CN114774509A

CN114774509A - 一种谷胱甘肽还原酶测定试剂盒

Info

Publication number: CN114774509A
Application number: CN202210608033.9A
Authority: CN
Inventors: 蔡其浩; 马庆伟; 易剑峰; 晏宗秀; 钱伟; 曾曜龙; 汪志义
Original assignee: Jiangxi Yingda Biotechnology Co ltd
Current assignee: Jiangxi Yingda Biotechnology Co ltd
Priority date: 2022-05-31
Filing date: 2022-05-31
Publication date: 2022-07-22

Abstract

本发明公开了一种谷胱甘肽还原酶测定试剂盒，所述试剂盒包括试剂R1和试剂R2，其特征在于所述试剂R1包括Tris缓冲液、抗坏血酸氧化酶、丙酮酸氧化酶、亚铁氰化钾、氧化型谷胱甘肽GSSG、MgCl₂和烷基糖苷；所述试剂R2包括：Tris缓冲液、NADPH和烷基糖苷。本发明通过谷胱甘肽还原酶测定试剂盒的试剂R1以及试剂R2中添加烷基糖苷，该试剂盒稳定性好、线性范围广，能够实现谷胱甘肽还原酶的准确测定，适于临床应用及推广。

Description

一种谷胱甘肽还原酶测定试剂盒

技术领域

本发明属于生化检测技术领域，具体涉及一种谷胱甘肽还原酶测定试剂盒。

背景技术

谷胱甘肽还原酶(GR)是一种黄素酶，每分子酶蛋白含有一分子的FAD。由辅酶NADPH供氢，催化氧化型谷胱甘肽(GSSG)，还原成还原型谷胱甘肽(GSH)。还原型谷胱甘肽(GSH)可使含巯基(-SH)的酶处于还原状态及活性状态，维持红细胞膜的完整性，防止血红蛋白氧化。GR在机体内活性强弱，依次为肝、肾、胰、心、甲状腺、红细胞和血浆。GR定位于微粒体及细胞液部分。因各脏器的组织细胞普遍含有GR，因而GR在机体氧化还原反应中起了举足轻重的地位。

在正常机体代谢过程中，机体存在有效的抗氧化防御系统，不断产生的氧自由基在抗氧化系统的作用下不断地被清除，从而维持生理水平的浓度。抗氧化系统包括细胞内抗氧化酶系统和非酶性的抗氧化剂，其中最主要的是谷胱甘肽抗氧化物酶系统。谷胱甘肽抗氧化物酶系统主要包括谷胱甘肽(GSH)，谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)，谷胱甘肽还原酶(GR)，谷胱甘肽巯基转移酶(GST)。谷胱甘肽是人类细胞中自然合成的，主要在肝内合成，由谷氨酸、半胱氨酸、甘氨酸组成的小分子三肽化合物，是细胞内主要的非蛋白质巯基化合物。在细胞内正常环境下以硫醇还原性(GSH)存在，还原型是其主要的活性状态，大约占95％；氧化型谷胱甘肽(GSSG)是非活性状态，约占1％。内源性GSH主要存在于胞浆内，由γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶和谷胱甘肽合成酶催化合成。GSH含有的巯基是其发挥主要作用的基团。在许多生命活动包括基因表达调控、酶活性和代谢调节、对细胞的保护、氨基酸转运、免疫功能调节等起着直接或间接的作用。氧化应激或亲电化合物攻击可使细胞内GSH含量下降，或使其转变为双硫氧化性(GSSG)。GR是一种黄素蛋白氧化还原酶，以还原性辅酶Ⅱ为供氢体，能催化GSSG还原成GSH，对于维持生物体GSH和GSSG比的稳定、保持体内氧自由基平衡起着重要作用。GPX可以特异的催化GSH对过氧化氢的还原反应，起到保护细胞膜结构和功能完整的作用，而且能够使脂质过氧化物变成无毒的羟化物。GST在GPX活力低下的条件下，具有清除体内氧自由基的功能，同时能使有害的亲电物质与GSH结合，将其排出体外，从而起到保护体内蛋白质和核酸等的功能。

目前，测定谷胱甘肽还原酶的方法主要有Elisa法和紫外酶法，前者需要手工操作，耗时较长，步骤繁琐，成本较高，后者步骤简单，成本较低，被广泛推广应用。后者的检测原理在于：本谷胱甘肽还原酶(GR)催化氧化型谷胱甘肽(GSSG)还原成还原型谷胱甘肽(GSH)，同时还原型辅酶Ⅱ(NADPH)被氧化成为辅酶Ⅱ(NADP⁺)。NADPH在波长340nm有特异吸收峰，其氧化的速率与血清中GR的活性成正比，在340nm处测定NADPH吸光度下降的速率，即可计算出GR活性。为了提高紫外酶法谷胱甘肽还原酶测定试剂盒检测的准确度和保存稳定性，通常需要加入大量的防腐剂、表面活性剂和稳定剂。

