KR20120027332A - 시그널 증폭 마이크로스피어, 단일단계 및 다단계 분석 증폭 공정에 있어서의 이들의 용도 및 이들의 제조 방법 - Google Patents

시그널 증폭 마이크로스피어, 단일단계 및 다단계 분석 증폭 공정에 있어서의 이들의 용도 및 이들의 제조 방법 Download PDF

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링 와이 웡
푸이 이 캉겔 찬
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Abstract

본 발명은 단백질 시그널 전구체 분자, 시그널 전구체 분자에 결합된 또는 캐리어 단백질을 포함하는 마이크로스피어에 관한 것으로, 여기서 상기 시그널 전구체 분자들은, 캐리어 단백질에 결합된 채로 활성화되어 검출가능한 시그널을 생성시킬 수 있는 것이다. 또한 단백질 분자를 용액 중에서 매트릭스 형성제와 혼합하는 단계; 환원제를 이 혼합물에 첨가하는 단계; 환원제를 제거하는 단계; 및 매트릭스 형성제를 제거하여 단백질 분자들의 마이크로스피어를 남기는 단계를 포함하여 이루어지는, 상기 마이크로스피어의 제조 방법도 개시된다. 또한 사이클링 공정을 증폭하는 것을 포함하여, 시그널 증폭을 제공하는, 마이크로스피어를 이용한 바이오어세이 방법도 제공된다.

Description

시그널 증폭 마이크로스피어, 단일단계 및 다단계 분석 증폭 공정에 있어서의 이들의 용도 및 이들의 제조 방법{SIGNAL AMPLIFICATION MICROSPHERES, THEIR USE IN ONE-STEP AND MULTI-STEP ANALYTICAL AMPLIFICATION PROCEDURES AND METHODS FOR THEIR PRODUCTION}
본 발명은 단백질 캐리어 물질과 시그널 전구체 분자를 포함하는 단백질 마이크로스피어 및 그의 제조 방법 및 샘플 중에서 표적 종의 검출을 위한 시험관내 바이오어세이에 있어서 이러한 단백질 마이크로스피어의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한 광학적, 자기적, 전기화학적 또는 화학적 방법 (그러나 이에 한정되지 않음)을 비롯한 검출 기술을 이용하여 시험관내 바이오어세이의 감도 수준을 향상시키기 위한 방법에 관한 것이기도 하다. 직접적인 시그널 증폭법과 강력한 순차적 시그널 증폭법의 두가지 모두의 검출 방법과 다양한 테스트 키트 역시도 제공된다.
본 발명의 단백질 마이크로스피어를 바이오어세이 분야에 적용하는데 있어서, 단백질 마이크로스피어는 샘플 중의 표적 분자를 특이적으로 인식하여 이에 결합하기 위한 표면 친화성 분자 상에 담지된다. 효소결합 면역분석법(ELISA), 방사능면역분석법(RIA), 형광 면역분석법(FIA), 면역응집 분석법 또는 DNA, RNA 또는 게놈 분석법과 같은 바이오어세이는 잘 알려져 있으며 피검물 연구 검출, 인간을 대상으로 하거나 수의학 분야의 진단 분야, 법의학적 진단, 환경 분석, 식품 분석 및 대기 또는 수중의 위험 물질의 바이오디펜스 스크리닝 등의 분야에서 중요한 역할을 한다.
바이오어세이는 하나 이상의 표지된 바이오분자와 검출하고자 하는 피검물(표적)과의 상호 반응에 기초한다. 표지는 상호반응을 "가시화"하기 위한 수단이다. 여러가지 서로 다른 종류의 표지들이 알려져 있으며 전술한 다양한 기술에 적절한 물질들이 사용된다; ELISA에서는 효소, RIA에서는 방사능 동위원소, FIA에서는 플루오로포어 또는 웨스턴, 서던 또는 노던 블랏의 특이 표지 등이 그것이다. 그 밖의 표지 형태로는 면역 응집 분석법의 라텍스 입자, 리포좀, 그리고 염료, 매개자, 금 입자 등이 알려져 있다.
바이오어세이에 있어서 가장 중요한 요구사항은 분석 특이성과 분석 감도이다. 분석 특이성은 친화성 분자 또는 바이오인식 분자에 의해 결정되는데, 예컨대 항체의 그의 항원(피검물)에 대한 항체 결합 위치의 맷칭 또는 2개의 상보적인 핵산 가닥들의 하이브리다이제이션을 들 수 있다. 바이오어세이의 분석 감도는 표적 종과의 생물 상호반응의 친화도 상수로 인해 바이오인식 분자에 의해서도 영향을 받는다. 표지는 표적과 친화성 분자 사이에서 반응이 일어났음을 알려주는 마커로서 작용하며 다음의 여러가지 기술:
(i) 염료의 흡수도 또는 플루오로포어에 의해 발광되는 형광, 발광(luminescent) 또는 화학발광 화합물에 의해 방출되는 발광, 또는 응집된 라텍스 입자의 광산란에 의해 야기되는 혼탁도 측정에 의해 광학적으로 측정하거나;
(ii) 방사능 동위원소의 측정에 의한 방사능을 이용한 측정 기술에 의하거나;
(iii) 매개체 또는 전자활성 물질을 측정하는 전기화학적 방법에 의하거나;
(iv) 자기장 측정에 의한 자기장 측정 기술에 의하거나;
(v) 질량 변화의 측정을 이용하는 압전 기술 방식
을 이용하여 측정될 수 있다.
방사능 동위원소를 표지로서 이용하는 방사능면역분석법은 많은 사람들이 여전히 가장 감도가 좋은 방법으로 꼽고 있다. 매우 강력한 이 기술은 1959년에 Yalo와 Berson에 의해 최초로 도입되었으며 분석 화합, 진단분야 및 의약 분야에 신기원을 연 것으로 평가받고 있다. 그럼에도 불구하고, 이 기술은, 사용되는 방사능 동위원소로 인하여, 인간과 환경에 미치는 유해한 오염 위험성을 완전히 제거할 수 없다는 단점이 있다.
한편, 비방사능 방법이 개발되었으며 필적할만한 분석 감도를 달성할 목적으로 계속 발전을 거듭해왔다. 형광, 방광 및 흡수분광학에 기초한 광학적 방법의 중요성은 시간이 지날수록 점점 더해가고 있으며 지금도 그 중요성은 날로 증가하고 있다.
ELISA 기술은 마커로서 효소를 이용하여 시그널을 증폭한다. 바이오어세이 수행 후, 피검물과 프로브의 상호반응은 한가지 효소 마커 분자에 의한 매우 많은 수의 염료 입자 생산에 의해 증폭된다. 글루코스 옥시다제(GOD, EC 1.1.3.4.), 알칼라인 포스파타제(AP, EC 3.1.3.1) 또는 퍼옥시다제(POD, EC 1.11.1.7)와 같은 효소를 턴오버수가 2000인 기질 분자와 함께 각각 초당 (s-l), 5000 s-l 및 10000 s-l,로 이용될 수 있다. ELISA 기술의 단점은 공정에 관련된 단계의 수가 너무 많고 기질 인큐베이션에 소요되는 기간이 길다는 것이다.
오래 전부터 형광법도 바이오어세이 분야에서 사용되어 왔으며, 지속적으로 많은 관심을 받고 있다. 모든 형광 기반 기술은 우수한 감도와 10-8 내지 10-18 M이라는 낮은 검출 한계를 제공해준다. 예컨대 "시분해 형광(time resolved fluorescence)", 화학발광 및 생물발광법 또는 도너 분자와 억셉터 분자 간의 에너지 이동에 기반한 기술과 같은 특수 기술을 이용하면 검출 한계가 10-15 내지 10- l8 M에 이를 수 있다.
종래 기술에 알려져 있는 형광-면역분석법은 반응 관능성 링커기가 있는 저분자량의 형광 표지, (SOUTHWICK, P. L., 외, Cytometry, 11, pp. 418-430, 1990, MUJUMDAR, R. B., 외, Bioconjugate Chemistry, 4, pp. 105-111, 1993, MUJUMDAR, R. B., 외, Cytometry, 10, pp. 11-19, 1989), 형광 및 염료 착색 입자 (미국특허4,837,168 및 US 6,013,531 및 국제특허출원 WO 95/08772) 또는 플루오로포어 스파이크형 덴드리머 (DE 197 03 718)를 이용한다.
면역분석법에서는 시그널 증폭을 위해 마커가 로딩된 리포좀을 사용하는 것도 알려져 있다 (미국특허 US 5,756,362, US 4,874,710 및 US 4,703,017). 사실상, 이 방법들의 감도는 용해된 형태로 리포좀 내로 통합가능한 마커 물질의 양에 의해 제한된다. 표지된 리포좀을 이용하는 것의 또 다른 단점은 리포좀의 제한된 안정성이다.
전술한 바와 같이, 바이오어세이 개발에 있어서는 피검물 농도의 특정 변화에 대한 시그널 반응 정도(칼리브레이션 곡선의 기울기)로 정의되는 분석 감도를 매우 높게 달성하는 것이 중요하다. 면역화학적 판정에 있어서는 샌드위치 분석법 또는 경쟁형 분석법인지에 따라, 분석 감도가 농도 범위에 따라 달라진다.
분석 감도에 영향을 미치는 다른 두가지 인자는 측정에 필요한 샘플의 양과 측정 결과를 얻는데 필요한 총체적인 반응 시간이다. 샘플 부피가 클수록, 전체적으로 필요한 반응 시간은 길어지고, 검출 및 측정가능한 피검물 농도는 낮다. 그러나, 많인 실제 상황에 있어서는, 샘플의 부피가 충분하지 않거나 (예컨대 제약 연구 분야) 또는 성분들이 어마어마한 다량의 샘플 중에 흩어져 있다 (예컨대 우유 중의 항생제 잔사 또는 대기 중의 바이오디펜시브 물질). 따라서, 해결하여야 할 중요한 문제점은 이용가능한 소량의 샘플 중의 극소량의 물질을 검출 및/또는 존재 여부를 측정하거나, 또는 매우 대량의 샘플 중에 극히 저농도로 분포하는 물질을 검출 및/또는 존재여부를 검색하는 것이다.
결과적으로, 이러한 응용 기술은 특히 매우 저농도 범위에서 고도의 분석 감도를 가져야만 한다.
여러가지 공지 기술의 분석 감도를 매우 저농도 범위에서 객관적으로 비교하기 위하여, CLSI (미국의 임상실험 표준기관 및/또는 NCCLS)는 3가지 용어를 이용하여 분석 감도를 정의하였다: 블랭크 한계 (LoB: Limit of Blank), 검출 한계 (LoD: Limit of Detection), 및 정량 한계 (LoQ: Limit of Quantitation)이 그것이다. 이들 변수들의 데이터를 평가하여 여러가지 기술을 비교하는데 이용한다.
높은 분석 감도를 달성하기 위하여, 효소 바이오표지, 유기 미세결정 바이오표지 및 콜로이드형 금 표지 등과 같은 다양한 바이오표지 시스템이 시그널을 증폭시키는데 이용되어 왔다.
효소 바이오표지 시스템에 있어서는, 효소 분자들이 기질을 광학적 또는 전기화학적 특성을 갖는 생성물로 변환시킨다. 호스래디쉬 퍼옥시다제를 이용한 경우처럼 높은 턴오버 비율로 인하여, 또는 알칼라인 포스파타제와 같은 초대형의 선형 효소 반응으로 인하여, 막대한 양의 생성물(시그널)이 증폭 달성을 위해 생성될 수 있다.
또 다른 접근법은 분석 감도를 향상시키기 위해 검출 시그널을 증폭하는, 소위 "효소 사이클링" 기술이다.
