CN103525797A - 液体脂肪酶保护剂及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种液体脂肪酶保护剂，所述液体脂肪酶保护剂，按重量计由以下组分组成：聚丙二醇10～20％、山梨醇10～20％、氯化钙0.1～0.3％、氯化钾0.05～0.2％、乙酸钠0.01～0.03％、水60～79％。本发明的液体脂肪酶保护剂中的醇类及盐类与脂肪酶相互作用在脂肪酶的表面形成多羟基结构，使脂肪酶的空间结构保持稳定，从而使脂肪酶的酶活保持稳定，经过产品稳定性考察实验验证，本发明的液体脂肪酶保护剂能大大减少液体脂肪酶的酶活损失，大大提高液体脂肪酶使用寿命及应用效果。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种液体脂肪酶保护剂及其制备方法和应用。
背景技术
脂肪酶(又名三酰甘油水解酶，EC3.1.0.3)是具有生物活性的高分子蛋白，除了具有生物酶的选择性和专一性特点外，脂肪酶的显著特点是能在油水界面或水不溶性系统中催化水解、酸解、醇解等多种化学反应，尤其是脂肪酶催化的水解反应是一种非均相体系，水溶性的酶在非水溶性的底物和水的界面进行反应，因此脂肪酶被广泛应用于食品、医药、饲料、油脂加工、造纸、皮革等多种行业和领域中。
脂肪酶广泛存在于动物、植物、微生物中，其中微生物脂肪酶以其用途广，易于工业化生产及纯化等优点成为脂肪酶的重要来源。
目前国产的脂肪酶主要以固体脂肪酶为主，固体脂肪酶易于储存、运输，且有利于保护脂肪酶的活性，但固体脂肪酶生产技术复杂、生产成本高，并且固体脂肪酶的应用范围窄。由于液体脂肪酶的生产工艺简单、生产成本低，使得液体脂肪酶具有比固体脂肪酶更广的应用范围，但液体脂肪酶在存放、运输的过程中酶活会大大下降，大大降低液体脂肪酶的使用寿命及应用效果。
发明内容
本发明主要解决的技术问题是提供一种液体脂肪酶保护剂及其制备方法和应用，经过产品稳定性考察实验验证，所述液体脂肪酶保护剂能大大降低液体脂肪酶的酶活损失，大大提高液体脂肪酶使用寿命及应用效果。
为解决上述技术问题，本发明采用的一个技术方案是：提供一种液体脂肪酶保护剂，按重量计由以下组分组成：
其中，所述聚丙二醇的分子量为76～400。
所述液体脂肪酶保护剂的制备方法，包括以下步骤：
A、在反应釜中，依次加入60～79％的水、0.1～0.3％的氯化钙、0.05～0.2％的氯化钾和0.01～0.03％的乙酸钠，以100～150转/分钟的搅拌速度搅拌20～30分钟，得到一溶液；
B、在所述溶液中依次加入10～20％的聚丙二醇和10～20％的山梨醇，室温下，以100～150转/分钟的搅拌速度搅拌10～30分钟；
C、停止搅拌，静置，得到所述液体脂肪酶保护剂。
其中，所述聚丙二醇的分子量为76～400。
所述液体脂肪酶保护剂的应用，即在所述液体脂肪酶保护剂中加入液体脂肪酶，以100转/分钟的搅拌速度搅拌20分钟，使所述液体脂肪酶与液体脂肪酶保护剂混合均匀后停止搅拌，其中，按重量计，所述液体脂肪酶保护剂为70％～80％，所述液体脂肪酶为20％～30％。
优选地，按重量计，所述液体脂肪酶保护剂为72％～75％，所述液体脂肪酶为25％～28％。
最优选地，按重量计，所液体脂肪酶保护剂为72％，所述液体脂肪酶为28％。
其中，所述液体脂肪酶为碱性液体脂肪酶。
其中，所述液体脂肪酶来源于动物、植物或微生物。
