CN106290329A - 一种聚合物的应用以及稳定酶和显色剂的组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及医学检测领域，具体公开了一种聚合物的应用以及稳定酶和显色剂的组合物。本发明所述聚合物具有R1‑R2‑R3的结构通式，R1选自烯属不饱和基团或烯属不饱和单体；R2选自‑COO‑或‑O‑；R3选自聚乙二醇、聚氧丙烯、聚丙二醇、聚丙烯醇等聚合物基团。本发明提供了所述聚合物的应用，其通过与酶和显色指示剂的相互作用增加其稳定性，从而使多种体外检测项目可以在极端环境下(如高温)保持酶和显色指示剂的稳定，使检测结果偏差较小，准确性更高，可与其他组分组成稳定酶和显色剂的组合物，应用于酶催化显色反应中、制备基于酶催化显色反应原理的体外检测产品中以及制备酶和显色指示剂的稳定剂中。

Description

一种聚合物的应用以及稳定酶和显色剂的组合物
技术领域
本发明涉及医学检测领域，具体涉及一种聚合物的应用以及稳定酶和显色剂的组合物。
背景技术
作为目标成分的测定(定性、定量)方法，氧化还原反应是显色反应中最常见的一种类型。而酶催化显色反应是其中应用最广泛的一种，其应用于干化学检测的原理是：将所需反应试剂及所需酶固定在膜载体上，滴加样品后使待测的目标成分生成氧化物质，利用氧化酶催化该氧化物分解，释放出新生态氧，新生态氧与显色剂反应生成显色化合物，通过检测所生成的显色化合物，来间接地测定目标成分。
如上所述，在临床生化检验中，酶催化显色反应十分重要，在心脏病、肝胆疾病、肾脏疾病等的体外诊断中有重要意义。酶具有专一性强，在温和条件下有高效催化化学反应的能力，但酶在一般条件下非常不稳定，尤其是液态或低浓度下易失活，影响酶的生物特性及临床应用。各因素如物理(温度、压力、光等)、化学(氧化还原、离子、pH等)、生物(酶修饰、酶降解等)均有可能使酶丧失生物活性。而且具有氧化还原活性的显色剂往往也非常不稳定，具有在由于添加酶而导致的人为的氧化还原反应及在保存时产生自然显色这样的问题。因此为了得到准确的结果，必须提高生物活性酶及显色剂的稳定性，使显色反应完全。
目前，关于提高酶及显色剂稳定性的方法有较多的研究和报道。
艾桂萍等研制了一种加至酶溶液的保护剂，能使丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、乳糖脱氢酶(LDH)、碱性磷酸酶(ALP)、肌酸激酶(CK)在水溶液或血清基质中的活性在室温下稳定2周，但对干化学试条作用不显著。刘朝辉等研究发现当蔗糖、壳聚糖和山梨醇浓度为2g/L时能显著提高β-甘露聚糖酶的热稳定性且使其最适反应温度从50℃提高至60℃。
CN 103525797A公开了一种液体脂肪酶保护剂及其制备方法和应用，该液体脂肪酶保护剂中的醇类及盐类与脂肪酶相互作用在脂肪酶的表面形成多羟基结构，使脂肪酶的空间结构保持稳定，从而使脂肪酶的酶活保持稳定，经过产品稳定性考察实验验证，该液体脂肪酶保护剂能大大减少液体脂肪酶的酶活损失，大大提高液体脂肪酶使用寿命及应用效果。该方法只对液体脂肪酶有效对其他酶作用不大。
CN 101297025A公开了一种浓缩的液体酶添加剂，其中包括酶和苯基硼酸或其衍生物和表面活性剂，其中酶以多于1.5g/L的量存在。另外，该专利还公开了用于制备浓缩的液体酶添加剂的方法。但是该方法所需酶量较大，成本较高。
CN 103540156A公开了一种显色剂的稳定性方法，该方法采用具有碳原子数8～16的烷基的表面活性剂及类黄酮系色素物质。但该方法配方复杂，并且试剂在市面上难以买到，保护剂本身对测试结果又有一定的干扰。
CN 103740659A本发公开了一种提高酶热稳定性的方法，通过将双亲短肽与重组酶进行融合表达获得热稳定性的提高的重组酶。该方法具有效果显著、工艺简单、便于推广。本发明为快速提高工业酶热稳定性提高了新的方法和思路。
CN201010549775.6采用的稳定剂包括两种。其中，一种显色稳定剂具有比显色剂较强的还原能力，另一种显色稳定剂具有介于显色剂和第一种显色稳定剂之间的还原能力。但其加入的保护剂含有伯氨基常常引起非特异性反应。
CN105295441A采用偶氮染料作为显色剂的稳定剂，不仅起到了良好的稳定作用，而且不会对检测造成干扰。实验表明，述偶氮染料的加入，改善了显色剂的自发显色并且使显色剂保持了更好的显色能力。但是上述方法加入的染料有时与显色剂的最大吸收波长接近，使空白对照偏高。
上述各种现有关于酶或显色剂的保护剂，主要的缺陷集中在成本高、原料不易得，检测结果出现偏差以及仅适用于湿化学中的酶催化显色反应。因此，需要提供一种新的保护剂来提高酶和显色剂的稳定性。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种聚合物的应用以及包含该聚合物的用于稳定酶和显色剂的组合物，使得所述聚合物以及组合物能够提高葡萄糖、肌酐、尿酸、胆固醇、甘油三脂、高密度脂蛋白胆固醇、谷丙转氨酶、谷草转氨酶等体外检测项目中对应酶、显色指示剂的稳定性，从而减小检测偏差，提高准确性。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
