CN111321198A - 一种谷胱甘肽还原酶测定试剂盒及其制备方法和应用 - Google Patents

一种谷胱甘肽还原酶测定试剂盒及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种谷胱甘肽还原酶测定试剂盒及其制备方法和应用，涉及生化试剂测定技术领域，该试剂盒包括试剂R1和试剂R2，所述试剂R1包括：磷酸缓冲液、抗坏血酸氧化酶、丙酮酸氧化酶、亚铁氰化钾、氧化型谷胱甘肽、MgCl2、FAD、防腐剂和表面活性剂；所述试剂R2包括甘氨酸缓冲液、NADPH、防腐剂和保护剂。通过在试剂中加入EGTA以及二硫苏糖醇能够扩大试剂盒的线性范围、提高试剂盒的稳定性。此外，本发明还提供了上述试剂盒的制备方法和应用，该试剂盒能够对谷胱甘肽还原酶进行准确测定。

Description

一种谷胱甘肽还原酶测定试剂盒及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及生化试剂测定技术领域，具体涉及一种谷胱甘肽还原酶测定试剂盒及其制备方法和应用。
背景技术
谷胱甘肽还原酶(GR)是一种利用还原型NAD将氧化型谷胱甘肽(GS-SG)催化反应成还原型(GSH)的酶，具有极其重要的生理功能，广泛的存在于血清、红细胞、单核巨噬细胞、心、肝、肾等组织细胞内，各类肝脏疾病、尿毒症患者全血中GR活性会显著升高，同时组织中的GR会显著降低，检测样品中GR活性可用于辅助判断肝脏与多种疾病。对于肝脏疾病而言，在急性肝炎的早期，血清中谷胱甘肽还原酶的出现比转氨酶更早，和目前急性肝炎的其他检查项目结果进行综合评估可以辅助判断病人的发病时间和发病阶段。同时，谷胱甘肽还原酶的测定还可以辅助鉴别黄疸类型，谷胱甘肽还原酶的检测在诊断黄疸成因时也能与区别是肝前性、肝源性、肝后性黄疸，非肝源性黄疸谷胱甘肽还原酶活性处于正常水平，综合其他检查项目结果进行评估可以辅助判断病人的病因病情。
目前，国内测定谷胱甘肽还原酶的方法主要有Elisa法和紫外酶法，前者需要手工操作，耗时较长、步骤比较繁琐且价格不菲，而后者为目前国内主要推广的方法，但现有的紫外酶法谷胱甘肽还原酶的试剂盒主要为进口干粉试剂，虽然结果准确，但是价格不菲，使用前需用缓冲液和蒸馏水溶解，溶解后的试剂液只能在2～8℃环境下保存两天，使用非常不方便并且复溶后使用不完会出现大量的浪费。而临床生化分析仪上最方便使用的国产液体双试剂目前存在稳定性差，抗干扰能力差等缺点。
中国专利CN108828215B公开了一种谷胱甘肽还原酶测定试剂盒及其制备方法和应用，该试剂盒含有试剂R1和试剂R2；试剂R1中含有以下成分：Tris缓冲液50-200mmol/L、EDTA 0.5-2mmol/L、丙酮酸羧化酶1-5KU/L、抗坏血酸氧化酶1-5KU/L、亚铁氰化钾5-20mg/L、表面活性剂、防腐剂；试剂R2中含有以下成分：Tris缓冲液50-200mmol/L、EDTA 0.5-2mmol/L、GSSG 2-10mmol/L、NADPH 0.1-0.5mmol/L、稳定剂1-15g/L、防腐剂0.5-2g/L。该试剂盒具有稳定性强以及抗干扰能力强的特点，与此同时，该发明还提供了上述试剂盒的制备方法和应用。但该试剂盒线性范围较小，同时稳定性也相对较弱。
中国专利CN110734952A公开了一种谷胱甘肽还原酶检测试剂盒及应用，包括以下组分：第一试剂，包括磷酸盐缓冲液、EDTA-NA2、抗坏血酸氧化酶、高铁氰化钾、防腐剂和氧化型谷胱甘肽；第二试剂，包括三羟甲基胺基甲烷缓冲液、EGTA、防腐剂和还原型辅酶。同时，该发明还公开了上述试剂盒的应用。但该试剂盒稳定性相对较差，抗干扰能力不强。
针对现有的谷胱甘肽还原酶测定试剂盒存在的稳定性差，线性范围小以及抗干扰能力不强等问题，应寻找一种稳定性好、线性范围广、抗干扰能力强的试剂盒，使得该试剂盒能够实现谷胱甘肽还原酶的测定。
发明内容
本发明针对现有技术存在的问题，提供了一种谷胱甘肽还原酶测定试剂盒及其制备方法和应用，该试剂盒稳定性好、线性范围广、抗干扰能力强，能够实现谷胱甘肽还原酶的准确测定。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
