CN108700519A - 用于荧光检测的方法和组合物 - Google Patents

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Abstract

本文公开了用于成像和扫描Western或免疫印迹的方法和组合物。

Description

用于荧光检测的方法和组合物
相关申请的交叉引用
本申请要求2016年2月24日提交的美国临时申请号62/299,436的权益，该申请以其全文纳入本文用于所有目的。
背景技术
Western或斑点印迹通常用作分析技术以检测各种蛋白质。荧光检测是大多数Western和斑点印迹试验中的一种选择方法，用于可视化和定量蛋白质。然而，通常用于试验的硝基纤维素、聚偏二氟乙烯(PVDF)或其它膜会使得入射光发生散射，使得蛋白质难以定量。因此，本领域需要提供新型的方法和组合物以解决该光散射的问题。
发明内容
大致来说，本文提供了用于检测和/或定量硝基纤维、PVDF或在Westen印迹或其它分析技术中所用的其它合适的膜的荧光信号。本发明人已发现糖和表面活性剂的水性混合物提供了具有以下特性的溶液：其降低了标准捕获膜(例如PVDF，硝基纤维素)的背景信号、且增加了荧光检测试剂的信号。该溶液(也可包括缓冲液)可用作例如Western印迹检测工作流程的最终膜孵育溶液，以改进靶蛋白的检测。
一种提供的组合物包含70％重量/体积(w/v)或更多的糖、和两性离子表面活性剂。所述糖和两性离子表面活性剂溶解于水或水性缓冲液。在一些实施方式中，组合物的两性离子表面活性剂是氨基硫代甜菜碱。在一些实施方式中，氨基硫代甜菜碱是3-(二甲基(3-(4-辛基苯甲酰胺基)丙基)铵基)丙烷-1-磺酸盐(ASB-C80)。在一些实施方式中，两性离子表面活性剂浓度在约0.01％至约0.2％体积/体积(v/v)的范围内。在一些实施方式中，组合物中的糖选自下组：蔗糖、葡萄糖、麦芽糖、乳糖、右旋糖、纤维二糖和半乳糖。在一些实施方式中，组合物中的糖浓度在约70％至约90％w/v的范围内。在一些实施方式中，所述组合物还包括浸没在水或水性缓冲液中的膜，其中所述膜配置用于在分析物检测试验中使用。在一些实施方式中，组合物的膜包括硝基纤维素或PVDF。在一些实施方式中，分析物检测试验是Western印迹。
还提供了一种在分析物检测试验中使得膜成像的方法，所述方法包括：将膜浸没在溶液中。所述膜构造为用于在分析物检测试验中使用。所述溶液包含糖和两性离子表面活性剂，其中，糖和两性离子表面活性剂溶解于水或水性缓冲液。所述方法还包括：使得膜成像。在一些实施方式中，所述方法的膜包括硝基纤维素或PVDF。在一些实施方式中，分析物检测试验是Western印迹。在一些实施方式中，所述方法的两性离子表面活性剂是氨基硫代甜菜碱。在一些实施方式中，所述方法的氨基硫代甜菜碱是3-(二甲基(3-(4-辛基苯甲酰胺基)丙基)铵基)丙烷-1-磺酸盐(ASB-C80)。在一些实施方式中，所述方法中的两性离子表面活性剂浓度在约0.01％至约0.2％v/v的范围内。在一些实施方式中，所述方法中的糖选自下组：蔗糖、葡萄糖、麦芽糖、乳糖、右旋糖、纤维二糖和半乳糖。在一些实施方式中，所述方法中的糖浓度在约70％至约90％w/v的范围内。
还提供了用于检测分析物的试剂盒，所述试剂盒包含糖、两性离子表面活性剂、以及缓冲液。在一些实施方式中，所述试剂盒的两性离子表面活性剂是氨基硫代甜菜碱。在一些实施方式中，所述试剂盒的氨基硫代甜菜碱是3-(二甲基(3-(4-辛基苯甲酰胺基)丙基)铵基)丙烷-1-磺酸盐(ASB-C80)。在一些实施方式中，所述试剂盒中的糖选自下组：蔗糖、葡萄糖、麦芽糖、乳糖、右旋糖、纤维二糖和半乳糖。在一些实施方式中，所述试剂盒还包含结合剂。
附图说明
图1是浸没在85％w/v糖溶液或水中的聚偏二氟乙烯(PVDF)膜的照片。
图2是显示糖和表面活性剂对Westen印迹发射猝灭的影响的图。
图3是显示表面活性剂对Westen印迹发射强度的影响的图。
图4呈现出显示糖和表面活性剂在不同蛋白质浓度下对Westen印迹发射强度的影响的图。
图5呈现出膜的照片，其显示出浸没在糖/表面活性剂溶液中时分析物分辨率提高。
图6呈现出照片和图，其显示出浸没在糖/表面活性剂溶液中时分析物分辨率和发射强度提高。
图7是显示不同表面活性剂对Westen印迹发射猝灭的影响的图。
图8是显示表面活性剂浓度对Westen印迹发射猝灭的影响的图。
定义
