CN101929997B - 一种提高免疫检测灵敏度的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种提高免疫检测灵敏度的方法。具体地,本发明提供了一种生物素-亲和素的复合物,所述复合物包括:(i)引发序列;(ii)第n级亲和素,其中n为1-20的正整数;并且当n为1时,则第1级亲和素结合于所述引发序列上的生物素;和(iii)生长序列,所述的生长序列是两端标记有生物素的寡核苷酸单链,所述生长序列中位于一端的生物素与第n级亲和素结合,而位于另一端的生物素与第n+1级亲和素结合或处于未结合状态,其中n为1-20的正整数。本发明的复合物可有效提高免疫检测的灵敏度,并且可以基本上不改变也不增加原有的免疫检测试验操作程序。
Description
技术领域
本发明涉及体外检测技术领域,具体地涉及一种提高免疫分析检测灵敏度的方法。
背景技术
免疫分析法(immunoassay,IA)是基于抗原和抗体特征性反应的一种技术。由于免疫分析试剂在免疫反应中所体现出的独特的选择性和极低的检测限,使这种分析手段在临床、生物制药和环境化学等领域得到广泛应用。
生物素(biotin)-亲合素(avidin)是免疫分析技术中的重要工具,主要是因为其有下述几个特点:
①亲和素对生物素的亲和力极高,为抗原抗体反应的百万倍,具高度特异性和稳定性。
②生物素分子小,结构简单,极易与抗体、核酸、多糖及多种酶等生物大分子以共价键稳定结合,同时对结合物的原始生物活性无不良影响。
③亲和素性质极为稳定,每分子可结合4个生物素衍生物,其作为生物素化分子与信号物之间的桥,起到信号放大作用,从而提高检测的灵敏度。
由生物素-亲和素反应建立信号放大系统,一般有两种方法:一是用生物素标记抗体,与固相抗原结合后,再加入亲和素-酶结合物,从而使测定反应放大;二是使用生物素-抗体、游离亲和素和生物素-酶结合物三种试剂,于固相抗原中加入试剂的顺序为生物素-抗体、亲和素和生物素-酶。
上述方法之所以可行,在于亲和素对生物素的4价结合能力,上述多步模式也可通过预先制成可溶的亲和素-生物素化酶复合物而得到简化,亦即所谓的ABC(avidin-biotin-complex)方法(参见US专利4684609),这种生物素-亲和素放大系统可使常规的酶免疫分析法(EIA)或荧光免疫分析法(fluorescence immunoassay,FIA)的检测灵敏度提高2~100倍。然而,目前现有的这些检测方法还不能令人满意地满足临床上检测人血清中极低含量生物分子的需求。
因此,本领域迫切需要开发进一步提高免疫检测灵敏度的方法。
发明内容
本发明的目的就是提供一种进一步提高免疫检测灵敏度的方法。
在本发明的第一方面,提供了一种生物素-亲和素的复合物,所述复合物包括:
(a)固相载体;
(b)根序列,所述的根序列是固定于所述固相载体表面上的寡核苷酸单链;
(c)引发序列,所述的引发序列是互补结合于所述根序列的、并且在一端标记有生物素的寡核苷酸单链;
(d)第n级亲和素,其中n为1-20的正整数;并且当n为1时,则第1级亲和素结合于所述引发序列上的生物素;和
(e)生长序列,所述的生长序列是两端标记有生物素的寡核苷酸单链,所述生长序列中位于一端的生物素与第n级亲和素结合,而位于另一端的生物素与第n+1级亲和素结合或处于未结合状态,其中n为1-20的正整数。
在另一优选例中,所述的固相载体是微球;更佳地,所述的固相载体为磁性微球,例如微米级微球、纳米颗粒、或荧光微球。
在另一优选例中,n为1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,或19。
在另一优选例中,所述的根序列的长度为20-60个碱基,更佳地为25-50个碱基。
在另一优选例中,所述的引发序列的长度为10-50个碱基,更佳地为15-40个碱基。
在另一优选例中,所述引发序列与根序列的互补结合区的长度为20-40bp,更佳地为20-30bp。
在另一优选例中,所述的生长序列的长度为8-30个碱基,更佳地为10-20个碱基。
在另一优选例中,所述的生长序列是长度为8-20个碱基的polyT。