例如，中国授权专利CN108828215B公开了一种谷胱甘肽还原酶测定试剂盒，试剂盒含有试剂R1和试剂R2；试剂R1中含有以下成分：Tris缓冲液50-200mmol/L、EDTA 0.5-2mmol/L、丙酮酸羧化酶1-5KU/L、抗坏血酸氧化酶1-5KU/L、亚铁氰化钾5-20mg/L、表面活性剂、防腐剂；试剂R2中含有以下成分：Tris缓冲液50-200mmol/L、EDTA 0.5-2mmol/L、GSSG2-10mmol/L、NADPH 0.1-0.5mmol/L、稳定剂1-15g/L、防腐剂0.5-2g/L。该试剂盒是一种稳定性强，抗干扰能力强的液体试剂盒。

再例如，中国授权专利CN110734952B公开了一种谷胱甘肽还原酶检测试剂盒，包括以下组分：第一试剂，包括磷酸盐缓冲液、EDTA-NA2、抗坏血酸氧化酶、高铁氰化钾、防腐剂和氧化型谷胱甘肽；第二试剂，包括三羟甲基胺基甲烷缓冲液、EGTA、防腐剂和还原型辅酶。第一试剂和第二试剂均为液态，可在2～8℃环境下保存12个月；高铁氰化钾能氧化血红蛋白，生成稳定的氰化高铁血红蛋白，减小检测结果的影响；第二试剂采用EGTA能提高检测结果与吸光度变化率的线性关系，便于采用二点定标。本发明还公开了一种采用上述谷胱甘肽还原酶检测试剂盒的应用，步骤为：分别向样本液中加入第一试剂和第二试剂，放入生化分析仪内孵育，读取吸光度并计算吸光度变化率△A1，再计算样本的谷胱甘肽还原酶活性。

再例如，中国授权专利CN111321198B公开了一种谷胱甘肽还原酶测定试剂盒及其制备方法和应用，涉及生化试剂测定技术领域，该试剂盒包括试剂R1和试剂R2，所述试剂R1包括：磷酸缓冲液、抗坏血酸氧化酶、丙酮酸氧化酶、亚铁氰化钾、氧化型谷胱甘肽、MgCl2、FAD、防腐剂和表面活性剂；所述试剂R2包括Tris缓冲液、NADPH、防腐剂和保护剂。通过在试剂中加入EGTA以及二硫苏糖醇能够扩大试剂盒的线性范围、提高试剂盒的稳定性。

从上述现有技术的报道来看，谷胱甘肽还原酶测定试剂盒仍然存在配发复杂，导致品质控制和成本较高。因此，在确保检测质量和试剂盒的稳定性的情况下，如何进一步优化谷胱甘肽还原酶测定试剂盒的配方，仍然是本领域技术人员亟待解决的技术问题。

发明内容

基于上述原因，本发明提出一种谷胱甘肽还原酶测定试剂盒。具体而言，为了实现本发明的目的，本发明拟采用如下的技术方案：

本发明一方面涉及一种谷胱甘肽还原酶测定试剂盒，所述试剂盒包括试剂R1和试剂R2，其特征在于所述试剂R1包括Tris缓冲液、抗坏血酸氧化酶、丙酮酸氧化酶、亚铁氰化钾、氧化型谷胱甘肽GSSG、MgCl₂和烷基糖苷；所述试剂R2包括：Tris缓冲液、NADPH和烷基糖苷；所述试剂R1和试剂R2中的烷基糖苷相同或者不同。

在本发明的一个优选实施方式中，所述烷基糖苷在试剂R1中的含量是0.5-2g/L。

在本发明的一个优选实施方式中，所述烷基糖苷在试剂R2中的含量是0.5-2g/L。

在本发明的一个优选实施方式中，所述氧化型谷胱甘肽GSSG在试剂R1中的含量是1-3mmol/L。

在本发明的一个优选实施方式中，所述NADPH在试剂R2中的含量是0.05-0.2mmol/L。

在本发明的一个优选实施方式中，所述烷基糖苷选自烷基糖苷APG0810、烷基糖苷APG1214和烷基糖苷APG0814中的一种或者多种的组合；特别优选的，所述烷基糖苷为烷基糖苷APG1214。

在本发明的一个优选实施方式中，所述试剂R1和/或试剂R2中不包括其它防腐剂。需要说明的，在本领域中，防腐剂有时候也被称为抗菌剂、抑菌剂、稳定剂。

在本发明的一个优选实施方式中，所述试剂R1和/或试剂R2中不包括其它表面活性剂。

在本发明的一个优选实施方式中，所述试剂R1由Tris缓冲液40-60mmol/L、抗坏血酸氧化酶0.5-2KU/L、丙酮酸氧化酶0.5-2KU/L、亚铁氰化钾4-6mg/L、氧化型谷胱甘肽GSSG1-3mmol/L、MgCl₂ 0.05-2mmol/L和烷基糖苷0.5-2g/L组成。

