CN103131692B - 以改性核桃壳为载体的固定化脂肪酶的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种以改性核桃壳为载体的固定化脂肪酶的制备方法，首先利用核桃壳制备出活性炭，接着对制备出的活性炭进行改性处理，然后与脂肪酶液混合进行固定化处理制得固定化脂肪酶；本方法采用的核桃壳具有原料易得，价格低廉的特点，同时本方法工艺简单，操作成本低，制得的固定化酶具有良好的稳定性，反应酶活高，能反复多次使用。
Description
技术领域
本发明涉及固定化脂肪酶技术领域，特别涉及以改性核桃壳为载体的固定化脂肪酶的制备方法。
背景技术
脂肪酶（Lipase, EC 3.1.1.3），是一类甘油三酯水解酶，它可以催化天然油脂进行水解，生成脂肪酸、甘油、甘油单酯或二酯，可以完成水解、酯化、转酯、酯交换及合成等反应，被广泛应用于油脂水解、食品加工、食品品质改良、疾病诊断、催化药物合成、皮革生产、可生物降解的无污染洗涤剂的研发和生物柴油的生产等方面。然而，在实际使用过程中，游离酶即使在最适反应条件下也存在易失活、催化反应不稳定、与产物分离困难或分离成本高等缺点。另外，脂肪酶酶制剂一般是通过微生物发酵产生，或者是从动物、植物体内提取的，分离纯化成本高，导致酶的生产价格较高，加上游离酶很难重复利用，导致酶制剂的使用成本提高，从而限制了游离酶在工业生产中大规模的应用。
固定化酶指经物理或化学方法处理后，使酶变成不易随水流失，而又能发挥催化作用的酶制剂。与游离酶相比，固定化酶的优点有：可多次使用，且酶的稳定性提高；反应完成后，固定化酶易与底物和产物分离，而且酶活力降低较少，这样就降低了生产成本；反应条件易于控制，有利于自动化生产。固定化酶通常所用的载体有硅藻土、大孔树脂、层状硅酸盐、改性硅胶、氧化铝、壳聚糖、纤维素、聚乙烯醇、聚乙烯丙烯胶、卡拉胶、海藻酸纳、磁性淀粉微球以及复合二氧化硅等。
酶的固定化方法常用的是：吸附法、共价结合法、交联法和包埋法。在此基础上还出现了上述方法的结合法等。吸附法制备的固定化酶，酶与载体之间的结合力较弱，酶容易从载体上脱落下来，但此种方法具有酶活性中心不易被破坏和酶高级结构变化较少等优点。共价结合法的反应条件较为苛刻，同时由于发生了共价键结合，酶蛋白的高级结构容易产生变化，进而导致固定化酶的活力损失较大，甚至底物专一性等酶学性质发生改变。交联法反应条件比较激烈，酶分子之间依靠化学键实现连接，因此酶失活现象较为严重。包埋法酶容易漏失，催化反应过程容易受传质阻力限制，只适用于小分子底物和产物的反应。
酶固定化研究中，良好的载体是固定化酶成功的关键。所以在酶固定化领域，作为固定化载体的筛选和制备就成为了主要研究方向。
活性炭是由含碳物质制成的外观黑色、内部孔隙发达、比表面积大、吸附能力强的一类微晶质碳，其性质稳定，耐酸碱、耐热，不溶于水或有机溶剂、容易再生，是一种环境友好型吸附剂。核桃壳是一种资源丰富的农业废弃物，利用其制备出活性炭，并通过改性实现对活性炭结构和功能的调节，从而制备出固定化酶载体。
发明内容
本发明的目的在于提供一种以改性核桃壳为载体的固定化脂肪酶制备方法，本方法不仅操作成本低，而且制得的固定化脂肪酶具有较高催化活力以及酶活力回收率。
为了达成上述目的，本发明通过下述技术方案得以解决：
（1）核桃壳活性炭的制备：将核桃壳粉碎，按固液比为1:2-5的比例向核桃壳中加入质量百分比浓度为20-60%的活性剂，在40-60℃的条件下浸渍20-30h，然后将浸渍后的核桃壳置于马弗炉中，先在300-400℃的条件炭化60-120min，然后在500-700℃的条件下活化30-90min，取出用盐酸溶液清洗2-3次并用去离子水洗涤至中性，即得核桃壳活性炭，烘干备用；
（2）核桃壳活性炭的硅烷化处理：按每克核桃壳活性炭添加3-4ml环己烷和0.02-0.04 mL硅烷化试剂的比例，在核桃壳活性炭中加入环己烷和硅烷化试剂，充分混匀后，在温度为50-70℃条件下振荡1-2h，待反应结束后，过滤，滤渣用环己烷洗涤，烘干，粉碎分筛至20-120目，即得改性核桃壳；
