CN109633161A - 一种基于胶乳增强免疫比浊法的降钙素原检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本申请涉及一种基于胶乳增强免疫比浊法的降钙素原(PCT)检测试剂盒,包括试剂R1和试剂R2,试剂R1包含表面活性剂,试剂R2包含PCT抗体包被的胶乳微球,其中试剂R1中的表面活性剂为Triton X‑100、辛酰硫代甜菜碱或Emulgen B66或它们的组合,试剂R2中的PCT抗体包被的胶乳微球用甘氨酸、甘氨酸和1,2‑乙二胺的混合物或甘氨酸和酪蛋白的混合物作为封闭试剂进行封闭,封闭试剂的pH值为8.2,但当试剂R1中的表面活性剂为Triton X‑100时,试剂R2中的PCT抗体包被的胶乳微球不用单独的甘氨酸封闭。该检测试剂盒具有降低检测的背景信号而不降低免疫反应度的效果。
Description
技术领域
本发明涉及医疗检测技术领域,特别是胶乳增强免疫比浊法检测技术领域, 具体涉及一种基于胶乳增强免疫比浊法的降钙素原检测试剂盒。
背景技术
降钙素原(PCT)是一种蛋白质,在健康人体内含量极少,其在血浆中的水平 通常小于0.1ng/mL,但在人体处于病理状态下,各组织器官几乎都能分泌PCT。 影响PCT水平的因素包括被感染器官的大小和类型、细菌的种类、炎症的程度 和免疫反应的状况等。当人体受到严重的细菌、真菌、寄生虫感染以及出现脓 毒症和多脏器功能衰竭时,PCT在血浆中的水平升高,而在自身免疫、过敏和 病毒感染时PCT不会升高,局部有限的细菌感染、轻微的感染和慢性炎症也不 会导致其升高。
因此,PCT反映了全身炎症反应的活跃程度,其可以作为炎症反应监测的 关键指标,已在临床中得到了广泛的应用。PCT临床诊断的适应症包括:对细 菌感染与病毒感染的鉴别诊断;对抗生素治疗效果的监测,指导临床抗生素的 使用;帮助系统性细菌感染及脓毒症的早期诊断,评估疾病严重程度及预后; 手术和严重创伤患者细菌感染并发症监测等。
目前临床检测PCT常用的方法有放射免疫学分析法、胶体金比色法、免疫 比浊法和化学发光法。免疫比浊法是目前较为常用的检测方法,其基本原理是, 抗原(例如PCT抗原)与抗体(例如PCT抗体)在稀释系统中反应形成可溶性 免疫复合物,在稀释系统中的促聚剂(如聚乙二醇等)的作用下自液相析出, 形成微粒,使反应液出现浊度;当抗体浓度固定时,形成的免疫复合物的量随 着待检测样本中抗原的量的增加而增加,反应液的浊度也随之增加;通过测定 反应液的浊度与一系列抗原标准品制作的校准曲线对照,得到样本中抗原的含 量。根据反应液的浊度的测定原理,免疫比浊法分为免疫透射比浊法和免疫散射比浊法。这两种方法的免疫反应几乎相同,区别在于透射比浊法检测的是免 疫复合物吸收入射光所引起的入射光信号减弱,散射比浊法检测的是免疫复合 物使入射光折射偏转所引起的散射光的信号强弱。为解决免疫复合物颗粒体积 小,检测灵敏度差的问题,还开发了胶乳增强免疫比浊法,即将待测抗原相对 应的抗体包被在胶乳微球(通常为聚苯乙烯胶乳微球)上,使抗原抗体结合物 的体积增大。检测时,由于体积较大的抗原抗体结合物的存在,透射光和散射 光的强度变化更为显著,从而提高检测的灵敏度。
目前常用的基于胶乳增强免疫比浊法的PCT检测试剂盒包括试剂R1和试 剂R2。试剂R1包括促聚剂、缓冲剂、表面活性剂、电解质、稳定剂和防腐剂 组分,其中表面活性剂使用Triton X-100。试剂R2包括PCT抗体包被的胶乳微 球、缓冲剂、表面活性剂、电解质、稳定剂和防腐剂组分,其中在PCT抗体包 被的胶乳微球的制备中,在PCT抗体包被反应后使用1M甘氨酸溶液(pH 8.0) 封闭反应。通过两点终点法检测PCT浓度,检测波长为主波长600nm,次波长 800nm。首先将试剂R1与含有PCT的待测样本混合并温育一段时间,然后加 入试剂R2混合反应一段时间,读取第一个吸光度A1(OD600-800),再反应一段时 间,读取第二个吸光度A2(OD600-800),计算吸光度差值△OD=A2-A1。通过将计 算得到的吸光度差值与使用标准PCT抗原浓度按相同方法制作的校准曲线对 照,得到待测样本中的PCT的浓度。应用两点终点法进行检测,可以减少检测 仪器带来的背景信号,但试剂R1和试剂R2的组分仍可能给检测带来背景信号, 影响检测灵敏度。由于本领域技术人员通常采购市售的基于胶乳增强免疫比浊 法的PCT检测试剂盒,未注意到也未能克服试剂盒的试剂R1和试剂R2所带来 的上述问题。
发明内容
本发明的目的在于对基于胶乳增强免疫比浊法的PCT检测试剂盒的试剂R1 和试剂R2进行优化,减少试剂给检测带来背景信号。
为此,本发明人经过深入的研究,开发出本发明的基于胶乳增强免疫比浊 法的降钙素原(PCT)检测试剂盒。