具有R1-R2-R3结构通式的聚合物在酶催化显色反应中、在制备基于酶催化显色反应原理的体外检测产品中以及在制备酶和显色指示剂的稳定剂中的应用；
其中，R1选自CH3C＝CH2-、CH2＝C(CH3)CH2-、CH3(CH2)5CH(OH)CH2CH＝CH(CH2)7-、CH2＝C(CH3)CH(CH3)-、CH2＝CHCH2-、HOOCCH＝CH-、CH2＝CH-、CH3CH＝CH-、C6H5CH2CH2C6H4-、CH2＝C(COOH)CH2-；
R2选自或-O-；
R3选自-(CH2CH2O)nH、-(CH(CH3)CH2O)nCOC(CH3)＝CH2、-(CH2CH2O)nCOC(CH3)＝CH2、-(CH2CH2O)nCH3、-(CH2CH2O)nCOCH＝CH2、-(C2H4OC3H6O)nH、-(CH2CH2O)nOCH3，n为聚合度。
本发明所述聚合物在上述R1、R2、R3取代基的选择下均为现有已知产品，可通过购买或已报道的制备工艺获得。
本发明所述聚合物可作为载体与酶发生共价或非共价结合，使酶固定于载体上，或用适当的口袋包埋酶使酶微囊化，防止链的伸展，增加稳定性，同时空间位阻防止蛋白水解酶的降解作用。由于酶的疏水表面与水的接触在热力学上是不利的，通过生物活性聚合物修饰后可使酶表面的疏水性增强，提高稳定性。
其中，所述聚合物优选包括聚乙二醇甲基丙烯酸酯、聚丙二醇二甲基丙烯酸酯、蓖麻油聚氧乙烯醚、聚乙二醇二甲基丙烯酸酯、聚乙二醇单烯丙基醚、马来酸聚乙二醇单甲醚单酯、聚丙二醇甲基丙烯酸酯、马来酸聚乙二醇单甲醚单酯、聚乙二醇二丙烯酸酯、聚乙二醇甲基醚甲基丙烯酸酯、苯乙基苯酚聚氧乙烯聚氧丙烯醚、聚乙二醇双衣康酸单酯、聚乙二醇马来酸甲基酯、甲氧基聚乙二醇甲基丙烯酸酯。
作为优选，本发明所述聚合物中聚合度在4-20。
本发明所述聚合物在应用于葡萄糖、肌酐、尿酸、胆固醇、甘油三脂、高密度脂蛋白胆固醇、谷丙转氨酶、谷草转氨酶的体外检测时，提高了各检测项目对应酶和显色指示剂的稳定性，使50℃检测结果与4℃检测结果相比的绝对偏差和相对偏差相对于空白对照更小，检测结果更加准确。
同时，本发明所述聚合物可以选择其中一种或两种以上，与缓冲剂体系、辅助稳定剂组成稳定酶和显色剂的组合物，其与聚合物同样具有上述优异的技术效果，基于此，本发明同样提供了所述组合物在酶催化显色反应中、在制备基于酶催化显色反应原理的体外检测产品中以及在制备酶和显色指示剂的稳定剂中的应用。
作为优选，所述酶包括过氧化物酶、胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶、碱性磷酸酶、肌酸激酶、甘油激酶、磷酸甘油氧化酶、脂蛋白脂肪酶、尿酸氧化酶、丙酮酸氧化酶、葡萄糖氧化酶、肌酐水解酶、肌酸水解酶中的一种或两种以上，即葡萄糖、肌酐、尿酸、胆固醇、甘油三脂、高密度脂蛋白胆固醇、谷丙转氨酶、谷草转氨酶的各检测项目对应的酶，故所述体外检测产品优选为体外检测葡萄糖、肌酐、尿酸、胆固醇、甘油三脂、高密度脂蛋白胆固醇、谷丙转氨酶或谷草转氨酶的产品。
作为优选，所述显色指示剂包括苯胺类显色指示剂和/或新型Trinder显色指示剂。例如：DHBS(3，5-二氯-2-羟基苯磺酸钠)、4AA(4-氨基安替比林)、TOOS[N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺钠盐]、ABTS[(2，2′-偶氮-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐)]、TBHBA(2,4,6-三溴-3-羟基苯甲酸)、TOPS(N-乙基-N-(3-磺丙基)-3-甲基苯胺钠盐)、MAOS(N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-5-二甲氧基苯胺)、MADB(N,N-双(4-磺丁基)-3-5-二甲基苯胺)、MBTH(3-甲基苯并噻唑砜腙)等显色剂中的一种或两种以上，可应用于上述各种体外检测项目中。
本发明所述聚合物可单独使用与上述体外检测项目并提高相关酶和显色指示剂的稳定性，从而增加检测的准确性，所述聚合物的浓度为整个检测体系的0.1-1.0％wt。在此基础上，所述聚合物还可以添加现有技术中常常使用的辅助稳定剂、缓冲剂体系和表面活性剂(表面活性剂也可不添加)，成为一种稳定剂，来进一步提高其性能；对于这些试剂的选择，本发明给出了较为优选的方案。