除非另外定义，本文中使用的所有技术和科学术语具有本领域普通技术人员通常所理解的同样含义。参见例如Lackie，《细胞和分子生物学词典(Dictionary of Cell andMolecular Biology)》，埃尔斯威尔出版社(Elsevier)(第4版，2007)；以及Sambrook等人，《分子克隆，实验室手册(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)》，冷泉港实验室出版社(冷泉港，纽约1989和后续版本)。术语“一个”或“一种”意在表示“一个(种)或多个(种)”。当术语“包含”及其各种变体例如“包括”和“含有”位于叙述步骤或要素之前的时候，是用来表示添加其它的步骤或要素是任选的，并且是非排它性的。本发明的实践中可以使用与本文所述类似或等价的方法、装置和材料。提供以下定义是用来帮助理解本文经常用到的某些术语，不对本发明的范围构成限制。本文所用的缩写具有其在化学和生物领域内的常规涵义。
如本文中所用，术语"糖"是指单糖、二糖、低聚糖或多糖。单糖包括但不限于葡萄糖、核糖、果糖、甘露糖、木糖、阿拉伯糖、和半乳糖。二糖包括但不限于：蔗糖、乳糖、纤维二糖和麦芽糖。多糖包括但不限于：纤维素、半纤维素、和木质纤维素或淀粉。其它糖均可用于本发明。
本文所使用术语“表面活性剂”是指用于降低液体之间或液体和固体之间表面张力的表面活性试剂(surface active agent)。表面活性剂可用作清洁剂、润湿剂、乳化剂、泡沫剂或分散剂。
本文所用术语“两性离子表面活性剂”是指不具有净电荷的两亲性表面活性剂分子，其包含疏水性基团和一个或多个亲水性基团、以及相反形式电荷的两个部分。
本文所使用术语“缓冲液”是指任意无机或有机的酸或碱，其抵抗pH的变化并使得其所加入的溶液的pH值保持在所需点附近。
本文所用术语“膜”是指聚合物材料片，其用于使得可通过适当的化学方法检测的分析物暴露于其表面上。分析物可以通过从电泳凝胶电印迹转移到膜上。
本文所用术语“分析物”、“抗原”和“靶”是指任何相关分子、化合物或复合物，确定其的存在、量、表达水平、活化状态和/或种类。可以通过结合剂的特异性识别来进行确定。相关分子、化合物或复合物可以是大分子，例如，例如，多肽或蛋白质、多糖、毒素、细胞壁、细胞被囊、病毒被囊、病毒包衣、鞭毛、纤毛或菌毛、微生物、与蛋白质或多糖复合的核酸、脂质、与蛋白质或多糖复合的脂质、多核苷酸、多肽、碳水化合物、化学部分、或它们的组合(例如，磷酸化或糖基化的多肽等)。本领域技术人员会理解该术语并不表示该分析物在各种情况中是免疫原性的，但仅仅表示其可被结合剂或抗体靶向。
本文所用术语“结合剂”指特异性结合抗原或分析物的分子。示例性结合剂包括但不限于抗体、抗体片段、非抗体蛋白支架、抗体模拟物、适体、Affimer、猝体(quenchbody)、酶标记的抗体或分析物特异性抗体对。
本文所使用的关于结合剂和靶的术语“结合”是指结合剂与纯群体中的大多数靶连接(假定结合剂与靶的合适摩尔比)。例如，结合给定靶的结合剂将结合溶液中至少2/3的靶(例如75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)。本领域技术人员将认识到一些变异性将根据结合剂对靶的亲和性以及测定结合的方法和/或阈值而产生。
本文所用的术语“特异性结合”或“对…有特异性”指分子(例如，结合剂)与靶的结合亲和性比非靶化合物高至少2倍，例如高至少4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、25倍、50倍、或100倍。当使用一种或多种可检测的蛋白质分析物时，在其他生物制剂和蛋白质的异质群体中，特异性结合是蛋白质存在的决定性因素。因此，在给定的免疫测定条件下，特定的抗体结合特定蛋白质序列，由此鉴定其存在。
本文中，术语“抗体”是指免疫球蛋白家族的多肽或包含能够非共价、可逆并以特定方式结合相应抗原表位的免疫球蛋白片段的多肽。该术语包括但不限于：源自人或其它哺乳动物细胞的IgA、IgD、IgE、IgG和IgM同种型类的多克隆或单克隆抗体，包括天然形式或遗传修饰形式，如人源化、人、单链、嵌合、合成、重组、杂合、突变、移接和体外生成的抗体。该术语包括偶联物，包括但不限于含有免疫球蛋白部分的融合蛋白(如嵌合或双特异性抗体或单链Fv’s(scFv’s))以及片段(如Fab、F(ab')2、Fv、scFv、Fd、dAb和其他组合物)。
