CN109321510B - 独脚金内酯在促进单针藻油脂积累中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开独脚金内酯在促进单针藻油脂积累中的应用,通过两阶段培养单针藻,实现了单针藻的快速高密度生长和高品质培养,将独脚金内酯母液添加到诱导藻液中,并将培养基置于光照下培养,提取油脂制备得到生物柴油;本发明添加外源独脚金内酯可有效促进异养单针藻细胞中油脂的积累;本发明简单易行、能大幅提高油脂含量,从而提高了单针藻生产生物柴油的效率。
Description
技术领域
本发明属于生物工程领域,具体涉及独脚金内酯在促进单针藻油脂积累中的应用。
背景技术
近年来,由于化石燃料的广泛应用,导致化石燃料的枯竭,生物柴油作为化石燃料的替代燃料,已成为国际上发展最快、应用最广的环保可再生能源。生物柴油又称为生质柴油,是用未加工过的或者使用过的植物油以及微生物油脂、动物油脂、废餐饮油等为原料通过酯交换或热化学工艺制备出来的一种被认为是环保的生物质燃料。与常规石油相比较具有环保、可再生、可降解、稳定性好,十六烷值高、容易保存、安全性能高等优点。
微藻是一种自养型光合作用生物,利用光合作用的方式将二氧化碳固定在细胞内,并和各类色素吸收的光能结合转化成生活所需的能量。微藻将能量固定在细胞内,供细胞活动,多余的能量以油脂等方式存储下来,含量是别的生物所不能比的。一些微藻因为易于培养,含油量高,单位面积产量大等优点而被称为新一代能够实现代替石化柴油的生物柴油原料。微藻具有生长周期短、光合利用率高、生长速度快、对生长环境要求低及储能物质(油脂、烃)含量高等优点已被广泛研究。但是因为现有技术的限制,导致微藻的油脂产率较低。
提高微藻油脂产率的方法有很多,通过超声的方法使微藻的油脂含量达到37.83%;在氮限制磷过量的情况下异养培养小球藻将其油脂含量提高到42.32%。独脚金内酯(Strigolactones,SLs)是一类倍半萜烯类化合物,它能响应土壤养分亏缺状况,从植物根系分泌并刺激了寄生植物种子发芽和丛枝菌根真菌菌丝的分枝,研究发现SLs还可以沿茎干向上运输,与生长素和细胞分裂素一起直接或间接抑制植物分枝,作为一种次生信号物质向地上部传输到芽,从而抑制芽的生长;SLs能与乙烯信号互作调控植物根毛延长及叶片衰老;SLs参与糖代谢的调节,与植物的光合作用相关,SLs是一种可调控植物株型发育的新型植物激素,主要在植物中应用,在微藻中的应用基本上没有。
发明内容
本发明的目的在于提供独脚金内酯在促进单针藻油脂积累中的应用,利用异养BG-11培养基培养单针藻,利用自养的BG-11培养单针藻油脂积累,加入独脚金内酯促进单针藻油脂含量和生物量的增加,该方法过程简单,具体包括以下步骤:
(1)以BG-11培养基作为基础培养基,葡萄糖作为碳源,按照8-11g/L添加到BG-11培养基中,23-26℃下异养培养单针藻,待单针藻生长至对数生长期后期收集单针藻细胞;
(2)制备诱导的培养基:以BG-11培养基作为产油单针藻的基础培养基,调节pH值至6.8-7.0,121℃、0.1MPa下灭菌20min;
(3)产油单针藻诱导:将步骤(1)收集到的单针藻细胞接入到步骤(2)灭菌后的培养基中,单针藻细胞浓度为0.7-1g/L,再加入用丙酮配制的独脚金内酯SLs母液,使最终加入培养基中的独脚金内酯SLs浓度为0.2-5μmol/L,置于光照下培养;
(4)制备生物柴油:将步骤(3)中的单针藻富集,提取油脂,制备得到生物柴油。
步骤(1)单针藻为Monoraphidiumsp. QLY-1。
步骤(3)调节pH值采用的是浓度为1mol/L的氢氧化钠溶液或浓度为1mol/L的盐酸。
步骤(3)培养条件为:温度为24-26℃,光照强度为3500-4500lux,摇床转速为140-160r/min。