该检测试剂盒包括:
试剂R1和试剂R2,试剂R1包含促聚剂、缓冲剂、表面活性剂、电解质和 稳定剂,试剂R2包含PCT抗体包被的胶乳微球、缓冲剂、表面活性剂、电解 质和稳定剂,
其中,试剂R1中的表面活性剂为Triton X-100,试剂R2中的PCT抗体包 被的胶乳微球用0.5-1.5M甘氨酸和0.05-0.15M 1,2-乙二胺的混合物或0.5-1.5M 甘氨酸和1.5-2.5%酪蛋白的混合物作为封闭试剂进行封闭,
或者,所述试剂R1中的所述表面活性剂为Triton X-100与辛酰硫代甜菜碱 和/或Emulgen B66的组合,或者为辛酰硫代甜菜碱或Emulgen B66或它们的组 合,所述试剂R2中的所述PCT抗体包被的胶乳微球用0.5-1.5M甘氨酸、0.5-1.5 M甘氨酸和0.05-0.15M 1,2-乙二胺的混合物或0.5-1.5M甘氨酸和1.5-2.5%酪蛋 白的混合物作为封闭试剂进行封闭,
封闭试剂的pH值为大于6.5至小于10.1。
PCT抗体包被的胶乳微球的制备工艺是,将带有羟基的聚苯乙烯胶乳悬浊 液用N-羟基丁二酰亚胺(NHS)和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐 (EDAC)处理,得到活化聚苯乙烯胶乳悬浊液,然后将PCT抗体溶液加入到制得 的活化聚苯乙烯胶乳悬浊液中,进行PCT抗体包被反应,然后再加入封闭试剂 封闭反应,经离心、清洗后,得到PCT抗体包被的胶乳微球。
在本发明的优选实施方案中,试剂R1和试剂R2还包含防腐剂。
在本发明的优选实施方案中,试剂R1中的表面活性剂为辛酰硫代甜菜碱或Emulgen B66或它们的组合。
在本发明的优选实施方案中,试剂R2中的封闭试剂的pH值为8.2。
在本发明的优选实施方案中,试剂R2中的PCT抗体包被的胶乳微球用 0.5-1.5M甘氨酸和0.05-0.15M 1,2-乙二胺的混合物作为封闭试剂进行封闭;更 优选用1M甘氨酸和0.1M 1,2-乙二胺作为封闭试剂进行封闭。
本领域技术人员可以选择试剂R1的各组分的常规含量。在本发明的优选实 施方案中,试剂R1包含1.0-3.0%w/v的促聚剂、40-60mM的缓冲剂、0.05-0.15% w/v的表面活性剂、100-200mM的电解质、0.05-0.15%w/v的稳定剂和0.05-0.15% w/v的防腐剂。
本领域技术人员可以选择试剂R2的各组分的常规含量。在本发明的优选实 施方案中,试剂R2包含0.05-0.3%w/v的PCT抗体包被的胶乳微球、40-200mM 的缓冲剂、0.01-0.5%w/v的表面活性剂、10-200mM的电解质、0.05-1.0%w/v 的稳定剂和0.05-0.2%w/v的防腐剂。
本领域技术人员可以选择试剂R1的各组分的常规种类。在本发明的优选实 施方案中,试剂R1中的促聚剂选自聚乙二醇4000-200000或它们的组合,例如 聚乙二醇4000、聚乙二醇6000、聚乙二醇8000或聚乙二醇10000或聚乙二醇 20000等或它们的组合,缓冲剂选自三羟甲基氨基甲烷(Tris)或4-羟乙基哌嗪乙 磺酸(HEPES)或它们的组合,电解质选自氯化钠或氯化钾或它们的组合,稳定剂 选自海藻糖、甘油或牛血清白蛋白(BSA)或它们的组合,防腐剂选自硫柳汞、叠 氮钠或抗生素或它们的组合。
本领域技术人员可以选择试剂R2的各组分的常规种类。在本发明的优选实 施方案中,试剂R2中的缓冲剂选自三羟甲基氨基甲烷(Tris)或4-羟乙基哌嗪乙 磺酸(HEPES)或它们的组合,表面活性剂选自吐温20、吐温60或吐温80或它 们的组合,电解质选自氯化钠或氯化钾或它们的组合,稳定剂选自海藻糖、甘 油或牛血清白蛋白(BSA)或它们的组合,防腐剂选自硫柳汞、叠氮钠或抗生素或 它们的组合。
在本发明的更优选实施方案中,试剂R1包含1.0-3.0%w/v的聚乙二醇 10000、40-60mM的三羟甲基氨基甲烷(Tris)、0.05-0.15%w/v的辛酰硫代甜菜碱 或Emulgen B66或它们的组合、100-200mM的氯化钠、0.05-0.15%w/v的牛血 清白蛋白(BSA)、0.05-0.15%w/v的叠氮钠,pH为7.0-8.0;试剂R2包含0.05-0.3% w/v的PCT抗体包被的胶乳微球、40-200mM的4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)、 0.05-0.5%w/v的吐温20、10-200mM的氯化钠、0.05-1.0%w/v的牛血清白蛋白 (BSA)、0.05-0.1%w/v的叠氮钠,pH为7.0-9.0。
