CN108351351B - 使用亲和素和生物素的试验 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了使用亲和素‑生物素试验检测分析物的方法和试剂盒。

Description

使用亲和素和生物素的试验
相关申请的交叉引用
本申请要求2015年11月9日提交的美国临时申请第62/252,993号的优先权，其内容通过引用全文纳入本文。
背景
生物素-(链霉)亲和素系统是在多种不同应用中广泛使用的检测系统(Diamandis和Christopoulos(1991)Clin.Chem.37：625-36)。已将抗免疫球蛋白，蛋白A，蛋白G，凝集素，酶，核苷酸，核酸，激素或细胞与亲和素偶联或生物素化并用于各种应用，如免疫测定，流式细胞术，免疫组织化学，蛋白质印迹，受体定位，显微术，核酸杂交，亲和层析，受体-配体相互作用和杂交瘤生产(Diamandis表1和2，同上)。
亲和素-生物素相互作用已经用于以三种基本构型检测多种靶标。在其最简单的形式中，亲和素或链霉亲和素(本文有时称为(链霉)亲和素)用可检测分子例如酶，荧光，化学发光或放射性探针；金属；或一些其他部分标记。存在于另一反应物(抗体，核苷酸，蛋白A，凝集素等)上的生物素将靶分子与标记系统连接。该检测形式广泛用于免疫试验，DNA杂交试验，免疫组织化学和流式细胞术。携带多种可检测分子的亲和素和链霉亲和素偶联物可商购获得。
在间接试验中，使用未标记的(链霉)亲和素并用于将生物素化的结合剂与生物素化的检测分子连接起来。该系统的这种变化利用了每个亲和素或链霉亲和素分子中的多个生物素结合位点。它还广泛用于免疫试验和DNA杂交技术，特别是伴随可以容易地生物素化的探针(例如，酶和蛋白质荧光分子)。
第三种方法结合了上述试验的原理以产生更灵敏的系统(Hsu等，(1981)J.Histochem.Cytochem.29，577-80)。其概念是在受控条件下混合未标记的(链霉)亲和素和生物素化的检测试剂，例如酶。考虑到(链霉)亲和素上的多个生物素结合位点，可以产生具有一些游离生物素结合位点的聚合物。然后如上述试验中那样使用该试剂，但提供优异的灵敏度。提供优化浓度的链霉亲和素或亲和素和生物素化酶，使人们可以通过简单混合试剂形成复合物的试剂盒可商购获得并称为ABC(亲和素-生物素复合物)试剂盒。在美国专利号4684609中，Hsu等公开并声称亲和素与生物素化大分子的重量比为1∶1至16∶1；1∶6至16∶1；和2∶1至4∶1。该专利的表2公开了通过以32∶1，16∶1，8∶1，4∶1，2∶1，1∶1，0.5∶1和0.25∶1的比例使用亲和素与生物素化大分子获得的数据。该专利表2中的数据进一步表明，32∶1，0.5∶1和0.25∶1的比率的亲和素与生物素化大分子没有产生可检测的信号。还值得注意的是，在高亲和素浓度(40mg/ml)下16∶1，8∶1和4∶1的比率导致更高的背景染色。该专利提到，通过混合亲和素和生物素化大分子形成的复合物的制备物至少在数天内保持活性(USPN6684609，第3栏，第43-44行)。因此，每次都需要尝试几个比率来确定产生最大信号所需的最佳浓度。而且，该专利中描述的成功比率通常是有用的，其中需要小复合物，如在免疫组织化学中那样。使用亲和素-生物素系统的较高放大信号可以允许增加的检测范围以及使用较少的一抗和抗原标准品，从而降低试验的成本。因此，本领域需要开发提供这些和其他优点的新型试验。
发明内容
本公开涉及使用(链霉)亲和素-生物素检测系统的新型改进的分析物检测和/或定量试验和组合物。在一个实施方式中，公开了用于检测样品中的分析物的方法，包括：将样品与包被有结合分析物的结合剂的表面孵育；用由生物素标记的分析物的相同或不同结合剂孵育表面；用(链霉)亲和素孵育表面；在不去除(链霉)亲和素的情况下，进一步用标记的生物素(例如，生物素-荧光团)孵育表面；洗涤表面以除去未结合到表面的试剂；并检测和/或定量标记物，从而检测和/或定量分析物。
在一个方面，表面是珠，磁响应珠，发光珠或被覆有不同发光物的珠。在另一方面，所述表面是微量滴定板孔，蛋白质或核酸转移膜，生物细胞，显微镜载玻片或微流体芯片。
在一个方面，(链霉)亲和素与标记的生物素的摩尔比为约0.1∶1至3∶1。在另一方面，该比率为约0.3∶1至1∶1。
在一个方面，生物素用荧光团，酶，放射性标记物，电子密度试剂，半抗原或蛋白质标记。在一个方面，该荧光团是藻红蛋白(PE)。在另一方面，该酶是辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶。
在一个方面，链霉亲和素用荧光团，酶，放射性标记物，电子密度试剂，半抗原或蛋白质标记。在一个方面，该荧光团是藻红蛋白(PE)。在另一方面，该酶是辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶。
在一个方面，链霉(亲和素)和生物素都用荧光团，酶，放射性标记物，电子密度试剂，半抗原或蛋白质标记。在另一方面，(链霉)亲和素和生物素用相同的荧光团标记。在另一方面，(链霉)亲和素和生物素用不同的荧光团标记。在一个方面，该荧光团是藻红蛋白(PE)。在另一方面，该酶是辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶。