시그널-생성 물질의 고체 입자들을 이용하는 새로운 부류의 표지가 유럽공개특허출원 EP 1309867에 설명되어 있다. 각각의 고체 입자 내에 존재하는 수십 수백억개의 시그널 생성 분자들은 방출 시약에 노출되자마자 즉시 방출되어 "초신성 효과(Supernova Effect)"를 일으킬 수 있다.
효소 시스템의 시그널 증폭 원리는 시그널을 생산하는 효소 기질의 변환에 기초하는데 이러한 시그널들은 벌크상(bulk phase)으로 방출된다. 고체 입자 시스템의 시그널 증폭 원리는 대량의 시그널 분자들의 생성 및 이들의 반응 챔버의 벌크상으로의 방출에 기반한다. 그러나, 벌크상으로의 시그널 분자들의 방출은 시그널 분자 농도를 부분적으로 희석시켜서 분석 감도에 악영향을 미치기도 한다.
또한, 콜로이드상 금 표지를 이용하는 시그널 증폭 바이오어세이도 알려져 있다. 테이튼(Taton) 등 (T. Andrew Taton, Chad A. Mirkin, Robert L. Letsinger, "Scanometric DNA Array Detection with Nanoparticle Probes", Science, 289(8) 1757-1760, 2000)은 콜로이드상 금 및 이어서 은 인핸스먼트에 기초한 시그널 증폭법을 보고한 바 있는데, 이 방법에서 콜로이드상 금은 금입자 표면 상에서의 은(I)의 환원을 촉진하여, 다량의 은 금속이 콜로이드상 금 표지 위에 축적되도록 한다. 은 인핸스먼트 접근법은 올리고뉴클레오타이드를 매우 낮은 농도로, 예컨대 리터 당 5 나노미터의 범위까지 검출해낼 수 있다.
증폭된 바이오어세이에 콜로이드상 금 표지를 사용하는 또 다른 접근법은 콜로이드상 금의 생물친화성에 의해 유발된 응집에 기초하는데, 이것은 적색에서 청색으로의 색상 변화를 야기하며 이는 육안으로 관찰가능하다. 생물친화성-유도된 응집 접근방법은 올리고뉴클레오타이드를 리터 당 10 펨토몰(femtomoles)의 농도 수준까지 검출해낼 수 있다. 콜로이드상 금 표지의 시그널 증폭 원리는 시그널 분자의 농축된 소부피로의 축적 또는 응집에 기초한다. 전술한 표지 시스템들의 시그널 증폭 능력을 비교하자, 고체 캐리어 상에서 포커스된 대역에서, 시그널 분자를 축적하는 콜로이드상 금 증폭 시스템 - 다른 친화성 분자에 의해 고정됨 - 이 가장 높은 분석 감도를 얻었다 (예컨대 측면 유동 장치에서).
본 발명의 한가지 실시상태는 샘플 중의 표적 분자를 검출하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 반복적인 사이클 증폭, 순차적으로 적용되는 공정에 의해 탁월한 분석 감도, 낮은 검출 한계 및, 임의로 검출 시그널의 추가 향상을 가능케 한다.
본 발명의 또 다른 실시상태는 연구 진단 분야에 있어서 표적 분자의 광학적, 전기화학적 또는 화학적 검출을 위한 다양한 테스트 키트를 제공한다.
본 발명의 또 다른 실시상태는 신뢰가능하게 제조될 수 있고 바이오어세이, 좋기로는 인간 및 수의학 진단 분야, 법의학적 진단 분야, 환경 분석, 식품 분석, 바이오디펜스 스크리닝, DNA, RNA 또는 게놈 연구 및 진단 분야에서 광범하게 적욕능한, 표지된 바이오분자들을 제공해준다.
정의
친화성/바이오인식 분자
친화성 분자들은 그들의 구조나 포어 크기 또는 전하에 의해, 특정한 친화력(친화성/결합활성 상수(avidity constant))을 가지고, 다른 물질을 특이적으로 인식하여 결합하는 물질이다.
특정 부류의 물질에 대해 일반적으로 사용되거나 (예컨대 IgG-항체용 단백질 A/G) 또는 오로지 한 가지 물질에 대해서만 매우 특이적일 수 있는 (예컨대 항원에 대한 항체, 다른 서열에 대한 DNA 서열, 바이오틴에 대한 아비딘, 기질에 대한 특정 효소) 매우 다양한 여러가지 친화성 분자들이 존재한다.
캐리어 단백질
캐리어 단백질은 세포내 S-S 결합을 개발시킨 다음, 분자내 및 분자간의 양자 모두의 S-S 결합을 자가 조립 형성함으로써 스폰지형 마이크로캡슐을 형성하는 것에 주로 관련된 것이다; 분자간 S-S 결합은 단백질 마이크로스피어의 구조적 일체성에 책임이 있다.
본 발명에서 사용가능한 캐리어 단백질의 예로는 다음을 들 수 있다:
- 섬유 단백질 (예컨대, 세포골격 단백질, 세포외 매트릭스 단백질 등)
- 구상 단백질(globular protein)
- 혈청 및 혈장으로부터 분리가능한 혈액 단백질
(예컨대, 헤모단백질, 수송 단백질, DNA 결합 단백질 등).
- 지질 단백질
- 당단백질
- 면역계 단백질(예컨대 모노클로날 및 폴리클로날 항체, 항원 등)
- 재조합 단백질
- 유전적으로 변형된 단백질
- 화학적으로 변형된 단백질
- 합성 단백질
- 여러가지 단백질의 혼합물
- 영양 단백질 (예컨대 저장 단백질, 수송 단백질 등)
- 효소
- 리보자임
일반적으로, 사람, 동물 및 식물 기원의 함황 단백질 또는 함황 펩타이드(합성 펩타이드 포함)도 사용가능하다.
시그널 증폭 ( Signal Amplification )
물리화학적으로 측정가능한 시그널을 유발하는, 2 이상의 물질/반응 파트너 간의 모든 반응.
대부분의 경우, 면여화학적 반응과 하이브리다이제이션 반응에 있어서의 시그널은 너무 약해서 이 시그널은 측정치로부터 해석가능한 결과를 유도하기 전에 반드시 증폭시켜야만 한다.
증폭은 여러가지 방법학 및 기술에 의해 달성된다.
본 발명은 시그널 증폭 마이크로스피어를 이용하여 단일 단계 및 다단계 증폭 공정을 모두 제공한다. 여러가지 다단계 증폭 공정에 있어서, 증폭 사이클 중 한개 이상은 시그널 생성 유기 물질의 고체 입자들을 캡슐화하는 캡슐을 사용하며, 본 발명에 그 내용이 참고 병합된 EP 1309867에 설명된 유형의 표적 분자들을 특이적으로 인식하여 이에 결합하기 위하여 그의 표면에 친화성 분자를 담지한다.
마이크로스피어( Microspheres )
본 발명의 마이크로스피어는 고체 바운더리를 갖지 않으며, 내부로 뻗어있는 포어를 갖는 스폰지 볼과 닮아있을 수 있다. 이들은 서로 공유적으로 결합된 단백질 분자들의 네트워크이다.
이들은 새로 침전된 템플릿에서 흡착성 결합 또는 공침전되어 분자내 S-S 결합을 개방시킴으로써 형성된다. 이렇게 얻어진 유리 티올기는 새로운 분자간 및 분자내 S-S 결합을 형성하게 되고, 분자간 S-S 결합은 마이크로스피어 형성에 기여하게 된다. 마이크로스피어는 균일한 구조를 가지며 EP 1309867에 기재된 바와 같은 층별(layer-by layer) 기술에 의해 형성된 캡슐과 같이 층이 지지 않는다.
마이크로스피어는 직경이 10 nm 내지 1 mm이며, 좋기로는 400 nm 내지 10 ㎛이다. 비록 이러한 범위의 적어도 일부는 마이크로미터 범위를 벗어나기는 하지만, 본 명세서에서는 편의상 본 발명에 따른 단백질 분자의 네트워크로 형성된 불연속적인 입자들을 지칭하는데 "마이크로스피어"라는 용어를 사용하기로 한다.
시그널 증폭 마이크로스피어( Signal Amplification Microspheres )
시그널 증폭 마이크로스피어는 캐리어 단백질 + 시그널 전구체 분자 + 친화성 분자로 이루어진 마이크로스피어이다.
이들은 측정하고자 하는 물질(표적 또는 피검물)에 대하여 특이적인 결합 특성들을 그들의 표면에 갖는다.
매트릭스 형성제( Matrix Former )
매트릭스 형성제는 캐리어 단백질 및/또는 시그널 전구체 분자와 혼합되어 공침에 의해 마이크로스피어를 형성하는 덱스트란과 같은 올리고당 또는 다당류, 탄산칼슘, 알긴산칼슘, 다공성 실리카와 같은 물질이다.
환원제( Reducing Reagent )
환원제는 마이크로스피어 템플릿 내의 단백질 분자들 간의 분자내 다이설파이드 결합을 열게 하는 물질이다. 환원제의 예로는 디티오쓰레이톨(DTT)을 들 수 있다.
매트릭스 제거제
매트릭스 제거제는 마이크로스피어 템플릿으로부터 매트릭스 형성제를 제거하여 단백질 마이크로스피어만을 남기는데 사용되는 킬레이팅제(EDTA), 산 또는 염기와 같은 물질이다.
시그널 전구체 분자
시그널 전구체 분자는 하나 이상의 다른 시약과 반응하여, 측정가능한 시그널에 이르게 하는 분자이다. 시그널 전구체 분자는 직접형과 간접형이 있다. 직접 시그널 전구체의 경우, 이러한 시그널 전구체 분자들은 그 자체가 활성화에 의해 변경되어서, 검출하고자 하는 시그널을 생성시킨다. 간접 시그널 전구체의 경우, 이러한 시그널 전구체 분자들은 활성화시 다른 종과 반응하는데, 이 다른 종들이 검출하고자 하는 시그널을 생성하는데 책임이 있는 것들이다. 시그널 전구체 분자들은 저분자량의 시그널 전구체 분자일수도 있고 또는 고분자량의 시그널 전구체 분자들일 수도 있다.
저분자량의 시그널 전구체 분자
시그널 전구체 분자들은 플루오로포어 및 그 유도체, 루미노포어 및 그 유도체, 크로모포어 및 그 유도체, 보결 원자단(prosthetic groups), 또는 레독스 매개자로부터 선택된 레독스 활성 물질, 전극 활물질로 이루어진 군으로부터 선택된 저분자량의 물질일 수 있다.
고분자량의 시그널 전구체 분자
고분자량의 단백질 시그널 전구체 분자의 비제한적인 예로는, 효소 및 그의 전구체, 생물발광 및 형광발생 단백질 및 리보자임; 모노클로날 항체 및 폴리클로날 항체를 비롯한 항체, 수용체, 항원, 재조합 단백질, 렉틴, 아비딘, 지질단백질, 및 당단백질로 이루어진 군으로부터 선택된 펩타이드 또는 단백질, 핵산, 리보자임 및 앱타머로 이루어진 군으로부터 선택된 고분자량의 물질을 들 수 있다.
개시된 반응을 경유하여 측정가능한 시그널에 이르는 다양한 화학 부류의 다양한 물질들이 매우 많이 존재한다. 측정가능한 시그널은 다음에 기초한 것일 수 있다:
- 형광측정학(fluorimetry)
- 발광측정학(luminometry)
- 자외선, 가시광선 및 근적외선 범위에 있어서의 색상 변화
- 레독스 전위의 변화
- 착물 형성 또는 침전에 의해 야기되는 질량 변화
표적 분자
이 용어는 "피검물(analyte)"와 동의어로서, 면역분석법과 같이, 분석 공정에서 측정되는 물질 또는 화학적 구성성분을 의미하는 것이다.
발명의 상세한 설명
첫 번째 구체예에서, 본 발명은 시그널 전구체 분자와 결합된 담체 단백질을 포함하는 마이크로스피어를 제공하며, 여기서 상기 시그널 전구체 분자는 캐리어 단백질에 대한 결합을 유지한 채로, 검출가능한 시그널을 생성하도록 활성화될 수 있는 것이다.