在本发明的一个还更优选的实施方案中,试剂R1包含2.0%w/v的聚乙二 醇10000、50mM的三羟甲基氨基甲烷(Tris)、0.1%w/v的辛酰硫代甜菜碱或 Emulgen B66或它们的组合、150mM的氯化钠、0.1%w/v的牛血清白蛋白 (BSA)、0.1%w/v的叠氮钠,pH为7.5;试剂R2包含0.1%w/v的PCT抗体包 被的胶乳微球、50mM的4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)、0.1%w/v的吐温20、 20mM的氯化钠、0.2%w/v的牛血清白蛋白(BSA)、0.1%w/v的叠氮钠,pH为 8.0。
在本发明的另一个还更优选的实施方案中,试剂R1包含2.0%w/v的聚乙 二醇10000、50mM的三羟甲基氨基甲烷(Tris)、0.05%w/v的辛酰硫代甜菜碱和 0.05%w/v的Emulgen B66、150mM的氯化钠、0.1%w/v的牛血清白蛋白(BSA)、 0.1%w/v的叠氮钠,pH为7.5;试剂R2包含0.1%w/v的PCT抗体包被的胶乳 微球、50mM的4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)、0.1%w/v的吐温20、20mM的 氯化钠、0.2%w/v的牛血清白蛋白(BSA)、0.1%w/v的叠氮钠,pH为8.0。
如本说明书具体实施方式部分所示,本发明人经过实验证实,一方面,试 剂R1使用辛酰硫代甜菜碱或Emulgen B66代替Triton X-100作为表面活性剂, 可以降低检测的背景信号,另一方面,试剂R2中的PCT抗体包被的胶乳微球 用1M甘氨酸和0.1M 1,2-乙二胺的混合物或1M甘氨酸和2%酪蛋白的混合物 代替1M甘氨酸作为封闭试剂进行封闭,且封闭试剂的pH值在大于6.5至小于 10.1的范围内,也可以降低检测的背景信号,同时不降低检测的免疫反应度。 因此,本发明的基于胶乳增强免疫比浊法的降钙素原(PCT)检测试剂盒通过采用 优化的试剂R1和优化的试剂R2,能够降低检测的背景信号,提高检测灵敏度。
具体实施方式
下面通过具体实施方式对本发明作进一步详细说明。
现有的基于胶乳增强免疫比浊法的PCT检测试剂盒包括试剂R1和试剂R2。 下文对试剂R1和试剂R2的组成和制备、PCT抗原校准曲线的制作和PCT抗原 的检测方法进行说明。在此基础上,研究了试剂R1中的表面活性剂的种类、试 剂R2中的PCT抗体包被的胶乳微球的封闭试剂种类和pH值对基于胶乳增强免 疫比浊法的PCT检测试剂盒的背景信号的影响,证明了本发明的用基于胶乳增 强免疫比浊法的PCT检测试剂盒具有降低检测的背景信号且不降低检测的免疫 反应度的效果。
1.试剂R1的组成和制备
1.1.试剂R1的组成
试剂R1包括聚乙二醇10000作为促聚剂、三羟甲基氨基甲烷(Tris)作为缓冲 剂、Triton X-100作为表面活性剂、氯化钠作为电解质、牛血清白蛋白(BSA)作 为稳定剂和叠氮钠作为防腐剂。具体组成如下:
pH 7.0-8.0
1.2.试剂R1的制备
将计算量的聚乙二醇10000、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、Triton X-100、氯化 钠、牛血清白蛋白(BSA)和叠氮钠加入到装有800mL纯水的容器中,常温搅拌 至固体完全溶解,pH调至7.50,用纯水定容至1L并混合均匀,0.45μm过滤 膜过滤,即得试剂R1。
2.试剂R2的组成和制备
2.1.试剂R2的组成
试剂R2包括PCT抗体包被的胶乳微球、4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)作为 缓冲剂、吐温20作为表面活性剂、氯化钠作为电解质、稳定剂和防腐剂。具体 组成如下:
pH 7.0-9.0
2.2.试剂R2的制备
2.2.1.活化聚苯乙烯胶乳悬浊液的制备
将100mg/mL的表面带有羟基的聚苯乙烯胶乳悬浊液(Bangs Lab,美国) 用50mM2-(N-吗啉基)乙磺酸缓冲液(pH 6.0)稀释至浓度为10mg/mL。加入N- 羟基丁二酰亚胺(NHS),使NHS在反应体系中的浓度达到1mg/mL。搅拌溶解 后,再加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDAC),使EDAC在反 应体系中的浓度达到0.3mg/mL。将反应体系在2-8℃下搅拌1小时后,15000rpm 离心20分钟。弃去上清液,然后向沉淀物加入50mM 2-(N-吗啉基)乙硫酸缓冲 液(pH 6.0),超声分散,得到活化聚苯乙烯胶乳悬浊液。
2.2.2.PCT抗体溶液的制备
PCT抗体从海肽生物科技(上海)有限公司购得。包被前PCT抗体的缓冲 液换为100mM磷酸盐,得到PCT抗体溶液,pH 7.0。
