔径＞50nm)。
(2)固定化葡萄糖氧化酶的制备
游离葡萄糖氧化酶(蛋白)：固体粉末，购于日本TCI公司。
取50mg步骤(1)制备的双亲性中空碳微球，均匀分散到2mL葡萄糖氧化酶溶液(由游离葡萄糖氧化酶和0.05mol/L pH5.5的NaH2PO3-Na2HPO3缓冲液组成；葡萄糖氧化酶浓度为20mg/mL)中，30℃、100rpm振荡6h，离心分离，用0.05mol/L pH5.5的NaH2PO3-Na2HPO3缓冲液冲洗负载有葡萄糖氧化酶的碳微球2-3次，即得蛋白载量为30.23mg/g的固定化葡萄糖氧化酶。
(3)催化性能
在35℃，pH 5.5条件下，每分钟氧化1μmol葡萄糖生成1μmol过氧化氢所需酶的量定义为一个酶活力单位。葡萄糖氧化酶比活力的单位为U/mg。
将50mg固定化葡萄糖氧化酶(或与固定化葡萄糖氧化酶等蛋白量的游离葡萄糖氧化酶)35℃预热5min，然后加入4mL葡萄糖溶液(由葡萄糖和0.05mol/L pH5.5的NaH2PO3-Na2HPO3缓冲液组成；葡萄糖浓度为1g/100mL)中，150rpm反应30min，离心终止反应，上清液过滤后，在240nm下测定吸光值，根据过氧化氢标准曲线求得稀释液中的过氧化氢的浓度。
固定化葡萄糖氧化酶的比活力为1.00U/mg。游离葡萄糖氧化酶的比活力为0.94U/mg蛋白。固定化酶的活力略高于游离酶活力，为游离酶活力的1.06倍。
实施例6、应用双亲性中空碳微球固定β-葡萄糖苷酶
(1)双亲性中空碳微球的制备
称20g啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)(商品名称为耐高温高活性啤酒酵母，购自安琪酵母股份有限公司，商品目录号80000012)，分散于100ml的1g/100mLHNO3水溶液中，然后转移到反应釜置于恒温箱中在200℃下加热10h，反应结束后，收集沉淀，将得到的沉淀用去离子水洗涤，然后在20℃下干燥24h。干燥后即得到双亲性中空碳微球。粒径为2-4微米，孔径＞50nm。
(2)固定化β-葡萄糖苷酶的制备
游离β-葡萄糖苷酶(蛋白)：购于上海卓康生物科技有限公司。
取50mg步骤(1)制备的双亲性中空碳微球，均匀分散到1mLβ-葡萄糖苷酶溶液(由游离β-葡萄糖苷酶和0.05mol/L pH4.8的HAc-NaAC缓冲液组成；β-葡萄糖苷酶浓度为1mg/mL)中，45℃、100rpm振荡2h，离心分离，用10mL 0.05mol/L pH4.8的HAc-NaAC缓冲液冲洗负载有β-葡萄糖苷酶的碳微球2-3次，即得蛋白载量为10.34mg/g的固定化β-葡萄糖苷酶。
(3)催化性能
以水杨素为底物，在50℃，pH4.8条件下每分钟产生1μmol葡萄糖所需酶的量定义为一个酶活力单位。β-葡萄糖苷酶比活力的单位为U/mg。
液相色谱为Agilent 1100LC，色谱柱为125-01040 HPX-87H，流动相为二次蒸馏水，流速为0.2mL·min-1，柱箱温度35℃，示差折光检测器，自动进样器，进样量5μL。
将50mg固定化β-葡萄糖苷酶(或与固定化β-葡萄糖苷酶等蛋白量的游离β-葡萄糖苷酶)50℃预热5min，然后加入4mL水杨素溶液(由水杨素和0.05mol/L pH4.8的HAc-NaAC缓冲液组成；水杨素浓度为2g/100mL)中，150rpm反应30min，离心终止反应，通过液相色谱测定产生的葡萄糖量，面积归一法定量。
固定化β-葡萄糖苷酶的比活力为100U/mg。游离β-葡萄糖苷酶的比活力为50U/mg。固定化酶的活力为游离酶活力的2倍。
Claims (10)
1.一种制备固定化酶的方法，包括如下步骤：将双亲性中空碳微球和待固定酶的溶液混合，4-45℃反应0.5-24h，得到固定化酶；所述双亲性中空碳微球按照如下方法制备：在恒温条件下，将酵母在水溶液或水中进行碳化，得到双亲性中空碳微球；所述恒温的温度为180-240℃之间的任一温度。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述恒温的时间为8-14小时。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述酵母为啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)；所述水溶液为己二醛水溶液、NaOH水溶液或HNO3水溶液；所述酵母与所述水溶液的配比为10-200g酵母∶1L水溶液，优选为200g酵母∶1L水溶液。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于：所述己二醛水溶液为0.01mol/L己二醛水溶液；所述NaOH水溶液为1g/100mL NaOH水溶液；所述HNO3水溶液为1g/100mL HNO3水溶液。
5.如权利要求1至4中任一所述的方法，其特征在于：所述待固定酶为水解酶、氧化还原酶、脱氢酶或异构酶；所述水解酶为脂肪酶、β-葡萄糖苷酶、蛋白酶、淀粉酶或纤维素酶；所述氧化还原酶为过氧化氢酶或葡萄糖氧化酶；所述脱氢酶为乙醇脱氢酶；所述异构酶为葡萄糖异构酶。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于：所述固定化酶为固定化脂肪酶；所述待固定酶的溶液由游离脂肪酶和0.02mol/L pH6.0的醋酸-醋酸钠缓冲液组成，脂肪酶浓度为4mg/mL；所述双亲性中空碳微球与所述待固定酶的溶液的配比为0.05g∶2mL；所述反应的参数为：4-25℃，振荡反应12h。
7.如权利要求5所述的方法，其特征在于：所述固定化酶为固定化过氧化氢酶；所述待固定酶的溶液由游离过氧化氢酶和0.05mol/L pH7.0的NaH2PO3-Na2HPO3缓冲液组成，过氧化氢酶浓度为20-50mg/mL；所述双亲性中空碳微球与所述待固定酶的溶液的配比为0.05g∶4mL；所述反应的参数为：4-25℃，振荡反应0.5-24h。
8.如权利要求5所述的方法，其特征在于：所述固定化酶为固定化葡萄糖氧化酶；所述待固定酶的溶液由游离葡萄糖氧化酶和0.05mol/L pH5.5的NaH2PO3-Na2HPO3缓冲液组成；葡萄糖氧化酶浓度为20mg/mL；所述双亲性中空碳微球与所述待固定酶的溶液的配比为0.05g∶2mL；所述反应的参数为：30℃，振荡反应6h。
9.如权利要求5所述的方法，其特征在于：所述固定化酶为固定化β-葡萄糖苷酶；所述待固定酶的溶液由游离β-葡萄糖苷酶和0.05mol/L pH4.8的HAc-NaAC缓冲液组成，β-葡萄糖苷酶浓度为1mg/mL；所述双亲性中空碳微球与所述待固定酶的溶液的配比为0.05g∶1mL；所述反应的参数为：45℃，振荡反应2h。
10.权利要求1至9中任一所述方法制备得到的固定化酶。
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