在一个实施方式中，公开了用于(链霉)亲和素-生物素试验的试剂盒，其包含用结合剂包被的一个或多个珠组，用生物素标记的检测抗体，用荧光团标记的(链霉)亲和素和/或生物素。在一个实施方式中，荧光团是藻红蛋白。
本文他处描述本发明的其他方面。
附图说明图1是示意图，显示潜在的(链霉)亲和素-标记的生物素相互作用。
图1A是示意图，显示潜在标记的(链霉)亲和素-标记的生物素相互作用。
图2显示了使用三种方案的代表性试验的结果。
图3显示链霉亲和素对生物素-PE摩尔比对MFI的影响。
图4显示了标准BIO-PLEX方案和新型放大方案之间的比较。
具体实施方式
除非另外定义，本文中使用的所有技术和科学术语具有本发明产生时本领域普通技术人员通常所理解的同样含义。参见例如Lackie，DICTIONARY OF CELLAND MOLECULARBIOLOGY(《细胞和分子生物学词典》)，埃尔斯威尔出版社(Elsevier)(第4版2007)；Sambrook等，MOLECULAR CLONING，A LABORATORY MANUAL(《分子克隆，实验室手册》)，冷泉港实验室出版社(冷泉港，纽约1989和后续版本)。术语“一个”或“一种”意在表示“一个(种)或多个(种)”。当术语“包含”及其各种变体例如“包括”和“含有”位于叙述步骤或要素之前的时候，是用来表示添加其它的步骤或要素是任选的，并且是非排它性的。本发明的实践中可以使用与本文所述类似或等价的任何方法、装置和材料。本文提供的以下定义是用来帮助理解本文经常用到的某些术语，不对本发明的范围构成限制。
定义
术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用以表示氨基酸残基的聚合物。该术语适用于其中一个或多个氨基酸残基是相应天然产生氨基酸的人造化学模拟物的氨基酸聚合物，以及天然产生的氨基酸聚合物和非天然产生的氨基酸聚合物。
术语“结合剂”指特异性结合抗原或分析物的分子。示例性结合剂包括但不限于抗体、抗体片段、非抗体蛋白支架、抗体模拟物、适体、Affimer、猝体(quenchbody)、酶标记的抗体或分析物特异性抗体对。
术语“抗体”指免疫球蛋白家族的多肽或包含能够非共价、可逆并以特定方式结合相应抗原的免疫球蛋白的片段的多肽。该术语包括但不限于：源自人或其它哺乳动物细胞的IgA、IgD、IgE、IgG和IgM同种型类的多克隆或单克隆抗体，包括天然形式或遗传修饰形式，如人源化、人、单链、嵌合、合成、重组、杂合、突变、移接和体外生成的抗体。该术语包括偶联物，包括但不限于含有免疫球蛋白部分的融合蛋白(如嵌合或双特异性抗体或单链Fv’s(scFv’s))以及片段(如Fab、F(ab′)2、Fv、scFv、Fd、dAb和其他组合物)。
本文所用术语“抗原”、“免疫原”、“抗体靶标”、“靶标分析物”和类似术语是指由结合剂识别的分子、化合物或复合物，即可被结合剂特异性结合的分子、化合物或复合物。该术语可以指可被结合剂特异性识别的任意分子，例如，蛋白质、多糖、毒素、细胞壁、细胞、病毒、鞭毛、纤毛或菌毛、微生物、真核细胞、与蛋白质或多糖复合的核酸、与蛋白质或多糖复合的脂质、多核苷酸、多肽、碳水化合物、化学部分或其组合(例如，磷酸化或糖基化的多肽等)。本领域技术人员会理解该术语并不表示该分子在各种情况中是免疫原性的，但仅仅表示其可被结合剂或抗体靶向。
抗体结合抗原上的“表位”。表位是抗原上被抗体识别并结合的局部位点。蛋白质表位可包括几个氨基酸或几个氨基酸的部分，例如，5或6个，或更多，例如20个或更多氨基酸，或这些氨基酸的部分。表位也可包括非蛋白质组分，例如核酸(例如，RNA或DNA)，碳水化合物，或脂质或其组合。在一些情况中，表位是三维部分。因此，例如，在靶标是蛋白质标靶的情况中，该表位可由连续氨基酸、或来自蛋白质的不同部分的氨基酸组成，这些部分通过蛋白质折叠靠近(例如，不连续表位)。这对于形成三维结构的其它类型的目标分子(例如DNA和染色质)也是一样的。
术语“对...有特异性”、“特异性结合”和类似术语指分子(例如，结合剂)与其靶标的结合亲和性比非靶标化合物高至少2倍，例如至少4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、25倍、50倍或100倍中的任意情况。例如，特异性结合特定标靶的结合剂通常以与非标靶相比高至少2倍的亲和性结合标靶。
关于靶标(例如，抗原、分析物和表位)的术语“结合”一般表示结合剂与纯群体中的大多数靶标结合(假定结合剂与标靶的合适的摩尔比)。例如，结合给定标靶的结合剂通常结合溶液中至少2/3的目标分子(例如75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)。本领域技术人员将认识到一些变异性将根据结合剂对靶标的亲和性以及测定结合的方法和/或阈值而产生。
术语“标记物”和“可检测标记物”可互换地指可通过光谱、光化学、生物化学、免疫化学、化学或其它物理手段检测的组合物。可用的标记物包括荧光染料(荧光团)、荧光猝灭剂、发光剂、高电子密度试剂、酶(例如ELISA中常用的酶)、生物素、地高辛、32P和其它放射性同位素、半抗原、蛋白质、核酸或可被检测的其他物质，例如通过将标记整合至与目标分子特异性反应的抗体、肽或寡核苷酸中。该术语包括单一标记试剂的组合，例如，提供独特可检测特征(例如，特定波长或波长组合下)的荧光团的组合。