한가지 실시상태에서, 마이크로스피어는 하이브리드이거나 또는 이종-입자들이며, 이는, 캐리어 단백질과 시그널 전구체 분자들이 서로 다르다는 것을 의미하는 것이다. 또 다른 실시상태에 있어서, 마이크로스피어는 동종-입자들이며, 이는 캐리어 단백질과 시그널 전구체가 동일하다는 것을 의미한다.
전술한 바와 같이, 시그널 전구체 분자는 직접형일수도 간접형일수도 있다. 직접 시그널 전구체의 경우, 시그널 전구체 분자들은 그 자체가 활성화에 의해 변화되어 검출하고자 하는 시그널을 생성한다. 간접 시그널 전구체의 경우, 시그널 전구체 분자는 활성화시 다른 종과 반응하며 이 다른 종이 바로, 검출하고자 하는 시그널을 생성하는 것이다.
좋기로는, 캐리어 단백질은 비제한적인 예로 세포골격 단백질 또는 세포외 매트릭스 단백질과 같은 섬유 단백질; 또는 비제한적인 예로 혈액 단백질, 헤모단백질, 세포 부착 단백질을 비롯한 구상 단백질; 또는 수송 단백질, 성장인자, 수용체 단백질, DNA-결합 단백질, 면역계 단백질, 비제한적인 예로 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 영양 보관/수송 단백질, 샤프롱 단백질, 또는 효소; 또는 유전적으로 변형된 단백질; 또는 재조합 단백질 또는 화학적으로 변형된 단백질 및 합성 단백질 중에서 선택된다. 더욱 좋기로는, 캐리어 단백질은 소의 혈청 알부민과 같이, 혈액 내에서 순환하는 단백질이다. 이 단백질은 ELISA 및 면역블랏 기술을 포함하는, 생화학 응용 분야에서 널리 사용되고 있다. 이것은 안정성이 우수하며, 소의 혈액으로부터 축산업 분야에서 부산물로서 쉽게 정제가능하며 대량으로 저렴하게 얻을 수 있다.
시그널 전구체 분자는 플루오로포어및 그의 유도체, 루미노포어및 그의 유도체, 크로모포어및 그의 유도체, 보결 원자단, 또는 전극활 물질, 레독스 매개체로부터 선택된 레독스 활성 물질로 이루어진 군으로부터 선택된 저분자량의 물질일 수 있다.
좋기로는, 저분자량의 시그널 전구체 분자는 예컨대 플루오레신, 시아닌, 카르보시아닌, 로다민, 잔텐, 디아조-염료 기반 형광 물질 및 소형 형광 방향족 및 헤테로방향족 분자와 같은 플루오로포어일 수 있다.
별법으로, 저분자량의 시그널 전구체 분자는 피라졸론, 안트라퀴논, 카로티노이드 및 디아조- 및 모노아조, 옥사진, 인디고이드, 또는 리보플라빈계 염료 물질과 같은 크로모포어일 수 있다.
가장 바람직하기로는 저분자량의 시그널 전구체 분자는 플루오레신 디아세테이트(FDA), 플루오레신 디아세테이트 이소티오시아네이트(FDA-이소티오시아네이트) 또는 플루오레신 말레이미드(FDA-말레이미드)와 같은 플루오레신 유도체인 것이 좋다.
고분자량의 단백질 시그널 전구체 분자의 비제한적인 예로는 효소 및 그의 전구체, 생물발광성 단백질 및 형광성 단백질 및 리보자임; 모노클로날 항체 및 폴리클로날 항체를 비롯한 항체, 수용체, 항원, 재조합 단백질, 렉틴, 아비딘, 지질단백질 및 당단백질로 이루어진 군으로부터 선택된 펩타이드 또는 단백질, 핵산, 리보자임 및 앱타머를 들 수 있다.
좋기로는, 고분자량의 시그널 전구체 분자는 펩타이드 및 단백질, 핵산 가닥, 탄수화물, 저분자량 및 분자 각인 폴리머(MIP; molecular imprinted polyemrs) 또는 이들의 혼합물과의 리간드와 같은 친화성 분자이다.
별법으로, 고분자량의 시그널 전구체 분자는 퍼옥시다제, 옥시도리덕타제, 리가제, 폴리머라제 및 트랜스페라제와 같은 효소일 수 있다.
가장 좋기로는, 고분자량의 시그널 전구체 분자는 아비딘과 NeutrAvidin(상표명)인 것이다.
전술한 마이크로스피어는 직경이 10 nm 내지 1 mm 범위이며, 좋기로는 400 nm 내지 10 ㎛의 범위이다. 마이크로스피어의 구조는 좋기로는 실질적으로 균질한 것이 좋다; 즉, 마이크로스피어를 형성하는 물질은 실제로 균질하게 분산되며 입자 바디를 통해 이들은 실제로 균일한 밀도와 다공도를 갖는다.
마이크로스피어는 미니어쳐 스펀지 또는 코튼 우드볼과 닮아있는데 비록 이들은 식별가능한 바운더리를 갖기는 하지만, 바운더리를 경계짓는 고체 외곽 쉘을 갖는 캡슐은 아니다.
마이크로스피어가 용액 중에서 표적과의 결합을 위해 친화성 분자와 결합될 때, 이들 친화성 분자들은 마이크로스피어에 부착되게 된다. 마이크로스피어는 친화성 분자들로 되어 있거나 또는 친화성 분자들은 링커 분자를 경유하거나 아니면 직접 마이크로스피어의 표면에 컨쥬게이트 또는 결합되거나 또는 흡착에 의해 결합/부착된다. 링커 분자의 비제한적인 예로는 바이오분자, 예컨대 아비딘, 스트렙트아비딘, NeutrAvidin(상표명), 단백질 A, 단백질 G, 렉틴 또는 저분자량의 크로스 링커를 들 수 있다. 그러나, 몇몇 친화성 분자들은 마이크로스피어 내부로 확산되어 특별한 경우, 그 내부에도 부착된다. 물론, 이러한 확산의 정도는 친화성 분자의 크기 및 마이크로스피어의 포어 크기에 따라 달라진다.
마이크로스피어에 부착된 친화성 분자는 특이적인 펩타이드 및 단백질, 핵산 가닥, 탄수화물, 저분자량의 리간드 및 분자 각인 폴리머(MIPs) 또는 이들의 혼합물과 같은 생물인식(biorecognition) 분자일 수 있다.
펩타이드 또는 단백질은 모노클로날 항체 및 폴리클로날 항체를 비롯한 항체, 수용체, 항원, 렉틴, 아비딘, 올리고펩타이드, 지질단백질, 당단백질, 펩타이드 호르몬 및 알레르겐 또는 그의 일부일 수 있다. 핵산은 DNA, RNAs, 올리고뉴클레오타이드, 리보자임, 앱타머 및 그의 일부일 수 있다. 탄수화물의 예로는 단당류, 올리고당류 및 다당류, 당지질, 프로테오-다당류 및 그의 일부를 들 수 있다. 저분자량 리간드는 바이오틴 또는 바이오틴 유도체, 스테로이드 또는 호르몬, 코팩터 또는 코엔자임, 활성화제, 저해제, 슈도기질 또는 효소, 약물, 알레르겐 또는 합텐의 보결 원자단일 수 있다.
두번째 구체예에서, 본 발명은 본 발명에 정의된 바와 같은 마이크로스피어의 제조 방법, 시그널 전구체 분자에 결합된 캐리어 단백질을 포함하는 마이크로스피어 (여기서 상기 시그널 전구체 분자는 캐리어 단백질에 결합되어 있는 채로 검출가능한 시그널을 생성하도록 활성화될 수 있는 것임)를 제공한다. 본 발명의 방법은: 캐리어 단백질과 시그널 전구체 분자를 용액, 좋기로는 수용액 중에서 교반하면서 매트릭스 형성제와 혼합하는 단계; 소분자 환원제를 교반하면서 첨가하는 단계; 세척하여 소분자 환원제를 제거하는 단계; 교반하면서 매트릭스 제거제를 첨가하는 단계; 및 매트릭스 형성제를 세척 제거하여 시그널 전구체 분자와 결합한 캐리어 단백질의 마이크로스피어를 남기는 단계를 포함하여 이루어진다.
좋기로는, 이 방법은 수성 시약을 이용하여 좋기로는 실온에서 수용액 중에서 실시된다. 바람직한 혼합 방법은 자석 스터러를 이용하여 교반 혼합하는 것이다.
매트릭스 형성제의 기능은 단백질 분자를 마이크로스피어 템플릿에 포획, 즉 잡아두는 것이다. 매트릭스 형성제는 탄산칼슘, 알긴산칼슘, 다공성 실리카 또는 올리고당 또는 다당류 예컨대 덱스트란일 수 있다. 탄산칼슘은 좋기로는 탄산나트륨 용액을 용액 중에서 캐리어 단백질, 시그널 전구체 분자 및 염화칼슘의 혼합물에 혼합함으로써 형성하는 것이다.
전술한 바와 같이, 마이크로스피어는 캐리어 단백질과 시그널 전구체 분자가 서로 다른 하이브리드 입자일 수 있다. 별법으로, 캐리어 단백질과 시그널 전구체는 같을 수도 있다. 또한, 시그널 전구체는 전술한 바와 같이 직접형일수도, 간접형일 수도 있다.
좋기로는 캐리어 단백질은 비제한적인 예로서 세포골격 단백질 또는 세포외 매트릭스 단백질을 비롯한 섬유 단백질; 또는 비제한적인 예로서 혈액 단백질, 헤모단백질, 세포 부착 단백질을 비롯한 구상 단백질; 또는 수송 단백질, 성장인자, 수용체 단백질, DNA-결합 단백질, 면역계 단백질, 예컨대 비제한적인 예로서 모노클로날 항체 도는 폴리클로날 항체, 영양 보관/수송 단백질, 샤프롱 단백질 또는 효소; 또는 유전적으로 변형된 단백질; 또는 재조합 단백질 또는 화학적으로 변형된 단백질 및 합성 단백질을 들 수 있다. 더욱 좋기로는, 캐리어 단백질은 소의 혈청 알부민처럼, 혈액 내에서 순환하는 단백질인 것이 바람직하다.
시그널 전구체 분자는 플루오로포어와 그의 유도체, 루미노포어와 그의 유도체, 크로모포어와 그의 유도체, 보결 원자단 또는 전극 활물질, 레독스 매개체로부터 선택된 레독스 활성 물질로 이루어진 군으로부터 선택된 저분자량의 물질일 수 있다.
좋기로는 저분자량의 시그널 전구체 분자는 예컨대 플루오레신, 시아닌, 카르보시아닌, 로다민, 잔텐, 디아조-염료 기반 형광 물질, 및 소형 형광 방향족 및 헤테로방향족 분자와 같은 플루오로포어인 것이 바람직하다.
별법으로, 저분자량의 시그널 전구체 분자는 피라졸론, 안트라퀴논, 카로티노이드 및 디아조- 및 모노아조, 옥사진, 인디고이드, 또는 리보플라빈계 염료 물질과 같은 크로모포어일 수 있다.
가장 바람직하기로는 저분자량의 시그널 전구체 분자는 플루오레신 디아세테이트(FDA), 플루오레신 디아세테이트 이소티오시아네이트(FDA-이소티오시아네이트) 또는 플루오레신 말레이미드(FDA-말레이미드)와 같은 플루오레신 유도체인 것이 좋다.
고분자량의 단백질 시그널 전구체 분자의 비제한적인 예로는 효소 및 그의 전구체, 생물발광성 단백질 및 형광성 단백질 및 리보자임; 모노클로날 항체 및 폴리클로날 항체를 비롯한 항체, 수용체, 항원, 재조합 단백질, 렉틴, 아비딘, 지질단백질 및 당단백질로 이루어진 군으로부터 선택된 펩타이드 또는 단백질, 핵산, 리보자임 및 앱타머를 들 수 있다.