本文所用术语“表位”是指抗原上被抗体识别并结合的局部位点。蛋白质表位可包括几个氨基酸或几个氨基酸的部分，例如，5或6个或更多，或者20个或更多个氨基酸或这些氨基酸的部分。表位还可包括非蛋白质组分，例如核酸(例如，RNA或DNA)、碳水化合物、脂质、或它们的组合。表位可以是三维部分。因此，例如，当靶是蛋白质靶时，表位可包括由连续氨基酸、或来自蛋白质不同部分的氨基酸，这些部分通过蛋白质折叠靠近(例如，不连续表位)。这对于形成三维结构的其它类型的目标分子(例如DNA和染色质)也是一样的。
本文所用术语“标记物”和“可检测标记物”是指通过光谱、光化学、生物化学、免疫化学、化学或其它物理手段可检测的组合物。可用的标记物包括荧光染料(荧光团)、荧光猝灭剂、发光剂、高电子密度试剂、酶(例如，ELISA中常用的酶)、生物素、地高辛、32P和其它放射性同位素、半抗原、蛋白质、核酸或可被检测的其他物质，例如通过将标记物整合至或连接至与目标分子特异性反应的抗体、肽或寡核苷酸。该术语包括单一标记试剂的组合，例如，提供独特可检测特征(例如，特定波长或波长组合下)的荧光团的组合。
本文所用的关于标记物和结合剂(例如本文所述的带标记抗体)的术语“连接”是指结合的标记物共价(通过接头或化学键)或非共价(通过离子、范德华力、静电或氢键)地结合至结合剂，从而能够通过测定与结合剂连接的标记物是否存在来检测分析物是否存在。
本文所用术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用以表示氨基酸残基的聚合物。三个术语全部适用于其中一个或多个氨基酸残基是相应天然产生氨基酸的人造化学模拟物的氨基酸聚合物，以及天然产生的氨基酸聚合物和非天然产生的氨基酸聚合物。如本文所用，该术语涵盖任意长度的氨基酸链，包括全长蛋白质，其中所述氨基酸残基通过共价肽键连接。
本文所用，术语“Western印迹(Western blotting/Western blot)”或“蛋白质免疫印迹”是指用于检测相关生物学或其它样品中的特定蛋白质的分析技术。该技术可以使用凝胶电泳或其他合适过程通过大小、形状、长度、电荷或其它特征来分离蛋白质。然后可以将蛋白质转移到膜上，并用可以对一种或多种目标蛋白质是特异性的结合剂进行检测。
本文中使用术语“约”和“近似”修饰数值并表示在围绕该值所限定的范围。如果"X"是值，那么"约X"或"近似等于X"通常表示0.90X至1.10X的值。任何提及“约X”至少表示值X、0.90X、0.91X、0.92X、0.93X、0.94X、0.95X、0.96X、0.97X、0.98X、0.99X、1.01X、1.02X、1.03X、1.04X、1.05X、1.06X、1.07X、1.08X、1.09X和1.10X。因此，“约X”也意在公开例如"0.98X"。当将“约”用于数值范围的开始时，其用于范围的两端。因此，“约6至8.5”等于“约6至约8.5”。当“约”用于一组值的第一个值时，其用于该集合中的所有值。因此，“约7、9、或11％”等于“约7％、约8％、或约11％”。
具体实施方式
I.概述
Western印迹首先由Towbin等人于1979年进行了描述((1979)Proc.Natl.Acad.Sci USA 76：4350)，并且已经被用于使用抗体或其它检测手段的蛋白质检测和定量。该技术的早期应用依赖于抗体-酶偶联物(包括辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)，并且仅是半定量的。后来的方案利用了开发例如提供更多的蛋白质定量测定的荧光和化学发光染料标签物。然而，与这些技术相关的膜的固有的自发荧光仍然是一个未解决的问题。
本文描述了一种新方法，用于减少Western印迹和其他分析过程的膜的自发荧光、以及增加用于检测和定量目标分析物的荧光团标记物的荧光强度。本发明提供了包含糖和表面活性剂的特定溶液的组合物和方法。发明人发现具有特浓浓度范围的糖的溶液在使得浸没在其中的膜成像时使得自发荧光和光散射的影响最小化。发明人还发现向糖溶液中添加表面活性剂用于至少部分减轻与相关的目标分析物检测有关的所需荧光发射的猝灭。
II.组合物
本文提供了多种组合物。所述组合物可以用作用于分析物检测试验的成像溶液。分析物检测试验可以是Western印迹。已经观察到将糖加入该组合物中可以使得浸没在组合物中的膜成像时的自发荧光或光散射降低。