作为优选，所述缓冲剂体系选自生物缓冲液或两性离子缓冲液，其优选的浓度为0.01～0.5mM；所述生物缓冲液pH在5.0-9.0，包括HEPES(4-羟乙基哌嗪乙磺酸)、PIPES(哌嗪-1,4-二乙磺酸)、MPOS(3-(N-吗啡啉)-丙磺酸)、MES(2-(N-吗啉)乙磺酸一水合物)、TES等。所述两性离子缓冲液pH在5.0-9.0，包括Good’s缓冲液、有机酸缓冲液、磷酸盐缓冲剂等。
作为优选，所述辅助稳定剂选自氨基酸类稳定剂、糖类稳定剂、蛋白质类稳定剂、Gantrez AN共聚物稳定剂中一种或两种以上，优选的浓度为整个检测体系的0.1％～10％wt。其中，糖类优选自蔗糖，海藻糖，甘露醇，葡聚糖等；氨基酸类优选自甘氨酸，谷氨酸，赖氨酸等；蛋白类优选牛血清白蛋白(BSA)；Gantrez AN共聚物选自Gantrez AN-119、GantrezAN-139、Gantrez AN-149、Gantrez AN-169、Gantrez S-97BF。
作为优选，所述组合物还包括表面活性剂。进一步优选，所述表面活性剂为非离子表面活性剂中的一种或两种以上，其优选的浓度为0.01％～10％wt；所述非离子表面活性剂包括Span系列、Brij系列、Emulgen系列、Pluronic系列、Tween系列、曲拉通系列等。Span系列优选Span20；Brij系列包括Brij30，Brij35，Brij58，Brij98等；Emulgen系列包括EmulgenB66，EmulgenA60，EmulgenA90等；Pluronic系列包括Pluronic F88，Pluronic F68，Pluronic L121，Pluronic F127，Pluronic L101等；Tween系列包括Tween20，Tween40，Tween60，Tween80等；曲拉通系列优选Tx-100。各表面活性剂可单独使用或组合使用。
由以上技术效果可知，本发明提供了所述具有R1-R2-R3结构通式聚合物的应用，其通过与酶和显色指示剂的相互作用增加其稳定性，从而使多种体外检测项目可以在极端环境下(如高温)保持酶和显色指示剂的稳定，使检测结果偏差较小，准确性更高，可与其他组分组成稳定酶和显色剂的组合物，应用于酶催化显色反应中、制备基于酶催化显色反应原理的体外检测产品中以及制备酶和显色指示剂的稳定剂中。
具体实施方式
本发明公开了一种聚合物的应用以及稳定酶和显色剂的组合物，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明所述产品已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的聚合物、应用和稳定剂进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
依照本发明的技术方案，在一些具体实施方式中，本发明所述聚合物可以是如下任意一种聚合物，并可按照以下组合使用在稳定酶和显色剂的组合物中，所有聚合物均可通过市售途径购买或根据已报道的制备工艺制备获得，在实际生产中，聚合物不可能是单一聚合度，而为多种不同聚合度的混合物，唯一可控的是聚合度所处的范围，故本发明中聚合度n可具体选自4-20范围之中：
1、聚乙二醇甲基丙烯酸酯(R1：CH3C＝CH2-，R2：-COO-，R3：-(CH2CH2O)nH)，n＝4-20；
2、聚丙二醇二甲基丙烯酸酯(R1：CH3C＝CH2-，R2：-COO-，R3：-(CH(CH3)CH2O)nCOC(CH3)＝CH2)，n＝4-20；
蓖麻油聚氧乙烯醚(R1：CH3(CH2)5CH(OH)CH2CH＝CH(CH2)7-，R2：-COO-，R3：-(CH2CH2O)nH)，n＝4-20；
3、聚乙二醇二甲基丙烯酸酯(R1：CH2＝C(CH3)CH(CH3)-，R2：-COO-，R3：-(CH2CH2O)nCOC(CH3)＝CH2)，n＝4-20；
蓖麻油聚氧乙烯醚(R1：CH3(CH2)5CH(OH)CH2CH＝CH(CH2)7-，R2：-COO-，R3：-(CH2CH2O)nH)，n＝4-20；
4、聚乙二醇单烯丙基醚(R1：CH2＝CHCH2-，R2：-O-，R3：-(CH2CH2O)nH)，n＝4-20；
5、聚乙二醇单烯丙基醚(R1：CH2＝CHCH2-，R2：-O-，R3：-(CH2CH2O)nH)，n＝4-20；
马来酸聚乙二醇单甲醚单酯(R1：HOOCCH＝CH-，R2：-COO-，R3：-(CH2CH2O)nCH3)，n＝4-20；
6、聚丙二醇甲基丙烯酸酯(R1：CH3CH＝CH-，R2：-COO-，R3：-(CH(CH3)CH2O)nH)，n＝4-20；
马来酸聚乙二醇单甲醚单酯(R1：HOOCCH＝CH-，R2：-COO-，R3：-(CH2CH2O)nCH3)，n＝4-20；
7、聚乙二醇二丙烯酸酯(R1：CH2＝CH-，R2：-COO-，R3：-(CH2CH2O)nCOCH＝CH2)，n＝4-20；
聚乙二醇甲基醚甲基丙烯酸酯(R1：CH3C＝CH2-：，R2：-COO-，R3：-(CH2CH2O)nCH3)，n＝4-20；