좋기로는, 고분자량의 시그널 전구체 분자는 펩타이드 및 단백질, 핵산 가닥, 탄수화물, 저분자량 및 분자 각인 폴리머 또는 이들의 혼합물과의 리간드와 같은 친화성 분자이다.
별법으로, 고분자량의 시그널 전구체 분자는 퍼옥시다제, 옥시도리덕타제, 리가제, 폴리머라제 및 트랜스페라제와 같은 효소일 수 있다.
가장 좋기로는, 고분자량의 시그널 전구체 분자는 아비딘과 NeutrAvidin(상표명)인 것이다.
마이크로스피어를 제조하는 방법은 친화성 분자를 마이크로스피어의 표면에 부착시키는 것을 추가로 포함할 수 있다. 친화성 분자는 예컨대 반 데어 발스력, 수소 결합 또는 정전기적 상호작용에 의해 마이크로스피어의 외곽 표면에 컨쥬게이트되어 있을 수 있으며, 또는 이들은 직접 또는 링커 분자를 경유하여 마이크로스피어의 외표면에 공유적으로 결합되어 있을수도 잇다. 만일 간적접으로 결합된 경우, 링커 분자들의 비제한적인 예로는 바이오분자, 예컨대 아비딘, 스트렙트아비딘, NeutrAvidin(상표명), 단백질 A, 단백질 G, 렉틴 또는 저분자량의 크로스 링커를 들 수 있다. 친화성 분자는 매트릭스 제거제를 첨가하는 단계에 앞서서 반응 혼합물에 첨가되어질 수 있다.
전형적인 친화성 분자들은 특이적인 펩타이드 및 단백질, 핵산 가닥, 탄수화물, 저분자량의 리간드, 수용체 분자 및 분자 각인 폴리머(MIPs) 또는 이들의 혼합물과 같은 생물인식(biorecognition) 분자일 수 있다.
펩타이드 또는 단백질은 모노클로날 항체 및 폴리클로날 항체를 비롯한 항체, 수용체, 항원, 렉틴, 아비딘, 올리고펩타이드, 지질단백질, 당단백질, 펩타이드 호르몬 및 알레르겐 또는 그의 일부일 수 있다. 핵산은 DNA, RNAs, 올리고뉴클레오타이드, 리보자임, 앱타머 및 그의 일부일 수 있다. 탄수화물의 예로는 단당류, 올리고당류 및 다당류, 당지질, 프로테오-다당류 및 그의 일부를 들 수 있다. 저분자량 리간드는 바이오틴 또는 바이오틴 유도체, 스테로이드 또는 호르몬, 코팩터 또는 코엔자임, 활성화제, 저해제, 슈도기질 또는 효소, 약물, 알레르겐 또는 합텐의 보결 원자단일 수 있다.
세 번째 구체예에서, 본 발명은 시그널 전구체 분자들에 결합된 캐리어 단백질을 포함하는 마이크로스피어를 이용하여 샘플 중에서 1 이상의 표적 분자들을 검출하는 시그널 증폭 방법을 제공하는데, 여기서 상기 시그널 전구체 분자들은 캐리어 단백질에 결합되어 있는 채로 검출가능한 시그널을 생성시키도록 활성화될 수 있으며, 상기 마이크로스피어는 그 표면에 상기 표적 분자를 특이적으로 인식하여 상기 표적 분자에 결합하기 위한 친화성 분자를 갖는 것으로서, 상기 방법은:
(a) 표적 분자들을 상기 마이크로스피어와 함께 인큐베이션시키는 단계;
(b) 그 표면에 친화성 분자-표적 분자 복합체를 갖는 마이크로스피어들을 친화성 분자-표적 분자 복합체를 갖지 않는 마이크로스피어들로부터 분리하는 단계;
(c) 그 표면에 친화성 분자-표적 분자 복합체를 갖는, 분리된 마이크로스피어들을 발달 시약(developing areagent)으로 처리하여 시그널 전구체 분자를 활성화시켜 시그널을 생성시키는 단계, 및
(d) 시그널을 검출 또는 정량하는 단계
를 포함하여 이루어진다.
이렇게 생성된 시그널은 샘플 중의 표적 분자의 양과 직접 또는 간접적으로 관련이 있다. 뿐만 아니라, 시그널 전구체 분자들은 마이크로스피어 내에 결합된 채로 유지되고 용액 내로 방출되지 않으므로, 시그널이 국소화된다. 따라서, 시그널은 희석되지 않는다. 이와 반대로, 인큐베이션 단계 도중에 형성된 각각의 친화성 분자-표적 분자 복합체에 대하여, 활성화 단계 동안 활성화된 시그널 전구체 분자들이 많이 있기 때문에, 시그널은 증폭된다.
좋기로는, 캐리어 단백질은 세포골격 단백질 또는 세포외 매트릭스 단백질과 같은 섬유 단백질; 또는 비제한적인 예로 혈액 단백질, 헤모단백질, 세포 부착 단백질을 비롯한 구상 단백질; 또는 수송 단백질, 성장인자, 수용체 단백질, DNA-결합 단백질, 면역계 단백질, 비제한적인 예로 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 영양 보관/수송 단백질, 샤프롱 단백질, 또는 효소; 또는 유전적으로 변형된 단백질; 또는 재조합 단백질 또는 화학적으로 변형된 단백질 및 합성 단백질 중에서 선택된다. 더욱 좋기로는, 캐리어 단백질은 소의 혈청 알부민과 같이, 혈액 내에서 순환하는 단백질이다.
시그널 전구체 분자는 플루오로포어및 그의 유도체, 루미노포어및 그의 유도체, 크로모포어및 그의 유도체, 보결 원자단, 또는 전극활 물질, 레독스 매개체로부터 선택된 레독스 활성 물질로 이루어진 군으로부터 선택된 저분자량의 물질일 수 있다.
좋기로는, 저분자량의 시그널 전구체 분자는 예컨대 플루오레신, 시아닌, 카르보시아닌, 로다민, 잔텐, 디아조-염료 기반 형광 물질 및 소형 형광 방향족 및 헤테로방향족 분자와 같은 플루오로포어일 수 있다.
별법으로, 저분자량의 시그널 전구체 분자는 피라졸론, 안트라퀴논, 카로티노이드 및 디아조- 및 모노아조, 옥사진, 인디고이드, 또는 리보플라빈계 염료 물질과 같은 크로모포어일 수 있다.
가장 바람직하기로는 저분자량의 시그널 전구체 분자는 플루오레신 디아세테이트(FDA), 플루오레신 디아세테이트 이소티오시아네이트(FDA-이소티오시아네이트) 또는 플루오레신 말레이미드(FDA-말레이미드)와 같은 플루오레신 유도체인 것이 좋다.
고분자량의 단백질 시그널 전구체 분자의 비제한적인 예로는 효소 및 그의 전구체, 생물발광성 단백질 및 형광성 단백질 및 리보자임; 모노클로날 항체 및 폴리클로날 항체를 비롯한 항체, 수용체, 항원, 재조합 단백질, 렉틴, 아비딘, 지질단백질 및 당단백질로 이루어진 군으로부터 선택된 펩타이드 또는 단백질, 핵산, 리보자임 및 앱타머를 들 수 있다.
좋기로는, 고분자량의 시그널 전구체 분자는 펩타이드 및 단백질, 핵산 가닥, 탄수화물, 저분자량 및 분자 각인 폴리머 또는 이들의 혼합물과의 리간드와 같은 친화성 분자이다.
별법으로, 고분자량의 시그널 전구체 분자는 퍼옥시다제, 옥시도리덕타제, 리가제, 폴리머라제 및 트랜스페라제와 같은 효소일 수 있다.
가장 좋기로는, 고분자량의 시그널 전구체 분자는 아비딘과 NeutrAvidin(상표명)인 것이다.
마이크로스피어에 부착된 친화성 분자는 펩타이드, 단백질, 핵산 가닥, 탄수화물, 저분자량의 리간드 및 분자 각인 폴리머(MIPs) 또는 이들의 혼합물과 같은 생물인식(biorecognition) 분자일 수 있다.
펩타이드 또는 단백질은 모노클로날 항체 및 폴리클로날 항체를 비롯한 항체, 수용체, 항원, 렉틴, 아비딘, 올리고펩타이드, 지질단백질, 당단백질, 펩타이드 호르몬 및 알레르겐 또는 그의 일부일 수 있다. 단일 가닥 핵산은 DNA, RNAs, 올리고뉴클레오타이드, 리보자임, 앱타머 및 그의 일부일 수 있다. 탄수화물의 예로는 단당류, 올리고당류 및 다당류, 당지질, 프로테오-다당류 및 그의 일부를 들 수 있다. 저분자량 리간드는 바이오틴 또는 바이오틴 유도체, 스테로이드 또는 호르몬, 코팩터 또는 코엔자임, 활성화제, 저해제, 슈도기질 또는 효소, 약물, 알레르겐 또는 합텐의 보결 원자단일 수 있다.
특히 바람직한 마이크로스피어 형태는 그의 캐리어 단백질이 소의 혈청 알부민(BSA)이고 시그널 전구체 분자들은 플루오레신 디아세테이트(FDA), 플루오레신 디아세테이트 이소티오시아네이트(FDA-이소티오시아네이트) 또는 플루오레신 말레이미드(FDA-말레이미드)와 같은 플루오레신 유도체로부터 선택되는 것이 좋다. 발달 시약은 활성화 단계에서 이들 플루오레신 유도체를 "활성화"시켜서, 예컨대 화학반응, 예컨대 알칼리 시약, 또는 생화학 반응, 예컨대 에스테라제를 통하여 이들을 플루오레신으로 변환시킴으로써 검출가능한 시그널을 생성하는데 적합한 것이다. 별법으로, 활성화 단계는 마이크로웨이브 가열과 같은 물리적 수단에 의해 수행되어도 좋다.
네 번째 구체예에서, 본 발명은 시그널 전구체 분자들에 결합된 캐리어 단백질을 포함하는 마이크로스피어를 이용하여 샘플 중에서 1 이상의 표적 분자들을 검출하는 또 다른 시그널 증폭 방법을 제공하는데, 여기서 상기 시그널 전구체 분자들은 캐리어 단백질에 결합되어 있는 채로 검출가능한 시그널을 생성시키도록 활성화될 수 있으며, 상기 마이크로스피어는 그 표면에 상기 표적 분자를 특이적으로 인식하여 상기 표적 분자에 결합하기 위한 친화성 분자를 갖는 것으로서, 상기 방법은:
(a) 표적 분자들을 상기 마이크로스피어와 함께 인큐베이션시키는 단계;
(b) 그 표면에 친화성 분자-표적 분자 복합체를 갖는 마이크로스피어들을 친화성 분자-표적 분자 복합체를 갖지 않는 마이크로스피어들로부터 분리하는 단계;
(c) 그 표면에 친화성 분자-표적 분자 복합체를 갖는, 분리된 마이크로스피어들을 방출 시약(releasing reagent)으로 처리하여 마이크로스피어를 해체시키고 제1 시그널 전구체 분자들을 방출시키는 단계;
(d) 상기 방출된 제1 시그널 전구체 분자들을, 방출된 제1 시그널 전구체 분자들에 대해 친화성을 갖는 제2 친화성 분자들로 관능화된 추가 뱃치의 마이크로스피어로 처리하는 단계로서, 여기서 상기 마이크로스피어는 제2 시그널 전구체 분자들과 결합된 캐리어 단백질을 포함하는 것이고, 여기서 상기 제2 시그널 전구체 분자들은 캐리어 단백질에 결합되어 있는 채로 검출가능한 시그널을 생성하도록 활성화될 수 있는 것인 단계;
(e) 그 표면에 제2 친화성 분자-제1 시그널 전구체 분자 복합체가 있는 마이크로스피어들을 제2 친화성 분자-제1 시그널 전구체 분자 복합체가 없는 마이크로스피어들로부터 분리하는 단계;
(f) 그 표면에 제2 친화성 분자-제1 시그널 전구체 분자 복합체가 있는, 분리된 마이크로스피어들을 발달 시약으로 처리하여 제2 시그널 전구체 분자들을 활성화시켜 시그널을 생성하는 단계, 및
(g) 시그널을 검출 또는 정량하는 단계
를 포함하여 이루어진다.