本发明提供了一种谷胱甘肽还原酶测定试剂盒，包括试剂R1和试剂R2，所述试剂R1包括：磷酸缓冲液、抗坏血酸氧化酶、丙酮酸氧化酶、亚铁氰化钾、氧化型谷胱甘肽、MgCl2、FAD、防腐剂和表面活性剂；所述试剂R2包括甘氨酸缓冲液、NADPH、防腐剂和保护剂。
进一步地，所述试剂R1包括：磷酸缓冲液50-500mmol/L、抗坏血酸氧化酶1-5KU/L、丙酮酸氧化酶1-5KU/L、亚铁氰化钾5-20mg/L、氧化型谷胱甘肽GSSG 2-10mmol/L、MgCl2 1-10mmol/L、FAD 1-20μmol/L、防腐剂0.1-1g/L和表面活性剂1-10mL/L。
进一步地，所述试剂R2包括甘氨酸缓冲液50-500mmol/L、NADPH 0.1-1mmol/L、防腐剂0.1-1g/L和保护剂1-10g/L。
进一步地，所述试剂R1还包括EGTA 1-6mmol/L，所述试剂R2还包括EGTA 1-6mmol/L；所述试剂R2还包括二硫苏糖醇1-20mmol/L。
进一步地，所述试剂R1和试剂R2的体积比为1-5:1。
优选地，所述试剂R1和试剂R2的体积比为4:1。
进一步地，所述磷酸缓冲液和甘氨酸缓冲液的重量比为1:10-10:1。
优选地，所述磷酸缓冲液和甘氨酸缓冲液的重量比为1:1。
优选地，所述试剂R1包括：磷酸缓冲液100mmol/L、EGTA 4mmol/L、抗坏血酸氧化酶3KU/L、丙酮酸氧化酶4KU/L、亚铁氰化钾8mg/L、氧化型谷胱甘肽GSSG 10mmol/L、MgCl28mmol/L、FAD 1.5μmol/L、防腐剂1g/L和表面活性剂5mL/L。所述试剂R2包括甘氨酸缓冲液100mmol/L、EGTA 4mmol/L、二硫苏糖醇15mmol/L、NADPH 0.6mmol/L、防腐剂1g/L和保护剂8g/L。
进一步地，试剂R1或试剂R2中所述防腐剂为叠氮钠、PC300和硫酸庆大霉素中的一种或多种；试剂R1中所述表面活性剂为吐温20、吐温80、TritonX-100、TritonX-405、Brij-35和十二烷基苯磺酸钠中的一种或多种；试剂R2中所述保护剂为海藻糖、葡聚糖、甘露醇、甘油和牛血清白蛋白总的一种或多种。
优选地，试剂R1或试剂R2中所述防腐剂为叠氮钠；试剂R1中所述表面活性剂为吐温20；试剂R2中所述保护剂剂为海藻糖、葡聚糖和甘油。
进一步优选地，所述海藻糖、葡聚糖和甘油的重量比为1-9:1:3-10。
更进一步优选地，所述海藻糖、葡聚糖和甘油的重量比为4:1:5。
进一步地，所述试剂R1使用盐酸调节pH至6.5-7.5，所述试剂R2使用氢氧化钠调节pH至9.0-10.0。
进一步地，本发明还提供了上述试剂盒的制备方法，包括以下步骤：
(1)配制试剂R1：取适量水，依次加入R1中的各原料，搅匀溶解一个原料后加入下一个原料，待各原料均匀混合后，调节pH至6.5-7.5，用水定容至所需体积，即得；
(2)配制试剂R2：取适量水，依次加入R1中的各原料，搅匀溶解一个原料后加入下一个原料，待各原料均匀混合后，调节pH至9.0-10.0，用水定容至所需体积，即得。
进一步地，步骤(1)和步骤(2)中所述适量的水均占各步骤总加水量体积的80％。
进一步地，本发明还提供了上述试剂盒在谷胱甘肽还原酶非疾病测定中的应用。
本发明所取得的技术效果是：
1.本发明中的丙酮酸氧化酶和抗坏血酸氧化酶可以去除血清中的丙酮酸和抗坏血酸的干扰，提高试剂的准确性。亚铁氰化钾能将血红蛋白中的亚铁离子(Fe2+)转为高铁离子(Fe3+),生产稳定的氰化高铁血红蛋白，减小对试剂检测结果的影响.氧化型谷胱甘肽(GSSG)作为底物参与反应。Mg2+作为谷胱甘肽还原酶(GR)的辅助因子，能够激活还原反应。EGTA能提高检测结果与吸光度的线性关系，提高线性范围。二硫苏糖醇(DTT)能有效保护NADPH，减少NADPH的自我降解，提高试剂的稳定性。FAD是黄素腺嘌呤二核苷酸，作为GR的辅基，参与反应。上述各类成分选取合适的含量相互搭配、组合，制备出的试剂盒具有稳定性好，线性范围广，抗干扰能力强，适用于普遍的全自动生化仪的特点。