8、聚乙二醇甲基丙烯酸酯(R1：CH3CH＝CH-，R2：-COO-，R3：-(CH2CH2O)nH)，n＝4-20；
苯乙基苯酚聚氧乙烯聚氧丙烯醚(R1：C6H5CH2CH2C6H4-，R2：-O-，R3：-(C2H4OC3H6O)nH)，n＝4-20；
9、聚乙二醇二甲基丙烯酸酯(R1：CH2＝CHCH2-，R2：-COO-，R3：-(CH2CH2O)nCOC(CH3)＝CH2)，n＝4-20；
10、聚乙二醇双衣康酸单酯(R1：CH2＝C(COOH)CH2-，R2：-COO-，R3：-(CH2CH2O)nH)，n＝4-20；
聚乙二醇马来酸甲基酯(R1：HOOCCH＝CH-，R2：-COO-，R3：-(CH2CH2O)nH)，n＝4-20；
11、聚乙二醇单烯丙基醚(R1：CH2＝CHCH2-，R2：-O-，R3：-(CH2CH2O)nH)，n＝4-20；
甲氧基聚乙二醇甲基丙烯酸酯(R1：CH3C＝CH2-，R2：-COO-，R3：-(CH2CH2O)nOCH3)，n＝4-20；
在一些具体实施方式中，本发明所述辅助稳定剂可以按照如下组合使用：
甘氨酸，甘露醇，Span40，BSA；蔗糖，葡聚糖，PEG6000；海藻糖，Gantrez AN-149；海藻糖，Gantrez S-97BF；赖氨酸，BSA，Gantrez AN-169；甘氨酸，海藻糖；海藻糖，甘氨酸，Gantrez AN-139；蔗糖，Gantrez AN-119。
在一些具体实施方式中，本发明所述表面活性剂可以按照如下组合使用：
Tx-100，Tween20；Tx-100，Proclin F127；Emulgen B66，Brij58；Tx-100，Brij58。
下面结合实施例，进一步阐述本发明。
实施例1：聚乙二醇甲基丙烯酸酯(R1：CH3C＝CH2-，R2：-COO-，R3：-(CH2CH2O)nH，n＝4-20)
检测项目：总胆固醇；
检测项目所需酶和显色指示剂：胆固醇酯酶，胆固醇氧化酶，过氧化物酶，4AA，MAOS；
聚合物：聚乙二醇甲基丙烯酸酯；
按照表1配制不同处理组进行项目检测：
表1
方案A 方案B 方案C 方案D 方案E
胆固醇酯酶 200KU/L 200KU/L 200KU/L 200KU/L 200KU/L
胆固醇氧化酶 200KU/L 200KU/L 200KU/L 200KU/L 200KU/L
过氧化物酶 200KU/L 200KU/L 200KU/L 200KU/L 200KU/L
4AA 50mM 50mM 50mM 50mM 50mM
MAOS 50mM 50mM 50mM 50mM 50mM
聚乙二醇甲基丙烯酸酯 -- 0.1％ 0.5％ 1％ 2％
用超纯水溶解上述试剂，测试波长为630nm；
试验过程：
1.制备测试滤纸：
根据不同方案溶液分别浸湿滤纸，然后烘干，裁剪成4mm×4mm大小滤纸。将滤纸装入含有干燥剂的试条筒中，然后分别放入4℃冰箱和50℃烘箱保存7天。7天后，分别取在4℃和50℃保存的各方案滤纸，测试高、中、低值的血浆样本。每次测试使用一片滤纸，加样量为8μL。
2.测试方法如下：
将8μL的样本加在4℃保存的滤纸上，反应2min，根据不同项目选择不同波长的光源读取反射率。将生化仪定值的样本浓度与发射率拟合标准曲线。用同样的方法测试50℃保存的各方案滤纸，将所得的反射率代入标准曲线中，计算得到样本浓度，并求出50℃与4℃相比的绝对偏差和相对偏差。结果见表2。
表2(单位：mM)
从表2可以看出，只在聚合物聚乙二醇甲基丙烯酸酯的存在下，对检测总胆固醇的试条稳定性具较明显的改善，且0.5％效果最好。
实施例2：聚丙二醇二甲基丙烯酸酯(R1：CH3C＝CH2-，R2：-COO-，R3：-(CH(CH3)CH2O)nCOC(CH3)＝CH2，n＝4-20)；蓖麻油聚氧乙烯醚(R1：CH3(CH2)5CH(OH)CH2CH＝CH(CH2)7-，R2：-COO-，R3：-(CH2CH2O)nH，n＝4-20)
检测项目：总胆固醇；
检测项目所需酶和显色指示剂：胆固醇酯酶，胆固醇氧化酶，过氧化物酶，4AA，MADB；
聚合物：聚丙二醇二甲基丙烯酸酯和蓖麻油聚氧乙烯醚；
表面活性剂：Tx-100，Tween20；
辅助稳定剂：蔗糖，Gantrez AN-119；
缓冲剂体系：PBS；
按照表3配制不同处理组进行项目检测：
表3
用盐酸或者氢氧化钠调节pH值至6.4，测试波长为630nm；
试验过程：同实施例1，结果见表4。
表4(单位：mM)
从表4可以看出，配合使用聚丙二醇二甲基丙烯酸酯和蓖麻油聚氧乙烯醚，以及辅助稳定剂、表面活性剂和缓冲剂体系，对检测总胆固醇的试条和试剂稳定性具有较明显的改善。
实施例3：聚乙二醇二甲基丙烯酸酯(R1：CH2＝C(CH3)CH(CH3)-，R2：-COO-，R3：-(CH2CH2O)nCOC(CH3)＝CH2，n＝4-20)；蓖麻油聚氧乙烯醚(R1：CH3(CH2)5CH(OH)CH2CH＝CH(CH2)7-，R2：-COO-，R3：-(CH2CH2O)nH，n＝4-20)