“连接”至标记物的分子(例如，本文所述经标记抗体)是共价(通过接头或化学键)或非共价(通过离子、范德华力、静电或氢键)地结合标记物的分子，从而可通过检测与该分子结合的标记物来检测是否存在该分子。
“多重试验”是在单个反应试验或容器中同时检测超过一种分析物的分析方法。多重试验方法和试剂描述于，例如美国专利号6,773,578和WO2008148883。
本文所用术语“固体支持物”或“表面”指固体惰性表面或物体，其上可固定试剂，如抗体或抗原。非限制性示例包括塑料、硝酸纤维素、膜、芯片、和颗粒或珠。本文所用术语“固定”指分子基础的偶联，其在本文所述试验的任意步骤期间所施加的条件下都不会明显去偶联。这类固定可通过共价键、离子键、亲和型键或任意其他化学键实现。
本文所用术语“颗粒”指任何形状或表面结构的固体或半固体主体，通常线性尺寸为微米级(即小于100微米)。除非另有说明，该术语与“微粒”可互换使用，其是指微米级颗粒，并且与“珠”可互换使用，其是指形状是球形或近似球形的颗粒，通常在组成上是部分聚合的。
“生物素”，一种在所有活细胞中以很小的量存在的244道尔顿的维生素，以高亲和性结合亲和素、链霉亲和素和中性亲和素TM蛋白。由于生物素是较小的分子，其可偶联至许多蛋白质而不会显著改变它们的生物学活性。蛋白质可与几个生物素分子反应，其进而可各自结合亲和素分子。这将极大地增加许多试验过程的灵敏度。生物素还可用检测标记物，例如，用荧光团或酶标记。
“亲和素”是在鸟类、爬行类和两栖动物的蛋白和组织中存在的糖蛋白。它含有四个相同的亚基，其总质量为67,000-68,000道尔顿。每个亚基由128个氨基酸组成，并结合一个生物素分子。另一种生物素结合蛋白是“链霉亲和素”，其从阿维丁链霉菌(Streptomycesavidinii)分离并具有75,000道尔顿的质量。与亲和素相反，链霉亲和素不含碳水化合物并具有轻度酸性pI(5.5)。“中性亲和素(Neutravidin)”TM是亲和素的去糖基化版本，质量约为60,000道尔顿。术语亲和素，链霉亲和素和(链霉)亲和素在本文中可互换使用。这些亲和素还可用检测标记物，例如，荧光团或酶标记。
试验
由Guesdon首先描述的间接或桥接生物素-亲和素-生物素试验(Guesdon等，J.Histochem.Cytochem.27：1131-9(1979)，并且遵循多种方案)可能不太敏感，由于空间位阻，它允许仅一个或很少的亲和素分子与生物素化的抗体分子结合。这些方案然后在加入标记的生物素之前洗掉未结合的亲和素。因此，在这些间接方法中，亲和素与标记的生物素的进一步交联不可行。
另一方面，ABC(亲和素-生物素复合物)方法由于形成链霉亲和素和标记的生物素的较大交联复合物而显示出比直接或间接结合方法更灵敏。然而，这可能导致顶部重分子复合物，其中亲和素和标记的生物素的大晶格最终被结合到与感兴趣抗原结合的生物素化的抗体分子。由ABC方法形成的复合物可能不是非常高效的，因为空间干扰将限制大复合物与生物素化位点的结合。此外，多个晶格复合物可能没有可用于与分析物结合的生物素化抗体结合的亲和素的结合位点。
本文描述了称为“放大方案”的新方法，首先使(链霉)亲和素结合生物素化的结合剂(例如抗体)。亲和素-生物素复合物是蛋白质和配体之间最强的已知非共价相互作用(Kd＝10-15M)之一。因此，向“表面结合的结合剂-分析物-生物素化结合剂”复合物中加入(链霉)亲和素将确保结合剂上的每个可用生物素都被一个或多个(链霉)亲和素分子结合。在合适的孵育时间，例如15-30分钟后，加入标记的生物素分子，例如PE-生物素。只是现在(链霉)亲和素上的自由结合位点被PE-生物素结合，其进而又可以与可用的亲和素分子形成更大的复合物。不希望受理论束缚，相信这些相互作用可以导致更多的所得复合物的树状结构，并确保每种生物素化的结合剂都被(链霉)亲和素结合，其又被一个或多个标记的生物素化分子结合，其进而又被由标记的生物素结合的(链霉)亲和素结合。在合适的孵育时间后，洗涤表面。该洗涤步骤除去任何未结合的亲和素或标记的生物素分子，并测量表面的可检测信号。在一个实施方式中，亲和素未经标记。在另一个实施方式中，亲和素被标记。
在另一个实施方式中，(链霉)亲和素和生物素都被相同或不同的可检测标记物(例如荧光团)标记。为了区别于上述“放大方案”，新方案被称为“双标记放大方案”或DLAP或有时被称为“放大方案II”。如果使用超过两个放大步骤，则双重或多重放大提供更大的灵敏度并减少试剂的使用，特别是针对被检测靶标的一抗。在亲和素和生物素上使用不同的荧光团可以允许直接结合与放大阶段之间的区分。
样品
本文所述的试验和方法可用于检测任何类型样品中的一种或多种分析物。在一些实施方式中，所述样品是生物样品。在一些实施方式中，样品可以是化学或物理样品，例如，水或化学溶液或空气或岩石。生物样品可获自任何生物体，例如动物、植物、真菌、细菌、病毒或朊病毒或任何其他生物体，或者样品本身是生物体。在一些实施方式中，该生物样品来自动物，例如哺乳动物(如人或非人灵长类动物、奶牛、马、猪、绵羊、猫、狗、小鼠或大鼠)、鸟(如鸡)或鱼。生物样品可以是获自生物体的任何组织或体液，例如血液，血液成分或血液产品(如血清、血浆、血小板、血红细胞等)，痰液或唾液，组织(如肾、肺、肝、心、脑、神经组织、甲状腺、眼、骨骼肌、软骨或骨组织)；培养的细胞，例如原代培养物，外植体，和转化的细胞，干细胞，粪便或尿液。
