CN111965365A - 一种果糖胺测定试剂盒 - Google Patents

一种果糖胺测定试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种果糖胺测定试剂盒，包括R1试剂和R2试剂，其中R1试剂pH为10.0～10.8，包括：200～500mmol/L碱性缓冲液、1～10g/L金属盐、0.5～2g/L Emulgen A90和Emulgen B66等体积比混合物、0.5～2g/L防腐剂；R2试剂pH为4.0～5.0，包括：5mmol/L～25mmol/L酸性缓冲液、0.5～2g/L异丙胺烷基苯磺酸盐；1～5g/L NBT以及0.5～2g/L防腐剂。本发明通过在R1试剂中特殊选取Emulgen A90和Emulgen B66的等体积比混合物，与强碱性环境配合，以有效清除血清样本中的干扰物；并且在R2试剂中将酸性环境与异丙胺烷基苯磺酸盐配合使用，并适当降低其中缓冲液的浓度，以增强NBT的溶解度和试剂稳定性，同时提高了试剂的精密度和线性范围，从而得到了一种抗干扰能力和稳定性显著增强，且试剂的线性和精密度也更优异的果糖胺测定试剂盒。

Description

一种果糖胺测定试剂盒
技术领域
本发明属于临床化学检测技术领域，具体涉及一种果糖胺测定试剂盒。
背景技术
果糖胺是血浆中的蛋白质在葡萄糖非酶糖化过程中形成的一种物质，它的浓度与血糖水平成正相关，并相对保持稳定，并且果糖胺的测定不受血糖的影响。由于血浆蛋白的半衰期为17～20天，故果糖胺可以反映糖尿病患者检测前1～3周内的平均血糖水平。从一定程度上弥补了糖化血红蛋白不能反映较短时期内血糖浓度变化的不足，是临床糖尿病人较长时间血糖控制水平的研究指标。
果糖胺的测定方法有多种，主要是化学法和层析法。其中化学法包括硫代巴比妥酸法和硝基四氮唑蓝(NBT)法等，而目前应用最广的方法是NBT法，即在碱性条件下，样品中的果糖胺能与NBT起显色反应，其颜色深浅与果糖胺含量成正比。如专利CN101135688A公开了血清中果糖胺NBT测定方法，包括R1试剂和R2试剂，其中R1包括NBT反应成分，pH为中性，R2为碱性碳酸钾缓冲液。
然而在检测过程中，血清样本中会存在抗坏血酸、胆红素、胆固醇等还原性物质的干扰，从而影响果糖胺检测结果的准确性，而仅依赖强碱性环境难以有效解决所有干扰问题；其次NBT的溶解性较差，因此试剂长期放置的过程中会出现底物析出的现象，从而影响了检测试剂的稳定性和检测准确性。
发明内容
本发明的目的提供一种果糖胺测定试剂盒，分别对R1试剂和R2试剂进行优化，通过特殊选取Emulgen A90和Emulgen B66的等体积比混合物，与强碱性环境配合，可有效去除样本中还原性物质的干扰；同时适当降低R2试剂的pH值，并加入具有增溶稳定作用的异丙胺烷基苯磺酸盐，以促进NBT的溶解，从而得到一种抗干扰能力和稳定性显著增强，并且试剂的线性和精密度也更优异的果糖胺测定试剂盒。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：
一种果糖胺测定试剂盒，包括R1试剂和R2试剂，其中所述R1试剂的pH为10.0～10.8，包括：
Figure BDA0002598321200000021
所述R2试剂的pH为4.0～5.0，包括：
Figure BDA0002598321200000022
本技术方案的原理是：首先对用于处理血清样本的R1试剂进行优化，在强碱性环境的基础上，特殊选取了Emulgen A90和Emulgen B66的等体积比混合物，与强碱性环境配合使用，以有效清除血清样本中胆固醇类、抗坏血酸等还原性物质的干扰，从而显著提高试剂的抗干扰能力；同时R2试剂中通过酸性环境和异丙胺烷基苯磺酸盐配合使用，以有效增强NBT的溶解性和稳定性，同时还可进一步提高试剂的精密度和线性。并且为避免R1、R2试剂混合后，R2试剂的低pH影响果糖胺与NBT反应所需的碱性环境，因此适当降低了R2试剂中缓冲液的浓度，从而得到了上述R1试剂和R2试剂的配方。
优选地，所述R1试剂的pH为10.5，包括：
Figure BDA0002598321200000023
所述R2试剂的pH为4.5，包括：
Figure BDA0002598321200000031
优选地，所述R1试剂中所述碱性缓冲液为Na2CO3-NaHCO3缓冲液或K2CO3-KHCO3缓冲液。
优选地，所述R2试剂中所述酸性缓冲液为甘氨酸缓冲液、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液、乙酸-乙酸钠缓冲液、磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液中的一种或多种。
优选地，所述R1试剂中所述金属盐为氯化钠、氯化钾、碘化钾、谷氨酸钠、草氨酸钠、氯化锂、L-乳酸锂中的一种或多种。