2.2.3.PCT抗体包被的胶乳微球的制备
将PCT抗体溶液加入到制得的活化聚苯乙烯胶乳悬浊液中,加入量为0.4 mg抗体/mL活化聚苯乙烯胶乳悬浊液。室温下20rpm搅拌2-4小时,进行PCT 抗体包被反应。然后加入1M甘氨酸溶液(pH 8.2)封闭反应,封闭试剂的加入量 为反应体系总体积的10%。将反应液在15000rpm下离心20分钟,然后弃去上 清。将沉淀物清洗三次,即得PCT抗体包被的胶乳微球,胶乳微球直径为50-400 nm。
2.2.4.试剂R2的制备
将制得的PCT抗体包被的胶乳微球用含有50mM 4-羟乙基哌嗪乙磺酸 (HEPES)、0.1%w/v吐温20、20mM氯化钠、0.2%w/v牛血清白蛋白和0.1%w/v 叠氮钠的稀释液重悬,使胶乳微球的最终浓度为0.05-0.3%w/v,超声分散,即 得试剂R2。
3.PCT抗原校准曲线的制作
3.1.PCT抗原校准品的制备
按设定的0ng/mL、1.0ng/mL、2.5ng/mL、8.0ng/mL、24.0ng/mL、58.0ng/mL 的PCT抗原校准品浓度,计算所需的PCT抗原质量,分别加入到含有50mM Tris-HCl、150mM KCl、5mMCaCl2、5%BSA(W/V)、10%甘露醇、0.09%叠氮 钠的稀释液(pH7.50)中,混合均匀后,用0.45μm过滤膜过滤除菌,得到相应的 设定浓度的PCT抗原校准品。
3.2.PCT抗原的检测方法
基于胶乳增强免疫比浊法的PCT检测试剂盒采用两点终点法,用PCT抗体 包被的胶乳微球检测PCT抗原,检测波长为主波长600nm,次波长800nm。 3.3.PCT抗原校准曲线的制作
为制作PCT抗原校准曲线,分别将180μL的试剂R1和16μL的每个PCT 抗原校准品混合均匀,37℃孵育5分钟。然后分别加入60μL的试剂R2。将每 个混合物混合均匀,37℃反应30秒,自动化分析仪(Hitachi 7180)读取第一吸光 度A1(OD600-800),再37℃反应5分钟,读取第二吸光度A2(OD600-800)。按公式 △OD=A2-A1分别计算吸光度差值,代表PCT抗原与PCT抗体的反应度,结果 如表1所示。可以以PCT抗原校准品浓度为X轴,相应的吸光度差值△OD为 Y轴,制作校准曲线。
表1.PCT抗原校准品浓度与对应的吸光度差值
PCT抗原校准品浓度(ng/mL) | 吸光度差值(△OD) |
0 | 694 |
0.9 | 1150 |
2.4 | 2126 |
8 | 4836 |
24 | 7320 |
58 | 8568 |
4.背景信号和抗原抗体免疫反应度的定义
4.1.背景信号的定义
在本发明中,用基于胶乳增强免疫比浊法的PCT检测试剂盒的检测PCT浓 度时的背景信号,由PCT抗原校准品浓度为0ng/mL时吸光度差值(△OD)的大 小来定义。吸光度差值(△OD)越小,则背景信号越小,反之吸光度差值(△OD) 越大,则背景信号越大。
4.2.抗原抗体免疫反应度的定义
在本发明中,用基于胶乳增强免疫比浊法的PCT检测试剂盒检测PCT浓度 时的抗原抗体免疫反应度,由PCT抗原校准品浓度为58ng/mL时吸光度差值 (△OD)与由PCT抗原校准品浓度为0ng/mL时吸光度差值(△OD)的差值的大小 来定义。该差值越小,则抗原抗体免疫反应度越小,反之该差值越大,抗原抗 体免疫反应度越大。
5.试剂R1中的表面活性剂的种类对背景信号的影响
按上述“1.2.试剂R1的制备”中所描述的方法,但将表面活性剂Triton X-100 用表4中所列的表面活性剂替代,得到新制备的试剂R1。
按上述“3.3.PCT抗原校准曲线的制作”中所描述的方法,用上述制备的PCT 抗原校准品与新制备的试剂R1和试剂R2进行反应,读取第一吸光度A1和第 二吸光度A2,计算吸光度差值(△OD),结果如表2所示(包括表1的结果以便 比较)。
表2.试剂R1的制备中表面活性剂的种类对背景信号的影响
由表2可见,使用Triton X-100作为表面活性剂时,背景吸光度差值(△OD) 为694,免疫反应度为7874。使用辛酰硫代甜菜碱和Emulgen B66作为表面活 性剂时,背景吸光度差值(△OD)分别为550和390,低于Triton X-100的结果, 表明两者能降低检测的背景信号,且免疫反应度分别为7990和8023,与Triton X-100的结果相比还有所提高。使用Tergitol(NP-40)作为表面活性剂时,背景吸 光度差值(△OD)为258,更加远低于比TritonX-100的结果,表明其能很好地降 低检测的背景信号,但免疫反应度为7468,与Triton X-100的结果相比差距较 大,表明其造成反应度明显下降。使用Genapol X-080作为表面活性剂时,吸光 度差值(△OD)为796,远高于Triton X-100的结果,表明其造成检测的背景信号增加,且其免疫反应度为7792,与Triton X-100的结果相比也有一定的差距。