液体脂肪酶保护剂中的醇类及盐类与脂肪酶相互作用在脂肪酶的表面形成多羟基结构，使脂肪酶的空间结构保持稳定，从而使脂肪酶的酶活保持稳定。
本发明的有益效果是：区别于现有液体脂肪酶在存放、运输的过程中酶活会大大下降、大大降低液体脂肪酶的使用寿命及应用效果的情况，本发明的液体脂肪酶保护剂中的醇类及盐类与脂肪酶相互作用在脂肪酶的表面形成多羟基结构，使脂肪酶的空间结构保持稳定，从而使脂肪酶的酶活保持稳定，经过产品稳定性考察实验验证，本发明的液体脂肪酶保护剂能大大降低液体脂肪酶的酶活损失，大大提高液体脂肪酶使用寿命及应用效果。
附图说明
图1为本发明的液体脂肪酶保护剂对脂肪酶稳定性的影响。
具体实施方式
下面结合附图及实施例对本发明进行详细说明。
实施例1
在15升的反应釜中，先依次加入6公斤的水、0.03公斤的氯化钙、0.005公斤的氯化钾、0.001公斤的乙酸钠，以100～150转/分钟的搅拌速度搅拌20～30分钟，使氯化钙、氯化钾、乙酸钠充分溶解得到一溶液；然后在所述溶液中依次加入2公斤的聚丙二醇和1.964公斤的山梨醇，室温下，以100～150转/分钟的搅拌速度搅拌10～30分钟，使其混合均匀后停止搅拌，静置，得到所述液体脂肪酶保护剂。
实施例2
在15升的反应釜中，先依次加入7.9公斤的水、0.02公斤的氯化钙、0.01公斤的氯化钾、0.003公斤的乙酸钠，以100～150转/分钟的搅拌速度搅拌20～30分钟，使氯化钙、氯化钾、乙酸钠充分溶解得到一溶液；然后在所述溶液中依次加入1.067公斤的聚丙二醇和1公斤的山梨醇，室温下，以100～150转/分钟的搅拌速度搅拌10～30分钟，使其混合均匀后停止搅拌，静置，得到所述液体脂肪酶保护剂。
实施例3
在15升的反应釜中，先依次加入6.968公斤的水、0.01公斤的氯化钙、0.02公斤的氯化钾、0.002公斤的乙酸钠，以100～150转/分钟的搅拌速度搅拌20～30分钟，使氯化钙、氯化钾、乙酸钠充分溶解得到一溶液；然后在所述溶液中依次加入1公斤的聚丙二醇和2公斤的山梨醇，室温下，以100～150转/分钟的搅拌速度搅拌10～30分钟，使其混合均匀后停止搅拌，静置，得到所述液体脂肪酶保护剂。
实施例4
在15升的反应釜中，先依次加入7公斤的水、0.025公斤的氯化钙、0.015公斤的氯化钾、0.001公斤的乙酸钠，以100～150转/分钟的搅拌速度搅拌20～30分钟，使氯化钙、氯化钾、乙酸钠充分溶解得到一溶液；然后在所述溶液中依次加入1.48公斤的聚丙二醇和1.479公斤的山梨醇，室温下，以100～150转/分钟的搅拌速度搅拌10～30分钟，使其混合均匀后停止搅拌，静置，得到所述液体脂肪酶保护剂。
实施例5
在15升的反应釜中，先依次加入7.3公斤的水、0.03公斤的氯化钙、0.01公斤的氯化钾、0.002公斤的乙酸钠，以100～150转/分钟的搅拌速度搅拌20～30分钟，使氯化钙、氯化钾、乙酸钠充分溶解得到一溶液；然后在所述溶液中依次加入1.158公斤的聚丙二醇和1.5公斤的山梨醇，室温下，以100～150转/分钟的搅拌速度搅拌10～30分钟，使其混合均匀后停止搅拌，静置，得到所述液体脂肪酶保护剂。
以上各实施例中的聚丙二醇的分子量为76～400。
比较例
设置各实验组：
实验组1：实施例1所制得的液体脂肪酶保护剂+液体脂肪酶；
实验组2：实施例2所制得的液体脂肪酶保护剂+液体脂肪酶；
实验组3：实施例3所制得的液体脂肪酶保护剂+液体脂肪酶；
实验组4：实施例4所制得的液体脂肪酶保护剂+液体脂肪酶。
实验组5：实施例5所制得的液体脂肪酶保护剂+液体脂肪酶。