2.进口的干粉试剂在短时间内不使用，试剂不稳定导致结果不可靠从而造成浪费，本发明为液体型试剂，较为稳定，从而可以减少试剂的浪费。
具体实施方式
值得说明的是，本申请中使用的材料均为普通市售产品，因此对其来源不做具体限定。
实施例1
一种谷胱甘肽还原酶测定试剂盒，包括试剂R1和试剂R2，其中，试剂R1包括：磷酸缓冲液50mmol/L、抗坏血酸氧化酶1KU/L、丙酮酸氧化酶1KU/L、亚铁氰化钾5mg/L、氧化型谷胱甘肽GSSG 2mmol/L、MgCl2 1mmol/L、FAD 1μmol/L、叠氮钠0.1g/L和Brij-351mL/L。试剂R2包括：甘氨酸缓冲液50mmol/L、NADPH 0.1mmol/L、叠氮钠0.1g/L和保护剂1g/L。其中，保护剂为重量比为1:1:3的海藻糖、葡聚糖和甘油。
实施例2
一种谷胱甘肽还原酶测定试剂盒，包括试剂R1和试剂R2，其中，试剂R1包括：磷酸缓冲液500mmol/L、抗坏血酸氧化酶5KU/L、丙酮酸氧化酶5KU/L、亚铁氰化钾20mg/L、氧化型谷胱甘肽GSSG 10mmol/L、MgCl2 10mmol/L、FAD 20μmol/L、PC300 1g/L和TritonX-10010mL/L。试剂R2包括：甘氨酸缓冲液500mmol/L、NADPH 1mmol/L、硫酸庆大霉素1g/L和保护剂10g/L。其中，保护剂为重量比为9:1:10的海藻糖、葡聚糖和甘油。
实施例3
与实施例1的区别在于，试剂R1中还包括EGTA 1mmol/L，试剂R2中还包括EGTA1mmol/L。
实施例4
与实施例2的区别在于，试剂R1中还包括EGTA 6mmol/L，试剂R2中还包括EGTA6mmol/L。
实施例5
与实施例3的区别在于，试剂R2还包括二硫苏糖醇1mmol/L。
实施例6
与实施例4的区别在于，试剂R2还包括二硫苏糖醇20mmol/L。
实施例7
一种谷胱甘肽还原酶测定试剂盒，包括试剂R1和试剂R2，其中，试剂R1包括：磷酸缓冲液100mmol/L、EGTA 4mmol/L、抗坏血酸氧化酶3KU/L、丙酮酸氧化酶4KU/L、亚铁氰化钾8mg/L、氧化型谷胱甘肽GSSG 10mmol/L、MgCl2 8mmol/L、FAD 1.5μmol/L、叠氮钠1g/L和表面活性剂5mL/L。所述试剂R2包括甘氨酸缓冲液100mmol/L、EGTA 4mmol/L、二硫苏糖醇15mmol/L、NADPH 0.6mmol/L、叠氮钠1g/L、和保护剂8g/L。其中，保护剂为重量比为4:1:5的海藻糖、葡聚糖和甘油。
对比例1
与实施例7的区别在于，试剂R1和R2中EGTA的浓度均为7mmol/L。
对比例2
与实施例7的区别在于，试剂R2中二硫苏糖醇的浓度为22mmol/L。
对比例3
与实施例7的区别在于，磷酸缓冲液和甘氨酸缓冲液的重量比为15:1(磷酸缓冲液和甘氨酸缓冲液的总重量与实施例7相同)。
对比例4
与实施例7的区别在于，葡聚糖、海藻糖和甘油的重量比为9:1:2(葡聚糖、海藻糖和甘油的总重量与实施例7相同)。
对比例5
与实施例7的区别在于，将试剂R1中的磷酸缓冲液替换为Tris缓冲液，将试剂R2中的甘氨酸缓冲液替换为HEPES缓冲液。
对比例6
与实施例7的区别在于，一种谷胱甘肽还原酶测定试剂盒，包括试剂R1和试剂R2，其中，试剂R1包括：磷酸缓冲液520mmol/L、EGTA 0.8mmol/L、抗坏血酸氧化酶6KU/L、丙酮酸氧化酶0.8KU/L、亚铁氰化钾25mg/L、氧化型谷胱甘肽GSSG 1mmol/L、MgCl2 15mmol/L、FAD0.8μmol/L、叠氮钠2g/L和吐温20 0.8mL/L。试剂R2包括甘氨酸缓冲液520mmol/L、EGTA0.8mmol/L、二硫苏糖醇25mmol/L、NADPH 0.05mmol/L、叠氮钠1.5g/L和保护剂0.8g/L。其中，保护剂的类型和重量比于实施例7一致。
对比例7