在一些实施方式中，待测的一种或多种分析物是肽、蛋白质(如抗体、酶、生长调节剂、凝血因子或磷蛋白)、免疫原、多糖、毒素、细胞壁、细胞被囊、病毒被囊、病毒包衣、鞭毛、纤毛或菌毛、微生物、与蛋白质或多糖复合的核酸、或与蛋白质或多糖复合的脂质。
在一些实施方式中，可检测两种、三种、四种、五种或更多种不同分析物。在一些实施方式中，其中两种或更多种不同的分析物待检测，所述两种或更多种不同的分析物是相同类型的分析物(例如复合物中存在的两种或更多种蛋白质)。在一些实施方式中，其中两种或更多种不同的分析物待检测，所述两种或更多种不同的分析物是不同类型的分析物。
结合剂
适用于本发明方法的结合剂是特异性结合感兴趣的分析物(例如，抗原)的任何分子。在一些实施方式中，结合剂是抗体或其部分。
在一些实施方式中，本文所述的结合剂连接可检测标记物。该标记物可直接连接至结合剂(例如通过共价键)或可以间接连接(例如使用螯合剂或接头分子)。术语“标记物”和“可检测标记物”在本文中可互换使用并在下面详细描述。
单分析物试验
目前描述的试验可以如微量滴定板孔中的独立单分析物试验那样进行。该板可以用结合样品中感兴趣分析物的第一结合剂包被。在洗涤板(孔)后，如本文所述进行试验。
多重试验
本发明所述的试验能够在单一试验中检测超过一种分析物，并因此描述为多重试验。本文所述的试验包括用于在可区分的固体支持物上固定多种分析物，使得多种分析物各自可被流式细胞术或其他合适手段鉴定和定量的组分。试验组分和考量包括固体支持物和如何互相区分不同类型的固体支持物(例如，标记物和其它分化参数)、特异性固定所需分析物并去除其它样品材料的组分、和用于检测和定量所需分析物的标记物。
本文所述的多重试验包括使用固体支持物，一般是颗粒(也称为微粒或珠)。为了通过流式细胞术进行检测，应该避免发出自发荧光的颗粒，因为这会增加背景信号，因而它们不合适。通过标准乳液聚合从多种起始单体产生的颗粒一般显示出低自发荧光，而已经修饰以增加孔隙率(“大孔”颗粒)的那些颗粒可能会显示高自发荧光。这类颗粒中的自发荧光随着尺寸和二乙烯基苯单体百分比的增加而增加。
在这些限制内，微粒的尺寸范围可变化而粒径范围不重要。在大多数情况中，在粒径上，微粒的聚集尺寸范围在约0.001微米至约100微米的范围内，例如，在约0.5微米至约40微米的范围内。最近描述的纳米颗粒也适用于这些试验。
本领域中通常使用磁性颗粒，并且可对于本文所述的试验更方便地进行分离和洗涤步骤。“磁性颗粒”、“磁力响应性材料”、“磁珠”等术语表示响应磁场的材料。磁力响应性材料包括顺磁性材料(例如铁、镍和钴，以及金属氧化物，如Fe3O4、BaFe12O19、CoO、NiO、Mn2O3、Cr2O3和CoMnP)、铁磁性材料、亚铁磁性材料和变磁性材料。磁力响应性材料并非组成完整微粒，而是一般组成微粒的一个组分，而其余可由聚合材料组成，其可以经化学衍生化以允许试验试剂(例如，抗原或抗体)连接。
作为试验的一部分，施加并移去磁场的方法和仪器是本领域技术人员已知的并且在文献中报道。文献报道的示例是Forrest等，美国专利号4,141,687；Ithakissios，美国专利号4,115,534；Vlieger等，Ahalytical Biochemistry 205：1-7(1992)；Dudley，Journalof Clinical Immunoassay 14：77-82(1991)；和Smart，Journal of ClinicalImmunoassay 15：246-251(1992)。
形成微粒的聚合基质可以是与本文所述的试验相容的任意材料。该基质应该对于生物样品的组分和试验试剂是惰性的，具有最小的自发荧光，在试验中使用的样品和任何其它试剂或洗涤中是固态且不溶，并且能够将试验试剂固定于微球。合适的聚合物的非限制性示例是聚酯、聚醚、聚烯烃、聚环氧烷、聚酰胺、聚氨酯、多糖、纤维素和聚异戊二烯。许多聚合物中可使用交联来赋予微粒结构完整性和刚性。
用于连接试验试剂(例如，抗原或抗体)的官能团可通过常规手段整合到聚合物结构中。合适的官能团的非限制性示例是胺基团、铵基团、羟基、羧酸基团和异氰酸酯基团。试验试剂一般通过例如连接基团与固相表面直接或间接共价结合。连接基团可用作增加固相表面上反应性基团的密度并降低空间位阻以增加试验的范围和灵敏度的手段，或者用作增加向固相表面增加特定类型的反应性基团以拓宽可与固相固定的试验试剂类型范围的手段。合适的可用连接基团的非限制性示例是聚赖氨酸、聚天冬氨酸、聚谷氨酸和聚精氨酸。
多重试验中不同类型的微粒可通过例如尺寸、重量、光散射或吸收、反射、形状、或标记物(例如，荧光标记物)互相区分。
在使用微粒尺寸作为分化因子(区分特性)的情况中，选择尺寸子范围的宽度和相邻子范围的平均直径之间的间隔以允许通过流式细胞术区分不同类型的微粒，这在流式细胞术的应用和说明之下对于本领域技术人员而言是明显的。一般而言，给定平均直径的子范围是平均直径的约土5％CV或更小，其中CV是变异系数并定义为颗粒直径的标准偏差除以平均颗粒直径再乘以100％。不同类型颗粒的子范围的平均直径一般由子范围之一的平均直径的至少约6％隔开，例如，子范围之一的平均直径的至少约8％或10％。