组合物的糖可以是高度水溶性的任意的糖。例如，可以使用蔗糖、果糖、葡萄糖、麦芽糖、右旋糖、或乳糖。也可使用其它单糖、二糖、和多糖。例如，糖可以是单糖，例如，木糖、岩藻糖、塔格糖、半乳糖胺、氨基葡萄糖、甘露糖胺、半乳糖、甘露糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸、艾杜糖醛酸、甘露糖醛酸、N-乙酰半乳糖胺、N-乙酰葡糖胺、N-乙酰甘露糖胺、N-乙酰胞壁酸、2-酮-3-脱氧-甘油-半乳糖-壬酸、N-乙酰神经氨酸或N-神经氨酸。糖可以是二糖，例如，乳果糖、海藻糖、纤维二糖、异麦芽糖、异麦芽酮糖、海藻酮糖(trehalulose)或壳二糖。糖可以是多糖，例如糊精、糖原、淀粉、纤维素、半纤维素、聚葡萄糖、菊粉、β-葡聚糖、果胶、洋车前子壳粘液、β-甘露聚糖、葡甘露聚糖、阿拉伯木聚糖、阿格拉(agra)、藻酸盐、角叉菜胶、几丁质、壳聚糖、或各种树胶。所述糖可以是D-异构体、L异构体、或它们的混合物。糖可以是另一种糖的甲基化衍生物、乙酸盐衍生物、磷酸盐衍生物或硫酸盐衍生物。组合物可以包含任意比例的两种或更多种糖的混合物。其它高度水溶性聚合物(例如聚乙二醇、聚乳酸等)也可用于使膜从半透明到透明。
减少自发荧光和光散射所需的糖的量可取决于浸没在溶液中的膜的厚度、以及相关荧光团的激发和发射波长。通常，发现溶液中约70％至100％或更高的重量/体积的糖使得浸没的膜呈现为透明(transparent)至几乎半透明(translucent)。组合物中的糖的量可以为50％至80％、60％至90％、70％至100％、80％至110％、或90％至120％重量/体积。组合物中的糖的量可以为70％至82％、72％至84％、74％至86％、76％至88％、或78％至90％重量/体积。在一些实施方式中，组合物中糖的量为70％至90％重量/体积。在一些实施方式中，糖浓度为75％至90％重量/体积。在一些实施方式中，糖浓度为约70％，约85％、或约90％重量/体积。
将糖添加到水或缓冲溶液可以使得浸没在溶液中的膜呈现为透明至半透明。然而，糖的添加也会导致荧光信号的猝灭。为了减少猝灭，还可以将表面活性剂添加到组合物中。表面活性剂可以是阴离子、阳离子、非离子、或两性。在一些实施方式中，所述表面活性剂是两性离子表面活性剂。两性离子表面活性剂可以是例如磺基甜菜碱(sultaine)、甜菜碱、磷脂、或鞘脂。两性离子表面活性剂可以是硫代甜菜碱(sulfobetaine)(SB)、氨基硫代甜菜碱(ABS)、或辛基苄基酰胺基硫代甜菜碱。两性离子表面活性剂可以是例如3-((3-胆酰胺丙基)二甲基铵)-1-丙磺酸盐(CHAPS)、椰油酰胺丙基羟基磺基甜菜碱、椰油酰胺丙基甜菜碱、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰胆碱或鞘磷脂。两性离子表面活性剂可以是氨基硫代甜菜碱或芳族氨基硫代甜菜碱。在一些实施方式中，两性离子表面活性剂是3-(二甲基(3-(4-辛基苯甲酰胺基)丙基)铵基)丙烷-1-磺酸盐(ASB-C80)。一方面中，表面活性剂选自：SB 3-10、SB 3-12、SB 3-14、ASB-14、ASB-16、或ASB-C80。组合物可以包含任意比例的两种或更多种表面活性剂的混合物。
减少糖导致的荧光猝灭所需的表面活性剂的量可取决于溶液中糖的类型和浓度、以及相关荧光团的激发和发射波长。通常，发现溶液中约0.01％至0.2％或更高的体积/体积的表面活性剂使得荧光猝灭减少。组合物中的表面活性剂的量可以为0.001％至0.01％、0.002％至0.2％、0.005％至0.4％、0.01％至0.9％、或0.02％至2％体积/体积。组合物中的表面活性剂的量可以为0.01％至0.06％、0.015％至0.08％、0.02％至0.1％、0.025％至0.15％、或0.035％至0.02％体积/体积。在一些实施方式中，表面活性剂的浓度为约0.05％、约0.1％、或约0.2％体积/体积。
糖和表面活性剂可以溶解于水或适用于分析物检测试验使用的任意水性缓冲液。例如，缓冲液可以包括：2-氨基-2-(羟甲基)丙烷-1,3-二醇(Tris)、Tris-HCl、Tris缓冲盐水(TBS)、甘氨酸，2-(4-(2-羟乙基)哌嗪-1-基)乙烷磺酸(HEPES)、磷酸盐缓冲盐水(PBS)、或它们任意比例的组合。分析物检测试验可以是Western印迹。组合物还可以包含配置用于分析物检测试验的膜，其中，膜被浸没在水或水性缓冲液中。膜可以包括：例如，硝基纤维素、聚偏二氟乙烯、尼龙、或其任意比例的两种或更多种的组合。