在本发明第二方面,提供了一种生物素-亲和素的复合物,所述复合物包括:
(i)引发序列,所述的引发序列是在一端标记有生物素的寡核苷酸单链;
(ii)第n级亲和素,其中n为1-20的正整数;并且当n为1时,则第1级亲和素结合于所述引发序列上的生物素;和
(iii)生长序列,所述的生长序列是两端标记有生物素的寡核苷酸单链,所述生长序列中位于一端的生物素与第n级亲和素结合,而位于另一端的生物素与第n+1级亲和素结合或处于未结合状态,其中n为1-20的正整数。
在本发明的第三方面,提供了一种免疫检测分析方法,在本发明第一或第二方面中所述的生物素-亲和素的复合物存在下进行免疫分析检测。
在本发明的第四方面,提供了一种在本发明第一或第二方面中所述的生物素-亲和素的复合物的用途,它用于制备提高免疫检测灵敏度的灵敏度增强剂。
在本发明的第五方面,提供了一种制备的本发明所述生物素-亲和素的复合物的方法,包括步骤:
(a)将用作根序列的第一寡核苷酸单链固定于固相载体,
(b)将用作引发序列的第二寡核苷酸单链与所述根序列接触,所述的第二寡核苷酸单链是在一端标记有生物素的寡核苷酸单链,从而形成相对稳定的“根序列-引发序列”杂合体,其中所述的引发序列互补结合于所述的根序列;随后去除过量的引发序列;
(c)将亲和素与所述引发序列上的生物素接触并结合;随后去除过量的、未结合的亲和素,从而获得第1级生物素-亲和素的复合物;
或者所述步骤(c)还包括重复以下步骤(c1)-(c2)共1至n-1次,从而获得第n级生物素-亲和素的复合物,其中,n为2-20的正整数:
(c1)将用作生长序列的第三寡核苷酸单链与上一步骤获得的生物素-亲和素的复合物接触,其中所述第三寡核苷酸单链是两端标记有生物素的寡核苷酸单链,从而使得所述生长序列中位于一端的生物素与上一步骤中形成的结合状态的亲和素形成结合;随后去除过量的、未结合的生长序列;
(c2)将亲和素与步骤(c1)中所述生长序列另一端的生物素接触并结合;随后去除过量的、未结合的亲和素。
在另一优选例中,还包括步骤:将形成的第n级生物素-亲和素复合物与结合于固相载体的根序列解离开,从而获得不含固相载体和根序列的生物素-亲和素复合物。
应理解,在本发明范围内,本申请上述以及下述的各技术特征可以各种方式进行组合,以构成各种优选例。例如,根序列的长度一般范围的下限20个碱基可以与优选范围的上限50个碱基进行组合,从而构成范围20-50个碱基。
附图说明
图1至图5显示了本发明一个实例中生物素-亲和素n级复合物的制备示意图。
图6显示了常规的免疫分析法产生信号的机制。
图7显示了在本发明的免疫分析法中“生物素-亲和素n级复合物”产生信号的机制。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究,基于生物素/亲和素反应的特性,首次提供了一种新的生物素-亲和素复合物的生产方法。利用该复合物,可进一步显著提高免疫检测灵敏度,通常可提高1000倍至10000倍或更多(理论上,对免疫反应信号的放大倍数可达106或更高)。与现有技术相比,本发明方法使免疫检测灵敏度提高了至少1-2个数量级,从而可以较好地满足临床上检测人血清中极低含量生物分子的需求。
如本文所用,术语“根序列”指可通过例如共价键固定于固相载体的寡核苷酸单链。此外,该术语还包括用于形成根序列或用作根序列的寡核苷酸单链。
如本文所用,术语“引发序列”指互补结合于所述根序列的、并且在一端标记有生物素的寡核苷酸单链。此外,该术语还包括用于形成引发序列或用作引发序列的寡核苷酸单链。
如本文所用,术语“生长序列”指两端标记有生物素的寡核苷酸单链,所述生长序列中位于一端的生物素与第n级亲和素结合,而位于另一端的生物素与第n+1级亲和素结合或处于未结合状态,其中n为1-20的正整数。此外,该术语还包括用作引发序列的寡核苷酸单链。
如本文所用,术语“亲和素”包括亲合素(avidin)和链亲和素(streptavidin)。该术语还包括野生型、突变型以及衍生型的亲和素。
在本发明的复合物中,以引发序列上的生物素为起点,可一层一层地通过“生物素-亲和素-生长序列”方式连接的大的n级复合物。
