CN110760565A - 一种对氧磷酶1的检测试剂盒及制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种对氧磷酶1的检测试剂盒，其特征在于：包括试剂R1和试剂R2，试剂R1的各组分及浓度包括：20‑100mmol/L的第一缓冲液、0.5‑2g/L的稳定剂、5‑20mmol/L的激活剂、1‑5g/L的抗干扰剂A、20‑60ml/L的表面活性剂、5‑20g/L的抗干扰剂B以及0.8‑2.0ml/L的防腐剂；试剂R2的各组分及浓度包括：20‑100mmol/L的第二缓冲液，2‑10mmol/L的对硝基苯乙酸乙酯，5‑20g/L的电解质，1‑5ml/L的助溶剂，5‑10g/L的促进剂以及0.8‑2.0ml/L的防腐剂。本发明的优点是：稳定性好、线性范围宽、准确度高、精密度好。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种对氧磷酶1的检测试剂及制备方法。
背景技术
PON1基因产物，也叫血清对氧磷酶，不仅在有机磷神经毒剂解毒中起重要作用，而且与动脉粥样硬化、冠心病及2型糖尿病等疾病发病有密切关系。
血清对氧磷酶的动物和体内实验表明，该蛋白可能有重要的病理生理学和药理学作用。随着分子生物学技术的发展，PON1基因产物的体外表达及基因治疗将成为可能，使其在有机磷农药中毒、心血管疾病和糖尿病血管并发症等救治中发挥重要作用。
已有的检测对氧磷酶1的试剂和检测方法存在着灵敏度和重复性差、检测时间长、准确性低的缺陷，限制了它的应用。因此，应该提供一种新的技术方案解决上述问题。
发明内容
本发明的目的是：提供一种稳定性好，准确度高的对氧磷酶1的检测试剂盒及制备方法。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：
一种对氧磷酶1的检测试剂盒，包括试剂R1和试剂R2，所述试剂R1的各组分及浓度包括：
所述试剂R2的各组分及浓度包括：
进一步的技术方案：
所述试剂R1中的第一缓冲液和试剂R2中的第二缓冲液分别为PBS缓冲液、HEPES缓冲液、GOOD’S缓冲液、MES缓冲液、Tris缓冲液中的一种或两种以上混合物。
所述试剂R1、R2中的防腐剂分别为叠氮钠、Proclin950、Proclin300、硫柳汞中的一种或两种以上混合物。
所述试剂R1中的稳定剂为酪蛋白、甘露醇、牛血清白蛋白中的一种或两种以上混合物。
所述试剂R1中的表面活性剂为2-吡咯烷酮、吐温20、曲拉通、聚乙烯吡咯烷酮、辛基苯基聚氧乙烯醚、NP-40中的一种或两种以上混合物。
具体的：
所述试剂R1中的激活剂为氯化钙，抗干扰剂A为亚铁氰化钾，抗干扰剂B为尿素。
所述试剂R2中的电解质为氯化钠、氯化钾、氯化镁、硫酸镁中一种或两种以上混合物。
所述试剂R2中助溶剂为丙三醇、苯甲酸钠、水杨酸钠、对氨基苯甲酸、尿素、菸酰胺、乙酰胺中的一种或两种以上混合物。
所述试剂R2中促进剂为聚乙二醇8000、聚乙二醇6000、聚乙二醇4000、聚乙二醇2000中的一种或两种以上混合物。
对氧磷酶1的检测试剂盒的制备方法，包括如下步骤，
(1)、试剂R1制备；
在配液罐中先加入适量纯化水于磁力搅拌器上，调节搅拌器至中档转速，使溶液保持中速转动状态，按照以上浓度要求边搅拌边投入第一缓冲液、稳定剂、激活剂、抗干扰剂A、表面活性剂、抗干扰剂B和防腐剂，搅拌20-30分钟至物料完全溶解、溶液清澈透明、配液罐底部无沉淀后，调节pH值到6.30-9.50之间，最后定容至最终体积，存放在成品罐中，进行标识；
(2)、试剂R2制备；