由以上分析可知,在制备试剂R1时,辛酰硫代甜菜碱和Emulgen B66可很 地替代Triton X-100作为表面活性剂,更有利于降低检测的背景信号,而不影响 免疫反应度。
6.试剂R2的制备中抗体包被封闭试剂的种类对背景信号的影响
按上述“2.2.3.PCT抗体包被的胶乳微球的制备”中所描述的方法,进行PCT 抗体包被反应,然后分别用以下试剂代替甘氨酸溶液作为封闭试剂封闭反应: 甘氨酸和1,2-乙二胺的混合物、甘氨酸和牛血清白蛋白的混合物、甘氨酸和山羊 血清的混合物、甘氨酸和酪蛋白的混合物、甘氨酸和马血清的混合物、甘氨酸 和明胶的混合物,得到分别经不同封闭试剂封闭处理的PCT抗体包被的胶乳微 球,即新制备的试剂R2。
按上述“3.3.PCT抗原校准曲线的制作”中所描述的方法,用上述制备的PCT 抗原校准品与试剂R1和新制备的试剂R2进行反应,读取第一吸光度A1和第 二吸光度A2,计算吸光度差值(△OD),结果如表3所示(包括表1的结果以便 比较)也可如上所述制作校准曲线。
表3.封闭试剂的种类对背景信号的影响
由表3可见,使用1M甘氨酸作为封闭试剂时,背景吸光度差值(△OD)为 694,免疫反应度为7874。使用1M甘氨酸或甘氨酸和0.1M 1,2-乙二胺的混合 物作为封闭试剂时,背景吸光度差值(△OD)为470,免疫反应度为7986,表明 其能明显降低检测的背景信号,且提高免疫反应度。使用1M甘氨酸和2%酪蛋 白的混合物作为封闭试剂时,背景吸光度差值(△OD)为601,免疫反应度为7947, 表明其能一定程度地降低检测的背景信号,且提高免疫反应度。使用1M甘氨 酸和2%山羊血清的混合物、1M甘氨酸和2%牛血清的混合物、1M甘氨酸和2%马血清的混合物和1M甘氨酸和2%明胶的混合物作为封闭试剂时,背景吸 光度差值(△OD)分别为801、796、856和750,表明它们造成检测的背景信号的 增加,且它们造成免疫反应度有一定的下降。
由以上分析可知,在试剂R2的制备中,可以选择1M甘氨酸和0.1M 1,2- 乙二胺的混合物和1M甘氨酸和2%酪蛋白的混合物代替1M甘氨酸作为封闭试 剂。
以上研究了甘氨酸、1,2-乙二胺和酪蛋白三种封闭试剂单独或组合对背景信 号的影响,其中的浓度可以做适当的扩展,例如,甘氨酸的浓度可以在0.5-1M 的范围内,1,2-乙二胺的浓度可以在0.05-0.15M的范围内,酪蛋白的浓度可以 在1.5-2.5%的范围内。
7.试剂R2的制备中抗体包被封闭试剂pH值对背景信号的影响
按上述“2.2.3.PCT抗体包被的胶乳微球的制备”中所描述的方法,进行PCT 抗体包被反应,然后分别用甘氨酸溶液(1M,pH 6.5)和甘氨酸溶液(1M,pH 10.1) 作为封闭试剂封闭反应,得到分别经不同pH的甘氨酸封闭试剂封闭处理的PCT 抗体包被的胶乳微球,即新制备的试剂R2。
按上述“3.3.PCT抗原校准曲线的制作”中所描述的方法,用上述制备的PCT 抗原校准品与试剂R1和新制备的试剂R2进行反应,读取第一吸光度A1和第 二吸光度A2,计算吸光度差值(△OD),结果如表4所示(包括表1的结果以便 比较)。
表4.作为封闭试剂的甘氨酸溶液的pH值对背景信号的影响
由表4可见,使用pH 8.2的1M甘氨酸作为封闭试剂时,背景吸光度差值 (△OD)为694,免疫反应度为7874。使用低pH值的甘氨酸溶液(pH 6.5)作为封 闭试剂时,背景吸光度差值(△OD)为310,远低于pH 8.2时的结果,表明其能 明显降低检测的背景信号,但免疫反应度为7256,表明其造成反应度降低。使 用高pH值的甘氨酸溶液(pH 10.1)作为封闭试剂时,背景吸光度差值(△OD)为 956,表明其造成造成检测的背景信号增加,且免疫反应度为7652,表明其也造 成反应度有一定的下降。
由以上分析可见,pH 8.2是封闭试剂的理想pH值。
以下通过实施例说明本发明的基于胶乳增强免疫比浊法的降钙素原(PCT) 检测试剂盒。
实施例1
1.试剂R1的组成和制备
1.1.试剂R1的组成
试剂R1包括聚乙二醇10000作为促聚剂、三羟甲基氨基甲烷(Tris)作为缓冲 剂、Triton X-100作为表面活性剂、氯化钠作为电解质、牛血清白蛋白(BSA)作 为稳定剂和叠氮钠作为防腐剂。具体组成如下:
pH 7.5
1.2.试剂R1的制备