在本发明的一个优选实施方式中，所述试剂R2由Tris缓冲液40-60mmol/L、NADPH0.05-0.2mmol/L和烷基糖苷0.5-2g/L组成。

本发明另一方面还涉及上述试剂盒的应用，所述试剂盒用于定量检测谷胱甘肽还原酶的含量。

有益效果

本发明通过谷胱甘肽还原酶测定试剂盒的试剂R1以及试剂R2中添加烷基糖苷，该试剂盒稳定性好、线性范围广，能够实现谷胱甘肽还原酶的准确测定，适于临床应用及推广。

具体实施方式

为了进一步理解本发明，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

如无特殊说明，本发明实施例中所涉及的试剂均为市售产品，均可以通过商业渠道购买获得。

实施例1：

一种谷胱甘肽还原酶测定试剂盒，包括试剂R1和试剂R2，其中，试剂R1包括：Tris缓冲液50mmol/L、抗坏血酸氧化酶1KU/L、丙酮酸氧化酶1KU/L、亚铁氰化钾5mg/L、氧化型谷胱甘肽GSSG 2mmol/L、MgCl₂ 1mmol/L和烷基糖苷APG0810 1g/L。试剂R2包括：Tris缓冲液50mmol/L、NADPH 0.1mmol/L和烷基糖苷APG0810 1g/L。

实施例2：

一种谷胱甘肽还原酶测定试剂盒，包括试剂R1和试剂R2，其中，试剂R1包括：Tris缓冲液50mmol/L、抗坏血酸氧化酶1KU/L、丙酮酸氧化酶1KU/L、亚铁氰化钾5mg/L、氧化型谷胱甘肽GSSG 2mmol/L、MgCl₂ 1mmol/L和烷基糖苷APG1214 1g/L。试剂R2包括：Tris缓冲液50mmol/L、NADPH 0.1mmol/L和烷基糖苷APG1214 1g/L。

实施例3：

一种谷胱甘肽还原酶测定试剂盒，包括试剂R1和试剂R2，其中，试剂R1包括：Tris缓冲液50mmol/L、抗坏血酸氧化酶1KU/L、丙酮酸氧化酶1KU/L、亚铁氰化钾5mg/L、氧化型谷胱甘肽GSSG 2mmol/L、MgCl₂ 1mmol/L和烷基糖苷APG0814 1g/L。试剂R2包括：Tris缓冲液50mmol/L、NADPH 0.1mmol/L和烷基糖苷APG0814 1g/L。

比较例1：

一种谷胱甘肽还原酶测定试剂盒，包括试剂R1和试剂R2，其中，试剂R1包括：Tris缓冲液50mmol/L、抗坏血酸氧化酶1KU/L、丙酮酸氧化酶1KU/L、亚铁氰化钾5mg/L、氧化型谷胱甘肽GSSG 2mmol/L、MgCl₂ 1mmol/L和吐温20 1g/L。试剂R2包括：Tris缓冲液50mmol/L、NADPH 0.1mmol/L和吐温20 1g/L。

实施例4：试剂盒的应用

上述的谷胱甘肽还原酶检测试剂盒的应用，包括以下步骤：

(1)取新鲜血液，制成样本液；

(2)向所述样本液中加入所述第一试剂R1混合均匀，得混合液；

(3)将混合液置于生化分析仪内，调节温度为37℃，孵育300秒；

(4)加入第二试剂R2，调节温度为37℃，孵育60秒；

(5)用全自动生化分析仪测定反应后的吸光度差值(主波长340nm，副波长405nm)，测定方法为两点终点法，定标曲线的方式为两点定标；

(6)根据吸光度变化值计算出样本中GR的浓度。

在本实施例中，生化分析仪采用日立7180型全自动生化分析仪，校准品为已知的磷酸盐缓冲液、牛血清和蔗糖的混合物。

(1)准确度验证

使用试剂盒对质控品进行准确度测试，设3个重复，通过日立7180型全自动生化分析仪读取信号，计算测定均值与靶值的相对偏差进行准确度验证。检测结果如下表1所示：

表1：准确度验证结果

由上述实验结果可知，实施例1-3与靶值的相对偏差均不超过1.0％，实验结果说明本发明所述谷胱甘肽还原酶检测试剂盒的准确度较好。

(2)精密度验证

取临床特低值样本、中值样本以及高值样本，使用实施例和比较例的试剂盒分别对样本进行测试，每个样本分别重复测定10次，通过日立7180型全自动生化分析仪读取信号，分别计算测定均值和标准差，计算变异系数进行精密度考察。检测结果如下表2所示：