III.方法
还提供了用于在分析物检测试验中使得膜成像的多种方法。所述方法可以包括：将膜浸没在溶液中。所述膜可以构造为用于在分析物检测试验中使用，如上所述。在一些实施方式中，分析物检测试验是Western印迹，并且膜包括硝基纤维素或PVDF。所述溶液可以具有任意如上所述的组合物。在一些实施方式中，溶液包含糖，所述糖是蔗糖、葡萄糖、麦芽糖、乳糖、右旋糖、纤维二糖或半乳糖。在一些实施方式中，溶液中的糖浓度为70％至90％重量/体积。在一些实施方式中，溶液包含两性离子表面活性剂。两性离子表面活性剂可以是氨基硫代甜菜碱，例如ASB-C80。在一些实施方式中，溶液中的表面活性剂浓度为0.01％至0.2％体积/体积。
所述方法还可以包括：使得膜成像。成像可以用于检测任何类型样品中的一种或多种分析物。在一些实施方式中，所述样品是生物样品。在一些实施方式中，所述样品是化学或物理样品，例如，水或化学溶液或空气或岩石。生物样品可获自任何生物体，例如动物、植物、真菌、细菌、病毒或朊病毒、或任何其他生物体。在一些实施方式中，该生物样品来自动物，例如哺乳动物(如人或非人灵长类动物、奶牛、马、猪、绵羊、猫、狗、小鼠或大鼠)、鸟(如鸡)、或鱼。生物样品可以是获自生物体的任何组织或体液，例如血液、血液成分或血液产品(如血清、血浆、血小板、血红细胞等)、痰液或唾液、组织(如肾、肺、肝、心、脑、神经组织、甲状腺、眼、骨骼肌、软骨或骨组织)；培养的细胞，例如原代培养物、外植体，转化的细胞、干细胞、粪便或尿液。
在一些实施方式中，待检测的一种或多种分析物包括肽、蛋白质(如抗体、酶、生长调节剂、凝血因子或磷蛋白)、免疫原、多糖、毒素、细胞壁、细胞被囊、病毒被囊、病毒包衣、鞭毛、纤毛或菌毛、微生物、与蛋白质或多糖复合的核酸、或与蛋白质或多糖复合的脂质。在一些实施方式中，将检测两种、三种、四种、五种或更多种不同的分析物。在一些实施方式中，其中两种或更多种不同的分析物待检测，所述两种或更多种不同的分析物是相同类型的分析物(例如复合物中存在的两种或更多种蛋白质)。在一些实施方式中，其中两种或更多种不同的分析物待检测，所述两种或更多种不同的分析物是不同类型的分析物。目前描述的方法和组合物可用作独立的单一分析物试验，其中，在不同样品中检测单一分析物。或者，所述方法和组合物可用于在检测在转移膜上所分离的许多不同样品上的多种分析物。
分析物可以使用结合剂进行检测。本文所述的适用于根据本发明方法的结合剂是与相关分析物(例如，抗原)特异性结合的任意分子。在一些实施方式中，结合剂是抗体或其部分。在一些实施方式中，本文所述的结合剂连接可检测标记物。该标记物可直接连接至结合剂(例如通过共价键)或可以间接连接(例如使用螯合剂或接头分子)。术语“标记物”和“可检测标记物”在本文中可互换使用并在下面进行详细描述。
可检测标记物的示例包括但不限于：生物素/链霉亲和素标记物、核酸(例如寡核苷酸)标记物、化学反应性标记物、荧光标记物、酶标记物、放射性标记物、量子点、聚合物点、质量标记物及其组合。在一些实施方式中，该标记物可包括光学试剂，如荧光剂、磷光剂、化学发光剂等。多种试剂(如染料、探针或指示剂)是本领域已知的并可用于本发明。(参见例如英杰公司(Invitrogen)，《手册——荧光探针和标记技术指导(The Handbook—AGuide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies)》，第10版(2005))。荧光剂可包括多种有机和/或无机小分子或多种荧光蛋白及其衍生物。荧光团的文献来源包括Cardullo等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:8790-8794(1988)；Dexter(1953)物理化学期刊(J.of Chemical Physics)21:836-850(1953)；Hochstrasser等人(1992)生物物理化学(Biophysical Chemistry)45:133-141(1992)；Selvin(1995)酶学方法(Methods inEnzymology)246:300-334(1995)；Steinberg(1971)生物化学回顾年鉴(Ann.Rev.Biochem.)40:83-114(1971)；Stryer(1978)生物化学回顾年鉴(Ann.Rev.Biochem.)47:819-846(1978)；Wang等人(1990)四面体通讯(TetrahedronLetters)31:6493-6496(1990)；以及Wang等人(1995)分析化学(Anal.Chem.)67:1197-1203(1995)。荧光染料和荧光标记物试剂包括可购自英杰/分子探针公司(Invitrogen/Molecular Probes)(俄勒冈州尤金市)和皮尔斯生物技术公司(Pierce Biotechnology,Inc.)(伊利诺斯州洛克福德)。