将计算量的聚乙二醇10000、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、辛酰硫代甜菜碱、 氯化钠、牛血清白蛋白(BSA)和叠氮钠加入到装有800mL纯水的容器中,常温 搅拌至固体完全溶解,pH调至7.50,用纯水定容至1L并混合均匀,0.45μm过 滤膜过滤,即得试剂R1。
2.试剂R2的组成和制备
2.1.试剂R2的组成
试剂R2包括PCT抗体包被的胶乳微球、4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)作为 缓冲剂、吐温20作为表面活性剂、氯化钠作为电解质、稳定剂和防腐剂。具体 组成如下:
pH 8.0
2.2.试剂R2的制备
2.2.1.活化聚苯乙烯胶乳悬浊液的制备
将100mg/mL的表面带有羟基的聚苯乙烯胶乳悬浊液(Bangs Lab,美国) 用50mM2-(N-吗啉基)乙磺酸缓冲液(pH 6.0)稀释至浓度为10mg/mL。加入N- 羟基丁二酰亚胺(NHS),使NHS在反应体系中的浓度达到1mg/mL。搅拌溶解 后,再加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDAC),使EDAC在反 应体系中的浓度达到0.3mg/mL。将反应体系在2-8℃下搅拌1小时后,15000rpm 离心20分钟。弃去上清液,然后向沉淀物加入50mM 2-(N-吗啉基)乙硫酸缓冲 液(pH 6.0),超声分散,得到活化聚苯乙烯胶乳悬浊液。
2.2.2.PCT抗体溶液的制备
PCT抗体从海肽生物科技(上海)有限公司购得。包被前PCT抗体的缓冲 液换为100mM磷酸盐,得到PCT抗体溶液,pH 7.0。
2.2.3.PCT抗体包被的胶乳微球的制备
将制得的PCT抗体溶液加入到制得的活化聚苯乙烯胶乳悬浊液中,加入量 为0.4mg抗体/mL活化聚苯乙烯胶乳悬浊液。室温下20rpm搅拌2-4小时,进 行PCT抗体包被反应。然后加入1M甘氨酸和0.1M 1,2-乙二胺的混合物(pH 8.2) 封闭反应,封闭试剂的加入量为反应体系总体积的10%。将反应液在1500rpm 下离心20分钟,然后弃去上清。将沉淀物清洗三次,即得PCT抗体包被的胶乳 微球,胶乳微球直径约为300nm。
2.2.4.试剂R2的制备
将制得的PCT抗体包被的胶乳微球用含有50mM 4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)(pH7.5)、0.1%w/v吐温20、20mM氯化钠、0.2%w/v牛血清白蛋白和 0.1%w/v叠氮钠的稀释液重悬,使胶乳微球的最终浓度为0.1%w/v,超声分散, 即得试剂R2。
3.检测试剂盒的制备
将40mL试剂R1和10mL试剂R2分别装入合适的试剂瓶中,分别在两个 试剂瓶上贴上相应的标签,装入盒子中,盒子附上试剂盒使用说明书,即制得 本发明的基于胶乳增强免疫比浊法的降钙素原(PCT)检测试剂盒。在使用时,如 上文所述制作PCT抗原校准曲线,并采用两点终点法检测样本中的PCT含量。
实施例2
本实施例中,试剂1使用0.1%w/v辛酰硫代甜菜碱作为表面活性剂,同时 试剂2的PCT抗体包被的胶乳微球的制备中使用1M甘氨酸和0.1M 1,2-乙二 胺的混合物(pH 8.2)封闭反应,其余的组分、含量和制备过程与实施例1相同, 胶乳微球直径约为300nm,制得本发明的基于胶乳增强免疫比浊法的降钙素原 (PCT)检测试剂盒。在使用时,如上文所述制作PCT抗原校准曲线,并采用两点 终点法检测样本中的PCT含量。
实施例3
本实施例中,试剂1使用0.1%w/v Emulgen B66作为表面活性剂,同时试 剂2的PCT抗体包被的胶乳微球的制备中使用1M甘氨酸和0.1M 1,2-乙二胺 的混合物(pH 8.2)封闭反应,其余的组分、含量和制备过程与实施例1相同,胶 乳微球直径约为300nm,制得本发明的基于胶乳增强免疫比浊法的降钙素原 (PCT)检测试剂盒。在使用时,如上文所述制作PCT抗原校准曲线,并采用两点 终点法检测样本中的PCT含量。
实施例4
因为如上所述,在制备试剂R1时,辛酰硫代甜菜碱和Emulgen B66可很地 替代Triton X-100作为表面活性剂,因此本实施例中,试剂1使用0.05%w/v辛 酰硫代甜菜碱和0.05%w/v Emulgen B66作为表面活性剂,同时试剂2的PCT 抗体包被的胶乳微球的制备中使用1M甘氨酸和0.1M 1,2-乙二胺的混合物(pH 8.2)封闭反应,其余的组分、含量和制备过程与实施例1相同,胶乳微球直径约 为300nm,制得本发明的基于胶乳增强免疫比浊法的降钙素原(PCT)检测试剂 盒。在使用时,如上文所述制作PCT抗原校准曲线,并采用两点终点法检测样 本中的PCT含量。
实施例5