이렇게 생성된 시그널은 샘플 중의 표적 분자의 양과 관련이 있다. 시그널은 2개의 서로 다른 단계에서 많이 증폭되는데, 이는, 인큐베이션 단계 (a)에서 생성된 각각의 친화성 분자-표적 분자 복합체에 대해, 단계 (c)에서 방출된 제1 시그널 전구체 분자들이 많이 존재하고, 이들은 다시 제1 시그널 전구체 분자들에 대해 친화성을 갖도록 관능화된, 다른 마이크로스피어 뱃치와 함께 인큐베이션되기 때문이다. 방출된 많은 제1 시그널 전구체 분자들은 다른 마이크로스피어와 복합체를 형성하고, 방출된 제1 시그널 전구체 분자들과 복합체를 형성하지 못한 마이크로스피어들을 제거한 후, 활성화제를 첨가하여, 각각의 복합체화된 마이크로스피어 내부의 많은 제2 시그널 전구체 분자들이 시그널을 생성하도록 활성화시킨다.
시그널 전구체 분자들의 방출 및 재복합체화의 이러한 사이클은 많이 반복되어 매우 많은 수의 다중 증폭이 이루어진다. 달리 말하면, 단계 (c) 내지 (e)가, 단계 (f) 및 (g)의 수행 전에 1회 내지 n회 반복되며 (여기서 n은 양수이다), 적어도 최종 반복 사이클 중의 시그널 전구체 분자들이 검출가능한 시그널을 생성하도록 활성화될 수 있는 것이다.
표적 분자는 제1 피검물을 나타내고; 제1 시그널 전구체 분자는 제2 피검물을 나타내며, 제2 시그널 전구체 분자는 제3 피검물을 나타내는 식으로 계속 반복된다.
한 가지 변형예에서는, 검출가능한 시그널을 생성하는데 있어서, 오직 최종 반복 사이클 중의 시그널 전구체 분자들만이 활성화되면 된다. 전기(earlier) 사이클에서 방출된 시그널 전구체 분자들은 검출가능한 시그널을 발생시키기 위해 활성화될 필요가 없지만 - 이들은 아비딘과 같은 결합 분자들일 수 있다 - 시그널을 궁극적으로 유도하는 반응의 캐스캐이드에 있어서 중요한 부분을 이루기 때문에 시그널 전구체 분자들인 것으로 간주된다. 특히 공정 후반부 단계에서, 즉 검출 또는 측정하고자 하는 특정 표적에 알맞는 제1 표적 분자-친화성 분자 커플이 선택된 후에, 전구체 분자-친화성 분자쌍으로서, 예컨대 아비딘 및 바이오틴과 같이 잘 이해되고 날리 사용되는 커플을 이용함으로써, 이 증폭 공정의 높은 신뢰도와 확실성을 제고할 수 있다.
최종 증폭 단계에서, 만일 최종의 시그널 전구체 분자들이 최종의 마이크로스피어와 결합된 채로 유지되어 용액 내로 방출되지 않을 경우에는, 시그널이 국소화된다. 이에 의하여 시그널의 희석이 최소화된다.
이와 반대로, 미방출 상태로 있는 최종의 시그널 전구체 분자들을 검출하는 것은 필수적인 것은 아니다; 이들은 자유로워질 경우 용액 중에서도 측정될 수 있고, 또는 다른 증폭 단계를 일으킬 수도 있다. 예를 들어, 만일 턴오버 비율이 높은 효소가 최종적인 시그널 전구체 분자인 경우, 그 효소는 형광 또는 발광 기질에 대해 반응할 수 있을 것이다. 또 다른 예는 최종의 시그널 전구체 분자로서 캡슐화된 FDA를 사용하는 것에 관한 것이다. 수산화나트륨 수용액과 같은 발달 시약을 첨가하면 FDA는 용해, 가수분해되어 다수의 플루오레신 분자들을 방출하게 됨으로 해서, 증폭된 플루오레신 시그널을 제공하게 된다.
좋기로는, 적어도 인큐베이션 단계 (a)에서 사용된 마이크로스피어에 있어서는, 캐리어 단백질은 비제한적인 예로서 세포골격 단백질 또는 세포외 매트릭스 단백질과 같은 섬유 단백질; 또는 비제한적인 예로, 헤모단백질, 세포 부착 단백질을 비롯한 구상 단백질; 또는 수송 단백질, 성장인자, 수용체 단백질, DNA-결합 단백질, 면역계 단백질, 비제한적인 예로 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 영양 보관/수송 단백질, 샤프롱 단백질, 또는 효소; 또는 유전적으로 변형된 단백질; 또는 재조합 단백질 및 합성 단백질 중에서 선택된다. 더욱 좋기로는, 캐리어 단백질은 소의 혈청 알부민과 같이, 혈액 내에서 순환하는 단백질이다.
마찬가지로, 적어도 인큐베이션 단계 (a)에서 사용된 마이크로스피어의 경우, 시그널 전구체 분자들 플루오로포어및 그의 유도체, 루미노포어및 그의 유도체, 크로모포어및 그의 유도체, 보결 원자단, 또는 전극활 물질, 레독스 매개체로부터 선택된 레독스 활성 물질로 이루어진 군으로부터 선택된 저분자량의 물질일 수 있다. 좋기로는, 저분자량의 시그널 전구체 분자는 예컨대 플루오레신, 시아닌, 카르보시아닌, 로다민, 잔텐, 디아조-염료 기반 형광 물질 및 소형 형광 방향족 및 헤테로방향족 분자와 같은 플루오로포어일 수 있다. 별법으로, 저분자량의 시그널 전구체 분자는 피라졸론, 안트라퀴논, 카로티노이드 및 디아조- 및 모노아조, 옥사진, 인디고이드, 또는 리보플라빈계 염료 물질과 같은 크로모포어일 수 있다. 가장 바람직하기로는 저분자량의 시그널 전구체 분자는 플루오레신 디아세테이트(FDA), 플루오레신 디아세테이트 이소티오시아네이트(FDA-이소티오시아네이트) 또는 플루오레신 말레이미드(FDA-말레이미드)와 같은 플루오레신 유도체인 것이 좋다. 고분자량의 단백질 시그널 전구체 분자의 비제한적인 예로는 효소 및 그의 전구체, 생물발광성 단백질 및 형광성 단백질 및 리보자임; 모노클로날 항체 및 폴리클로날 항체를 비롯한 항체, 수용체, 항원, 재조합 단백질, 렉틴, 아비딘, 지질단백질 및 당단백질로 이루어진 군으로부터 선택된 펩타이드 또는 단백질, 핵산, 리보자임 및 앱타머를 들 수 있다. 좋기로는, 고분자량의 시그널 전구체 분자는 펩타이드 및 단백질, 핵산 가닥, 탄수화물, 저분자량 및 분자 각인 폴리머(MIPs) 또는 이들의 혼합물과의 리간드와 같은 친화성 분자이다. 별법으로, 고분자량의 시그널 전구체 분자는 퍼옥시다제, 옥시도리덕타제, 리가제, 폴리머라제 및 트랜스페라제와 같은 효소일 수 있다. 가장 좋기로는, 고분자량의 시그널 전구체 분자는 아비딘과 NeutrAvidin(상표명)인 것이다.
적어도 인큐베이션 단계 (a)에서 사용된 마이크로스피어에 있어서, 친화성 분자는 특이적인 펩타이드 및 단백질, 핵산 가닥, 탄수화물, 저분자량의 리간드 및 분자 각인 폴리머(MIPs) 또는 이들의 혼합물과 같은 바이오인식 분자일 수 있다.
펩타이드 또는 단백질은 모노클로날 항체 및 폴리클로날 항체를 비롯한 항체, 수용체, 항원, 렉틴, 아비딘, 올리고펩타이드, 지질단백질, 당단백질, 펩타이드 호르몬 및 알레르겐 또는 그의 일부일 수 있다. 핵산은 DNA, RNAs, 올리고뉴클레오타이드, 리보자임, 앱타머 및 그의 일부일 수 있다. 탄수화물의 예로는 단당류, 올리고당류 및 다당류, 당지질, 프로테오-다당류 및 그의 일부를 들 수 있다. 저분자량 리간드는 바이오틴 또는 바이오틴 유도체, 스테로이드 또는 호르몬, 코팩터 또는 코엔자임, 활성화제, 저해제, 슈도기질 또는 효소, 약물, 알레르겐 또는 합텐의 보결 원자단일 수 있다.
최종 마이크로스피어의 특히 바람직한 형태는 그의 캐리어 단백질이 소의 혈청 알부민(BSA)이고 시그널 전구체 분자들은 플루오레신 디아세테이트(FDA), 플루오레신 디아세테이트 이소티오시아네이트(FDA-이소티오시아네이트) 또는 플루오레신 말레이미드(FDA-말레이미드)와 같은 플루오레신 유도체로부터 선택되는 것이 좋다. 발달 시약은 활성화 단계에서 이들 플루오레신 유도체를 "활성화"시켜서, 예컨대 화학반응, 예컨대 알칼리 시약, 또는 생화학 반응, 예컨대 에스테라제를 통하여 이들을 플루오레신으로 변환시킴으로써 검출가능한 시그널을 생성하는데 적합한 것이다.
마이크로스피어를 해체하여 시그널 전구체 분자를 방출하는데 사용되는 화학 방출 시약은 마이크로스피어 내의 황-황 결합(분자간 및 분자내)을 절단하는데 효과적인 소형 분자 환원제일 수 있다. 디티오쓰레이톨(DTT)는 특히 바람직한 방출제이다. 마이크로스피어의 해체는 초음파 처리, 고온, 광조사 또는 pH 변화를 통해 달성될 수도 있다.
이하에 첨부된 도면을 참조로 본 발명을 더욱 상세히 설명하나 이는 어디까지나 예시적인 것으로 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.
도 1은 본 발명에 따른 마이크로스피어의 조립 기술을 도시한 개략도이다.
도 2는 본 발명의 첫번째 구체예에 따른 단백질 마이크로스피어의 상 대조 마이크로그래프이다.
도 3은 상이한 다공도를 갖는 단백질 마이크로스피어의 주사전자 현미경 영상을 나타낸 도면이다; 상단의 이미지는 22,000 배율의 이미지이고 하단 이미지는 150,000 배율의 이미지이다.
도 4는 샌드위치 바이오어세이에 있어서 시그널의 축적 및 국소와의 작동 원리를 나타내는 개략적 다이아그램이다.
도 5는 염소 항마우스 IgG (Gt-α-MIgG)로 관능화된 BSA-FDA 마이크로스피어에 대한 고체상 샌드위치 형광 면역분석법의 개략적 다이아그램이다.
도 6은 증폭 사이클링의 원리를 나타낸 개략적 다이아그램이다.
도 1을 참조하여 설명하면, (a)는 염화칼슘(CaCl2), 캐리어 단백질 및 시그널 전구체 분자의 혼합 용액을 함유하는 제1 용기 100과 탄산나트륨 (Na2CO3) 용액을 함유하는 제2 용기 200을 도시하고 있다. 이들 2개의 용기의 내용물을 신속히 혼합하여 단백질과 시그널 전구체 분자들, 예컨대 BSA-FDA가 지지체 탄산칼슘(CaCO3) 마이크로스피어 템플릿 300에서 공침에 의해 포획되도록 한다.