光散射也可用于区分不同类型的微粒。侧角光散射随着颗粒尺寸、粒度、吸光度和表面粗糙度变化，而前向角光散射主要受到尺寸和折射率的影响。改变任意这些性质可能导致光散射差异，其可用作区分各组的手段。
分化参数的另一个示例是吸光度。当向颗粒施加光时，颗粒对光的吸光度主要表示为侧向(侧角)散射光的强度变化，而前向散射光的强度相对不受影响。由此，通过观察横向散射光强度的差异来确定各种与颗粒相关的有色染料之间的吸光度差异。
可将广泛的参数或特征用作区分参数以区分一组的颗粒和另一组的颗粒。区分参数可来自颗粒尺寸、来自颗粒组成、来自影响光散射的颗粒物理特征、来自将不同发射光谱和/或散射特征赋予颗粒的可激发荧光染料或有色染料，或者来自不同浓度的一种或多种荧光染料。
当可区分特征是荧光染料或颜色时，可将其包被于微粒表面上，包埋在微粒内或者连接至微粒材料的分子。因此，可通过将聚合物材料与荧光染料混合，或通过使用染料浸渍微粒来制造荧光微粒。已整合有染料并因此适用于本发明的微粒是市售可得的，可购自供应商，如斯菲罗公司(Spherotech，Inc.)(美国伊利诺伊州利伯蒂维尔)和分子探针有限公司(Molecular Probes，Inc.)(美国俄勒冈州尤金)。可在例如网站http：//www.molbio1.princeton.edu/facility/flowcyt/上找到流式细胞术产品的供应商。
可检测标记物的示例包括但不限于：生物素/链霉亲和素标记物(下文进一步描述)、核酸(例如寡核苷酸)标记物、化学反应性标记物、荧光标记物、酶标记物、放射性标记物、量子点、聚合物点、质量标记物及其组合。在一些实施方式中，该标记物可包括光学试剂，如荧光剂、磷光剂、化学发光剂等。多种试剂(如染料、探针或指示剂)是本领域已知的并可用于本发明。(参见例如英杰公司(Invitrogen)，The Handbook-A Guide toFluorescent Probes and Labeling Technologies(《手册——荧光探针和标记技术指导》)，第10版(2005))。荧光剂可包括多种有机和/或无机小分子或多种荧光蛋白及其衍生物。荧光团的文献来源包括Cardullo等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：8790-8794(1988)；Dexter，J.of Chemical Physics 21：836-850(1953)；Hochstrasser等，BiophysicalChemistry 45：133-141(1992)；Selvin，Methods in Enzymology 246：300-334(1995)；Steinberg，Ann.Rev.Biochem.，40：83-114(1971)；Stryer，Ann.Rev.Biochem.，47：819-846(1978)；Wang等，Tetrahedron Letters 31：6493-6496(1990)；以及Wang等，Anal.Chem.67：1197-1203(1995)。荧光染料和荧光标记物试剂包括可购自英杰/分子探针公司(Invitrogen/Molecular Probes)(俄勒冈州尤金市)和皮尔斯生物技术公司(PierceBiotechnology，Inc.)(伊利诺斯州洛克福德)的那些。
以下是可用作标记物的荧光团的非限制性示例：4-乙酰胺基-4’-异硫氰酸根合茋-2，2′二磺酸、吖啶、吖啶异硫氰酸酯、5-(2′-氨基乙基)氨基萘-1-磺酸(EDANS)、4-氨基-N-[3-乙烯基磺酰基)苯基]萘酰亚胺-3，5二磺酸酯、N-(4-苯胺基-1-萘基)马来酰亚胺、邻氨基苯甲酰胺、BODIPY、亮黄、香豆素、7-氨基-4-甲基香豆素(AMC，香豆素120)、7-氨基-4-三氟甲基香豆素(香豆素151)、花青染料、荧光桃红、4′，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)、5′，5″-二溴连苯三酚-磺酞(溴邻苯三酚红)、7-二乙基氨基-3-(4′-异硫氰酸根合苯基)-4-甲基香豆素二乙烯基三胺五乙酸酯、4，4′-二异硫氰根合二氢-茋-2，2′-二磺酸、4，4′-二异硫氰酸根合茋-2，2′-二磺酸、5-[二甲基氨基]萘-1-磺酰氯(DNS，丹酰氯)、4-(4′-二甲基氨基苯基偶氮)苯甲酸(DABCYL)、4-二甲基氨基苯基偶氮苯基-4’-异硫氰酸酯(DABITC)、曙红、曙红异硫氰酸酯、赤藓红B、赤藓红异硫氰酸酯、乙啶、5-羧基荧光素(FAM)、5-(4，6-二氯三嗪-2-基)氨基荧光素(DTAF)、2′，7′-二甲氧基-4′，5′-二氯-6-羧基荧光素(JOE)、荧光素、荧光素异硫氰酸酯、荧胺、IR144、IR1446、孔雀石绿异硫氰酸酯、4-甲基伞形酮、邻甲酚酞、硝基酪氨酸、副品红、酚红、藻红蛋白(包括但不限于B型和R型)、邻苯二甲醛、芘、丁酸芘、琥珀酰亚胺基1-丁酸芘、量子点、反应红4(CibacronTM亮红3B-A)、6-羧基-X-若丹明(ROX)、6-羧基若丹明(R6G)、丽丝胺若丹明B磺酰氯若丹明(Rhod)、若丹明B、若丹明123、若丹明X异硫氰酸酯、磺基若丹明B、磺基若丹明101、磺基若丹明101的磺酰氯衍生物(德州红)、N，N，N′，N′-四甲基-6-羧基若丹明(TAMRA)、四甲基若丹明、四甲基若丹明异硫氰酸酯(TRITC)、核黄素、玫红酸、镧系螯合衍生物。在一些实施方式中，该光学试剂是插入染料。插入染料包括但不限于SYBR绿和Pico绿(来自分子探针公司(Molecular Probes)(俄勒冈州尤金市))、化乙啶、碘化丙啶、色霉素、吖啶橙、Hoechst 33258、TOTO-I、YOYO-1和DAPI(4′，6-二眯基-2-苯基吲哚盐酸盐)。