以下是可用作标记物的荧光团的非限制性示例：4-乙酰胺基-4’-异硫氰酸根合茋-2,2'二磺酸、吖啶、吖啶异硫氰酸盐/酯、5-(2'-氨基乙基)氨基萘-1-磺酸(EDANS)、4-氨基-N-[3-乙烯基磺酰基)苯基]萘酰亚胺-3,5二磺酸盐/酯、N-(4-苯胺基-1-萘基)马来酰亚胺、邻氨基苯甲酰胺、BODIPY、亮黄、香豆素、7-氨基-4-甲基香豆素(AMC，香豆素120)、7-氨基-4-三氟甲基香豆素(香豆素151)、花青染料、荧光桃红、4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)、5',5"-二溴连苯三酚-磺酞(溴邻苯三酚红)、7-二乙基氨基-3-(4'-异硫氰酸根合苯基)-4-甲基香豆素二乙烯基三胺五乙酸酯、4,4'-二异硫氰根合二氢-茋-2,2'-二磺酸、4,4'-二异硫氰酸根合茋-2,2'-二磺酸、5-[二甲基氨基]萘-1-磺酰氯(DNS，丹酰氯)、4-(4'-二甲基氨基苯基偶氮)苯甲酸(DABCYL)、4-二甲基氨基苯基偶氮苯基-4’-异硫氰酸酯(DABITC)、曙红、曙红异硫氰酸酯、赤藓红B、赤藓红异硫氰酸酯、乙啶、5-羧基荧光素(FAM)、5-(4,6-二氯三嗪-2-基)氨基荧光素(DTAF)、2',7'-二甲氧基-4',5'-二氯-6-羧基荧光素(JOE)、荧光素、荧光素异硫氰酸酯、荧胺、IR144、IR1446、孔雀石绿异硫氰酸酯、4-甲基伞形酮、邻甲酚酞、硝基酪氨酸、副品红、酚红、藻红蛋白(包括但不限于B型和R型)、邻苯二甲醛、芘、丁酸芘、琥珀酰亚胺基1-丁酸芘、量子点、反应红4(CIBACRONTM亮红3B-A)、6-羧基-X-若丹明(ROX)、6-羧基若丹明(R6G)、丽丝胺若丹明B磺酰氯若丹明(Rhod)、若丹明B、若丹明123、若丹明X异硫氰酸酯、磺基若丹明B、磺基若丹明101、磺基若丹明101的磺酰氯衍生物(德州红)、N,N,N',N'-四甲基-6-羧基若丹明(TAMRA)、四甲基若丹明、四甲基若丹明异硫氰酸酯(TRITC)、核黄素、玫红酸、镧系螯合衍生物。在一些实施方式中，该光学试剂是插入染料。插入染料包括但不限于SYBR绿和Pico绿(来自分子探针公司(Molecular Probes)(俄勒冈州尤金市))、溴化乙啶、碘化丙啶、色霉素、吖啶橙、Hoechst 33258、TOTO-I、YOYO-1和DAPI(4',6-二脒基-2-苯基吲哚盐酸盐)。
用于免疫试验的优选的一组荧光团包括荧光素、荧光素异硫氰酸盐/酯、藻红蛋白、若丹明B和德州红(磺基若丹明101的磺酰氯衍生物)。本段落前列表中的任意荧光团可用于本发明所述的试验中，用于标记微粒或标记结合剂(例如，抗体或链霉亲和素)。荧光染料可通过常规共价结合，使用荧光团上和微粒或结合剂上的合适官能团来连接。对此类基团的识别以及形成所述连接的反应对于本领域技术人员是显而易见的。
在一些实施方式中，荧光剂是聚合物点或量子点。使用的特定量子点(QD)对于本发明而言并不重要。量子点是本领域已知的且描述于例如Han等人的“用于生物分子的多重光学编码的量子点标记的微珠(Quantum-dot-tagged Microbeads for MultiplexedOptical Coding of Biomolecules)”，《国家生物科技(Nat Biotechnol)》(2001年7月)第19卷，第631-635页。本领域技术人员应理解存在多种量子点，其可用作荧光标记物并用于本发明的实施方式并可从多个销售商处获得。示例性量子点(OD)包括但不限于以下：硒化镉(CdSe)量子点纳米颗粒(例如CdSe量子点核心，480-640nm发射光谱，西格玛-奥德里奇公司)；硫化镉(CdS)量子点纳米颗粒(例如CdS量子点核心，380-480nm发射光谱，西格玛-奥德里奇公司)；硫化锌覆盖的硒化镉(ZnS覆盖的CdSe)纳米晶体(例如CdSe/ZnS LUMIDOTSTM和CdSe/ZnS NANODOTSTM，480-640nm发射光谱，西格玛-奥德里奇公司)；以及无镉的量子点(例如CFQDTM，400-650nm发射光谱，西格玛-奥德里奇公司)。