表2：精密度验证结果

由上述实验结果可知，在低值样本、中值样本以及高值样本检测时的变异系数分别均小于1.0％。实验结果说明本发明所述的谷胱甘肽还原酶检测试剂盒具有较高的精密度。

(3)线性范围验证

择临床超高值样本以及低值样本，随后利用高值样本以及低值样本按比例配置各浓度梯度样本，使用本发明所述试剂盒分别对样本进行测试，每个样本分别重复测定3次，通过日立7180型全自动生化分析仪读取信号，分别计算测定均值进行线性范围考察,检测值与理论值的相对偏差小于1.0％作为线性范围。检测结果如下表3所示：

表3：试剂盒线性范围

编号	下限值(U/L)	上限值(U/L)	R<sup>2</sup>
				实施例1	5	320	0.9961
实施例2	5	400	0.9994
				实施例3	5	400	0.9992
比较例1	20	280	0.9855

由上述实验结果可知，本发明所述试剂盒组检测值与理论值的相关性R²为0.99以上，线性范围在5-320U/L之间，特别是实施例2和3，其检测值与理论值的相关性R²为0.999以上，线性范围在5-400U/L之间。实验结果说明本发明所述的谷胱甘肽还原酶检测试剂盒在线性范围内具有较好的线性相关性。

(4)稳定性验证

试验方法：将实施例1-3和对比例1中的试剂R1和R2置于恒温摇床内，在37℃转速100rpm条件下振荡，隔天取出检测，监测靶值为60U/L质控品的数值，重复检测三遍，记录并计算平均值，检测质控品数值的变化从而来反应试剂的稳定性，连续检测6次(共计10天)，检测结果如下表4所示：

天数	0	2	4	6	8	10
							实施例1	59.6	57.9	56.5	54.6	53.3	52.2
实施例2	59.4	58.1	57.4	55.4	54.3	53.6
							实施例3	59.5	58.8	58.0	55.6	54.1	53.2
比较例1	59.1	55.6	51.3	47.9	44.6	40.2

由表4的实验结果可知，本发明中实施例1-3的试剂盒中的试剂拥有较高的稳定性，其中，实施例2和3的稳定性优于实施例1，而实施例2的稳定性则最优，由此可知，相比于其它表面活性剂，烷基糖苷的加入能够增强试剂盒的稳定性。

以上描述了本发明优选实施方式，然其并非用以限定本发明。本领域技术人员对在此公开的实施方案可进行并不偏离本发明范畴和精神的改进和变化。

Claims

1.一种谷胱甘肽还原酶测定试剂盒，所述试剂盒包括试剂R1和试剂R2，其特征在于所述试剂R1包括Tris缓冲液、抗坏血酸氧化酶、丙酮酸氧化酶、亚铁氰化钾、氧化型谷胱甘肽GSSG、MgCl₂和烷基糖苷；所述试剂R2包括：Tris缓冲液、NADPH和烷基糖苷；所述试剂R1和试剂R2中的烷基糖苷相同或者不同。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，所述烷基糖苷在试剂R1中的含量是0.5-2g/L。

3.根据权利要求1所述的试剂盒，所述烷基糖苷在试剂R2中的含量是0.5-2g/L。

4.根据权利要求1所述的试剂盒，所述氧化型谷胱甘肽GSSG在试剂R1中的含量是1-3mmol/L。

5.根据权利要求1所述的试剂盒，所述NADPH在试剂R2中的含量是0.05-0.2mmol/L。

6.根据权利要求1所述的试剂盒，所述烷基糖苷选自烷基糖苷APG0810、烷基糖苷APG1214和烷基糖苷APG0814中的一种或者多种的组合；特别优选的，所述烷基糖苷为烷基糖苷APG1214。

7.根据权利要求1所述的试剂盒，所述试剂R1和/或试剂R2中不包括其它防腐剂。

8.根据权利要求1所述的试剂盒，所述试剂R1由Tris缓冲液40-60mmol/L、抗坏血酸氧化酶0.5-2KU/L、丙酮酸氧化酶0.5-2KU/L、亚铁氰化钾4-6mg/L、氧化型谷胱甘肽GSSG 1-3mmol/L、MgCl₂ 0.05-2mmol/L和烷基糖苷0.5-2g/L组成。

9.根据权利要求1所述的试剂盒，所述试剂R2由Tris缓冲液40-60mmol/L、NADPH 0.05-0.2mmol/L和烷基糖苷0.5-2g/L组成。

10.权利要求1-9任意一项所述试剂盒的应用，所述试剂盒用于定量检测谷胱甘肽还原酶的含量。