用于免疫试验的常规使用的一组荧光团是荧光素、荧光素异硫氰酸酯、藻红蛋白、若丹明B和德州红(磺基若丹明101的磺酰氯衍生物)。本段落前列表中的任意荧光团可用于本发明所述的试验中，用于标记微粒或标记结合剂(例如，抗体或链霉亲和素)。荧光染料了通过常规共价结合，使用荧光染料上和微粒或结合剂上的合适官能团来连接。对此类基团的识别以及形成所述连接的反应对于本领域技术人员是显而易见的。
在一些实施方式中，荧光剂是聚合物点或量子点。使用的特定量子点(QD)对于本发明而言并不重要。量子点是本领域已知的且描述于例如Han等“Quantum-dot-taggedMicrobeads for Multiplexed Optical Coding of Biomolecules(用于生物分子的多重光学编码的量子点标记的微珠)”，Nat Biotechnol(2001年7月)第19卷，第631-635页。本领域技术人员应理解存在多种量子点，其可用作荧光标记物并用于本发明的实施方式并可从多个销售商处获得。示例性量子点(OD)包括但不限于以下：硒化镉(CdSe)量子点纳米颗粒(例如CdSe量子点核心，480-640nm发射光谱，西格玛-奥德里奇公司
Figure BDA0001653498590000131
)；硫化镉(CdS)量子点纳米颗粒(例如CdS量子点核心，380-480nm发射光谱，西格玛-奥德里奇公司)；硫化锌加帽的硒化镉(ZnS加帽的CdSe)纳米晶体(例如CdSe/ZnS LumidotsTM和CdSe/ZnS NanoDotsTM，480-640nm发射光谱，西格玛-奥德里奇公司)；以及无镉的量子点(例如CFQDTM，400-650nm发射光谱，西格玛-奥德里奇公司)。
连接可检测标记物与结合剂的技术是已知的。例如，常见蛋白标记技术的综述可参见Biochemical Techniques：Theory and Practice(《生物化学技术：理论和实践》)，John F.Robyt和Bernard J.White，维弗兰德出版公司(Waveland Press，Inc.)(1987)。其他标记技术综述于，例如，R.Haugland，Excited States of Biopolymers(《生物聚合物的兴奋状态》)，Steiner编，普莱南出版社(Plenum Press)(1983)；Fluorogenic ProbeDesign and Synthesis：A Technical Guide(《荧光探针设计与合成：技术指南》)，PE应用生物系统公司(PE Applied Biosystems)(1996)；以及G.T.Herman，BioconjugateTechniques(《生物偶联技术》)，学术出版社(Academic Press)(1996)。所述技术还可作为市售可得试剂盒(例如英国剑桥的银诺瓦生物科学有限公司(Innova Biosciences Ltd.)的Thunder-
Figure BDA0001653498590000141
和Lightning-
Figure BDA0001653498590000142
)的部分获得。许多适当标记的结合剂是可商购的，并且可以在有或没有进一步修饰的情况下使用。
可用于代替荧光团的其他标签是放射性标签和酶标签。这些方法也为本领域熟知。
流式细胞术方法和已知是本领域已知的。可在例如Introduction to FlowCytometry：A Learning Guide(《流式细胞术介绍：学习指南》)(2000)美国BD公司(Becton，Dickinson，and Company)；McHugh，″Flow Microsphere Immunoassay for theQuantitative and Simultaneous Detection of Multiple Soluble Analytes(用于多重可溶分析物的定量和同时检测的流式微球免疫试验)″Methods in Cell Biology 42(《细胞生物学方法42》)，B部分，(学术出版社(Academic Press)，1994)中发现仪器和方法的说明。
试剂盒
在另一方面，提供用于根据本文所述的方法检测分析物的试剂盒。在一些实施方式中，试剂盒包含一种或多种结合剂，例如，一种或多种用生物素标记的抗体，和/或分析物特异性抗体对，(链霉)亲和素，标记的生物素，例如，藻红蛋白标记的生物素，珠，对照试剂，如本文所述。在一些实施方式中，试剂盒还包含试验组分(例如缓冲液、缓冲盐和/或表面活性剂)。在一些实施方式中，用于检测分析物的试剂盒还包括所述结合剂特异性结合的分析物。在一些实施方式中，试剂盒还包括进行本文所述方法的说明。