(b)는 그 다음 단계에서 발생하는 상황을 도시한 것이다. 포획된 단백질 및 시그널 전구체 분자들이 있는 CaCO3 마이크로스피어 템플릿 300을 환원제인 디티오쓰레이톨(DTT)로 처리하면, 단백질 분자 내에서 분자내 다이설파이드 결합이 열린다. 이어서, 수차례 반복 세척 단계를 통하여 DTT를 제거한다. 단백질 분자들 사이에서 새로운 분자간 및 분자내 다이설파이드 결합이 형성된다. 새로이 형성된 분자간 다이설파이드 결합은 단백질 분자로 하여금 시그널 전구체 분자도 함유하는 마이크로스피어 20으로 조립되도록 기여한다. CaCO3 템플릿 물질을 제거하여, 화학적 크로스링커를 사용할 필요 없이, 단백질/시그널 전구체 분자 마이크로스피어 20을 남긴다.
도 2를 참조하면, 이 도면은 상기 공정에 따라 제조된 단백질 마이크로스피어의 상대조 마이크로그래프(phase contrast micrograph)이다. 이들 사진으로부터 마이크로스피어들의 크기가 평균값으로부터의 편차가 적은 매우 균일한 크기임을 알 수 있다. 마이크로스피어는 서로 들러붙지 않도록 동일한 표면 전하를 가져야만 한다는 것도 중요한 사항이다. 이렇게 서로 들러붙지 않는다는 것이 도면에 잘 나타나 있다. 또한, 정량적 분석을 위해서는, 크기 분포가 좁아야 함도 매우 중요한 사항이다.
도 3은 15분 내지 60분의 기간에 걸쳐서 0.01 내지 1 mM 범위의 DTT 농도를 이용하여 제조된 BSA 마이크로스피어의 SEM 마이크로그래프이다. 얻어진 마이크로스피어들은 직경이 서로 비슷하고, 마이크로스피어의 표면 조도 및 포어 크기는 DTT 농도가 감소함에 따라 증가한다.
DTT 농도가 높을수록 BSA 분자 내부의 분자내 다이설파이드 결합 절단율이 높아져서, 즉, 단백질 분자 내에서 유리 티올의 수가 증가한다. 세척 (반복적인 세척 단계를 이용하였음)에 의하여 DTT를 제거하자 BSA 분자 내의 유리 티올기들이 자가 조립(self-assembled)되어 새로운 분자간 및 분자내 다이설파이드 결합을 형성하게 되고, 분자간 다이설파이드 결합은 탄산칼슘 템플리트 제거 후에도 살아 남은 단백질 마이크로스피어의 형성에 기여한다.
저농도 DTT를 이용하여 조립된 마이크로스피어들은 적은 수의 분자간 다이설파이드 결합을 함유하였으며 따라서 포어가 더 많다.
도 4를 참조하면, 도 4는 본 발명의 마이크로스피어를 이용한 샌드위치 바이오어세이에 있어서 시그널의 축적 및 국소화의 작동 원리를 나타내는 개략적 다이아그램이다.
(a) 도면에서, 고체 지지체 10은 그의 표면에 친화성 분자 50을 갖는 것으로 도시되어 있다. 마이크로스피어 20은 시그널 전구체 분자 40에 결합된 담체 단백질 30을 함유하는 약간 평평한 서클로서 도시되어 있다. 이 도면은 어디까지나 개력적 다이아그램인 것을 명심하여야 하며 마이크로스피어는 오로지 도해 목적에서 실선의 바운더리(경계)를 갖는 것으로 그려져 있음을 이해하여야 한다. 또한, 캐리어 단백질 분자들 (및 캐리어 단백질 분자들과 시그널 전구체 분자들 간의 결합) 간의 S-S- 결합선은 도면을 명료하게 그리기 위하여 생략하였다. 실제로는, 마이크로스피어는 실선의 바운더리를 갖는 캡슐이 아니며; 그보다는 캐리어 단백질과 시그널 전구체 분자들이 서로 결합된 채 균질하게 분포되어 있으며, 그 내부로 포어들이 뻗어있는 일종의 미니어쳐 스폰지 볼처럼 생겼다.
마이크로스피어 20의 표면에는 친화성 분자 50이 부착되어 있다.
표적 분자 또는 피검물 60은 고체 지지체 10 상의 친화성 분자 50 중 어느 하나와 마이크로스피어 상의 친화성 분자 50 중 어느 하나 사이에 샌드위치되어 있다. 고체 지지체는 막, 마이크로타이터 플레이트의 웰, 자성 비드일 수 있고 또는 보다 일반적으로는 면역학 분석이나 하이브리다이제이션 분석법에서 사용되는 고체상 플랫폼일 수 있다.
(b) 도면에는 동일한 마이크로스피어 20이 도시되어 있으며, 여기에서도 구체상 지지체 10이 두 개의 친화성 분자들 50 사이에서 표적 분자 60의 "샌드위치"를 통하여 고체 지지체 10에 부착되어 있다. 그러나, 이 도면에서는 마이크로스피어 20이 발달 시약으로 처리된 이후의 도면이며 이제는 미니어쳐 태양 모양으로 표시된 시그널 분자 40*을 갖는데, 이전에는 다이아몬드로서 표시되어 있던 시그널 전구체 분자 40을 가졌었던 것이다.
간단히 설명해서, 도 4(a)는 꺼진(스위치 오프된) 마이크로스피어를 나타내는 반면, 도 4(b)는 켜진(스위치 온된) 마이크로스피어를 나타내는 것이다.
오로지 설명 목적에서, 도 4는 고체 지지체 10 상과 마이크로스피어 20의 표면 상의 친화성 분자 50을 서로 동일한 형태로 도시하고 있다. 그러나, 대부분의 실제 상황에서는, 폴리클로날 항체가 사용되거나 또는 표적 피검물이 반복적 에피토프인 경우를 제외하고는, 이들 2종의 친화성 분자들은 서로 동일하지 않다.
사실상, 많은 마이크로스피어 바이오표지들이, 피검물(표적) 분자와 마이크로스피어 크기의 크기에 따라, 바이오어세이에서의 각각의 표적 피검물에 특이적으로 결합하게 될 것이다. 면역학적 분석법에 있어서는, 마이크로스피어 바이오표지가 항원 표적 분자의 에피토프에 특이적으로 결합하고; 하이브리다이제이션 분석법에서는, 마이크로스피어 바이오표지가 특이적인 DNA-서열 표적 피검물에 결합할 것이다.
발달 시약을 첨가하면, 바이오표지 중에서 수백만개의 시그널 생성 전구체 분자들이 고도의 형광 분자로 변환되어 바이오표지가 발광하여 국소화된 시그널을 생성하게 된다.
도 5는 염소 항마우스 IgG (Gt-α-MIgG)로 관능화된 BSA-FDA 마이크로스피어에 대한 고체상 샌드위치 형광 면역분석법의 개략적 다이아그램이다.
(a) 도면은, Gt-α-MIgG가 고체 지지체에 부착되는 인큐베이션 단계를 설명하고 있다. 단계 (b)에서는, 고체 지지체 상에 결합된 Gt-α-MIgG가 표적 종 또는 피검물, MIgG를 함유하는 용액에 노출된다. 표적 종들은 결합된 Gt-α-MIgG에 의해 포획된다. 포획되지 않은 표적 종들은 세척 단계(도시하지 않음)에 의해 제거된다. 단계 (c)에서는 포획된 표적 종들을, 그 표면에 친화성 분자로서 Gt-α-MIgG로 관능화된 BSA-FDA로 형성된 마이크로스피어로 처리함으로써 샌드위치 분석을 실시한다. 또 다른 세척 단계(도시하지 않음)에서, 포획되지 않은 표적 종에 결합되지 않은 마이크로스피어들을 세척하여 제거한다. 단계 (d)에서는, 발달 시약을 첨가하여 FDA를 가수분해하여 플루오레신을 얻음으로써, 가시화된 국소화 시그널이 생성된다.
도 6은 증폭 사이클링의 원리를 개략적으로 도시한 도면이다.
도 (a)에는, 한쪽 말단은 고체 지지체 10'에 부착되어 있고, 다른쪽 말단은마이크로스피어 20'에 컨쥬게이트된 친화성 분자 50'와 표적 상보핵산 30 간의 샌드위치 하이브리다이제이션을 통해, 마이크로스피어 20'에 부착되어 있는 하나의 단일 포획 분자 60이 도시되어 있다. 도식적으로, 포획 분자 60은 표적 상보핵산 30과 마이크로스피어 20'에 컨쥬게이트된 친화성 분자 50'에 하이브리다이즈된 표적 핵산으로서 도시되어 있다.
도 (b)는 마이크로스피어를 해체시키는 방출 시약으로 처리된 이후의 마이크로스피어를 도시한 것이다. 이 도면에서, 마이크로스피어는 막 분해되기 시작하여 복수개(X)의 제2 피검물 40'을 용액 내로 방출하고 있다. 제2 피검물은 예컨대 아비딘일 수 있다.
도 (c)에서는 제2 피검물 40'이 친화성 분자 50"에 의해 상이한 고체 지지체 10" 상에 포획되어 있다. 제2 피검물 40'이 아비딘인 에에서는, 친화성 분자 50"은 알부민 12"에 결합된 바이오틴일 수 있다. 이 형태로 이것은 고체 지지체 10"에 부착될 것이다. 포획된 제2 피검물 40'은 고체 지지체 10"에 간접적으로 결합된 친화성 분자 50"와, 다른 마이크로스피어 20"에 결합된 또 다른 친화성 분자 50" 사이에 샌드위치되어 있다.
도 (d)는 마이크로스피어를 해체시키는 방출 시약으로 처리한 후의 마이크로스피어 20"을 도시한다. 이 도면에서, 마이크로스피어는 막 분해되지 시작하여 복수개의 제2 피검물 40"을 방출하고 있다. 따라서, 하나의 단일 표적 분자 60은 2회의 증폭 사이클 후에는 수백 수억개의 제2 피검물을 낼 수 있다. 필요하다면, 증폭 사이클을 추가로 반복할 수 있다.
이하에 다양한 실시예를 들어 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하나 본 발명이 이들 실시예로 한정되는 것은 아니다.
실시예 1:
BSA - FDA 마이크로스피어의 제조
제1 단계: BSA 프레임워크의 형성
염화칼슘(0.5 mol/L) 중의 BSA (10 mg/mL) 용액을 탄산나트륨(0.5 mol/L) 용액과 신속히 혼합하였다.
탄산칼슘이 형성되었으며 단지 약간만 용해되어, 탄산칼슘 매트릭스의 코어/인테리어 내의 BSA를 포획하였다. 탄산칼슘은 BSA를 포획하기 위한 템플릿 역할을하였다.
다음 단계는 BSA 분자내의 S-S 결합을 열어서 새로운 BSA 분자간 S-S 결합을 형성하는 것이다.
각각의 단계는 수차례의 세척과 원심분리 사이클로 이루어진다.
얻어진 BSA-로딩된 탄산칼슘 마이크로스피어를 실온에서 15-60분 동안 pH 7.5에서 0.01 내지 1 mM 농도 범위의 디티오쓰레이톨(DTT) 용액과 함께 인큐베이션하였다. 이어서, BSA-로딩된 탄산칼슘 마이크로스피어를 원심분리 (2000 rpm, 2 분)에 의해 완충액 (pH 7.4)로 5회 세척하고 재분산 사이클을 실시하였다.
DTT 첨가에 의해 BSA 중의 분자내 황-황 결합의 환원/절단이 일어나는 한편 이들 세척 단계에서의 DTT 제거는 BSA 분자들 간의 새로운 분자내 및 분자간 황-황 결합을 야기하여 단백질 분자를 한데 홀딩하여 마이크로스피어를 형성하게 된다.