检测项目：总胆固醇；
检测项目所需酶和显色指示剂：胆固醇酯酶，胆固醇氧化酶，过氧化物酶，4AA，MADB；
聚合物：聚乙二醇二甲基丙烯酸酯和蓖麻油聚氧乙烯醚；
表面活性剂：Tx-100；
辅助稳定剂：蔗糖，Gantrez AN-119；
缓冲剂体系：PBS；
按照表5配制不同处理组进行项目检测：
表5
用盐酸或者氢氧化钠调节pH值至6.4，测试波长为630nm；
试验过程：同实施例1，结果见表6。
表6(单位：mM)
从表6可以看出，配合使用聚乙二醇二甲基丙烯酸酯和蓖麻油聚氧乙烯醚，以及辅助稳定剂、表面活性剂和缓冲剂体系，对检测总胆固醇的试条和试剂稳定性具有较明显的改善。
实施例4：聚乙二醇单烯丙基醚(R1：CH2＝CHCH2-，R2：-O-，R3：-(CH2CH2O)nH，n＝4-20)
检测项目：高密度脂蛋白胆固醇；
检测项目所需酶和显色指示剂：胆固醇酯酶，胆固醇氧化酶，过氧化物酶，4AA，TOOS；
检测项目所需沉淀剂：磷钨酸，MgCl2；
聚合物：聚乙二醇单烯丙基醚；
辅助稳定剂：海藻糖，甘氨酸，Gantrez AN-139；
缓冲剂体系：PIPES；
按照表7配制不同处理组进行项目检测：
表7
用盐酸或者氢氧化钠调节pH值至6.4，测试波长为550nm；
试验过程：同实施例1，结果见表8。
表8(单位：mM)
从表8可以看出，配合使用聚乙二醇单烯丙基醚以及辅助稳定剂和缓冲剂体系，对检测高密度脂蛋白胆固醇的试条和试剂稳定性具有较明显的改善。
实施例5：聚乙二醇单烯丙基醚(R1：CH2＝CHCH2-，R2：-O-，R3：-(CH2CH2O)nH，n＝4-20)；马来酸聚乙二醇单甲醚单酯(R1：CH2＝C(COOH)CH2-，R2：-COO-，R3：-(CH2CH2O)nCH3，n＝4-20)
检测项目：高密度脂蛋白胆固醇；
检测项目所需酶和显色指示剂：胆固醇酯酶，胆固醇氧化酶，过氧化物酶，4AA，TOOS；
检测项目所需沉淀剂：磷钨酸，MgCl2；
聚合物：聚乙二醇单烯丙基醚，马来酸聚乙二醇单甲醚单酯；
辅助稳定剂：海藻糖，甘氨酸，Gantrez AN-139；
缓冲剂体系：PIPES；
按照表9配制不同处理组进行项目检测：
表9
方案A 方案B 方案C 方案D 方案E
胆固醇酯酶 300KU/L 300KU/L 300KU/L 300KU/L 300KU/L
胆固醇氧化酶 200KU/L 200KU/L 200KU/L 200KU/L 200KU/L
过氧化物酶 400KU/L 400KU/L 400KU/L 400KU/L 400KU/L
4AA 20mM 20mM 20mM 20mM 20mM
TOOS 50mM 50mM 50mM 50mM 50mM
磷钨酸 4mM 4mM 4mM 4mM 4mM
MgCl2 40mM 40mM 40mM 40mM 40mM
甘氨酸 1％ 1％ 1％ 1％ 1％
海藻糖 2.5％ 2.5％ 2.5％ 2.5％ 2.5％
Gantrez AN-139 0.1％ 0.1％ 0.1％ 0.1％ 0.1％
聚乙二醇单烯丙基醚 -- 0.1％ 0.2％ 0.1％ 0.2％
马来酸聚乙二醇单甲醚单酯 -- 0.1％ 0.1％ 0.5％ 0.5％
PIPES 0.1M 0.1M 0.1M 0.1M 0.1M
用盐酸或者氢氧化钠调节pH值至6.4，测试波长为550nm；
试验过程：同实施例1，结果见表10。
表10(单位：mM)
从表10可以看出，配合使用聚乙二醇单烯丙基醚和马来酸聚乙二醇单甲醚单酯，以及辅助稳定剂和缓冲剂体系，对检测高密度脂蛋白胆固醇的试条和试剂稳定性具有较明显的改善。
实施例6：聚丙二醇甲基丙烯酸酯(R1：CH3CH＝CH-，R2：-COO-，R3：-(CH(CH3)CH2O)nH，n＝4-20)；马来酸聚乙二醇单甲醚单酯(R1：HOOCCH＝CH-，R2：-COO-，R3：-(CH2CH2O)nCH3，n＝4-20)
检测项目：甘油三酯；
检测项目所需酶和显色指示剂：脂蛋白脂肪酶，甘油激酶，磷酸甘油酶，过氧化物酶，4AA，MADB；
聚合物：聚丙二醇甲基丙烯酸酯，马来酸聚乙二醇单甲醚单酯；
表面活性剂：TX-100，Proclin F127；
辅助稳定剂：甘氨酸，海藻糖；
缓冲剂体系：HEPES；
按照表11配制不同处理组进行项目检测：
表11
用盐酸或者氢氧化钠调节pH值至7.4，测试波长为630nm；
试验过程：同实施例1，结果见表12。
表12(单位：mM)
从表12可以看出，配合使用聚丙二醇甲基丙烯酸酯、马来酸聚乙二醇单甲醚单酯，以及辅助稳定剂、表面活性剂和缓冲剂体系，对检测甘油三酯的试条和试剂稳定性具有较明显的改善。