步骤(4)制备生物柴油的具体步骤为:将培养液离心富集,离心条件为3500r/min转速条件下离心10min,并以蒸馏水反复洗涤2次后冻干得到干藻粉,加入干藻粉质量2倍的石英砂混合研磨30min,然后加入氯仿和甲醇体积比为2:1的氯仿-甲醇的混合溶液进行油脂提取,重复提取3次后收集有机相进行浓缩,提取得到的油脂加入质量分数为98%的硫酸和甲醇按照体积比3:97混合的硫酸-甲醇混合液进行甲酯化,制备得到生物柴油。
本发明的有益效果是:
(1)本发明操作简单易行,通过两阶段培养单针藻的方法,既实现了单针藻的快速高密度生长,又实现了单针藻的高品质培养。
(2)本发明独脚金内酯SLs可有效促进异养单针藻细胞中油脂的积累。
附图说明
图1为本发明对照组1和实施例1-3不同诱导天数以及不同浓度独脚金内酯条件下油脂含量柱形图和生物量折线图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步详细说明,但本发明的保护范围并不限于所述内容。
对照例1
单针藻油脂积累具体包括以下步骤:
(1)以BG-11培养基作为基础培养基,葡萄糖作为碳源,按照10g/L添加到BG-11培养基中,25℃恒温条件下异养培养单针藻,单针藻的藻种为Monoraphidiumsp. QLY-1,待单针藻生长至对数生长期后期收集单针藻细胞;
(2)制备诱导的培养基:以BG-11培养基作为产油单针藻的基础培养基,采用1mol/L的氢氧化钠溶液调整pH值至7,121℃、0.1MPa下灭菌20min;
(3)产油单针藻诱导:将步骤(1)收集到的单针藻细胞接入到步骤(2)灭菌后的培养基中,单针藻细胞浓度为0.7g/L,置于光照下培养,培养条件为:光照培养温度为24℃,光照强度为3500lux,摇床转速为140r/min;
(4)制备生物柴油:将培养液中的单针藻富集,提取油脂,制备得到生物柴油,具体步骤为:将培养液离心富集,离心条件为3500r/min转速条件下离心10min,并以蒸馏水反复洗涤2次后冻干得到干藻粉,加入干藻粉质量2倍的石英砂混合研磨30min,然后加入氯仿和甲醇体积比为2:1的氯仿-甲醇的混合溶液进行油脂提取,重复提取3次后收集有机相进行浓缩,提取得到的油脂加入质量分数为98%的硫酸和甲醇按照体积比3:97混合的硫酸-甲醇混合液进行甲酯化,制备得到生物柴油。
本实施例通过两阶段培养单针藻的方法,既实现了单针藻的快速高密度生长,又实现了单针藻的高品质培养。对照组诱导第一天生物量达到0.77g/L,油脂含量可达到30.35%;诱导第三天生物量达到0.80g/L,油脂含量可达到38.12%;诱导第五天生物量达到0.87g/L,油脂含量可达到36.98%;诱导第七天生物量达到0.95/L,油脂含量可达到30.35%。
实施例1
独脚金内酯在促进单针藻油脂积累中的应用,应用方法具体包括以下步骤:
(1)以BG-11培养基作为基础培养基,葡萄糖作为碳源,按照10g/L添加到BG-11培养基中,25℃恒温条件下异养培养单针藻,单针藻的藻种为Monoraphidiumsp. QLY-1,待单针藻生长至对数生长期后期收集单针藻细胞;
(2)制备诱导的培养基:以BG-11培养基作为产油单针藻的基础培养基,采用1mol/L的氢氧化钠溶液调整pH值至7,121℃、0.1MPa下灭菌20min;
(3)产油单针藻诱导:将步骤(1)收集到的单针藻细胞接入到步骤(2)灭菌后的培养基中,单针藻细胞浓度为0.7g/L,然后加入用丙酮配制的独脚金内酯SLs母液,其中独脚金内酯SLs母液浓度为1mmol/L,接入培养基中的最终独脚金内酯SLs浓度为0.2μmol/L,置于光照下培养,培养条件为:光照培养温度为24℃,光照强度为3500lux,摇床转速为140r/min;