取实施例中所制得的液体脂肪酶保护剂7.2公斤，加入2.8公斤液体脂肪酶，以100转/分钟的搅拌速度搅拌20分钟，使液体脂肪酶与液体脂肪酶保护剂混合均匀后停止搅拌，得浅黄色液体。
设置对照组：水+液体脂肪酶。
在7.2公斤水中加入2.8公斤液体脂肪酶，以100转/分钟的搅拌速度搅拌20分钟，使液体脂肪酶与水混合均匀后停止搅拌，得浅黄色液体。
脂肪酶酶活力测定方法：
1试剂
1.1 0.05mol/LGly-NaOH缓冲液(pH9.4)
A液：0.2mol/LNaOH，称取NaOH(A.R)8.0g，用蒸馏水定容至1000m1；
B液：0.2mol/L Gly，称取甘氨酸15.014g，用蒸馏水定容1000ml；
使用前取A液16.8ml+B液50ml，加部分蒸馏水稀释，再用酸度计调节pH至9.4，定容到200ml。
1.2橄榄油
分析纯。
1.34％聚乙烯醇(PVA)溶液
称取聚乙烯醇40g(聚合度1750+50)，加1000ml 0.05mol/L pH 9.4的Gly-NaOH缓冲液，沸水浴完全溶解后，冷却，必要时过滤，溶解过程中蒸发的水分要用蒸馏水补充，定容至1000ml。
1.4乙醇
含量在95％以上，为分析纯。
1.5 0.01mol/L NaOH标准滴定溶液
制备标准滴定溶液的浓度值应在规定浓度值的±10％范围以内。标准溶液置于塑料瓶中保存，1个月后需重新标定。
2仪器设备
2.1乳化容器：体积为500ml
2.2均质机：转速10000转/分
2.3震荡恒温水浴锅
2.4液晶式酸度计
2.5多头磁力搅拌器
3乳化液的制备
取4％PVA溶液与橄榄油2∶1混合，放入烧杯或三角瓶中，然后用均质机乳化(外包冰块)，转速10000转/分，一次乳化3分钟，每次乳化间隔时间为3分钟，共4次，立即使用。
4酶活测定
4.1酶活测定(NaOH滴定法)：
准确吸取1ml样品于100ml容量瓶中，用缓冲液定容到刻度，摇匀，进行下一步稀释，稀释倍数：以样品与对照消耗碱量之差在4.5ml～5.5ml范围内。
注意：再次稀释次数不得超过两次。
测定：取100ml三角瓶3只，其中2只是试样，1只是空白照，每只中的组成液为：4.0ml缓冲液(pH9.4)，5.0ml橄榄油乳化液，1.0ml酶液。以上除酶液以外的组成液置于36℃水浴锅预热5分钟，然后精确加入1ml酶液，精确计时，缓慢振荡(80次/分钟)，保温10分钟，立即加入95％酒精20ml，取出，加入10ml30％的氯化钠溶液，摇匀，使之破乳约1分钟。并同时做空白对照，对照同样品一样，先预热5分钟，保温10分钟，立即加入20ml 95％酒精(1ml酶液先加入该20ml 95％酒精中灭活)。
用0.01mol/LNaOH滴定样品至空白溶液的pH。反应后的样品应在半小时内完成滴定。
4.2计算
式中：
X——样品的酶活力，单位为(u/g或u/ml)；
v——滴定样品时消耗标准NaOH溶液的体积，单位为(ml)；
C——氢氧化钠的浓度，单位为(mol/L)
10——反应时间10min，以1min计；
n——稀释倍数；
w——换算系数(根据不同批次的橄榄油进行换算)；
m——称取样品质量，单位为(g)。
按上述脂肪酶酶活测定方法对不同储存时间的对照组和各实验组进行酶活检测，储存时间分别设为0个月、0.5个月、1个月、2个月、3个月、6个月、12个月，储存温度为4℃，检测结果见表1。
表1不同储存时间的液体脂肪酶的酶活
根据表1中的数据计算脂肪酶的酶活保存率，酶活保存率按以下公式计算：
