CN104531665A - 一种功能化活性凹凸棒土固定酶催化剂的制备方法 - Google Patents

Abstract

一种功能化活性凹凸棒土固定酶催化剂的制备方法，通过选取高比表面积多孔天然材料凹凸棒土作为载体，对凹凸棒土表面进行活性修饰，在载体表面引入能够与酶发生特异性共价反应的功能化活性基团，并在温和条件下实现与酶的键合固定，并通过协同催化效应，提高酶的活性和反应转化率，并提高其稳定性。此制备技术可以应用于脂肪酸酯类酶催化合成生产，其转化率高，后处理简单，可重复利用，环保无污染，生产成本降低，应有较好的应用前景。

Description

一种功能化活性凹凸棒土固定酶催化剂的制备方法

技术领域

一种功能化活性凹凸棒土固定酶催化剂的制备方法，属于酶生物催化有机合成领域。

背景技术

当前，脂肪酸酯类食用香精如己酸乙酯等大多以化学法合成为主，即通过强酸性物质如硫酸催化酯化制备得到，一方面，该合成技术使用有机溶剂、强酸催化剂等有毒物质，在产品中有有害残留成分存在；其次，该技术还存在着副反应多、醇消耗量大、产品色泽深、能耗高、设备腐蚀严重、环境污染等缺点，在当今食品安全及环境保护日趋严格的形势下，亟待寻求绿色合成技术。作为一种新兴的生物酶法催化酯化制备技术，因其具有反应条件温和、催化高效专一、醇用量小、产物易分离、对环境友好等优点而得到广泛重视，被认为是取代化学法生产脂肪酸酯的绿色工艺，具有广阔的工业化应用前景。而与此同时，生物酶也存在价格高、易失活、游离酶在反应过程中容易结块、不易回收、重复使用率低等缺点。为此，当前研究多采用各种不同的技术手段将生物酶固定在某种载体上，以维持更高的酶活性，提高酶的稳定性和重复使用率。目前，常用的固定化方法主要有包埋法、吸附法、共价结合法和化学交联法。其中包埋法、吸附法存在着酶易脱落、酶活性低、重复使用率低等问题，而化学交联法则通常反应条件苛刻，反应比较剧烈，酶分子的活性位点容易遭到破坏，固定化酶活性降低。所谓共价结合法，是指利用载体表面的活性基团与酶分子的功能活性基团形成共价键牢固连接，以使酶固定化的一种方法。该技术已经成为当前国内外的研究热点，其具有挑战性的技术途径是需要寻找尽可能温和的共价键合反应物，在反应时避免酶的失活，另外需要寻找适宜的负载材料，尽可能提高负载率和催化活性。凹凸棒土在我国蕴藏量十分丰富，价廉易得，它为一种晶质水合镁铝硅酸盐矿物，具有独特的层链状结构特征，晶体呈针状、纤维状或纤维集合状，具有很好的吸附、脱色能力和耐高温、抗盐碱等性能，并具有独特的分散性、不易沉淀结块的胶体性状。凹凸棒土内部有多种孔道，其外比表面积和内比表面积都非常大，具有优异的吸附性和催化性能，可用作催化剂的载体、烯烃聚合的催化剂等，其催化性能表现为，当某种反应物质寄附于凹凸棒土晶体内部的大孔穴表面上时，可以产生协同催化效应，其反应速度得到加快，且反应生成物又可以从坡缕石粘土内部扩散释放出来，而凹凸棒土晶体格架不被破坏。本发明选择凹凸棒土作为酶固定载体，通过协同催化作用，提升酶催化效能，对拓展酶催化酯化技术应用及开发凹凸棒土功能材料市场有重要意义。

发明内容

本发明运用共价结合法固定脂肪酶技术，通过选取高比表面积多孔天然材料凹凸棒土作为载体，对凹凸棒土表面进行活性修饰，即在载体表面引入能够与酶发生特异性共价反应的功能化活性基团，并在温和条件下实现与酶的键合固定，并通过协同催化效应，提高酶的活性和反应转化率，并提高其稳定性。此制备技术可以应用于脂肪酸酯类酶催化合成生产，其转化率高，后处理简单，可重复利用，环保无污染，生产成本降低，应有较好的应用前景。

本发明的技术方案：一种功能化活性凹凸棒土固定酶催化剂的制备方法，具体步骤为：

1)功能化活性凹凸棒土的制备

a.酸活化凹凸棒土的制备

步骤：将1份质量的凹凸棒土加至15-20份2-6mol/L盐酸或硫酸溶液中，于30-60℃搅拌20min-1h，超声分散15min-30min，静置；离心沉淀分离后用去离子水洗，至洗液pH值为中性；将酸改性后的凹凸棒土在200-300℃下，加热45min-1h，冷却，即制得酸活化凹凸棒土，密闭干燥保存，备用。

b.功能化活性凹凸棒土的制备

步骤：将上述所得酸活化凹凸棒土加至pH为2的盐酸溶液中，于30-50℃搅拌20min-30min，超声分散20min-30min；再将上述分散液加到过量的2-(3,4-二羟基苯基)乙胺水溶液中，剧烈搅拌0.5-1h，使2-(3,4-二羟基苯基)乙胺与酸活化凹凸棒土表面充分螯合；将试液离心分离，所得固体用去离子水反复洗涤，直至洗涤液pH呈中性；再在80-90℃下真空干燥24h，得到表面活性基团修饰的功能化活性凹凸棒土(记为A1)。