제2 단계: BSA 골격-매트릭스에 대한 시그널 분자의 결합
재현탁된 탄산칼슘-함유 마이크로스피어에 플루오레신 디아세테이트-5-이소티오시아네이트(1 mg/mL)를 첨가하고, 이 반응 혼합물을 실온에서 1시간 인큐베이션하여 BSA 아미노기와 플루오레신 디아세테이트의 티오시아네이트 사이에 공유결합을 형성시킨다.
제3 단계: BSA - FDA 마이크로스피어의 관능화
EDC/NHS 화학을 이용하여 시그널 분자를 담지하는 마이크로스피어에 염소-항마우스 항체를 결합시켰다.
제3.1 단계: 친화성 분자 용액의 제조
염소-항마우스 IgG 용액 (0.2 mg/mL)을 pH 7.4의 MES 완충액 중 각각 2mM 및 5 mM의 1-에틸-3(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드(EDC) 및 N-히드록시 숙신이미드(NHS)에 첨가하였다. 용액을 실온에서 진탕시키면서 15분간 반응시켰다.
제3.2 단계: 항체에 의한 마이크로스피어의 관능화
15분간 인큐베이션한 후, 염소-항마우스 IgG 결합 활성화된 친화성 분자 용액을 미리 세척해둔 BSA-FDA 마이크로스피어 현탁액에 첨가하고 이 혼합물을 실온에서 진탕시키면서 2 시간 반응시켰다. BSA-FDA 마이크로스피어에 결합한 친화성 분자 용액을 1800 rpm에서 2 분간 원심분리시켰다.
상등액을 제거하고 펠릿을 2 mL의 MES 완충액 (pH 7.4)으로 재조성하였다. 친화성 분자들로 관능화된 BSA-FDA 마이크로스피어들을 MES 완충액 (pH 7.4)으로 3회 세척하고 2 mL의 MES 완충액 (pH 7.4)에 재현탁하였다.
제4 단계: 탄산칼슘 템플릿의 제거
이어서, 10 mL의 0.2 M EDTA를 BSA-FDA 마이크로스피어 현탁액에 첨가하고 그 전체를 5분간 교반하였다. EDTA 처리에 의해 마이크로스피어로부터 탄산칼슘 매트릭스를 제거하였다. 반응 혼합물을 3000 rpm에서 2분간 실온에서 원심분리시켰다. 상등액을 제거하고 항체 관능화된 BSA-FDA-마이크로스피어 펠릿을 2 mL의 MES 완충액 (pH 7.4)에 재현탁시켰다.
실시예 2:
알긴산칼슘 매트릭스 형성제를 이용한 BSA 골격의 형성
염화칼슘(0.5 mol/L) 중의 BSA (10 mg/mL) 용액을 알긴산나트륨 (0.5 mol/L) 용액과 신속히 혼합하였다.
알긴산칼슘이 형성되었으며 단지 약간만 용해되어, 탄산칼슘 매트릭스의 코어/인테리어 내의 BSA를 포획하였다. 알긴산칼슘은 BSA를 포획하기 위한 템플릿 역할을 하였다.
다음 단계는 BSA 분자내의 S-S 결합을 열어서 새로운 BSA 분자간 S-S 결합을 형성하는 것이다.
각각의 단계는 수차례의 세척과 원심분리 사이클로 이루어진다.
얻어진 BSA-로딩된 알긴산칼슘 마이크로스피어를 실온에서 15-60분 동안 pH 7.5에서 0.01 내지 1 mM 농도 범위의 디티오쓰레이톨(DTT) 용액과 함께 인큐베이션하였다. 이어서, BSA-로딩된 알긴산칼슘 마이크로스피어를 원심분리 (2000 rpm, 2 분)에 의해 완충액 (pH 7.4)로 5회 세척하고 재분산 사이클을 실시하였다.
DTT 첨가에 의해 BSA 중의 분자내 황-황 결합의 환원/절단이 일어나는 한편 이들 세척 단계에서의 DTT 제거는 BSA 분자들 간의 새로운 분자내 및 분자간 황-황 결합을 야기하여 단백질 분자를 한데 홀딩하여 마이크로스피어를 형성하게 된다.
제2 단계: BSA 골격-매트릭스에 대한 시그널 분자의 결합
재현탁된 탄산칼슘-함유 마이크로스피어에 플루오레신 디아세테이트-5-이소티오시아네이트(1 mg/mL)를 첨가하고, 이 반응 혼합물을 실온에서 1시간 인큐베이션하여 BSA 아미노기와 플루오레신 디아세테이트의 티오시아네이트 사이에 공유결합을 형성시킨다.
실시예 3:
마우스- IgG 의 측정을 위한 샌드위치형 분석
마우스 IgG의 측정은 샌드위치형 분석법으로 실시하였다. 측정하는 동안 마우스 IgG는 2개의 항체들 사이에 특이적으로 결합되었다. 폴리클로날 염소 항체가 사용되었으므로 항체들은 동일하였다. 고체상(예컨대 마이크로타이터 플레이트의 웰)을 염소-항마우스 IgG 항체로 흡착 코팅시켰다. 제2 항체는 BSA-FDA 마이크로스피어에 결합된 염소-항마우스 항체였다. 이 실시예는 도 5에 도식적으로 도시되어 있다.
100 μL의 Gt-α-MIgG (2 ng/μL의 코팅 완충액)을 마이크로타이터 플레이트로 옮기고 4℃에서 밤새 인큐베이션시켰다. 이어서 마이크로타이터 플레이트를 세척 완충액(10 mM PBS, 0.1% (w/v) BSA, 0.5% (w/v) Tween-20 (Tween은 상표명이다))으로 3회 세척하였다. 이어서 웰을 37℃에서 30분간 300 μL의 후코팅(post coating) 용액으로 블로킹시켰다. 여러 농도 (1-100 ㎍/L)의 MIgG 100 μL를각각의 웰에 첨가하여 37℃에서 1 시간 인큐베이션시켰다. 미결합 MIGG를 세척하여 제거한 후, Gt-α-MIgG -{BSA-FDA 마이크로스피어} 현탁액을 웰에 분주하고 (100 μL/웰), 마이크로플레이트를 다시 37℃에서 1시간 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 과량의 Gt-α-MIgG -{BSA-FDA 마이크로스피어)를 세척 완충액으로 세척하여 제거하였다. 이어서 각각의 웰에 방출액 100 μL씩 분주액을 첨가하고 형광 강도를 측정하였다.
실시예 4:
아비딘 마이크로스피어의 제조
실시예 4는 캐리어 단백질과 친화성 결합 분자가 하나의 동일한 분자인 경우의 실시예이다.
제1 단계: 아비인 골격의 형성
염화칼슘(0.5 mol/L) 중의 아미딘 (10 mg/mL) 용액을 탄산나트륨(0.5 mol/L) 용액과 신속히 혼합하였다.
탄산칼슘이 형성되었으며 단지 약간만 용해되어, 그의 결정 표면 상에서 아비딘을 침전 및 유인/흡착하였다. 탄산칼슘은 아비딘 침전을 위한 템플릿 역할을 하였다.
다음 단계는 아비딘 분자내의 S-S 결합을 열어서 아비딘을 가교시켜 아비딘 분자간의 S-S 결합을 형성하는 것이다.
각각의 단계는 수차례의 세척과 원심분리 사이클로 이루어진다.
얻어진 아비딘-로딩된 탄산칼슘 마이크로스피어를 실온에서 15-60분 동안 pH 7.5에서 0.01 내지 1 mM 농도 범위의 디티오쓰레이톨(DTT) 용액과 함께 인큐베이션하였다. 이어서, 아비딘-로딩된 탄산칼슘 마이크로스피어를 원심분리 (2000 rpm, 2 분)에 의해 완충액 (pH 7.4)로 5회 세척하고 재분산 사이클을 실시하였다.
DTT 첨가에 의해 아비딘 내의 분자내 황-황 결합의 환원/절단이 일어나는 한편 이들 세척 단계에서의 DTT 제거는 아비딘 분자들 간의 새로운 분자내 및 분자간 황-황 결합을 야기하여 단백질 분자를 한데 홀딩하여 마이크로스피어를 형성하게 된다. 상기 단백질 내의 환원된 SH 결합은 새로운 분자내 및 분자간 황-황 결합의 자가 조립 형성을 수행한다.
제2 단계: 시그널 분자의 관능화
이것은 친화성 결합 분자 없이 마이크로스피어에 친화성 분자의 공유결합을 위하여, 유리 아미노기, SH 및 카르복실기를 함유하는 아비딘에 특이적 검출 분자(친화성 분자)를 결합시킴으로써 달성된다.
아비딘-함유 마이크로스피어에 대한 관능화 공정에 관한 상세는 전술한 실시예 2를 참조하면 된다.
관능화 공정은 스트렙트아비딘 또는 탈글리코실화된 아비딘 예컨대 NeutNeutrAvidin(상표명)인 경우 훨씬 간편한데 이는 이들이 표적(피검물)-인식 분자, 즉 친화성 분자에 직접 결합하기 때문이다. 만일 스트렙트아비딘이나 NeutrAvidin(상표명)이 사용되면, 예컨대 바이오티닐화 항체와 같은 정상적으로 바이오티닐화된 친화성 분자가, 바이오틴에 대한 스트렙트아비딘의 강한 결합력에 의해, 스트렙트아비딘이나 NeutrAvidin(상표명)에 직접 결합한다 (K 약 1016). 따라서, 예컨대 EDC/NHS와 같은 화학 컨쥬게이션은 불필요하다.
제3 단계: 마이크로스피어 외부에서의 탄산칼슘의 용해
이것은 아비딘 마이크로스피어 현탁액에 EDTA (0.2 mol/L)를 첨가함으로써 수행하였다. 이 공정 후, 아비딘 시그널 전구체 마이크로스피어가 제조되었다.
상술한 실시예 1에서와 같이, 탄산칼슘 템플릿의 제거 단계는 관능화 단계에 앞서서 수행될 수 있음을 이해하여야 한다.
실시예 5:
고체상 직접 분석(이중 증폭 시스템, 바이오틴 / 아비딘 모델을 수반하는 DNA 어세이 모델)
이것은 캐리어 단백질과 친화성 결합 분자가 하나의 동일한 분자인 실시예로서 새로운 시그널 증폭 사이클링 기술에 있어서의 그 유용성을 입증하는 실시예이다. 이 실시예를 도 6에 개략적으로 도시하였다.
인체 유두종 바이러스 (HPV: human papilloma virus) DNA를 샌드위치형 분석법으로 측정하였다. HPV가 측정되는 동안, DNA-가닥은 바이오티닐화 되어 있는 그의 상보적인 핵산에 특이적으로 혼성화하였다. 이어서 이 혼성화 산물을NeutrAvidin(상표명)으로 만들어진 마이크로스피어와 반응시켰다. 아비딘 마이크로스피어를 해체시키는 방출 시약을 첨가하여 아비딘을 용액 내로 방출시켰다. 이어서, 방출된 아비딘을 후속적인 고체상 직접 분석법에서 피검물로서 처리하였다.