本实施例中,试剂1使用0.1%w/v Triton X-100作为表面活性剂,同时试剂 2的PCT抗体包被的胶乳微球的制备中使用1M甘氨酸和2%酪蛋白的混合物 (pH 8.2)封闭反应,其余的组分、含量和制备过程与实施例1相同,胶乳微球直 径约为300nm,制得本发明的基于胶乳增强免疫比浊法的降钙素原(PCT)检测试 剂盒。在使用时,如上文所述制作PCT抗原校准曲线,并采用两点终点法检测 样本中的PCT含量。
实施例6
本实施例中,试剂1使用0.1%w/v辛酰硫代甜菜碱作为表面活性剂,同时 试剂2的PCT抗体包被的胶乳微球的制备中使用1M甘氨酸和2%酪蛋白的混 合物(pH 8.2)封闭反应,其余的组分、含量和制备过程与实施例1相同,胶乳微 球直径约为300nm,制得本发明的基于胶乳增强免疫比浊法的降钙素原(PCT) 检测试剂盒。在使用时,如上文所述制作PCT抗原校准曲线,并采用两点终点 法检测样本中的PCT含量。
实施例7
本实施例中,试剂1使用0.1%w/v Emulgen B66作为表面活性剂,同时试 剂2的PCT抗体包被的胶乳微球的制备中使用1M甘氨酸和2%酪蛋白的混合 物(pH 8.2)封闭反应,其余的组分、含量和制备过程与实施例1相同,胶乳微球 直径约为300nm,制得本发明的基于胶乳增强免疫比浊法的降钙素原(PCT)检测 试剂盒。在使用时,如上文所述制作PCT抗原校准曲线,并采用两点终点法检 测样本中的PCT含量。
实施例8
本实施例中,试剂1使用0.05%w/v辛酰硫代甜菜碱和0.05%w/v Emulgen B66作为表面活性剂,同时试剂2的PCT抗体包被的胶乳微球的制备中使用1M 甘氨酸和2%酪蛋白的混合物(pH 8.2)封闭反应,其余的组分、含量和制备过程 与实施例1相同,胶乳微球直径约为300nm,制得本发明的基于胶乳增强免疫 比浊法的降钙素原(PCT)检测试剂盒。在使用时,如上文所述制作PCT抗原校准 曲线,并采用两点终点法检测样本中的PCT含量。
实施例9
本实施例中,试剂1使用0.1%w/v辛酰硫代甜菜碱作为表面活性剂,同时 试剂2的PCT抗体包被的胶乳微球的制备中使用1M甘氨酸(pH 8.2)封闭反应, 其余的组分、含量和制备过程与实施例1相同,胶乳微球直径约为300nm,制 得本发明的基于胶乳增强免疫比浊法的降钙素原(PCT)检测试剂盒。在使用时, 如上文所述制作PCT抗原校准曲线,并采用两点终点法检测样本中的PCT含量。
实施例10
本实施例中,试剂1使用0.1%w/v Emulgen B66作为表面活性剂,同时试 剂2的PCT抗体包被的胶乳微球的制备中使用1M甘氨酸(pH 8.2)封闭反应, 其余的组分、含量和制备过程与实施例1相同,胶乳微球直径约为300nm,制 得本发明的基于胶乳增强免疫比浊法的降钙素原(PCT)检测试剂盒。在使用时, 如上文所述制作PCT抗原校准曲线,并采用两点终点法检测样本中的PCT含量。
实施例11
本实施例中,试剂1使用0.05%w/v辛酰硫代甜菜碱和0.05%w/v Emulgen B66作为表面活性剂,同时试剂2的PCT抗体包被的胶乳微球的制备中使用1M 甘氨酸(pH 8.2)封闭反应,其余的组分、含量和制备过程与实施例1相同,胶乳 微球直径约为300nm,制得本发明的基于胶乳增强免疫比浊法的降钙素原(PCT) 检测试剂盒。在使用时,如上文所述制作PCT抗原校准曲线,并采用两点终点 法检测样本中的PCT含量。
以上应用了具体实例对本发明进行了阐述,只是用于帮助理解本发明,并 不用以限制本发明。本发明所属技术领域的技术人员依据本发明的构思,还可 以做出若干简单推演、变形或替换。这些推演、变形或替换方案也落入本发明 的权利要求范围内。
Claims (10)
1.一种基于胶乳增强免疫比浊法的降钙素原(PCT)检测试剂盒,包括试剂R1和试剂R2,所述试剂R1包含促聚剂、缓冲剂、表面活性剂、电解质和稳定剂,所述试剂R2包含PCT抗体包被的胶乳微球、缓冲剂、表面活性剂、电解质和稳定剂,
其中,所述试剂R1中的所述表面活性剂为Triton X-100,所述试剂R2中的所述PCT抗体包被的胶乳微球用0.5-1.5M甘氨酸和0.05-0.15M 1,2-乙二胺的混合物或0.5-1.5M甘氨酸和1.5-2.5%酪蛋白的混合物作为封闭试剂进行封闭,
或者,所述试剂R1中的所述表面活性剂为Triton X-100与辛酰硫代甜菜碱和/或Emulgen B66的组合,或者为辛酰硫代甜菜碱或Emulgen B66或它们的组合,所述试剂R2中的所述PCT抗体包被的胶乳微球用0.5-1.5M甘氨酸、0.5-1.5M甘氨酸和0.05-0.15M 1,2-乙二胺的混合物或0.5-1.5M甘氨酸和1.5-2.5%酪蛋白的混合物作为封闭试剂进行封闭,
所述封闭试剂的pH值为大于6.5至小于10.1。