在配液罐中先加入适量纯化水于磁力搅拌器上，调节搅拌器至中档转速，使溶液保持中速转动状态，按照以上浓度要求边搅拌边投入第二缓冲液、对硝基苯乙酸乙酯、电解质、助溶剂、促进剂和防腐剂，搅拌20-30分钟至物料完全溶解、溶液清澈透明、配液罐底部无沉淀后，调节pH值到6.30-9.50之间，最后定容至最终体积，存放在成品罐中，进行标识。
由于上述技术方案的应用，本发明与现有技术相比具有如下优点：
1、该发明首次实现在全自动生化分析仪上检测对氧磷酶1的活性，该方法使用的样本量较少，与其他检测方法相比具有简单、准确、快速的特点，并可在全自动生化分析仪上批量分析实现高通量检测。
2、本发明针对现有的检测试剂在检测过程中存在干扰物质较多，灵敏度较差的缺陷，在R1试剂中同时添加2-吡咯烷酮、亚铁氰化钾和尿素，可有效去除405nm波长附近的干扰，同时可使线性范围可达到2-300U/L，改善灵敏度，保证检测结果的准确性，可广泛应用大、中、小医院。
附图说明
图1是校准品定标曲线图
其中：X轴表示校准品浓度，Y轴表示吸光度。
图2是准确度线性曲线图
其中：X轴表示理论浓度，Y轴表示检测结果的均值。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步描述：
实施例1：
一种对氧磷酶1的检测试剂盒，包括试剂R1和试剂R2，所述试剂R1的各组分及浓度包括：作为第一缓冲液的三羟甲基氨基甲烷，其浓度为20mmol/L、作为稳定剂的牛血清白蛋白，其浓度为0.5g/L、作为激活剂的氯化钙，其浓度为10mmol/L、作为抗干扰剂的亚铁氰化钾，其浓度为3g/L、作为表面活性剂的2-吡咯烷酮，其浓度为20ml/L、同样作为抗干扰剂的尿素，其浓度为20g/L以及作为防腐剂的Proclin950，其浓雾为0.8ml/L。
所述试剂R2的各组分及浓度包括：作为第二缓冲液的三羟甲基氨基甲烷，其浓度为100mmol/L、浓度为10mmol/L的对硝基苯乙酸乙酯、作为电解质的氯化钠，其浓度为15g/L、作为助溶剂的丙三醇，其浓度为5ml/L、作为促进剂的聚乙二醇6000，其浓度为10g/L以及作为防腐剂的Proclin950，其浓度为2.0ml/L。
以上对氧磷酶1的检测试剂盒的制备方法，包括如下步骤，
A)、试剂R1制备；
在配液罐中先加入适量纯化水于磁力搅拌器上，调节搅拌器至中档转速，使溶液保持中速转动状态，按照上述的浓度要求边搅拌边投入三羟甲基氨基甲烷、牛血清白蛋白、氯化钙、亚铁氰化钾、2-吡咯烷酮、尿素和Proclin950，搅拌20分钟至物料完全溶解、溶液清澈透明、配液罐底部无沉淀后，调节pH值为6.30，最后定容至最终体积，存放在成品罐中，进行标识；
B)、试剂R2制备；
在配液罐中先加入适量纯化水于磁力搅拌器上，调节搅拌器至中档转速，使溶液保持中速转动状态，按照上述浓度要求边搅拌边投入三羟甲基氨基甲烷、对硝基苯乙酸乙酯、氯化钠、丙三醇、聚乙二醇6000和Proclin950，搅拌30分钟至物料完全溶解、溶液清澈透明、配液罐底部无沉淀后，调节pH值为6.30之间，最后定容至最终体积，存放在成品罐中，进行标识。
实施例2
一种对氧磷酶1的检测试剂盒，包括试剂R1和试剂R2，所述试剂R1的各组分及浓度包括：作为第一缓冲液的4-羟乙基哌嗪乙磺酸，其浓度为60mmol/L、作为稳定剂的甘露醇和牛血清白蛋白的混合物，其浓度为1g/L、作为激活剂的氯化钙，其浓度为5mmol/L、作为抗干扰剂的亚铁氰化钾，其浓度为5g/L、作为表面活性剂的聚乙烯吡咯烷酮，其浓度为40ml/L，同样作为抗干扰剂的尿素，其浓度为5g/L以及作为防腐剂的Proclin300，其浓雾为1.3ml/L。