为了便于理解本发明,本发明人提供了以下基本原理。然而,应理解,本发明的保护范围并不受限于本发明的基本原理。
参见附图1~5。将根序列固定于固相载体,在适宜的条件下引发序列与根序列形成相对稳定的杂合体(图1);去除过量的引发序列后,加入亲和素与固相载体上引发序列的生物素稳定结合(图2);去除过量的、未结合的亲和素,加入生长序列,在固相载体上形成“生物素-亲和素1级复合物”,单个复合物的生物素的数量为31(图3);去除过量的生长序列,加入亲和素,与固相载体上生长序列的生物素稳定结合(图4);去除过量的、未结合的亲和素,加入生长序列,在固相载体上形成“生物素-亲和素2级复合物”,单个复合物的生物素数为32(图5),依此类推,当生成“生物素-亲和素n级复合物”时,单个复合物的生物素数为3n,此时适当地改变溶液条件,使引发序列脱离根序列,经过分离得到处于稳定的溶液状态下的“生物素-亲和素n级复合物”,用于免疫反应的信号放大,提高检测的灵敏度。
参见图6,图中显示了常规的免疫反应产生信号的机制。捕获抗体经共价键固定于固相载体,和相应的抗原反应后再与标记了生物素的第二抗体反应,夹心后再与连接了酶或荧光染料的亲和素稳定结合,酶催化底物显色或直接检测荧光强度对抗原进行定量,信号强度(灵敏度)取决于经一系列反应后最终结合酶的量或荧光染料的量,图示中第二抗体标记的生物素与最终的酶或荧光染料的量的比例关系为1∶1。
参见图7,图中显示了本发明方法中,免疫反应应用了“生物素-亲和素n级复合物”后产生信号的机制:
形成夹心的步骤与图6完全一致,夹心后经连接有酶或荧光染料的亲和素将“生物素-亲和素n级复合物桥连于第二抗体,这样图示中第二抗体标记的生物素与最终的酶或荧光染料的量的比例关系约为1∶3n,相应地,灵敏度约为原来的3n倍。
(1)生物素-亲和素n级复合物的制备
1.1根序列固定于固相载体
合成5’端修饰的一段寡核苷酸序列(如:-NH2、生物素、-SH修饰等),使其与完全匹配的互补链形成的杂合体相对稳定(如:Tm在50~70℃之间);
选择合适的商业化的表面经相应修饰(如:羧基/亲和素化的聚苯乙烯微球、羧基/亲和素化的磁性微球等)的固相载体,按其使用说明或有关文献将跟序列稳定地固定于固相载体;
通过离心或施加磁场将固相载体与过量的游离的跟序列分离,固相载体经洗涤后存于缓冲液中备用。
1.2引发序列与根序列形成相对稳定的杂合体
合成5’端经生物素修饰的一段寡核苷酸,其序列与跟序列完全互补;
在适宜离子强度和温度的缓冲液中,引发序列与固相载体表面的跟序列杂交1小时后形成相对稳定的杂合体;
通过离心或施加磁场将固相载体与过量的游离的引发序列分离,固相载体经洗涤后存于缓冲液中备用。
1.3连接亲和素
在含有固相载体的缓冲液中加入游离的亲和素溶液适量,静置30min,固相载体表面引发序列的生物素与亲和素稳定地结合;
通过离心或施加磁场将固相载体与过量的游离的亲和素分离,固相载体经洗涤后存于缓冲液中备用。
1.4生物素-亲和素1级复合物的生成
合成3’、5’均经生物素修饰的一段寡核苷酸(生长序列),碱基数10~20个;
在含有固相载体的缓冲液中加入游离的生长序列溶液适量,生长序列一端的生物素与固相载体表面的亲和素稳定地结合;
通过离心或施加磁场将固相载体与过量的游离的生长序列分离,固相载体经洗涤后存于缓冲液中备用;
将含有固相载体缓冲液的温度升高到根序列与引发序列杂合体的Tm以上,使引发序列与根序列解离(也可采用改变溶液的离子强度或酸碱度等方法),脱离固相载体,在保持该温度的条件下进行离心或施加磁场,吸取上清液,得到生物素-亲和素1级复合物。
……
如此反复,得到固相载体表面“长出”的生物素-亲和素n级复合物。
(2)生物素-亲和素n级复合物用于免疫分析法的信号放大
2.1捕获抗体固定于固相载体(以羧基化的聚苯乙烯微球为例)
针对某种抗原Ag的捕获抗体(anti1Ag)与羧基化的聚苯乙烯微球(Beads)共价交联的详细操作程序请登录Luminex公司网站:www.luminexcorp.com上的技术支持,得到Beads与捕获抗体的耦联物anti1Ag-Beads,为A液,同时记录与Beads共价交联加入一抗的质量为M1。
2.2第二抗体的生物素标记