2.根据权利要求1所述的检测试剂盒,其特征在于,所述试剂R1和所述试剂R2还包含防腐剂。
3.根据权利要求2所述的检测试剂盒,其特征在于,所述试剂R1中的所述表面活性剂为辛酰硫代甜菜碱或Emulgen B66或它们的组合。
4.根据权利要求3所述的检测试剂盒,其特征在于,所述试剂R2中的所述封闭试剂的pH值为8.2。
5.根据权利要求4所述的检测试剂盒,其特征在于,所述试剂R2中的所述PCT抗体包被的胶乳微球用0.5-1.5M甘氨酸和0.05-0.15M 1,2-乙二胺的混合物作为封闭试剂进行封闭;更优选用1M甘氨酸和0.1M 1,2-乙二胺的混合物作为封闭试剂进行封闭。
6.根据权利要求2-5中任一项所述的检测试剂盒,其特征在于,
所述试剂R1包含1.0-3.0%w/v的促聚剂、40-60mM的缓冲剂、0.05-0.15%w/v的表面活性剂、100-200mM的电解质、0.05-0.15%w/v的稳定剂和0.05-0.15%w/v的防腐剂,
所述试剂R2包含0.05-0.3%w/v的PCT抗体包被的胶乳微球、40-200mM的缓冲剂、0.01-0.5%w/v的表面活性剂、10-200mM的电解质、0.05-1.0%w/v的稳定剂和0.05-0.2%w/v的防腐剂。
7.根据权利要求6所述的检测试剂盒,其特征在于,所述试剂R1中的所述促聚剂选自聚乙二醇4000-200000或它们的组合,所述缓冲剂选自三羟甲基氨基甲烷(Tris)或4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)或它们的组合,所述电解质选自氯化钠或氯化钾或它们的组合,所述稳定剂选自海藻糖、甘油或牛血清白蛋白(BSA)或它们的组合,所述防腐剂选自硫柳汞、叠氮钠或抗生素或它们的组合;所述试剂R2中的所述缓冲剂选自三羟甲基氨基甲烷(Tris)或4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)或它们的组合,所述表面活性剂选自吐温20、吐温60或吐温80或它们的组合,所述电解质选自氯化钠或氯化钾或它们的组合,所述稳定剂选自海藻糖、甘油或牛血清白蛋白(BSA)或它们的组合,所述防腐剂选自硫柳汞、叠氮钠或抗生素或它们的组合。
8.根据权利要求7所述的检测试剂盒,其特征在于,
所述试剂R1包含1.0-3.0%w/v的聚乙二醇10000、40-60mM的三羟甲基氨基甲烷(Tris)、0.05-0.15%w/v的辛酰硫代甜菜碱或Emulgen B66或它们的组合、100-200mM的氯化钠、0.05-0.15%w/v的牛血清白蛋白(BSA)、0.05-0.15%w/v的叠氮钠,pH为7.0-8.0,
所述试剂R2包含0.05-0.3%w/v的所述PCT抗体包被的胶乳微球、40-200mM的4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)、0.05-0.5%w/v的吐温20、10-200mM的氯化钠、0.05-1.0%w/v的牛血清白蛋白(BSA)、0.05-0.1%w/v的叠氮钠,pH为7.0-9.0。
9.根据权利要求8所述的检测试剂盒,其特征在于,
所述试剂R1包含2.0%w/v的聚乙二醇10000、50mM的三羟甲基氨基甲烷(Tris)、0.1%w/v的辛酰硫代甜菜碱或Emulgen B66或它们的组合、150mM的氯化钠、0.1%w/v的牛血清白蛋白(BSA)、0.1%w/v的叠氮钠,pH为7.5,
所述试剂R2包含0.1%w/v的所述PCT抗体包被的胶乳微球、50mM的4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)、0.1%w/v的吐温20、20mM的氯化钠、0.2%w/v的牛血清白蛋白(BSA)、0.1%w/v的叠氮钠,pH为8.0。
10.根据权利要求9所述的检测试剂盒,其特征在于,
所述试剂R1包含2.0%w/v的聚乙二醇10000、50mM的三羟甲基氨基甲烷(Tris)、0.05%w/v的辛酰硫代甜菜碱和0.05%w/v的Emulgen B66、150mM的氯化钠、0.1%w/v的牛血清白蛋白(BSA)、0.1%w/v的叠氮钠,pH为7.5,
所述试剂R2包含0.1%w/v的所述PCT抗体包被的胶乳微球、50mM的4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)、0.1%w/v的吐温20、20mM的氯化钠、0.2%w/v的牛血清白蛋白(BSA)、0.1%w/v的叠氮钠,pH为8.0。
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