所述试剂R2的各组分及浓度包括：作为第二缓冲液的4-羟乙基哌嗪乙磺酸，其浓度为20mmol/L、浓度为7mmol/L的对硝基苯乙酸乙酯、作为电解质的氯化钾，其浓度为5g/L、作为助溶剂的水杨酸钠，其浓度为1ml/L、作为促进剂的聚乙二醇4000，其浓度为8g/L以及作为防腐剂的Proclin300，其浓度为1.3ml/L。
以上对氧磷酶1的检测试剂盒的制备方法，包括如下步骤，
A)、试剂R1制备；
在配液罐中先加入适量纯化水于磁力搅拌器上，调节搅拌器至中档转速，使溶液保持中速转动状态，按照上述的浓度要求边搅拌边投入4-羟乙基哌嗪乙磺酸、甘露醇和牛血清白蛋白的混合物、氯化钙、亚铁氰化钾、聚乙烯吡咯烷酮、尿素和Proclin300，搅拌25分钟至物料完全溶解、溶液清澈透明、配液罐底部无沉淀后，调节pH值为8.0，最后定容至最终体积，存放在成品罐中，进行标识；
B)、试剂R2制备；
在配液罐中先加入适量纯化水于磁力搅拌器上，调节搅拌器至中档转速，使溶液保持中速转动状态，按照上述浓度要求边搅拌边投入4-羟乙基哌嗪乙磺酸、对硝基苯乙酸乙酯、氯化钾、水杨酸钠、聚乙二醇4000和Proclin300，搅拌20分钟至物料完全溶解、溶液清澈透明、配液罐底部无沉淀后，调节pH值为8.0，最后定容至最终体积，存放在成品罐中，进行标识。
实施例3
一种对氧磷酶1的检测试剂盒，包括试剂R1和试剂R2，所述试剂R1的各组分及浓度包括：作为第一缓冲液的2-(N-吗啡啉)乙磺酸，其浓度为100mmol/L、作为稳定剂的甘露醇，其浓度为2g/L、作为激活剂的氯化钙，其浓度为20mmol/L、作为抗干扰剂的亚铁氰化钾，其浓度为1g/L、作为表面活性剂的吐温20，其浓度为60ml/L，同样作为抗干扰剂的尿素，其浓度为13g/L以及作为防腐剂的叠氮钠，其浓雾为2.0ml/L。
所述试剂R2的各组分及浓度包括：作为第二缓冲液的2-(N-吗啡啉)乙磺酸，其浓度为60mmol/L、浓度为2mmol/L的对硝基苯乙酸乙酯、作为电解质的硫酸镁，其浓度为20g/L、作为助溶剂的乙酰胺，其浓度为3ml/L、作为促进剂的聚乙二醇2000，其浓度为5g/L以及作为防腐剂的叠氮钠，其浓度为0.8ml/L。
以上对氧磷酶1的检测试剂盒的制备方法，包括如下步骤，
A)、试剂R1制备；
在配液罐中先加入适量纯化水于磁力搅拌器上，调节搅拌器至中档转速，使溶液保持中速转动状态，按照上述的浓度要求边搅拌边投入2-(N-吗啡啉)乙磺酸、甘露醇、氯化钙、亚铁氰化钾、吐温20、尿素和叠氮钠，搅拌30分钟至物料完全溶解、溶液清澈透明、配液罐底部无沉淀后，调节pH值为9.50，最后定容至最终体积，存放在成品罐中，进行标识；
B)、试剂R2制备；
在配液罐中先加入适量纯化水于磁力搅拌器上，调节搅拌器至中档转速，使溶液保持中速转动状态，按照上述浓度要求边搅拌边投入2-(N-吗啡啉)乙磺酸、对硝基苯乙酸乙酯、硫酸镁、乙酰胺、聚乙二醇2000和叠氮钠，搅拌25分钟至物料完全溶解、溶液清澈透明、配液罐底部无沉淀后，调节pH值为9.50之间，最后定容至最终体积，存放在成品罐中，进行标识。
本发明对氧磷酶1的检测试剂盒的应用，其工作原理是:
即：血清样本中对氧磷酶1(PON-1)能够催化降解对硝基苯乙酸乙酯，生成对硝基酚和乙酸。通过在405nm波长条件下测定对硝基苯酚的含量，确定对氧磷酶1活性的大小。
下面通过具体的实验，结合表格和曲线图，对本发明对氧磷酶1的检测试剂盒的几个重要指标进行说明，具体如下：
1、定标：
使用校准品进行定标，结果如表1所示，定标曲线如图1所示。
表1、校准品定标结果：
2、线性范围检测：