取质量为M1经透析纯化后的针对Ag的第二抗体,加入生物素的二甲基亚砜(DMSO)溶液,避光反应,透析去除未反应的生物素,保存备用。
2.3荧光染料标记第二抗体
取生物素标记的第二抗体,加入亲和素标记的荧光染料,使生物素与亲和素结合,生成第二抗体-荧光染料,为C液。
2.4抗原标准品溶液的配制
用Ag的标准品配制一定浓度的标准品溶液,为B液。
2.5免疫反应及信号检测
将A、B、C液体混匀,37℃反应30min,离心洗涤后得到图6所示的复合物缓冲液(此时可按常规做法检测荧光信号);
加入生物素-亲和素n级复合物,使生物素与图6固相载体上的亲和素连接,离心洗涤后再加入亲和素标记的荧光染料,离心洗涤后得到图7所示的复合物后即可检测经放大的荧光信号。
本发明的主要优点在于:
(a)可有效提高免疫检测的灵敏度。
(b)基本上不改变也在不增加原来的免疫检测试验操作程序。
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,例如Sambrook等人,分子克隆:实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1
生物素-亲和素1级复合物用于甲胎蛋白抗原免疫分析检测
1、生物素-亲和素1级复合物的制备
1.1根序列固定于羧基修饰的磁颗粒
1.1.1原料
根序列:5’NH2-(T15)GACCAATGCATGGTCCAGAC3’(SEQ ID NO:1);
粒径为1μm表面羧基化的磁微球;
EDC(1-乙基-3-(3-二甲胺基丙基)碳二亚胺);
MES(吗啉乙磺酸)
1.1.2操作步骤
01.将根序列寡核苷酸用双蒸水溶解,浓度为0.01mM;
02.用振荡器将磁微球混合均匀;
03.取50μl(约6.0×106磁微球),放入洁净的Ep管中;
04.施加磁场沉淀磁微球,小心弃取上清液;
05.取消磁场,加入100μl双蒸水,充分振荡悬浮磁微球,施加磁场沉淀磁微球;
06.弃去上清液,取消磁场,用50μl 0.1M MES(pH 4.5)重新悬浮磁微球,并用振荡器混匀;
07.取10μl根序列溶液加到上步骤中的磁微球悬液中,用振荡器混匀;
08.按10mg/mL新鲜配制EDC溶液;
09.取2.5μl上步骤的EDC溶液加入磁微球悬液中,用振荡器混匀;
10.避光,37℃静置30分钟;
11.施加磁场沉淀磁微球;
12.弃去上清液,取消磁场,用1.0mL 0.1%SDS重新悬浮磁微球,并用振荡器混匀;
13.施加磁场沉淀磁微球;
14.弃去上清液,取消磁场,用100μl TE(pH 8.0)重新悬浮磁微球,并用振荡器混匀;
15.将固定了根序列的磁微球避光保存在2-10℃环境中。
1.2引发序列与根序列形成相对稳定的杂合体
1.2.1原料
引发序列:3’CTGGTTACGTACCAGGTCTG(T10)-生物素5’(或表示为5’-生物素-tttttttttt gtctggaccatgcattggtc-3’,SEQ ID NO:2);
固定了根序列的磁微球混悬液。
1.2.2操作步骤
01.将引发序列用TE(pH 8.0)溶解,浓度为0.01mM;
02.用振荡器将磁微球混悬液混合均匀;
03.取10μl引发序列溶液加入50μl磁微球混悬液中,混匀后室温放置30min;
04.施加磁场,弃去上清液;
05.取消磁场,加入1ml TE缓冲液洗涤磁微球;
06.施加磁场,弃去上清液,反复几次得到如图1复合物的TE混悬液100μl。
1.3连接亲和素
1.3.1原料
市售亲和素;
步骤1.2中制备复合物(图1)的TE混悬液。
1.3.2操作步骤
01.取10μl市售亲和素溶液加入图1复合物的100μl TE混悬液中,混合均匀,室温静置30min;
02.施加磁场,沉淀磁微球,弃去上清液;
03.取消磁场,加入1ml TE缓冲液洗涤磁微球;
04.施加磁场,弃去上清液,反复几次得到如图2复合物的TE混悬液100μl。
1.4生物素-亲和素1级复合物的生成
1.4.1原料
生长序列:3’生物素-TTTTTTTTTTTTTTT-生物素5’(SEQ ID NO:3);
图2复合物的TE混悬液。
1.4.2操作步骤
01.将生长序列用TE缓冲液配制成终浓度为10μM;