2)功能化活性凹凸棒土固定酶催化剂的制备

步骤：将上述300mg A1加入到100mL Tris-HCl缓冲液(50mmol/L，pH 7.0)中，超声分散15min-20min后，向上述溶液中加入15mL 50％的戊二醛溶液，室温下搅拌，活化2-3h后，离心分离，所得固体产物用去离子水洗涤；再将上述产物加到含300mg脂肪酶的200mL Tris-HCl缓冲液(0.05mol/L，pH 7.0)中，在4℃下反应12-24h后，离心分离，洗涤，得到固定化酶催化剂颗粒，冷冻干燥后储存于-20℃下备用，记为B1。

本发明的有益效果：通过应用本发明制备所得的功能化活性凹凸棒土固定酶催化剂可用于脂肪酸酯的催化合成，具有反应条件温和、转化率高、醇用量小、产物易分离、绿色环保等特点；该方法适于多种酶的固定化，所制得的固定化脂肪酶催化剂不易失活，不易脱落，反应转化率高，重复使用率高，降低了生产成本，特别适于食用香精类脂肪酸酯的合成，有较好的应用前景。

具体实施方式

实施例1：

1)功能化活性凹凸棒土的制备

a.酸活化凹凸棒土的制备

步骤：将10g质量的凹凸棒土加至200g 5mol/L盐酸溶液中，于40℃搅拌45min，超声分散30min，静置；离心沉淀分离后用去离子水洗，至洗液pH值为中性；将酸改性后的凹凸棒土在250℃下，加热1h；冷却，即制得酸活化凹凸棒土，密闭干燥保存，备用。

b.功能化活性凹凸棒土的制备

步骤：将2g上述所得酸活化凹凸棒土加至pH为2的50mL盐酸溶液中，于50℃搅拌30min，超声分散30min；再将上述分散液加到50mL 5％2-(3,4-二羟基苯基)乙胺水溶液中，剧烈搅拌1h，使2-(3,4-二羟基苯基)乙胺与酸活化凹凸棒土表面充分螯合；将试液离心分离，所得固体用去离子水反复洗涤，直至洗涤液pH呈中性；再在90℃下真空干燥24h，得到表面活性基团修饰的功能化活性凹凸棒土(记为A2)。

2)功能化活性凹凸棒土固定酶催化剂的制备

步骤：将上述300mg A2加入到100mL Tris-HCl缓冲液(50mmol/L，pH 7.0)中，超声分散20min后，向上述溶液中加入15mL 50％的戊二醛溶液，室温下搅拌，活化3h后，离心分离，所得固体产物用去离子水洗涤；再将上述产物加到含300mg Pseudomonas c1.脂肪酶(实验室制)的200mL Tris-HCl缓冲液(0.05mol/L，pH 7.0)中，在4℃下反应18h后，离心分离，洗涤，得到固定化酶催化剂颗粒，冷冻干燥后储存于-20℃下备用，记为B2。

应用案例：功能化活性凹凸棒土固定酶催化剂用于催化合成己酸乙酯，合成工艺如下：

在具塞锥形瓶中加入20mL正己烷，加入己酸、无水乙醇溶解，配成0.3mol/L己酸/无水乙醇反应复合物，其中己酸：无水乙醇摩尔比为1：1.3；加入适量(按酶活计)功能化活性凹凸棒土固定酶催化剂(B2)，加入适量水，混合均匀；置于35℃恒温水浴震荡器中反应，一定时间后加入2g分子筛；反应20h后滤去催化剂和分子筛，用0.1mol/LNa₂CO₃溶液洗涤反应液，再用去离子水洗涤，减压蒸馏，脱去溶剂，得己酸乙酯，转化率94％。固定化脂肪酶可重复回用，保持高催化活性。

Claims (1)

1.一种功能化活性凹凸棒土固定酶催化剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)功能化活性凹凸棒土的制备

a.酸活化凹凸棒土的制备

步骤：将1份质量的凹凸棒土加至15-20份2-6mol/L盐酸或硫酸溶液中，于30-60℃搅拌20min-1h，超声分散15min-30min，静置；离心沉淀分离后用去离子水洗，至洗液pH值为中性；将酸改性后的凹凸棒土在200-300℃下，加热45min-1h，冷却，即制得酸活化凹凸棒土，密闭干燥保存，备用。

b.功能化活性凹凸棒土的制备

步骤：将上述所得酸活化凹凸棒土加至pH为2的盐酸溶液中，于30-50℃搅拌20min-30min，超声分散20min-30min；再将上述分散液加到过量的具特殊功能基团的有机胺类水溶液中，剧烈搅拌0.5-1h，使有机胺与酸活化凹凸棒土表面充分螯合；将试液离心分离，所得固体用去离子水反复洗涤，直至洗涤液pH呈中性；再在80-90℃下真空干燥24h，得到表面活性基团修饰的功能化活性凹凸棒土。

2)功能化活性凹凸棒土固定酶催化剂的制备

步骤：将上述功能化活性凹凸棒土加入到一定体积的Tris-HCl缓冲液中，超声分散15min-20min后，向上述溶液中加入配比量的戊二醛溶液，室温下搅拌，活化2-3h后，离心分离，所得固体产物用去离子水洗涤；再将上述产物加到含脂肪酶的Tris-HCl缓冲液中，在4℃下反应12-24h后，离心分离，洗涤，得到功能化活性凹凸棒土固定酶催化剂。