选取待测样本用生理盐水进行稀释，产生接近于方法线性范围低限浓度水平的样本，一般为4个浓度水平，分别为：1.50U/L、2.00U/L、2.50U/L和3.00U/L。每个浓度水平样本重复测定10次。以CV≤8％为可接受界值，由数据中选取CV值等于或小于可接受界值的最低浓度水平做为检测范围低限。检测结果如下表：
| 理论浓度(U/L) | 1.50 | 2.00 | 2.50 | 3.00 |
| 1 | 1.27 | 2.00 | 2.68 | 3.08 |
| 2 | 1.63 | 2.14 | 2.30 | 2.95 |
| 3 | 1.45 | 1.89 | 2.44 | 3.05 |
| 4 | 1.56 | 1.93 | 2.35 | 3.15 |
| 5 | 1.44 | 2.20 | 2.44 | 3.02 |
| 6 | 1.36 | 1.89 | 2.60 | 3.13 |
| 7 | 1.70 | 2.18 | 2.70 | 3.08 |
| 8 | 1.59 | 1.90 | 2.49 | 2.82 |
| 9 | 1.30 | 2.05 | 2.38 | 2.91 |
| 10 | 1.47 | 2.12 | 2.53 | 3.17 |
| 均值 | 1.48 | 2.03 | 2.49 | 3.04 |
| SD | 0.14 | 0.12 | 0.14 | 0.11 |
| CV％ | 9.65％ | 6.12％ | 5.46％ | 3.71％ |
可见：当样本浓度低于2.00U/L时，CV＞8％。当样本浓度高于2.00U/L时，CV＜8％。故线性范围低限定为2.00U/L。
选取待测样本用生理盐水进行稀释，产生接近于方法线性范围高限浓度水平的样本，一般为4个浓度水平，分别为：240U/L、270U/L、300U/L和330U/L。每个浓度水平样本重复测定10次。以CV≤8％为可接受界值，由数据中选取CV值等于或小于可接受界值的最高浓度水平做为检测范围高限。检测结果如下表：
可见：当样本浓度高于300U/L时，CV＞8％。当样本浓度低于300U/L时，CV＜8％。故线性范围高限定为300U/L。
结论：该发明的线性范围可做到2-300U/L。
3、重复性CV检测：
以临床血清为样本，重复测定10次，检测结果如下表：
| 1 | 6.90 | 20.00 | 145.27 | 307.40 |
| 2 | 6.93 | 22.78 | 158.72 | 286.43 |
| 3 | 6.39 | 22.84 | 149.50 | 289.65 |
| 4 | 6.10 | 22.83 | 155.11 | 308.68 |
| 5 | 6.90 | 22.94 | 143.99 | 297.65 |
| 6 | 6.77 | 21.45 | 152.01 | 317.32 |
| 7 | 6.88 | 22.28 | 154.73 | 296.37 |
| 8 | 6.25 | 22.39 | 156.53 | 306.05 |
| 9 | 6.35 | 20.94 | 143.05 | 294.80 |
| 10 | 6.59 | 22.05 | 151.11 | 291.73 |
| 均值 | 6.61 | 22.05 | 151.00 | 299.61 |
| SD | 0.31 | 0.97 | 5.47 | 9.84 |
| CV％ | 4.72％ | 4.41％ | 3.62％ | 3.28％ |
结论：重复性CV均较小，8％以内。
4、准确度检测：
选取不同浓度临床血清样本，用试剂盒分别检测每个浓度3次，分别测出每个浓度检测结果的均值(Yi)。以理论浓度(Xi)为自变量，以检测结果的均值(Yi)为因变量求出线性回归方程并计算绝对偏差和相对偏差，准确度检测结果如下表，准确度线性曲线如图2。