02.取10μl生长序列溶液加入图2复合物的TE混悬液100μl中,混合均匀,室温静置30min;
03.施加磁场,沉淀磁微球,弃去上清液;
04.取消磁场,加入1ml TE缓冲液洗涤磁微球;
05.施加磁场,弃去上清液,反复几次得到如图3复合物的TE混悬液100μl;
06.施加磁场,沉淀磁微球,弃去上清液;
07.取消磁场,加入100μl纯水,混合均匀,提高温度至50℃,静置5min;
08.施加磁场,沉淀磁微球,吸取上清液,得到生物素-亲和素1级复合物,2-8℃保存备用。
2、生物素-亲和素1级复合物用于免疫分析法的信号放大
此处以Luminex流式荧光法检测甲胎蛋白抗原为例说明本专利放大检测信号提高灵敏度的有效性。
根据基本原理的阐述,生物素-亲和素1级复合物用于免疫分析,对信号的放大倍数理论上应是常规信号检测方法的3倍,为此用2种方法分别平行检测同样浓度的甲胎蛋白抗原5次,求各自的平均数,观察2个平均数的比值是否接近于3。
2.1常规方法检测甲胎蛋白抗原
2.1.1原料
市售“甲胎蛋白定量检测试剂盒(流式荧光免疫法)”。
2.1.2操作(反应原理如图6所示)
01.将试剂盒中16ng/ml的校准品复溶;
02.分别吸取5次,每次20μl,置于5个EP管中;
03.按试剂盒使用说明书操作,获取这5个平行样的荧光信号,结果见下表:
表1:16ng/ml的校准品的荧光信号值
2.2生物素-亲和素1级复合物配合常规方法检测甲胎蛋白抗原
2.2.1原料
使用上述同一试剂盒;
生物素-亲和素1级复合物纯水溶液。
2.2.2操作(反应原理如图7所示)
01.分别吸取上述复溶的同一校准品溶液5次,每次20μl,置于5个EP管中;
02.按试剂盒使用说明书操作至反应结束,不要上机检测荧光信号;
03.将5个EP管离心,弃去上清液;
04.用试剂盒提供的反应缓冲液配合离心操作洗涤如图6所示的复合物2次后,加入反应缓冲液100μl,振荡,使复合物悬浮;
05.复合物悬浮液中加入10μl生物素-亲和素1级复合物溶液,混合均匀,37℃静置30min;
06.重复“03,04”的操作;
07.加入标记了藻红蛋白(PE)的链亲和素,混合均匀,37℃静置30min,得到如图7所示的复合物;
08.上机检测荧光信号,结果见下表:
表2:生物素-亲和素1级复合物配合常规方法检测16ng/ml的校准品的荧光信号值
2种方法荧光信号的比值约为3.82,这提示:对于1个反应单元(图6、7所示),常规方法下只有1个荧光染料分子报告信号,而使用了生物素-亲和素1级复合物后,加原来的1个共有4个荧光染料分子报告信号,所以比值应接近4,因此本专利方法能够有效放大免疫分析方法的信号,提高检测灵敏度。
实施例2:生物素-亲和素8级复合物用于甲胎蛋白抗原免疫分析检测
1、生物素-亲和素8级复合物的制备
参照实施例1中生物素-亲和素1级复合物的制备方法和附图1-5,增加循环反应的次数得到生物素-亲和素8级复合物溶液。
2、生物素-亲和素8级复合物用于免疫分析法的信号放大
仍以Luminex流式荧光法检测甲胎蛋白抗原为例说明本专利放大检测信号提高灵敏度的有效性,本实施例仍以实施例1中16ng/ml的校准品为样品。
根据基本原理的阐述,生物素-亲和素8级复合物用于免疫分析,对信号的放大倍数理论上应是常规信号检测方法的38倍,即:6561倍。
为此用常规方法平行检测16ng/ml的甲胎蛋白校准品5次,求荧光信号的平均数;将16ng/ml的甲胎蛋白校准品用试剂盒提供的反应缓冲液稀释1000倍后(即:16pg/ml),再用生物素-亲和素8级复合物配合常规方法,平行检测16pg/ml的甲胎蛋白校准品5次,求荧光信号的平均数。
原料、操作步骤与实施例1中的相应部分完全一致,结果见表3、4。
表3:常规方法检测16ng/ml的校准品的荧光信号值
表4:生物素-亲和素8级复合物配合常规方法检测16pg/ml的校准品的荧光信号值
2种方法荧光信号平均值的比值约为:2.4,因后者测的样本的浓度为前者的1/1000,所以将2.4×1000=2400,虽与理论值有较大的差距,但还是大幅提高的检测的灵敏度。
实施例3:生物素-亲和素8级复合物用于甲胎蛋白抗原免疫分析检测