与实施例7的区别在于，一种谷胱甘肽还原酶测定试剂盒，包括试剂R1和试剂R2，其中，试剂R1包括：磷酸缓冲液40mmol/L、EGTA 8mmol/L、抗坏血酸氧化酶0.8KU/L、丙酮酸氧化酶6KU/L、亚铁氰化钾3mg/L、氧化型谷胱甘肽GSSG 15mmol/L、MgCl2 0.8mmol/L、FAD25μmol/L、叠氮钠0.05g/L和表面活性剂15mL/L。试剂R2包括甘氨酸缓冲液40mmol/L、EGTA8mmol/L、二硫苏糖醇0.08mmol/L、NADPH 2mmol/L、叠氮钠0.05g/L和保护剂12g/L。其中，保护剂的类型和重量比于实施例7一致。
对比例8
与对比例7的区别在于，试剂盒中不包括EGTA和二硫苏糖醇。
对比例9
专利CN108828215B中的试剂盒。
实施例1-7和对比例1-8的试剂盒的制备方法，均包括以下步骤：
(1)配制试剂R1：取适量水，依次加入R1中的各原料，搅匀溶解一个原料后加入下一个原料，待各原料均匀混合后，调节pH至6.5-7.5，定容至所需体积；
(2)配制试剂R2：取适量水，依次加入R1中的各原料，搅匀溶解一个原料后加入下一个原料，待各原料均匀混合后，调节pH至9.0-10.0，定容至所需体积。
一、线性范围试验
本发明中的试剂为液体，可直接使用，测定方法如表1所示：
表1
Figure BDA0002412663790000071
【测定条件】如表2所示：
表2
Figure BDA0002412663790000072
【计算公式】：
Figure BDA0002412663790000073
【样本要求】：
1.血清。
2.取血到实验室后须立即分离血清。血清在2～8℃可稳定2天，-20℃可保存一个月。
按照已知活度分组，1-5组对应活度分别为10U/L、50U/L、100U/L、150U/L和200U/L，最终得到实施例1-7、对比例1和对比例3-9中样品的活性，如表3所示：
表3
Figure BDA0002412663790000081
由表3可知，本发明中实施例1-7的试剂盒能够较为准确地测定活度10U/L-200U/L范围内的谷胱甘肽还原酶，其中，实施例3-4优于实施例1-2，实施例7最优，最终测得的数值与理论值最为接近，由此可知，本发明中的试剂盒拥有较广的线性范围，而EGTA的加入能够进一步扩大试剂盒的线性范围。对比例1、对比例3以及对比例5-9中试剂盒的线性范围相对而言窄于实施例7的线性范围，即本发明保护范围外的技术方案制备得到的试剂盒线性范围相对较小，由此可知，试剂盒中试剂的成分与含量(包括EGTA以及缓冲液等)能够影响试剂盒最终的线性范围，本发明中的试剂盒在谷胱甘肽还原酶的测定中拥有更广的线性范围。
二、稳定性试验
试验方法：将实施例1-7和对比例2-9中的试剂R1和R2置于恒温摇床内，在37℃转速100rpm条件下振荡，每天取出检测，监测靶值为50U/L质控品的数值，重复检测三遍，记录并计算平均值，检测质控品数值的变化从而来反应试剂的稳定性，连续检测7天，检测结果统计至表4。
表4
Figure BDA0002412663790000082
Figure BDA0002412663790000091
由表4可知，本发明中实施例1-7的试剂盒中的试剂拥有较高的稳定性，其中，实施例5-6的稳定性优于实施例3-4，而实施例7的稳定性则最优，由此可知，二硫苏糖醇的加入能够增强试剂盒的稳定性。对比例2-9与实施例7中的试剂盒相比，稳定性均相对较差，即表明本发明保护范围外的技术方案制备的试剂盒稳定性较差，由此可知，试剂的成分与含量(包括二硫苏糖醇、缓冲液以及保护剂等)能够影响试剂盒的稳定性，本发明中的试剂盒拥有较高的稳定性。
三、准确性试验
取40份在检测浓度范围内不同浓度的人源血清样品，以对实施例7作为比对试剂，分别测定40个样本，每个样本测定一次。对两组检测结果进行相关性分析，计算相关系数r；以比对实施例7检测结果作为靶值，分别计算40对数据的相对偏差(Bias％)。要求r不小于0.990，相对偏差不超过±10％。最终得到的实施例1、对比例1、对比例2、对比例4分别与实施例7的相对偏差如表5所示，相关系数如表6所示。
表5
Figure BDA0002412663790000092
Figure BDA0002412663790000111