(4)制备生物柴油:将培养液中的单针藻富集,提取油脂,制备得到生物柴油,具体步骤为:将培养液离心富集,离心条件为3500r/min转速条件下离心10min,并以蒸馏水反复洗涤2次后冻干得到干藻粉,加入干藻粉质量2倍的石英砂混合研磨30min,然后加入氯仿和甲醇体积比为2:1的氯仿-甲醇的混合溶液进行油脂提取,重复提取3次后收集有机相进行浓缩,提取得到的油脂加入质量分数为98%的硫酸和甲醇按照体积比3:97混合的硫酸-甲醇混合液进行甲酯化,制备得到生物柴油。
本实施例通过两阶段培养单针藻的方法,既实现了单针藻的快速高密度生长,又实现了单针藻的高品质培养。当独脚金内酯SLs浓度为0.2μmol/L时,诱导第一天生物量达到0.74g/L,油脂含量可达到37.96%;诱导第三天生物量达到0.77g/L,油脂含量可达到36.49%;诱导第五天生物量达到0.79g/L,油脂含量可达到37.20%;诱导第七天生物量达到0.89/L,油脂含量可达到35.75%。
实施例2
独脚金内酯在促进单针藻油脂积累中的应用,应用方法具体包括以下步骤
(1)以BG-11培养基作为基础培养基,葡萄糖作为碳源,按照8g/L添加到BG-11培养基中,23℃恒温条件下异养培养单针藻,单针藻的藻种为Monoraphidiumsp. QLY-1,待单针藻生长至对数生长期后期收集单针藻细胞;
(2)制备诱导的培养基:以BG-11培养基作为产油单针藻的基础培养基,采用1mol/L的盐酸调整pH值至6.8,121℃、0.1MPa下灭菌20min;
(3)产油单针藻诱导:将步骤(1)收集到的单针藻细胞接入到步骤(2)灭菌后的培养基中,单针藻细胞浓度为0.7g/L,然后加入用丙酮配制的独脚金内酯SLs母液,其中独脚金内酯SLs母液浓度为1mmol/L,接入培养基中的最终独脚金内酯SLs浓度为1μmol/L,置于光照下培养,培养条件为:光照培养温度为25℃,光照强度为4000lux,摇床转速为150r/min;
(4)制备生物柴油:将培养液中的单针藻富集,提取油脂,制备得到生物柴油,具体步骤为:将培养液离心富集,离心条件为3500r/min转速条件下离心10min,并以蒸馏水反复洗涤2次后冻干得到干藻粉,加入干藻粉质量2倍的石英砂混合研磨30min,然后加入氯仿和甲醇体积比为2:1的氯仿-甲醇的混合溶液进行油脂提取,重复提取3次后收集有机相进行浓缩,提取得到的油脂加入质量分数为98%的硫酸和甲醇按照体积比3:97混合的硫酸-甲醇混合液进行甲酯化,制备得到生物柴油。
本实施例通过两阶段培养单针藻的方法,既实现了单针藻的快速高密度生长,又实现了单针藻的高品质培养。当独脚金内酯SLs浓度为1μmol/L时,诱导第一天生物量达到0.76g/L,油脂含量可达到48.76%;诱导第三天生物量达到0.78g/L,油脂含量可达到46.49%;诱导第五天生物量达到0.84g/L,油脂含量可达到38.36%;诱导第七天生物量达到0.91/L,油脂含量可达到38.54%。
实施例3
独脚金内酯在促进单针藻油脂积累中的应用,应用方法具体包括以下步骤
(1)以BG-11培养基作为基础培养基,葡萄糖作为碳源,按照11g/L添加到BG-11培养基中,26℃恒温条件下异养培养单针藻,单针藻的藻种为Monoraphidiumsp. QLY-1,待单针藻生长至对数生长期后期收集单针藻细胞;
(2)制备诱导的培养基:以BG-11培养基作为产油单针藻的基础培养基,采用1mol/L的盐酸调整pH值至6.9,121℃、0.1MPa下灭菌20min;
(3)产油单针藻诱导:将步骤(1)收集到的单针藻细胞接入到步骤(2)灭菌后的培养基中,单针藻细胞浓度为0.7g/L,然后加入用丙酮配制的独脚金内酯SLs母液,其中独脚金内酯SLs母液浓度为1mmol/L,接入培养基中的最终独脚金内酯SLs浓度为5μmol/L,置于光照下培养,培养条件为:光照培养温度为26℃,光照强度为4500lux,摇床转速为160r/min,;