优选地，所述R1试剂和所述R2试剂中防腐剂为叠氮化钠、山梨酸钾、苯甲酸钠、Proclin系列中的一种或多种。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明在R1试剂中特殊选取了EmulgenA90和Emulgen B66的等体积比混合物，与强碱性环境配合，以有效清除血清样本中的干扰物；并且在R2试剂中将酸性环境与异丙胺烷基苯磺酸盐配合使用，并适当降低R2试剂中缓冲液浓度，以增强NBT的溶解度和试剂稳定性，同时还提高了检测试剂的精密度和线性范围，从而得到了一种抗干扰能力和稳定性显著增强，并且试剂的线性和精密度也更优异的果糖胺测定试剂盒。
具体实施方式
下面将结合本发明中的实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动条件下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1 R1试剂的优化
本实施例主要对R1试剂进行优化，其中R1试剂中包括：250mmol Na2CO3-NaHCO3缓冲液，5g/L NaCl，1g/L叠氮化钠以及Emulgen系列表面活性剂(均为花王公司产品)。其中主要对Emulegen系列表面活性剂的具体物质选取以及浓度进行优化，具体如下表所示：
组别 Emulegen系列表面活性剂 浓度
1 Emulgen A90：Emulgen B66＝1:1 1g/L
2 Emulgen A90 1g/L
3 Emulgen B66 1g/L
4 Emulgen A90：Emulgen 430＝1:1 1g/L
5 Emulgen B66：Emulgen A60＝1:1 1g/L
6 Emulgen A500：Emulgen709＝1:1 1g/L
7 Emulgen A90：Emulgen B66＝1:1 0.5g/L
8 Emulgen A90：Emulgen B66＝1:1 2g/L
9 Emulgen A90：Emulgen B66＝1:1 2.5g/L
10 无表面活性剂 0g/L
R2试剂则为常规试剂，具体包括：pH7.5 100mmol/L Tris-HCl缓冲液，2g/LNBT，1g/L叠氮化钠。试剂盒的使用方法与常规方法相同，具体为：每15μL样本中先加入240μLR1试剂进行处理，37℃恒温5min后加入60μL R2试剂，37℃恒温4min后在60秒内准确测定平均每分钟吸光度变化率ΔA/min。
性能评价：按照常规的试剂盒抗干扰能力评价方法，对上述10组得到的试剂盒进行抗坏血酸、胆红素、甘油三酯和血红蛋白的抗干扰能力研究，分别按各干扰物质的最大浓度配制不同浓度梯度并加入至待测样本中，计算测量值与准确值间的相对偏差。结果如表1所示。
表1抗干扰能力评价
Figure BDA0002598321200000041
Figure BDA0002598321200000051
根据表1的结果可知，表面活性剂不同类型的选取(组1-6)以及添加浓度的不同(组7-10)均会对试剂的抗干扰能力产生一定的影响，并且仅有当表面活性剂为1:1的Emulgen A90和Emulgen B66，且添加浓度为0.5～2g/L时，试剂的抗干扰能力低于10％，符合临床使用需求，并且当等体积比的Emulgen A90和Emulgen B66的添加浓度为1g/L时，试剂的抗干扰能力最强。
实施例2R2试剂的优化
本实施例中R1试剂为：250mmol Na2CO3-NaHCO3缓冲液，5g/L NaCl，1g/L叠氮化钠以及1g/L Emulgen A90和Emulgen B66等体积比混合物。本实施例主要对R2试剂进行优化，具体如下表所示：
组别 柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液 异丙胺烷基苯磺酸盐 NBT 叠氮化钠
1 pH 4.5，15mmol/L 1g/L 2g/L 2g/L
2 pH7.0，15mmol/L 1g/L 2g/L 2g/L
3 pH3.0，15mmol/L 1g/L 2g/L 2g/L
4 pH 4.5，15mmol/L 0.3g/L 2g/L 2g/L
5 pH 4.5，15mmol/L 2.5g/L 2g/L 2g/L
6 pH 4.0，15mmol/L 2g/L 2g/L 2g/L
7 pH 5.0，15mmol/L 0.5g/L 2g/L 2g/L
对上述7组试剂盒进行性能评价，具体包括：
(1)空白吸光度：试剂在546nm波长处的吸光度值。
(2)准确度：检测质控品，计算测定平均值与靶值的偏差，相对偏差应≤10％。
(3)精密度：在重复性条件下，用试剂盒测试同一血清样本或控制物质，重复测试20次，比较变异系数(CV)，CV应≤4％。
(4)分析灵敏度：试剂盒测试3mmol/L被测物时，吸光度变化率(ΔA/min)应在0.010～0.060。
(5)线性：测定线性范围为0～14mmol/L时，各试剂盒的线性相关系数，其中r2应≥0.99，且相关系数越大，线性越好。
(6)稳定性：