重复实施例1和2,不同点在于,制备生物素-亲和素2级复合物、生物素-亲和素3级复合物、生物素-亲和素4级复合物、生物素-亲和素5级复合物、生物素-亲和素6级复合物、和生物素-亲和素7级复合物。并测试各级复合物的检测灵敏度。
结果如表5所示。
表5各级复合物的检测灵敏度
复合物的级数(n) | 与对照相比的相对灵敏度倍数(复合物/对照的比值) |
0(对照) | 1 |
1 | 3.82 |
2 | 14 |
3 | 40 |
4 | 110 |
5 | 275 |
6 | 630 |
7 | 1320 |
8 | 2425 |
上述结果表明,本发明的2级复合物可以提高灵敏度约15倍,而4级复合物可以提高灵敏度约100倍,而6级复合物可以提高灵敏度约1000倍。随着n级数的增加,虽与理论值有较大的差距,但仍可大幅提高的检测的灵敏度。
实施例4-5:不同序列长度的根序列
重复实施例1和2,制备n=4的4级复合物。不同点在于:用5’NH2-(T13)GACCAATGCATGGTCCAGA3’(SEQ ID NO:4)或5’NH2-(T20)GACCAATGCATGGTCCAGAC3’(SEQ ID NO:5)分别替换SEQ ID NO:1所示的根序列。
测试结果表明,实施例4和5的二种4级复合物可以提高灵敏度约100倍和105倍。
实施例6-7:不同序列长度的引发序列
重复实施例1和2,制备n=3的3级复合物。不同点在于:用5’-生物素-ttttttttt gtctggaccatgcattggt-3’(SEQ ID NO:6)或5’-生物素-tttttttttttttt gtctggaccatgcattggtc-3’(SEQ ID NO:7)分别替换SEQ IDNO:2所示的引发序列。
测试结果表明,实施例6和7的二种3级复合物可以提高灵敏度约38倍和42倍。
实施例8:不同序列长度的生长序列
重复实施例1和2,制备n=4的4级复合物。不同点在于用tttttttttttt(SEQ ID NO:8)替换SEQ ID NO:3所示的生长序列。
测试结果表明,所制备的4级复合物可以提高灵敏度约100倍。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考,就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解,在阅读了本发明的上述讲授内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110>上海透景生命科技有限公司
<120>一种提高免疫检测灵敏度的方法
<130>088288
<160>8
<170>PatentIn version 3.2
<210>1
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<223>根序列
<400>1
tttttttttt tttttgacca atgcatggtc cagac 35
<210>2
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<223>引发序列
<400>2
tttttttttt gtctggacca tgcattggtc 30
<210>3
<211>15
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<223>生长序列
<400>3
tttttttttt ttttt 15
<210>4
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<223>根序列
<400>4
tttttttttt tttgaccaat gcatggtcca ga 32
<210>5
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<223>根序列
<400>5
tttttttttt tttttttttt gaccaatgca tggtccagac 40
<210>6