结论：得出线性回归方程为R2＝0.9986，绝对偏差≤5U/L，相对偏差≤5％。
综上：本发明的对氧磷酶1的检测方法与其他检测方法相比具有简单、准确、快速的特点，并可在全自动生化分析仪上批量分析实现高通量检测。该检测试剂盒具有稳定性好、线性范围宽、准确度高、精密度好、检测时间短等优点。
以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明所述原理的前提下，还可以作出若干改进或替换，这些改进或替换也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种对氧磷酶1的检测试剂盒，其特征在于：包括试剂R1和试剂R2，所述试剂R1的各组分及浓度包括：
所述试剂R2的各组分及浓度包括：
2.根据权利要求1所述的一种对氧磷酶1的检测试剂盒，其特征在于：所述试剂R1中的第一缓冲液和试剂R2中的第二缓冲液分别为PBS缓冲液、HEPES缓冲液、GOOD’S缓冲液、MES缓冲液、Tris缓冲液中的一种或两种以上混合物。
3.根据权利要求1或2所述的一种对氧磷酶1的检测试剂盒，其特征在于：所述试剂R1、R2中的防腐剂分别为叠氮钠、Proclin950、Proclin300、硫柳汞中的一种或两种以上混合物。
4.根据权利要求3所述的一种对氧磷酶1的检测试剂盒，其特征在于：所述试剂R1中的稳定剂为酪蛋白、甘露醇、牛血清白蛋白中的一种或两种以上混合物。
5.根据权利要求4所述的一种对氧磷酶1的检测试剂盒，其特征在于：所述试剂R1中的表面活性剂为2-吡咯烷酮、吐温20、曲拉通、聚乙烯吡咯烷酮、辛基苯基聚氧乙烯醚、NP-40中的一种或两种以上混合物。
6.根据权利要求4或5所述的一种对氧磷酶1的检测试剂盒，其特征在于：所述试剂R1中的激活剂为氯化钙，抗干扰剂A为亚铁氰化钾，抗干扰剂B为尿素。
7.根据权利要求6所述的一种对氧磷酶1的检测试剂盒，其特征在于：所述试剂R2中的电解质为氯化钠、氯化钾、氯化镁、硫酸镁中一种或两种以上混合物。
8.根据权利要求7所述的一种对氧磷酶1的检测试剂盒，其特征在于：所述试剂R2中助溶剂为丙三醇、苯甲酸钠、水杨酸钠、对氨基苯甲酸、尿素、菸酰胺、乙酰胺中的一种或两种以上混合物。
9.根据权利要求7或8所述的一种对氧磷酶1的检测试剂盒，其特征在于：所述试剂R2中促进剂为聚乙二醇8000、聚乙二醇6000、聚乙二醇4000、聚乙二醇2000中的一种或两种以上混合物。
10.如权利要求1-9任一项的对氧磷酶1的检测试剂盒的制备方法，其特征在于：包括如下步骤，
(1)、试剂R1制备；
在配液罐中先加入适量纯化水于磁力搅拌器上，调节搅拌器至中档转速，使溶液保持中速转动状态，按照权利要求1中的浓度要求边搅拌边投入第一缓冲液、稳定剂、激活剂、抗干扰剂A、表面活性剂、抗干扰剂B和防腐剂，搅拌20-30分钟至物料完全溶解、溶液清澈透明、配液罐底部无沉淀后，调节pH值到6.30-9.50之间，最后定容至最终体积，存放在成品罐中，进行标识；
(2)、试剂R2制备；
在配液罐中先加入适量纯化水于磁力搅拌器上，调节搅拌器至中档转速，使溶液保持中速转动状态，按照权利要求1中的浓度要求边搅拌边投入第二缓冲液、对硝基苯乙酸乙酯、电解质、助溶剂、促进剂和防腐剂，搅拌20-30分钟至物料完全溶解、溶液清澈透明、配液罐底部无沉淀后，调节pH值到6.30-9.50之间，最后定容至最终体积，存放在成品罐中，进行标识。
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