X——酶活保存率，％；
E1——放置不同时间后测得的酶活；
E——放置时间为零时测得的酶活。
请参见图1，图1为本发明液体脂肪酶保护剂对脂肪酶稳定性的影响，由图1及表1可知，随着放置时间的延长，各组脂肪酶的酶活逐渐下降，未加入液体脂肪酶保护剂的对照组的下降幅度明显大于加入液体脂肪酶保护剂的各实验组的下降幅度。放置时间为3个月时，对照组的脂肪酶酶活为12942u/ml，脂肪酶酶活保存率为46.6％，各实验组的脂肪酶酶活为25158～26948u/ml，脂肪酶酶活保存率高达93％～98％，实验组的脂肪酶酶活及酶活保存率约为对照组的2倍；放置时间为6个月时，对照组的脂肪酶酶活为9524u/ml，脂肪酶酶活保存率为34.3％，各实验组的脂肪酶酶活为24560～26002u/ml，脂肪酶酶活保存率高达89.7％～93.7％，实验组的脂肪酶酶活及酶活保存率约为对照组的2.6倍；放置时间为1年时，对照组的脂肪酶酶活为5553u/ml，脂肪酶酶活保存率的仅为20％，各实验组的脂肪酶酶活为21806～23487u/ml，脂肪酶酶活保存率仍高达79％～86％，实验组的脂肪酶酶活及酶活保存率约为对照组的4～4.3倍。由此可见，本发明的液体脂肪酶保护剂能大大降低液体脂肪酶的酶活损失，大大提高液体脂肪酶使用寿命及应用效果。
本领域技术人员不脱离本发明的实质和精神，可以有多种变形方案实现本发明，以上所述仅为本发明较佳可行的实施例而已，并非因此局限本发明的权利范围，凡运用本发明说明书内容所作的等效结构变化，均包含于本发明的权利范围之内。
Claims (9)
1.一种液体脂肪酶保护剂，其特征在于，按重量计由以下组分组成：
2.根据权利1所述的液体脂肪酶保护剂，其特征在于，所述聚丙二醇的分子量为76～400。
3.根据权利要求1所述的液体脂肪酶保护剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
A、在反应釜中，依次加入60～79％的水、0.1～0.3％的氯化钙、0.05～0.2％的氯化钾和0.01-0.03％的乙酸钠，以100～150转/分钟的搅拌速度搅拌20～30分钟，得到一溶液；
B、在所述溶液中依次加入10～20％的聚丙二醇和10～20％的山梨醇，室温下，以100～150转/分钟的搅拌速度搅拌10～30分钟；
C、停止搅拌，静置，得到所述液体脂肪酶保护剂。
4.根据权利要求3所述的液体脂肪酶保护剂的制备方法，其特征在于，所述聚丙二醇的分子量为76～400。
5.根据权利要求1所述的液体脂肪酶保护剂的应用，其特征在于，在所述液体脂肪酶保护剂中加入液体脂肪酶，以100转/分钟的搅拌速度搅拌20分钟，使所述液体脂肪酶与液体脂肪酶保护剂混合均匀后停止搅拌，其中，按重量计，所述液体脂肪酶保护剂为70％～80％，所述液体脂肪酶为20％～30％。
6.根据权利要求5所述的液体脂肪酶保护剂的应用，其特征在于，按重量计，所述液体脂肪酶保护剂为72％～75％，所述液体脂肪酶为25％～28％。
7.根据权利要求6所述的液体脂肪酶保护剂的应用，其特征在于，按重量计，所液体脂肪酶保护剂为72％，所述液体脂肪酶为28％。
8.根据权利要求5所述的液体脂肪酶保护剂的应用，其特征在于，所述液体脂肪酶为碱性液体脂肪酶。
9.根据权利要求5所述的液体脂肪酶保护剂的应用，其特征在于，所述液体脂肪酶来源于动物、植物或微生物。
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