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<223>引发序列
<400>6
tttttttttg tctggaccat gcattggt 28
<210>7
<211>34
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<223>引发序列
<400>7
tttttttttt ttttgtctgg accatgcatt ggtc 34
<210>8
<211>12
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<223>生长序列
<400>8
tttttttttt tt 12
Claims (12)
1.一种生物素-亲和素的复合物,其特征在于,所述复合物包括:
(a)固相载体;
(b)根序列,所述的根序列是固定于所述固相载体表面上的寡核苷酸单链;
(c)引发序列,所述的引发序列是互补结合于所述根序列的、并且在一端标记有生物素的寡核苷酸单链;
(d)生物素-亲和素的n级复合物,其中n为2-20的正整数;并且第1级亲和素结合于所述引发序列上的生物素;和
(e)生长序列,所述的生长序列是两端标记有生物素的寡核苷酸单链,所述生长序列中位于一端的生物素与第n级亲和素结合,而位于另一端的生物素与第n+1级亲和素结合或处于未结合状态,其中n为2-20的正整数。
2.如权利要求1所述的复合物,其特征在于,所述的固相载体是微球。
3.如权利要求1所述的复合物,其特征在于,n为3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,或19。
4.如权利要求1所述的复合物,其特征在于,所述的根序列的长度为20-60个碱基。
5.如权利要求4所述的复合物,其特征在于,所述的根序列的长度为25-50个碱基。
6.如权利要求1所述的复合物,其特征在于,所述的引发序列的长度为10-50个碱基。
7.如权利要求6所述的复合物,其特征在于,所述的引发序列的长度为15-40个碱基。
8.如权利要求1所述的复合物,其特征在于,所述的生长序列的长度为8-30个碱基。
9.如权利要求8所述的复合物,其特征在于,所述的生长序列的长度为10-20个碱基。
10.一种生物素-亲和素的复合物,其特征在于,所述复合物包括:
(i)引发序列,所述的引发序列是在一端标记有生物素的寡核苷酸单链;
(ii)生物素-亲和素的n级复合物,其中n为2-20的正整数;并且第1级亲和素结合于所述引发序列上的生物素;和
(iii)生长序列,所述的生长序列是两端标记有生物素的寡核苷酸单链,所述生长序列中位于一端的生物素与第n级亲和素结合,而位于另一端的生物素与第n+1级亲和素结合或处于未结合状态,其中n为2-20的正整数。
11.一种权利要求1或10所述的生物素-亲和素的复合物的用途,其特征在于,用于制备提高免疫检测灵敏度的灵敏度增强剂。
12.一种制备的生物素-亲和素的复合物的方法,包括步骤:
(a)将用作根序列的第一寡核苷酸单链固定于固相载体,
(b)将用作引发序列的第二寡核苷酸单链与所述根序列接触,所述的第二寡核苷酸单链是在一端标记有生物素的寡核苷酸单链,从而形成相对稳定的“根序列-引发序列”杂合体,其中所述的引发序列互补结合于所述的根序列;随后去除过量的引发序列;
(c)将亲和素与所述引发序列上的生物素接触并结合;随后去除过量的、未结合的亲和素,从而获得第1级生物素-亲和素的复合物;
或者所述步骤(c)还包括重复以下步骤(c1)-(c2)共1至n-1次,从而获得第n级生物素-亲和素的复合物,其中,n为3-20的正整数:
(c1)将用作生长序列的第三寡核苷酸单链与上一步骤获得的生物素-亲和素的复合物接触,其中所述第三寡核苷酸单链是两端标记有生物素的寡核苷酸单链,从而使得所述生长序列中位于一端的生物素与上一步骤中形成的结合状态的亲和素形成结合;随后去除过量的、未结合的生长序列;
(c2)将亲和素与步骤(c1)中所述生长序列另一端的生物素接触并结合;随后去除过量的、未结合的亲和素。
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