系统
还提供了进行本发明所述方法的系统。试验和方法可以使用平板读数器在ELISA样设置中进行或可以用于多重系统。例如，来自伯乐公司(BIO-RAD)的BIO-PLEXTM200 BIO-PLEXTMMAGPIX系统或来自路明克斯公司(Luminex Corporation)的Luminex 200TM，
Figure BDA0001653498590000143
可用于实施本发明的方法。该试验也适用于蛋白质印迹设置以及蛋白质/抗体阵列或微流体装置。任何和所有使用直接或间接(链霉)亲和素-生物素检测系统的分析物检测系统都可以经修改以使用本文所述的放大方案来提高灵敏度。
实施例
实施例1
我们现描述一种新型信号放大方案。在此方案中，我们首先试图在添加生物素化的PE(或其他合适的标记物)之前用(链霉)亲和素使抗体-生物素位点饱和以产生大荧光复合物。
BIO-PLEX工作流方案可从加利福尼亚州赫尔克里斯的伯乐公司获得，下面简要总结。
简而言之：将标准品或样品与包被有捕获抗体的珠孵育30分钟-洗涤-用检测抗体孵育30分钟-洗涤-用亲和素-PE孵育30分钟-洗涤-在BIO-PLEX系统上读取。
为了增加基于(链霉)亲和素-生物素的试验的灵敏度，我们决定通过在检测抗体结合珠之后使用未标记的亲和素和生物素化的PE来放大信号。我们已经尝试了使用BIO-PLEX ProTM人趋化因子组40-Plex(加利福尼亚州赫尔克里斯的伯乐实验室公司)的以下三种放大方案。
方案1)将生物素化的PE和链霉亲和素混合，使其形成复合物，然后在检测抗体孵育后添加至磁珠，所述方案类似于免疫组织化学方案(与美国专利号4684609相当)。
方案2)在检测抗体孵育后，链霉亲和素，生物素化的PE和磁珠全部在一起。
方案3)在检测抗体孵育后，首先将链霉亲和素与磁珠孵育15分钟，加入生物素化的PE而不除去链霉亲和素。这些方案在链霉亲和素与生物素化-PE的不同比率下测试。图2显示了六张代表图。
我们发现，新方案3比其中复合物是在结合前预先形成的方案1或其中复合物在结合抗体时同时形成的方案2产生更多的荧光单位(MFI，中值荧光强度)。这可能表明，在需要增加试验灵敏度的情况下，在抗体结合之前或同时形成复合物可能不合适。与美国专利号4684609中的公开内容一致，方案1的链霉亲和素与生物素探针的最佳摩尔比约为2。然而，我们发现方案3的最佳摩尔比仅为约0.75，表明可能与方案1和方案2不同的形成复合物的机制。有可能在方案1和2中形成许多非生产性复合物(例如，如果所有四个(链霉)亲和素结合位点已被生物素-PE占据)，其没有结合生物素化抗体的机会。不希望被理论束缚，并且作为仅有的许多可能性之一，我们设想如图1所示的复合物形成。然而，这里可能存在其他可能在图1中未描述的复杂物形成可能性。表1提供了来自该实验的其他示例。
表1.BIO-PLEX ProTM人趋化因子组，40-Plex的示例
Figure BDA0001653498590000161
FI-荧光强度；％CV-变异系数％；SA-链霉亲和素；PE-生物素化R-藻红蛋白
基于上述观察，使用方案3进行进一步实验，方案3也可互换地称为“放大方案”。
实施例2
在另一组研究中，链霉亲和素与生物素-PE的摩尔比增加到3以上，并且该新方案再次优于方案1和2，并且在约0.75∶1的(链霉)亲和素至生物素-PE摩尔比下显示出最高MFI(图3)。
实施例3
接下来，使用针对IL-4，IL-6，IL-8，IL-10，GM-CSF和TNF-α的人细胞因子多重组检测试验，将放大方案的性能与标准BIO-PLEX方案(使用链霉亲和素-PE)进行比较。按照由重组蛋白制作的标准曲线测试方案。两个试验均于同一天在相同的板上进行。我们观察到来自通过放大方案进行的试验的更强荧光信号(图4)。例如，用标准BIO-PLEX方案的IL-4饱和约为4,000pg/ml，而对于放大方案则约为200pg/ml。应指出，使用放大方案时只需要60pg/ml即可达到标准方案的饱和极限。同样，对于IL-6，使用标准BIO-PLEX方案，采用30,000pg/ml，荧光达到约25,000MFI最大值，而使用放大方案时，仅用2,000pg/ml，荧光达到相同最大值。
信号的这种增加意味着更好的由伯乐BIO-PLEX Manager软件确定的定量限(LOQ)值。使用放大方案的信号放大改进范围是标准BIO-PLEX方案的2至15倍，表明试验灵敏度提高(表2)。
为了评估这些蛋白质在自然环境中的检测，我们测量了这些细胞因子在用脂多糖(LPS)处理24小时的THP-1细胞的生长培养基中的量(表3)。IL-4仅在使用信号放大程序后才被检测到。所有其他细胞因子含量丰富，并通过两种方案均检测到。显而易见，对于这些靶标，放大方案产生与标准试验相似的值，表明放大方案在定量中没有引入显著偏差。
这些数据证明了使用放大方案优于标准试验的一些优点。如通过检测THP-1细胞培养基中的IL-4(表3)和通过较低的LOQ值(表2)所证明的，放大程序提高了试验灵敏度。放大程序可能潜在地导致材料成本节约，因为需要低得多的重组抗原浓度以达到标准曲线饱和以及需要低得多的检测抗体的量以与标准方案产生的MFI相匹配。