实施例7：聚乙二醇二丙烯酸酯(R1：CH2＝CH-，R2：-COO-，R3：-(CH2CH2O)nCOCH＝CH2，n＝4-20)；聚乙二醇甲基醚甲基丙烯酸酯(R1：CH3C＝CH2-：R2：-COO-，R3：-(CH2CH2O)nCH3，n＝4-20)
检测项目：尿酸；
检测项目所需酶和显色指示剂：尿酸氧化酶，过氧化物酶、MBTH，DHBS；
聚合物：聚乙二醇二丙烯酸酯，聚乙二醇甲基醚甲基丙烯酸酯；
表面活性剂：Emulgen B66，Brij58；
辅助稳定剂：赖氨酸，BSA，Gantrez AN-169；
缓冲剂体系：TES；
按照表13配制不同处理组进行项目检测：
表13
方案A 方案B 方案C 方案D 方案E
尿酸氧化酶 200KU/L 200KU/L 200KU/L 200KU/L 200KU/L
过氧化物酶 200KU/L 200KU/L 200KU/L 200KU/L 200KU/L
MBTH 10mM 10mM 10mM 10mM 10mM
DHBS 10mM 10mM 10mM 10mM 10mM
赖氨酸 1％ 1％ 1％ 1％ 1％
Brij58 0.5％ 0.5％ 0.5％ 0.5％ 0.5％
BSA 0.5％ 0.5％ 0.5％ 0.5％ 0.5％
Emulgen B66 0.5％ 0.5％ 0.5％ 0.5％ 0.5％
Gantrez AN-169 0.1％ 0.1％ 0.1％ 0.1％ 0.1％
聚乙二醇二丙烯酸酯 -- 0.5％ -- 0.1％ 0.5％
聚乙二醇甲基醚甲基丙烯酸酯 -- -- 0.1％ 0.5％ 0.1％
TES 0.1M 0.1M 0.1M 0.1M 0.1M
用盐酸或者氢氧化钠调节pH值至7.4，测试波长为510nm；
试验过程：同实施例1，结果见表14。
表14(单位：μM)
从表14可以看出，配合使用聚乙二醇二丙烯酸酯，聚乙二醇甲基醚甲基丙烯酸酯，以及辅助稳定剂、表面活性剂和缓冲剂体系，显著地改善了存在还原性干扰物质情况下的尿酸试纸的老化稳定性。
实施例8：聚乙二醇甲基丙烯酸酯(R1：CH3CH＝CH-，R2：-COO-，R3：-(CH2CH2O)nH，n＝4-20)；苯乙基苯酚聚氧乙烯聚氧丙烯醚(R1：C6H5CH2CH2C6H4-，R2：-O-，R3：-(C2H4OC3H6O)nH，n＝4-20)
检测项目：谷丙转氨酶；
检测项目所需酶和显色指示剂：丙酮酸氧化酶，丙氨酸，α-酮戊二酸，过氧化物酶，4AA，TODB；
聚合物：聚乙二醇甲基丙烯酸酯，苯乙基苯酚聚氧乙烯聚氧丙烯醚；
表面活性剂：Emulgen B66，Brij58；
辅助稳定剂：海藻糖，Gantrez S-97BF；
缓冲剂体系：MOPS；
按照表15配制不同处理组进行项目检测：
表15
方案A 方案B 方案C 方案D 方案E
丙酮酸氧化酶 200KU/L 200KU/L 200KU/L 200KU/L 200KU/L
丙氨酸 0.5M 0.5M 0.5M 0.5M 0.5M
α-酮戊二酸 20mM 20mM 20mM 20mM 20mM
过氧化物酶 400KU/L 400KU/L 400KU/L 400KU/L 400KU/L
4AA 10mM 10mM 10mM 10mM 10mM
TODB 10mM 10mM 10mM 10mM 10mM
海藻糖 2.5％ 2.5％ 2.5％ 2.5％ 2.5％
Gantrez S-97BF 0.1％ 0.1％ 0.1％ 0.1％ 0.1％
聚乙二醇甲基丙烯酸酯 -- 0.1％ -- 0.1％ 0.5％
苯乙基苯酚聚氧乙烯聚氧丙烯醚 -- -- 0.1％ 0.5％ 0.1％
MOPS 0.1M 0.1M 0.1M 0.1M 0.1M
用盐酸或者氢氧化钠调节pH值至7.15，测试波长为550nm；
试验过程：同实施例1，结果见表16。
表16(单位：U/L)
从表16可以看出，配合使用聚乙二醇甲基丙烯酸酯，苯乙基苯酚聚氧乙烯聚氧丙烯醚，以及辅助稳定剂、表面活性剂和缓冲剂体系，显著地改善了存在还原性干扰物质情况下的谷丙转氨酶试纸的老化稳定性。
实施例9：聚乙二醇二甲基丙烯酸酯(R1：CH2＝CHCH2-，R2：-COO-，R3：-(CH2CH2O)nCOC(CH3)＝CH2，n＝4-20)
检测项目：谷草转氨酶；
检测项目所需酶和显色指示剂：丙酮酸氧化酶，L-天门冬氨酸，α-酮戊二酸，过氧化物酶，4AA，TOPS；
聚合物：聚乙二醇二甲基丙烯酸酯；
表面活性剂：Tx-100；
辅助稳定剂：海藻糖，Gantrez AN-149；
缓冲剂体系：MOPS；
按照表17配制不同处理组进行项目检测：
表17
方案A 方案B 方案C 方案D 方案E
丙酮酸氧化酶 200KU/L 200KU/L 200KU/L 200KU/L 200KU/L
L-天门冬氨酸 0.5mM 0.5mM 0.5mM 0.5mM 0.5mM
α-酮戊二酸 20mM 20mM 20mM 20mM 20mM
过氧化物酶 400KU/L 400KU/L 400KU/L 400KU/L 400KU/L