(4)制备生物柴油:将培养液中的单针藻富集,提取油脂,制备得到生物柴油,具体步骤为:将培养液离心富集,离心条件为3500r/min转速条件下离心10min,并以蒸馏水反复洗涤2次后冻干得到干藻粉,加入干藻粉质量2倍的石英砂混合研磨30min,然后加入氯仿和甲醇体积比为2:1的氯仿-甲醇的混合溶液进行油脂提取,重复提取3次后收集有机相进行浓缩,提取得到的油脂加入质量分数为98%的硫酸和甲醇按照体积比3:97混合的硫酸-甲醇混合液进行甲酯化,制备得到生物柴油。
本实施例通过两阶段培养单针藻的方法,既实现了单针藻的快速高密度生长,又实现了单针藻的高品质培养。当独脚金内酯SLs浓度为5μmol/L时,诱导第一天生物量达到0.76g/L,油脂含量可达到40.07%;诱导第三天生物量达到0.77g/L,油脂含量可达到37.23%;诱导第五天生物量达到0.84g/L,油脂含量可达到37.33%;诱导第七天生物量达到0.89/L,油脂含量可达到36.06%。
图1为对照组1和实施例1、2、3不同诱导天数以及不同浓度独脚金内酯条件下油脂含量图和生物量图;从图中可以看出利用光自养添加诱导子诱导异养后的单针藻细胞可积累油脂,独脚金内酯SLs的添加可有效促进异养单针藻细胞中油脂的积累,实施例1、2、3中不同浓度独脚金内酯SLs之间对生物量没有明显差异,第一天和第三天时,当SLs浓度为1μmol/L时,藻细胞中油脂含量比对照组分别提高了27.92%和21.96%,达到了48.76%和46.49%。
当步骤(3)中单针藻细胞的接种浓度在0.7-1g/L之间改变时,按照实施例3进行实验,结论:利用光自养添加诱导子诱导异养后的单针藻细胞可积累油脂,独脚金内酯SLs的添加可有效促进异养单针藻细胞中油脂的积累。
Claims (3)
1.独脚金内酯在促进单针藻油脂积累中的应用,其特征在于,具体包括以下步骤:
(1)以BG-11培养基作为基础培养基,葡萄糖作为碳源,按照8-11g/L添加到BG-11培养基中,23-26℃下异养培养单针藻,待单针藻生长至对数生长期后期收集单针藻细胞;其中单针藻为Monoraphidium sp. QLY-1;
(2)制备诱导的基础培养基:以BG-11培养基作为产油单针藻的基础培养基,调节pH值至6.8-7.0,121℃、0.1MPa下灭菌20min;
(3)产油单针藻诱导:将步骤(1)收集到的单针藻细胞接入到步骤(2)灭菌后的培养基中,单针藻细胞浓度为0.7-1g/L,再加入用丙酮配制的独脚金内酯母液,使最终加入培养基中的独脚金内酯浓度为0.2-5μmol/L,置于光照下培养;其中培养条件为:温度为24-26℃,光照强度为3500-4500lux,摇床转速为140-160r/min;
(4)制备生物柴油:将步骤(3)中的单针藻富集,提取油脂,制备得到生物柴油。
2.根据权利要求1所述独脚金内酯在促进单针藻油脂积累中的应用,其特征在于,步骤(3)调节pH值采用的是浓度为1mol/L的氢氧化钠溶液或浓度为1mol/L的盐酸。
3.根据权利要求1所述独脚金内酯在促进单针藻油脂积累中的应用,其特征在于,步骤(4)制备生物柴油的具体步骤为:将培养液离心富集,离心条件为3500r/min转速条件下离心10min,并以蒸馏水反复洗涤2次后冻干得到干藻粉,加入干藻粉质量2倍的石英砂混合研磨30min,然后加入氯仿和甲醇体积比为2:1的氯仿-甲醇的混合溶液进行油脂提取,重复提取3次后收集有机相进行浓缩,提取得到的油脂加入质量分数为98%的硫酸和甲醇按照体积比3:97混合的硫酸-甲醇混合液进行甲酯化,制备得到生物柴油。
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