表2
Figure BDA0001653498590000171
Figure BDA0001653498590000181
表3
Figure BDA0001653498590000182
实施例4
在其他变化形式中，链霉亲和素试剂用PE标记。这产生了双重放大(放大II)，因为链霉亲和素和随后的生物素都用在相同波长处发荧光的荧光团标记。酶，例如HRP可以类似地使用。在这项研究中，我们比较了三种方案的荧光强度(FI)：Bio-Plex和信号放大版本I和II。该研究使用针对表4中列出的不同浓度的重组蛋白的八种人试验的多重性进行。
表4
Figure BDA0001653498590000183
Figure BDA0001653498590000191
表5中的试剂列列出了信号放大试剂的浓度。读数显示荧光增加，II版放大方案显示出比Bio-Plex或放大I方案更高的荧光。
表5
Figure BDA0001653498590000192
Figure BDA0001653498590000201
Stds-标准
实施例5
使用两种方案测试了三种Bio-Plex试验，标准Bio-Plex和II版信号放大。每个试验用包括空白的10个标准曲线点运行。测试的样品是掺入了重组抗原和从心血管疾病(CVD)，类风湿性关节炎(RA)和系统性红斑狼疮(SLE)患者汇集的血浆样品的人血清。在测试之前将样品稀释四倍，并从标准曲线外推蛋白质浓度。信号放大方案中的检测抗体稀释4倍以降低背景。在所有三个试验(表6，7和8)中，信号放大方案比当前的Bio-Plex方案更灵敏，使用户能够检测到在其它情况下将不会被检测到的蛋白质靶标并降低试剂成本。
表6
Figure BDA0001653498590000202
Figure BDA0001653498590000211
将Ag掺入从健康人群收集的血清中。
从患有心血管疾病的患者组汇集CVD血清。
从患有类风湿性关节炎疾病的患者组汇集RA血清。
从患有系统性红斑狼疮疾病的患者组汇集SLE血清。
表7
Figure BDA0001653498590000221
表8
Figure BDA0001653498590000231
本文引用的所有文件(例如，专利、专利申请、书籍、期刊论文或其它公开物)通过引用全文纳入本文以用于所有目的，就好像将各篇单独的文件特定且单独地通过引用全文纳入本文用于所有目的一样。对于通过引用纳入的此类文件与本说明书中所含公开内容相矛盾的内容，均意于以本说明书为准和/或本说明书优先于任何相矛盾的材料。
可获得本发明的多种修改形式和变化形式而不背离本发明的精神和范围，这对于本领域技术人员而言是显见的。本文所述的具体实施方式仅起示例作用，且不意于构成任何方式的限制。

Claims (18)

1.一种对样品中的分析物进行检测或定量的方法，包括：
a.将所述样品与用能够结合所述分析物的结合剂包被的表面孵育；
b.将所述表面与生物素标记的所述分析物的相同或不同结合剂孵育；
c.将所述表面与未标记的链霉亲和素或亲和素孵育；
d.在不除去链霉亲和素或亲和素的情况下，进一步将所述表面与用可检测标记物标记的生物素孵育；
e.洗涤所述表面以去除不与所述表面结合的试剂；并且
f.对所述标记物进行检测和/或定量并由此对所述分析物进行检测或定量。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述表面是珠。
3.如权利要求2所述的方法，其中所述珠具有磁力响应性。
4.如权利要求2或3所述的方法，其中所述珠是发光的。
5.如权利要求1所述的方法，其中超过一种分析物结合剂包被于具有不同发光的不同珠组上。
6.如权利要求1所述的方法，其中所述表面是微量滴定板孔。
7.如权利要求1所述的方法，其中所述表面是蛋白质转移膜。
8.如权利要求1所述的方法，其中所述表面是生物细胞。
9.如权利要求1所述的方法，其中所述表面是显微镜载玻片或微流体芯片。
10.如权利要求1所述的方法，其中链霉亲和素或亲和素与标记的生物素的摩尔比为0.1:1至3:1。
11.如权利要求10所述的方法，其中所述摩尔比为0.3:1至1:1。
12.如权利要求1所述的方法，其中生物素上的可检测标记物是荧光团、酶、放射性标记物、电子密度试剂，半抗原或蛋白质。
13.如权利要求12所述的方法，其中所述荧光团是藻红蛋白。
14.如权利要求12所述的方法，其中所述酶是辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶。
15.一种用于链霉亲和素或亲和素-生物素检测试验的试剂盒，包含：
a.一个或多个用结合剂包被的珠组；
b.用生物素标记的检测抗体；
c.未标记的链霉亲和素或亲和素；和
d.用可检测标记物标记的生物素。
16.如权利要求15所述的试剂盒，其中所述标记物是荧光团、酶、放射性标记物、电子密度试剂、半抗原或蛋白质。
17.如权利要求15所述的试剂盒，其中所述标记物是荧光团。
18.如权利要求17所述的试剂盒，其中所述荧光团是藻红蛋白。
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