4AA 10mM 10mM 10mM 10mM 10mM
topS 10mM 10mM 10mM 10mM 10mM
Tx-100 0.5％ 0.5％ 0.5％ 0.5％ 0.5％
海藻糖 2.5％ 2.5％ 2.5％ 2.5％ 2.5％
Gantrez AN-149 0.1％ 0.1％ 0.1％ 0.1％ 0.1％
聚乙二醇二甲基丙烯酸酯 -- 0.1％ 0.2％ 0.5％ 1％
MOPS 0.1M 0.1M 0.1M 0.1M 0.1M
用盐酸或者氢氧化钠调节pH值至7.15，测试波长为550nm；
试验过程：同实施例1，结果见表18。
表18(单位：U/L)
从表18可以看出，配合使用聚乙二醇二甲基丙烯酸酯，以及辅助稳定剂、表面活性剂和缓冲剂体系，有效地改善了存在还原性干扰物质情况下的谷草转氨酶试纸的老化稳定性。
实施例10：聚乙二醇双衣康酸单酯(R1：CH2＝C(COOH)CH2-，R2：-COO-，R3：-(CH2CH2O)nH，n＝4-20)；聚乙二醇马来酸甲基酯(R1：HOOCCH＝CH-，R2：-COO-，R3：-(CH2CH2O)nH，n＝4-20)
检测项目：血糖；
检测项目所需酶和显色指示剂：葡萄糖氧化酶，过氧化物酶，MBTH，MAOS；
聚合物：聚乙二醇双衣康酸单酯，聚乙二醇甲基丙烯酸乙酯，聚乙二醇马来酸甲基酯；
表面活性剂：Tx-100，Brij58；
辅助稳定剂：蔗糖，葡聚糖，PEG6000；
缓冲剂体系：PBS；
按照表19配制不同处理组进行项目检测：
表19
方案A 方案B 方案C 方案D 方案E
葡萄糖氧化酶 200KU/L 200KU/L 200KU/L 200KU/L 200KU/L
过氧化物酶 200KU/L 200KU/L 200KU/L 200KU/L 200KU/L
MBTH 10mM 10mM 10mM 10mM 10mM
MAOS 10mM 10mM 10mM 10mM 10mM
葡聚糖 0.1％ 0.1％ 0.1％ 0.1％ 0.1％
Brij58 0.5％ 0.5％ 0.5％ 0.5％ 0.5％
Tx-100 0.5％ 0.5％ 0.5％ 0.5％ 0.5％
蔗糖 2.5％ 2.5％ 2.5％ 2.5％ 2.5％
PEG6000 0.1％ 0.1％ 0.1％ 0.1％ 0.1％
聚乙二醇双衣康酸单酯 -- 0.1％ 0.1％ 0.1％ 0.1％
聚乙二醇马来酸甲基酯 -- -- 0.1％ 0.5％ 0.1％
PBS 0.1M 0.1M 0.1M 0.1M 0.1M
用盐酸或者氢氧化钠调节pH值至7.0，测试波长为630nm；
试验过程：同实施例1，结果见表20。
表20(单位：mM)
从表20可以看出，配合使用聚乙二醇双衣康酸单酯，聚乙二醇马来酸甲基酯，以及辅助稳定剂、表面活性剂和缓冲剂体系，有效地改善了血糖试纸的老化稳定性。
实施例11：聚乙二醇单烯丙基醚(R1：CH2＝CHCH2-，R2：-O-，R3：-(CH2CH2O)nH，n＝4-20)；甲氧基聚乙二醇甲基丙烯酸酯(R1：CH3C＝CH2-，R2：-COO-，R3：-(CH2CH2O)nOCH3，n＝4-20)
检测项目：肌酐；
检测项目所需酶和显色指示剂：肌酐水解酶，肌酸水解酶，过氧化物酶，肌氨酸氧化酶，4AA，TBHBA；
聚合物：聚乙二醇单烯丙基醚，甲氧基聚乙二醇甲基丙烯酸酯；
表面活性剂：Tx-100，Brij58；
辅助稳定剂：甘氨酸，甘露醇，Span40，BSA；
缓冲剂体系：Good’s；
按照表21配制不同处理组进行项目检测：
表21
用盐酸或者氢氧化钠调节pH值至7.4，测试波长为510nm；
试验过程：同实施例1，结果见表22。
表22(单位：μM)
从表22可以看出，配合使用聚乙二醇单烯丙基醚，甲氧基聚乙二醇甲基丙烯酸酯，以及辅助稳定剂、表面活性剂和缓冲剂体系，有效地改善了肌酐试纸的老化稳定性。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (20)

1.具有R1-R2-R3结构通式的聚合物在酶催化显色反应中、在制备基于酶催化显色反应原理的体外检测产品中以及在制备酶和显色指示剂的稳定剂中的应用；
其中，R1选自CH3C＝CH2-、CH2＝C(CH3)CH2-、CH3(CH2)5CH(OH)CH2CH＝CH(CH2)7-、CH2＝C(CH3)CH(CH3)-、CH2＝CHCH2-、HOOCCH＝CH-、CH2＝CH-、CH3CH＝CH-、C6H5CH2CH2C6H4-、CH2＝C(COOH)CH2-；
R2选自
R3选自-(CH2CH2O)nH、-(CH(CH3)CH2O)nCOC(CH3)＝CH2、-(CH2CH2O)nCOC(CH3)＝CH2、-(CH2CH2O)nCH3、-(CH2CH2O)nCOCH＝CH2、-(C2H4OC3H6O)nH、-(CH2CH2O)nOCH3，n为聚合度。