（3）脂肪酶的固定化：按给酶量为5-25mg/g的比例（（即每克改性核桃壳给酶量为5-25mg））向脂肪酶溶液中加入20-120目改性核桃壳，密封，在20-40℃下振荡固定1-5h后，抽滤，滤渣用缓冲液洗涤直至没有蛋白洗脱下来，然后冷冻干燥，即得到固定化脂肪酶。
本发明步骤（1）中所述活性剂为磷酸或者氯化锌。
本发明步骤（1）中所述盐酸浓度为1-3mol/L。
本发明步骤（2）中所述硅烷化试剂为三甲基氯硅烷、甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷、3-氨丙基三乙氧基硅烷中的一种。
本发明步骤（3）中所述脂肪酶溶液为脂肪酶和pH值为4-8的缓冲液混合制得的溶液，其中缓冲液是浓度为0.02-0.05mol/L的磷酸盐缓冲溶液或醋酸盐缓冲溶液。缓冲液按常规方法配制，磷酸盐缓冲溶液由磷酸氢二钠溶液和磷酸二氢钠溶液配制而成，醋酸盐缓冲溶液由醋酸溶液和醋酸钠溶液配制而成。
本发明中固定化脂肪酶的评价方法如下：
1、脂肪酶活力测定采用橄榄油乳化法。向锥形瓶中加入4ml橄榄油乳化液和5ml磷酸缓冲液，40℃水浴中预热5min，并设立空白组；加入固定化脂肪酶，混匀，40℃水浴震荡15min；反应结束后，各锥形瓶中加入15ml的95％乙醇终止反应。待测样品加入酚酞指示剂后，用0.05mol/L氢氧化钠标准溶液准确滴定至粉红色；由滴定消耗氢氧化钠的量计算出游离酶及固定化酶的酶活。
以在pH为7的缓冲液、温度为40℃的条件下，1min水解产生1μmol脂肪酸所需的酶量定义为一个活力单位(U)，酶活力的计算公式如下：
式中：c--标准NaOH溶液浓度(mol/L)；
?V--样品和空白样样品消耗标准NaOH溶液的体积差(mL)；
t--反应时间(h)；
m--酶的用量(g)。
2、固定化酶酶活回收率的计算公式如下：
本发明具有的优点和技术效果：
（1）酶活回收率高
通过核桃壳制备出的活性炭是一种具有高度发达的孔隙结构和极大比表面积的吸附剂，而且炭表面上含有（或可以附加上）多种官能团，经过改性剂修饰后形成的疏水性表面进一步增强了脂肪酶与载体的结合，从而有效防止了酶泄露，提升了酶活回收率；
（2）本发明制得的活性炭晶体颗粒具有良好的机械强度和稳定性，可用于酶固定化反应器的设计，制备的固定化酶适合于工业上大规模生产；
（3）所用的核桃壳在我国分布广泛，且廉价易得，有利于降低固定化脂肪酶的生产成本。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步的详细说明，但本发明保护范围并不局限于此。
实施例1：以改性核桃壳为载体的固定化脂肪酶的制备方法，方法如下：
（1）核桃壳活性炭的制备：取20g粉碎核桃壳，向其中加入50ml 质量百分比浓度为60%的磷酸，在60℃的条件下浸渍24h，然后将浸渍后的核桃壳置于马弗炉中，先在300℃的条件炭化60min，然后在600℃的条件下活化60min，取出核桃壳用1mol/L盐酸溶液清洗3次后再用去离子水洗涤至中性，110℃烘干备用，即得核桃壳活性炭；
（2）核桃壳活性炭的硅烷化处理：取10g核桃壳活性炭，向其中加入30ml环己烷和0.3 mL三甲基氯硅烷，充分混匀后，在温度为60℃条件下振荡反应1.5h，待反应结束后，过滤，滤渣用环己烷洗涤，110℃烘干，粉碎分晒至100目，即得改性核桃壳；
（3）脂肪酶的固定化：将25mg脂肪酶溶于20ml pH值为5、浓度为0.05mol/L的醋酸盐缓冲液中，然后向脂肪酶液中加入1g 100目的改性核桃壳，密封，在25℃下振荡固定2h后，抽滤，滤渣用醋酸盐缓冲液洗涤直至没有蛋白洗脱下来，然后冷冻干燥，即得到固定化脂肪酶。
采用橄榄油乳化法测定酶活力为877.5U/g，制得的固定化酶的酶活力回收率为78%。
实施例2：以改性核桃壳为载体的固定化脂肪酶的制备方法，方法如下：