a.热稳定性：将试剂分别置于37℃恒温水箱中热破坏7天和42℃摇床上震荡5天后，评价试剂空白吸光度、准确度、精密度、分析灵敏度和线性，结果如表2所示；
b.开瓶稳定性：将试剂置于2-8℃开瓶，检测质控品，测值3次取平均值，每隔3-5天检测一次，并与第0天比较，计算相对偏差，结果如表3所示；
c.长期稳定性：试剂在2-8℃储存18个月后，评价试剂空白吸光度、准确度、精密度、分析灵敏度和线性，结果如表4所示。
表2热稳定性评价数据
Figure BDA0002598321200000061
Figure BDA0002598321200000071
根据表2的测定结果，相比于组1、组6-7中pH为4-5，当R2试剂的pH增大时(组2)，会影响试剂中NBT的溶解稳定性，因此相比于现配现用，组2于37℃恒温水箱中热破坏7天和42℃摇床上震荡5天后的空白吸光度明显增大，进而显著影响了试剂的准确度、精密度和线性；而当R2试剂的pH减小时(组3)，虽然试剂中NBT的溶解稳定性增强(空白吸光度低)，但是R2试剂较低的pH会导致R1、R2试剂混合后体系的pH偏低，从而影响了果糖胺与NBT的显色反应，因此组3即使是现配现用，其准确度、精密度、分析灵敏度和线性也均无法满足临床使用需求。组4-5相比于组1，主要是改变了R2试剂中的异丙胺烷基苯磺酸盐的含量，结果发现异丙胺烷基苯磺酸盐含量的变化对于试剂的热稳定性也有显著影响，组4-5于37℃恒温水箱中热破坏7天或42℃摇床上震荡5天后，其空白吸光度增大，准确度、精密度和线性均有不同程度的降低。说明R2试剂的pH和异丙胺烷基苯磺酸盐的含量对试剂的热稳定性有显著影响，只有当pH值为4-5，并且异丙胺烷基苯磺酸盐的含量的为0.5-2g/L时，试剂的热稳定性强，并且当pH为4.5且异丙胺烷基苯磺酸盐的含量的为1g/L时，试剂的热稳定性和综合性能最强。
表3开瓶稳定性评价数据
Figure BDA0002598321200000072
Figure BDA0002598321200000081
根据表3的测定结果，组1、组6和组7的开瓶稳定性均优于组2、组4和组5，组3虽然开瓶稳定性强，但是根据表2的结果，组3的pH值过低会影响试剂检测的准确度等性能，综上，当R2试剂的pH值为4-5，且异丙胺烷基苯磺酸盐的含量的为0.5-2g/L时，试剂的开瓶稳定性最优，开瓶31天，测量结果偏差也满足要求。
表4长期稳定性评价数据
Figure BDA0002598321200000082
根据表4的测定结果，将各组试剂于2-8℃密闭避光储存18个月后，仅有组1、组6和组7的的空白吸光度、准确度、精密度、分析灵敏度和线性均满足临床使用需求，其他组的试剂经过长期保存后，试剂的各项性能均显著降低，无法满足临床使用需求。即当R2试剂的pH值为4-5，且异丙胺烷基苯磺酸盐的含量的为0.5-2g/L时，试剂的长期稳定性最优。
综合上述热稳定性、开瓶稳定性和长期稳定性的数据可知，R2试剂的pH值和其中异丙胺烷基苯磺酸盐的含量对试剂的稳定性和多种性能均有不同程度的影响。并且仅在R2试剂的pH为4.0-5.0并且异丙胺烷基苯磺酸盐的含量为05-2g/L时，试剂的稳定性和精密度、准确度、线性等性能均最优，可满足临床检测需求。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (6)

1.一种果糖胺测定试剂盒，包括R1试剂和R2试剂，其特征在于，所述R1试剂的pH为10.0～10.8，包括：
Figure FDA0002598321190000011
所述R2试剂的pH为4.0～5.0，包括：
Figure FDA0002598321190000012
2.根据权利要求1所述的一种果糖胺测定试剂盒，其特征在于，所述R1试剂的pH为10.0～10.8，包括：
Figure FDA0002598321190000013
所述R2试剂的pH为4.0～5.0，包括：
Figure FDA0002598321190000014
3.根据权利要求1或2所述的一种果糖胺测定试剂盒，其特征在于，所述R1试剂中所述碱性缓冲液为Na2CO3-NaHCO3缓冲液或K2CO3-KHCO3缓冲液。
4.根据权利要求1或2所述的一种果糖胺测定试剂盒，其特征在于，所述R2试剂中所述酸性缓冲液为甘氨酸缓冲液、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液、乙酸-乙酸钠缓冲液、磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液中的一种或多种。
5.根据权利要求1或2所述的一种果糖胺测定试剂盒，其特征在于，所述R1试剂中所述金属盐为氯化钠、氯化钾、碘化钾、谷氨酸钠、草氨酸钠、氯化锂、L-乳酸锂中的一种或多种。
6.根据权利要求1或2所述的一种果糖胺测定试剂盒，其特征在于，所述R1试剂和所述R2试剂中防腐剂为叠氮化钠、Proclin系列中的一种或多种。
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