2.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述聚合物包括聚乙二醇甲基丙烯酸酯、聚丙二醇二甲基丙烯酸酯、蓖麻油聚氧乙烯醚、聚乙二醇二甲基丙烯酸酯、聚乙二醇单烯丙基醚、马来酸聚乙二醇单甲醚单酯、聚丙二醇甲基丙烯酸酯、马来酸聚乙二醇单甲醚单酯、聚乙二醇二丙烯酸酯、聚乙二醇甲基醚甲基丙烯酸酯、苯乙基苯酚聚氧乙烯聚氧丙烯醚、聚乙二醇双衣康酸单酯、聚乙二醇马来酸甲基酯、甲氧基聚乙二醇甲基丙烯酸酯。
3.根据权利要求1或2所述应用，其特征在于，所述聚合度为4-20。
4.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述酶包括过氧化物酶、胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶、碱性磷酸酶、肌酸激酶、甘油激酶、磷酸甘油氧化酶、脂蛋白脂肪酶、尿酸氧化酶、丙酮酸氧化酶、葡萄糖氧化酶、肌酐水解酶、肌酸水解酶中的一种或者两种以上。
5.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述显色指示剂包括苯胺类显色指示剂和/或新型Trinder显色指示剂。
6.根据权利要求5所述应用，其特征在于，所述显色指示剂包括DHBS、4AA、TOOS、ABTS、TBHBA、TOPS、MAOS、MADB、MBTH中的一种或者两种以上。
7.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述体外检测产品为体外检测葡萄糖、肌酐、尿酸、胆固醇、甘油三脂、高密度脂蛋白胆固醇、谷丙转氨酶或谷草转氨酶的产品。
8.一种稳定酶和显色剂的组合物，其特征在于，包括一种或两种以上具有R1-R2-R3结构通式的聚合物、缓冲剂体系、辅助稳定剂；
其中，R1选自CH3C＝CH2-、CH2＝C(CH3)CH2-、CH3(CH2)5CH(OH)CH2CH＝CH(CH2)7-、CH2＝C(CH3)CH(CH3)-、CH2＝CHCH2-、HOOCCH＝CH-、CH2＝CH-、CH3CH＝CH-、C6H5CH2CH2C6H4-、CH2＝C(COOH)CH2-；
R2选自
R3选自-(CH2CH2O)nH、-(CH(CH3)CH2O)nCOC(CH3)＝CH2、-(CH2CH2O)nCOC(CH3)＝CH2、-(CH2CH2O)nCH3、-(CH2CH2O)nCOCH＝CH2、-(C2H4OC3H6O)nH、-(CH2CH2O)nOCH3，n为聚合度。
9.根据权利要求8所述组合物，其特征在于，所述聚合物的浓度为整个检测体系的0.1-1.0％wt。
10.根据权利要求8所述组合物，其特征在于，所述缓冲剂体系选自生物缓冲液或两性离子缓冲液。
11.根据权利要求8所述组合物，其特征在于，所述辅助稳定剂选自氨基酸类稳定剂、糖类稳定剂、蛋白质类稳定剂、Gantrez AN共聚物稳定剂中的一种或两种以上。
12.根据权利要求8所述组合物，其特征在于，还包括表面活性剂。
13.根据权利要求12所述组合物，其特征在于，所述表面活性剂为非离子表面活性剂中的一种或两种以上。
14.根据权利要求8所述组合物，其特征在于，所述聚合物包括聚乙二醇甲基丙烯酸酯、聚丙二醇二甲基丙烯酸酯、蓖麻油聚氧乙烯醚、聚乙二醇二甲基丙烯酸酯、聚乙二醇单烯丙基醚、马来酸聚乙二醇单甲醚单酯、聚丙二醇甲基丙烯酸酯、马来酸聚乙二醇单甲醚单酯、聚乙二醇二丙烯酸酯、聚乙二醇甲基醚甲基丙烯酸酯、苯乙基苯酚聚氧乙烯聚氧丙烯醚、聚乙二醇双衣康酸单酯、聚乙二醇马来酸甲基酯、甲氧基聚乙二醇甲基丙烯酸酯。
15.根据权利要求8或14所述组合物，其特征在于，所述聚合度为4-20。
16.权利要求8-15任意一项所述组合物在酶催化显色反应中、在制备基于酶催化显色反应原理的体外检测产品中以及在制备酶和显色指示剂的稳定剂中的应用。
17.根据权利要求16所述应用，其特征在于，所述酶包括过氧化物酶、胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶、碱性磷酸酶、肌酸激酶、甘油激酶、磷酸甘油氧化酶、脂蛋白脂肪酶、尿酸氧化酶、丙酮酸氧化酶、葡萄糖氧化酶、肌酐水解酶、肌酸水解酶中的一种或者两种以上。
18.根据权利要求16所述应用，其特征在于，所述显色指示剂包括苯胺类显色指示剂和/或新型Trinder显色指示剂。
19.根据权利要求18所述应用，其特征在于，所述显色指示剂包括DHBS、4AA、TOOS、ABTS、TBHBA、TOPS、MAOS、MADB、MBTH中的一种或者两种以上。
20.根据权利要求16所述应用，其特征在于，所述体外检测产品为体外检测葡萄糖、肌酐、尿酸、胆固醇、甘油三脂、高密度脂蛋白胆固醇、谷丙转氨酶或谷草转氨酶的产品。
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