（1）核桃壳活性炭的制备：取20g粉碎核桃壳，向其中加入40ml质量百分比浓度为40%的磷酸，在50℃的条件下浸渍30h，然后将浸渍后的核桃壳置于马弗炉中，先在350℃的条件炭化80min，然后在700℃的条件下活化90min，取出用2mol/L盐酸溶液清洗3次并用去离子水洗涤至中性，即得核桃壳活性炭，110℃烘干备用；
（2）核桃壳活性炭的硅烷化处理：取10g核桃壳活性炭，向其中加入30ml环己烷和0.2mL甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷，充分混匀后，在温度为50℃条件下振荡反应2h，待反应结束后，过滤，滤渣用环己烷洗涤，110℃烘干，粉碎分晒至20目，即得改性核桃壳；
（3）脂肪酶的固定化：将25mg脂肪酶溶于200ml pH值为7、浓度为0.03mol/L的磷酸盐缓冲液中，然后向酶液中加入5g 20目的改性核桃壳，密封，在25℃下振荡固定4h后，抽滤，滤渣用磷酸盐缓冲液洗涤直至没有蛋白洗脱下来，然后冷冻干燥，即得到固定化脂肪酶。
采用橄榄油乳化法测定酶活力为184.5U/g，制得的固定化酶的酶活力回收率为82%。
实施例3：以改性核桃壳为载体的固定化脂肪酶的制备方法，方法如下：
（1）核桃壳活性炭的制备：取20g粉碎核桃壳，向其中加入60ml 质量百分比浓度为40%的氯化锌，在60℃的条件下浸渍20h，然后将浸渍后的核桃壳置于马弗炉中，先在400℃的条件炭化60min，然后在700℃的条件下活化30min，取出用2mol/L盐酸溶液清洗3次并用去离子水洗涤至中性，即得核桃壳活性炭，110℃烘干备用；
（2）核桃壳活性炭的硅烷化处理：取10g核桃壳活性炭，向其中加入30ml环己烷和0.25mL甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷，充分混匀后，在温度为70℃条件下振荡反应1.5h，待反应结束后，过滤，滤渣用环己烷洗涤，110℃烘干，粉碎分晒筛至100目；
（3）脂肪酶的固定化：将200mg脂肪酶溶于200ml pH值为4、浓度为0.02mol/L的醋酸盐缓冲液中，然后向酶液中加入10g 100目的改性核桃壳，密封，在25℃下振荡固定5h后，抽滤，滤渣用醋酸盐缓冲液洗涤直至没有蛋白洗脱下来，然后冷冻干燥，即得到固定化脂肪酶。
采用橄榄油乳化法测定酶活力为639U/g，制得的固定化酶的酶活力回收率为71%。
实施例4：以改性核桃壳为载体的固定化脂肪酶的制备方法，方法如下：
（1）核桃壳活性炭的制备：取20g粉碎核桃壳，向其中加入50ml 质量百分比浓度为20%的磷酸，在40℃的条件下浸渍30h，然后将浸渍后的核桃壳置于马弗炉中，先在350℃的条件炭化60min，然后在600℃的条件下活化60min，取出用3mol/L盐酸溶液清洗2次后再用去离子水洗涤至中性，即得核桃壳活性炭，110℃烘干备用；
（2）核桃壳活性炭的硅烷化处理：取10g核桃壳活性炭，向其中加入35ml环己烷和0.4 mL甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷，充分混匀后，在温度为50℃条件下振荡反应1h，待反应结束后，过滤，滤渣用环己烷洗涤，110℃烘干，粉碎分晒至120目，即得改性核桃壳；
（3）脂肪酶的固定化：将375mg脂肪酶溶于200ml pH值为8、浓度为0.02mol/L的磷酸盐缓冲液中，然后向酶液中加入15g 120目的改性核桃壳，密封，在40℃下振荡固定1h后，抽滤，滤渣用磷酸盐缓冲液洗涤直至没有蛋白洗脱下来，然后冷冻干燥，即得到固定化脂肪酶。
采用橄榄油乳化法测定酶活力为776.3U/g，制得的固定化酶的酶活力回收率为69%。
实施例5：以改性核桃壳为载体的固定化脂肪酶的制备方法，方法如下：