连接可检测标记物与结合剂的技术是已知的。例如，常见蛋白标记技术的综述可参见《生物化学技术：理论和实践(Biochemical Techniques:Theory and Practice)》，John F.Robyt和Bernard J.White，维弗兰德出版公司(Waveland Press,Inc.)(1987)。其他标记技术综述于，例如，《生物聚合物的激发状态(R.Haugland,Excited States ofBiopolymers)》，Steiner编，普莱南出版社(Plenum Press)(1983)；《荧光探针设计与合成：技术指南(Fluorogenic Probe Design and Synthesis:A Technical Guide)》，PE应用生物系统公司(PE Applied Biosystems)(1996)；以及G.T.Herman,《生物偶联技术(Bioconjugate Techniques)》，学术出版社(Academic Press)(1996)。所述技术还可作为市售可得试剂盒(例如英国剑桥的银诺瓦生物科学有限公司(Innova Biosciences Ltd.)的和)的部分获得。许多适当标记的结合剂是市售可得的，并且可以在有或没有进一步修饰的情况下使用。可用于代替荧光团的其他标签是放射性标签和酶标签。这些方法也为本领域熟知。
IV.试剂盒
还提供用于检测一种或多种分析物的多个试剂盒。分析物可以是如上所述的任意分析物。在一些实施方式中，分析物是蛋白质。试剂盒包含糖和表面活性剂。糖可以包括如上所述糖的任意一种或多种。表面活性剂可以包括如上所述表面活性剂的任意一种或多种。在一些实施方式中，所述糖选自下组：蔗糖、葡萄糖、麦芽糖、乳糖、右旋糖、纤维二糖和半乳糖；并且表面活性剂是氨基硫代甜菜碱。试剂盒还可以包含缓冲剂。缓冲剂可以包括如上所述缓冲剂化合物的任意一种或多种。在一些实施方式中，糖、表面活性剂和/或缓冲剂作为干成分提供，通过终端用户组合为水性溶液。
试剂盒还可以包含膜。所述膜可以是任意如上所述的膜。在一些实施方式中，所述膜构造为用于在分析物检测试验中使用。在一些实施方式中，所述膜构造为用于在Western印迹试验中使用。在一些实施方式中，所述膜包括硝基纤维素或PVDF。
试剂盒还可以包含结合剂。结合剂可以包括如上所述结合剂的任意一种或多种。例如，如本文所述，试剂盒可以包含一种或多种用生物素标记的抗体，和/或分析物特异性抗体对，(链霉)亲和素，标记的生物素，例如，藻红蛋白标记的生物素，珠，对照试剂。在一些实施方式中，试剂盒还包括用来进行本文所述方法的说明。
V.实施例
实施例1.糖溶液对浸没的膜透明度的影响
由于固体的多孔性质以及膜(>1.45)与空气(1.00)或水(约1.33)之间的折射率相差很大，PVDF和硝基纤维素膜均在空气和水中散射大量的光。如果固体和环境之间的折射率匹配，则光不再具有进行散射的表面，并且膜看起来几乎透明。这可以通过添加和进一步控制膜浸没于其中的溶液中的糖的量来产生。
将两个相似的PVDF膜浸入85％糖溶液和水中(图1)。由图可见，浸渍在糖溶液中的左侧PVDF膜变得几乎透明。当用例如ChemiDoc MP成像系统(Bio-Rad)成像时，这种明显透明的膜具有显著减少的背景信号。
实施例2.表面活性剂对由糖导致的荧光猝灭的影响
糖是极性分子，并且极性溶剂通常使得荧光团猝灭。图2显示了水性糖水中的荧光团发射光谱。根据图中的数据，加入85％重量/体积的蔗糖后，中性磷酸盐缓冲液中的发射强度降低约50％。然而，向糖缓冲溶液中进一步添加表面活性剂(0.1％ASB-C80)减少了这种糖诱导的猝灭，由此恢复了约一半的损失的强度。此外，图3的数据显示出将表面活性剂(0.1％ASB-C80)加入磷酸盐或其它标准缓冲液中也会增加来自缓冲液的荧光信号。
实施例3.用糖和表面活性剂溶液成像的印迹蛋白质的荧光强度
图4显示出与浸泡在糖水+表面活性剂中的膜上检测到的蛋白质的强度进行比较的浸泡在糖水中的膜上检测到的蛋白质的信号强度。两个膜用相同曝光同时成像。所示结果表明浸泡在糖和表面活性剂中的膜产生更大的信号强度，这与图2和图3的荧光发射结果一致。