表6
实施例1与实施例7相关性系数R 0.9853
对比例1与实施例7相关性系数R 0.9966
对比例2与实施例7相关性系数R 0.9995
实施例4与实施例7相关性系数R 0.9996
由表5和表6可知，实施例1和对比例1与实施例7在测定时的偏差相对较大、线性相关系数小于0.999，而对比例2、对比例4与实施例7的测定偏差相对较小，线性相关系数大于0.999。由此可知，当试剂中不含有EGTA或者EGTA的含量在本发明保护范围外时试剂盒检测的准确性较差，而二硫苏糖醇的添加及保护剂的成分基本不会影响到试剂盒的准确性。
最后应当说明的是，以上内容仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，本领域的普通技术人员对本发明的技术方案进行的简单修改或者等同替换，均不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (10)

1.一种谷胱甘肽还原酶测定试剂盒，其特征在于：包括试剂R1和试剂R2，所述试剂R1包括：磷酸缓冲液、抗坏血酸氧化酶、丙酮酸氧化酶、亚铁氰化钾、氧化型谷胱甘肽、MgCl2、FAD、防腐剂和表面活性剂；所述试剂R2包括甘氨酸缓冲液、NADPH、防腐剂和保护剂。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂R1包括：磷酸缓冲液50-500mmol/L、抗坏血酸氧化酶1-5KU/L、丙酮酸氧化酶1-5KU/L、亚铁氰化钾5-20mg/L、氧化型谷胱甘肽GSSG 2-10mmol/L、MgCl2 1-10mmol/L、FAD 1-20μmol/L、防腐剂0.1-1g/L和表面活性剂1-10mL/L。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂R2包括甘氨酸缓冲液50-500mmol/L、NADPH 0.1-1mmol/L、防腐剂0.1-1g/L和保护剂1-10g/L。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂R1还包括EGTA 1-6mmol/L，所述试剂R2还包括EGTA 1-6mmol/L。
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂R2还包括二硫苏糖醇1-20mmol/L。
6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述磷酸缓冲液和甘氨酸缓冲液的重量比为1:10-10:1。
7.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：试剂R1或试剂R2中所述防腐剂为叠氮钠、PC300和硫酸庆大霉素中的一种或多种；试剂R1中所述表面活性剂为吐温20、吐温80、TritonX-100、TritonX-405、Brij-35和十二烷基苯磺酸钠中的一种多种；试剂R2中所述保护剂为海藻糖、葡聚糖、甘露醇、甘油和牛血清白蛋白总的一种或多种。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于：所述海藻糖、葡聚糖和甘油的重量比为1-9:1:3-10。
9.如权利要求1-8任一项所述的试剂盒的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)配制试剂R1：取适量水，依次加入试剂R1中的各原料，搅匀溶解一个原料后加入下一个原料，待各原料均匀混合后，调节pH至6.5-7.5，用水定容至所需体积，即得；
(2)配制试剂R2：取适量水，依次加入试剂R1中的各原料，搅匀溶解一个原料后加入下一个原料，待各原料均匀混合后，调节pH至9.0-10.0，用水定容至所需体积，即得。
10.如权利要求1-8任一项所述的试剂盒在谷胱甘肽还原酶非疾病测定中的应用。
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