（1）核桃壳活性炭的制备：取20g粉碎核桃壳，向其中加入100ml 质量百分比浓度为30%的氯化锌，在45℃的条件下浸渍30h，然后将浸渍后的核桃壳置于马弗炉中，先在300℃的条件炭化120min，然后在500℃的条件下活化80min，取出用2mol/L盐酸溶液清洗3次并用去离子水洗涤至中性，即得核桃壳活性炭，110℃烘干备用；
（2）核桃壳活性炭的硅烷化处理：取10g核桃壳活性炭，向其中加入35ml环己烷和0.2 mL 3-氨丙基三乙氧基硅烷，充分混匀后，在温度为65℃条件下振荡反应2h，待反应结束后，过滤，滤渣用环己烷洗涤，110℃烘干，粉碎分晒至60目，即得改性核桃壳；
（3）脂肪酶的固定化：将200mg脂肪酶溶于200ml pH值为7、浓度为0.03mol/L的磷酸盐缓冲液中，然后向酶液中加入10g 60目的改性核桃壳，密封，在30℃下振荡固定3h后，抽滤，滤渣用磷酸盐缓冲液洗涤直至没有蛋白洗脱下来，然后冷冻干燥，即得到固定化脂肪酶。
采用橄榄油乳化法测定酶活力为603U/g，制得的固定化酶的酶活力回收率为67%。
实施例6：以改性核桃壳为载体的固定化脂肪酶的制备方法，方法如下：
（1）核桃壳活性炭的制备：取20g粉碎核桃壳，向其中加入80ml质量百分比浓度为50%的磷酸，在55℃的条件下浸渍22h，然后将浸渍后的核桃壳置于马弗炉中，先在300℃的条件炭化100min，然后在650℃的条件下活化70min，取出用2.5mol/L盐酸溶液清洗3次后再用去离子水洗涤至中性，即得核桃壳活性炭，110℃烘干备用；
（2）核桃壳活性炭的硅烷化处理：取10g核桃壳活性炭，向其中加入40ml环己烷和0.35mL三甲基氯硅烷，充分混匀后，在温度为55℃条件下振荡反应2h，待反应结束后，过滤，滤渣用环己烷洗涤，110℃烘干，粉碎分晒至100目，即得改性核桃壳；
（3）脂肪酶的固定化：将50mg脂肪酶溶于200ml pH值为6、浓度为0.04mol/L的磷酸盐缓冲液中，然后向酶液中加入5g 100目的改性核桃壳，密封，在20℃下振荡固定4h后，抽滤，滤渣用磷酸盐缓冲液洗涤直至没有蛋白洗脱下来，然后冷冻干燥，即得到固定化脂肪酶。
采用橄榄油乳化法测定酶活力为337.5U/g，制得的固定化酶的酶活力回收率为75%。
Claims (1)
1.以改性核桃壳为载体的固定化脂肪酶的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）核桃壳活性炭的制备：将核桃壳粉碎，按固液比为1:2-5的比例向核桃壳中加入质量百分比浓度为20-60%的活性剂，在40-60℃的条件下浸渍20-30h，然后将浸渍后的核桃壳置于马弗炉中，先在300-400℃的条件炭化60-120min，然后在500-700℃的条件下活化30-90min，取出核桃壳用盐酸溶液清洗2-3次后再用去离子水洗涤至中性，即得核桃壳活性炭，烘干备用；
（2）核桃壳活性炭的硅烷化处理：按每克核桃壳活性炭添加3-4ml环己烷和0.02-0.04 mL硅烷化试剂的比例，在核桃壳活性炭中加入环己烷和硅烷化试剂，充分混匀后，在温度为50-70℃条件下振荡1-2h，待反应结束后，过滤，滤渣用环己烷洗涤，烘干，粉碎分筛至20-120目，即得改性核桃壳；
（3）脂肪酶的固定化：按给酶量为5-25mg/g的比例向脂肪酶溶液中加入20-120目改性核桃壳，密封，在20-40℃下振荡固定1-5h后，抽滤，滤渣用缓冲液洗涤直至没有蛋白洗脱下来，然后冷冻干燥，即得到固定化脂肪酶；
其中所述硅烷化试剂为三甲基氯硅烷、甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷、3-氨丙基三乙氧基硅烷中的一种；
所述活性剂为磷酸或者氯化锌；
所述盐酸浓度为1-3mol/L；
所述脂肪酶溶液为脂肪酶和pH值为4-8的缓冲液混合制得的溶液，其中缓冲液是浓度为0.02-0.05mol/L的磷酸盐缓冲溶液或醋酸盐缓冲溶液。
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