实施例4.使用糖和表面活性剂溶液的细胞裂解物成像
将分离的细胞裂解物样品印迹到PVDF膜上，然后在包含糖和表面活性剂的水性缓冲液的存在和不存在的条件下成像。图5所呈现的图像显示来自样品的无染剂发射，可以看出当使用糖/表面活性剂缓冲液成像时，样品内蛋白质条带的分辨率增强。从图6中的图可以看出，光散射的减少和发射强度的增加看起来与在糖和表面活性剂存在下成像情况下的分辨率增强一致。
实施例5.表面活性剂类型和浓度的影响
测试四种不同两性离子表面活性剂在减少由糖溶液导致的荧光猝灭中的效率。从图7中所示的图中，在这些表面活性剂中，芳族氨基磺基甜菜碱ASB-C80表现出减轻猝灭的能力最好并产生具有最大荧光强度的图像。进行进一步的实验以确定ASB-C80对减少荧光猝灭的浓度影响。如图8所示，所有测试的浓度呈现出足够的猝灭减少。
虽然通过阐述和举例的方式详细描述了上述发明以清晰理解，但本发明技术人员应理解可在所附权利要求书范围内实施某些改变和修改。此外，本文提供的各参考文献通过引用全文纳入本文，就如同各参考文献单独通过引用纳入本文。当即时应用和本文提供的参考之间存在冲突时，即时应用占主导地位。

Claims (20)

1.一种组合物，其包含：
70％w/v或更多的糖；以及
两性离子表面活性剂，其中，所述糖和两性离子表面活性剂溶解于水或水性缓冲液。
2.如权利要求1所述的组合物，所述组合物还包含：
配置用于分析物检测试验的膜，其中，所述膜被浸没在水或水性缓冲液中。
3.如权利要求2所述的组合物，其特征在于，所述膜包含硝基纤维素或聚偏二氟乙烯(PVDF)。
4.如权利要求1-3中任一项所述的组合物，其特征在于，所述两性离子表面活性剂是氨基硫代甜菜碱。
5.如权利要求4所述的组合物，其特征在于，所述氨基硫代甜菜碱是3-(二甲基(3-(4-辛基苯甲酰胺基)丙基)铵基)丙烷-1-磺酸盐(ASB-C80)。
6.如权利要求1-5中任一项所述的组合物，其特征在于，所述糖选自下组：蔗糖、葡萄糖、麦芽糖、乳糖、右旋糖、纤维二糖和半乳糖。
7.如权利要求1-6中任一项所述的组合物，其特征在于，糖浓度在约70％至约90％w/v的范围内。
8.如权利要求1-7中任一项所述的组合物，其特征在于，两性离子表面活性剂浓度在约0.01％至约0.2％v/v的范围内。
9.一种在分析物检测试验中使得膜成像的方法，所述方法包括：
将膜浸没在溶液中，其中，所述膜构造为用于分析物检测试验，其中所述溶液包含糖和两性离子表面活性剂，并且其中所述糖和两性离子表面活性剂溶解在水或水性缓冲液中；和
使得所述膜成像。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述膜包含硝基纤维素或聚偏二氟乙烯(PVDF)。
11.如权利要求9或10所述的方法，其特征在于，所述两性离子表面活性剂是氨基硫代甜菜碱。
12.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述氨基硫代甜菜碱是3-(二甲基(3-(4-辛基苯甲酰胺基)丙基)铵基)丙烷-1-磺酸盐(ASB-C80)。
13.如权利要求9-12中任一项所述的方法，其特征在于，所述糖选自下组：蔗糖、葡萄糖、麦芽糖、乳糖、右旋糖、纤维二糖和半乳糖。
14.如权利要求9-13中任一项所述的方法，其特征在于，糖浓度在约70％至约90％w/v的范围内。
15.如权利要求9-15中任一项所述的方法，其特征在于，两性离子表面活性剂浓度在约0.01％至约0.2％v/v的范围内。
16.一种用于检测分析物的试剂盒，所述试剂盒包含：
糖；
两性离子表面活性剂；以及
缓冲剂。
17.如权利要求16所述的试剂盒，其特征在于，所述两性离子表面活性剂是氨基硫代甜菜碱。
18.如权利要求17所述的试剂盒，其特征在于，所述氨基硫代甜菜碱是3-(二甲基(3-(4-辛基苯甲酰胺基)丙基)铵基)丙烷-1-磺酸盐(ASB-C80)。
19.如权利要求16-18中任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述糖选自下组：蔗糖、葡萄糖、麦芽糖、乳糖、右旋糖、纤维二糖和半乳糖。
20.如权利要求16-19中任一项所述的试剂盒，所示试剂盒还包含：
结合剂。
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