제1 단계: 고체상 직접 분석법 A ( HPV DNA 모델)
100 μL의 HPV 프로브(HPV 16)를 마이크로타이터 웰에 옮기고 4℃에서 밤새 인큐베이션시켰다. 이어서 마이크로타이터 플레이트를 300 μL의 세척 완충액으로 5회 세척하였다. 이어서 웰을 300 μL의 블로킹 용액으로 37℃에서 30분간 블로킹시켰다. 다음으로 마이크로타이터 플레이트를 300 μL의 세척 완충액으로 5회 세척하였다. 각각의 웰에 30 μL의 1M NaOH 및 50 μL의 PCR (바이오티닐화된 HPV-바이러스-DNA) 생성물을 희석 배수를 달리하여 첨가하고, 실온에서 10분간 방치시켰다. 이어서, 50 μL의 중화 완충액을 첨가하고 65℃에서 30분간 습윤 상자 내에서 인큐베이션시켰다. 이어서 마이크로타이터 플레이트를 300 μL의 세척 완충액으로 5회 세척하였다. 100 μL의 아비딘 마이크로스피어를 각각의 웰에 첨가하고 37℃에서 30분간 인큐베이션시켰다. 인큐베이션 후 플레이트를 꺼내고 DNA 세척 완충액으로 5회 세척하였다. pH 7.5의 농도가 0.01 내지 1 mM인 120 μL 디티오쓰레이톨(DTT) 용액을 각각의 웰에 첨가하고 실온엣 15-60분간 방치하였다. DTT 첨가에 의해 아비딘 내의 분자간 황-황 결합의 환원/절단이 일어나서, 마이크로스피어들이 해체되어 아비딘이 용액 내로 방출되게 된다. 방출된 아비딘 분자들은 후속적인 고체상 분석 (바이오틴/아비딘 모델)에서 피검물("제2 피검물")이 되었다.
제2 단계: 고체상 직접 분석법 B ( 바이오틴 / 아비딘 모델)
100 μL의 BSA-바이오틴(2 ng/μL의 코팅 완충액)을 4℃에서 밤새 0.1 mol/L 탄산염 완충액 (pH 9.6) 중의 Nunc Maxisorp 96-웰 마이크로플레이트(Nunc는 뉴욕 로체스터의 Nunc International의 상표임)에 직접 코팅하였다. 세척 완충액(10 mM PBS, 0.1% (w/v) BSA, 0.5% (w/v) Tween-20 (Tween은 상표명이다))으로 3회 세척한 후, 웰을 300 μL의 1.0% BSA 용액으로 37℃에서 30분간 블로킹시켰다. 이어서, 플레이트를 4회 세척하고 대응하는 "제2 피검물" (아비딘) 용액을 웰(100 μL/웰) 내로 분산시켰다. 마이크로플레이트를 37℃에서 다시 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 미결합 제2 피검물을 세척하여 제거한 후, 바이오틴-FDA 마이크로스피어 현탁액을 웰(100 μL/웰) 내로 분산시키고, 마이크로플레이트를 37℃에서 1 시간 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 과량의 바이오틴-FDA 마이크로스피어를 세척 완충액을 이용하여 세척하였다. 이어서, 100 μL의 발달 시약 분주액을 각각의 웰마다 첨가하여 형광 강도를 측정하였다.
전술한 내용으로부터 명확히 이해되는 바와 같이, 본 발명은 다재다능하며 유용하다. 본 발명의 시스템은 시종일관 간단한 화학/생화학과 온화한 조건을 이용한다. 제조 시간은 길지 않으며, 증폭 반응에서도, PCR과 같은 고도의 기술을 요하지 않고도, 많은 복수회의 증폭이 달성될 수 있다.
마이크로스피어 기술은 비제한적인 예로서 장치를 통한 유동, 마이크로-플루이드성 장치 및 측면 유동 장치와 같은 다양한 검출 포맷에 응용될 수 있다. 이 기술은 또한 자성 비드 및 비자성 비드, 그리고 마이크로타이터 웰에 대하여도 이용가능하다.
또 다른 응용예로서 면역화학, 조직학 분야 및 세포 구조 또는 부가적인 밴드의 검출을 위한 웨스턴, 서던 및 노던 블랏 기술에 있어서의 시그널 분자의 사용을 들 수 있는데, 이들은 이제까지 검출될 수 없었는데, 이는 예컨대 FITC-표지된 친화성 분자는 그의 분석 감도의 한계에서 작업되기 때문이다.
본 발명의 시그널 마이크로스피어를 이용하면 면역화학, 조직학 및 모든 검출 기술의 다양한 형태에서 새로운 가능성이 열린다. 전통적인 검출 이론이 몇배수의 배율에 의해 쉽게 개선될 수 있다.
따라서, 본 발명은 샘플 중의 표적 분자의 검출 및/또는 존재 여부를 판단하기 위한 다양한 검사용 키트를 제공하며, 이러한 키트는 시그널 전구체 분자에 결합된 캐리어 단백질을 포함하는 마이크로스피어를 포함하여 이루어지며, 여기서 상기 시그널 전구체 분자는 캐리어 단백질에 대한 결합을 유지한 채로 검출가능한 시그널을 생성하도록 활성화될 수 있는 것이고, 상기 마이크로스피어는 그 표면에, 표적 분자에 대한 특이적 인식 및 결합을 위한 친화성 분자를 지니도록 만들어진 것이다.
또 다른 키트 형식은 친화성 분자들을 마이크로스피어 표면에 결합하는데 적합하도록 변형시키기 위한 시약 및 마이크로스피어와 친화성 분자 사이의 결합 반응을 수행하기 위한 시약을 추가로 함유할 수 있다.
또 다른 키트 형식은 분석하고자 하는 유체 샘플을 검사 장치의 흡수재의 한쪽 말단에 첨가하는, 측면 유동 장치, 관통 유동 장치, 딥스틱 장치와 같은 검사 장치를 포함할 수 있다. 유체는 모세관힘에 의해 다른쪽 말단으로 이동한다. (임의로 상기 다른쪽에 위치하는 흡입 패드에 의해 모세관 힘이 증강될 수 있음). 마이크로스피어(시그널 생성 물질을 함유한다)로 표지된 검출자 항체는 검사 장치의 출발점에 과량으로 느슨하게 결합된다.
시그널-생성 물질은 형광 염료, 가시 염료, 바이오발광 또는 화학발광 물질, 자성 물질 또는 효소일 수 있다.
샘플 중의 항원은 검출자 항체와 상호반응하여 마이크로스피어를 따라 장치의 다른쪽 말단으로 이동한다. 흡입 패드 근방의 인디케이터 대역(점 또는 선)에서 캣처 항체와 함께 샌드위치가 형성된다. 여기서, 캣처 항체는 흡수제애 보다 단단히 결합되므로 이동할 수 없다.
샘플 중에 피검물이 많이 존재할수록, 더 많은 샌드위치 구조물이 형성되며 더 많은 마이크로스피어들이 인디케이터 대역에 결합된다. 시그널 생성 물질은 시그널 전구체 분자의 구조에 따라 여러 가지 공정에 의해 활성화될 수 있다. 예를 들어, 시그널 전구체로 사용되는 FDA의 경우, 장치 전체를 알칼리성 활성화 용액에 침지시키거나 또는 인디케이터 대역에 알칼리성 활성화제를 떨어뜨릴 수 있다.
검출자 항체(마이크로스피어로 표지됨)의 일부는 인디케이터 대역에 결합하지 않고 계속 이동한다. 인디케이더 대역 뒤에 위치하는 컨트롤 대역은 고체상 바응이 적절히 수행되는지를 나타내준다.
샌드우치형 고체상/막 기반 기술은 경쟁적 분석 원리를 이용하여 저분자량 물질용으로 변형시킬 수 있다.
첨부된 특허청구범위를 벗어남이 없이 본 발명에 대하여 다양한 변형이 행해질 수 있다.

Claims (87)

  1. (i) 단백질 시그널 전구체 분자, 또는
    (ii) 시그널 전구체 분자와 결합된 캐리어 단백질
    중 어느 하나를 함유하는 마이크로스피어로서, 여기서 상기 마이크로스피어는 단백질 분자들 간에 분자간 결합을 갖는 것이고, 상기 마이크로스피어는 다음 방법,즉:
    단백질 분자를 용액 중에서 매트릭스 형성제와 혼합하는 단계;
    환원제를 혼합물에 첨가하는 단계;
    환원제를 제거하는 단계;
    매트릭스 제거제를 첨가하는 단계, 및
    매트릭스를 제거하여 단백질 분자의 마이크로스피어를 남기는 단계
    를 포함하여 이루어지는 방법에 의하여 형성되는 것인 마이크로스피어.
  2. 제1항에 있어서, 단백질 시그널 전구체 분자는 표적에 결합하기 위한 친화성 분자인 것인 마이크로스피어.
  3. 제1항에 있어서, 표적에 결합하기 위한 친화성 분자가 추가로 표면에 있는 것인 마이크로스피어.
  4. 제1항에 있어서, 상기 시그널 전구체 분자는 마이크로스피어에 결합된 채로 검출가능한 시그널을 생성하도록 활성화될 수 있는 것인 마이크로스피어.
  5. 제1항에 있어서, 상기 캐리어 단백질은 비제한적인 예로 세포골격 단백질 또는 세포외 매트릭스 단백질과 같은 섬유 단백질; 또는 구상 단백질, 혈액 단백질, 헤모단백질, 세포 부착 단백질, 또는 수송 단백질, 성장인자, 수용체 단백질, DNA-결합 단백질, 면역계 단백질, 모노클로날 항체, 또는 폴리클로날 항체, 영양 보관/수송 단백질, 샤프롱 단백질, 또는 효소; 또는 유전적으로 변형된 단백질; 또는 재조합 단백질 또는 화학적으로 변형된 단백질 및 합성 단백질 중에서 선택되는 것인 마이크로스피어.
  6. 제5항에 있어서, 상기 캐리어 단백질은 혈액 단백질인 것인 마이크로스피어.
  7. 제5항 또는 제6항에 있어서, 상기 캐리어 단백질은 소의 혈청 알부민인 것인 마이크로스피어.
  8. 전술한 항들 중 어느 하나의 항에 있어서, 시그널 전구체 분자는 플루오로포어및 그의 유도체, 루미노포어및 그의 유도체, 크로모포어및 그의 유도체, 효소 기질, 보결 원자단, 또는 전극활 물질, 레독스 매개체로부터 선택된 레독스 활성 물질로 이루어진 군으로부터 선택된 저분자량의 물질, 또는 효소 및 그의 전구체, 생물발광 단백질 및 형광 단백질, 핵산, 리보자임 및 앱타머로 이루어진 군으로부터 선택된 고분자량의 물질인 것인 마이크로스피어.
  9. 제8항에 있어서, 시그널 전구체 분자는 플루오로포어인 것인 마이크로스피어.
  10. 제8항에 있어서, 플루오로포어는 플루오레신, 시아닌, 카르보시아닌, 로다민, 잔텐, 디아조-염료 기반 형광 물질, 및 소형 형광 방향족 및 헤테로방향족 분자로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 마이크로스피어.
  11. 제10항에 있어서, 플루오로포어는 플루오레신 디아세테이트(FDA), 플루오레신 디아세테이트 이소티오시아네이트(FDA-이소티오시아네이트) 및 플루오레신 말레이미드(FDA-말레이미드)로부터 선택된 플루오레신 유도체인 것인 마이크로스피어.
  12. 제8항에 있어서, 시그널 전구체 분자는 크로모포어인 것인 마이크로스피어.
  13. 제12항에 있어서, 크로모포어는 시아닌, 피라졸론, 안트라퀴논, 카르보시아닌, 로다민, 잔텐, 카로티노이드 및 디아조- 및 모노아조, 옥사진, 인디고이드, 또는 리보플라빈계 염료 물질로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 마이크로스피어.
  14. 제2항 또는 제3항, 또는 제4항 내지 제13항 중 어느 하나의 항에 있어서, 제2항 또는 제3항을 인용하는 경우, 친화성 분자가 바이오인식 분자인 것인 마이크로스피어.
  15. 제14항에 있어서, 친화성 분자는 펩타이드 및 단백질, 핵산 가닥, 탄수화물, 저분자량 리간드 및 분자 각인 폴리머(MIPs) 또는 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 마이크로스피어.
  16. 제15항에 있어서, 펩타이드 또는 단백질은 모노클로날 항체 및 폴리클로날 항체를 비롯한 항체, 수용체, 항원, 재조합 단백질, 렉틴, 아비딘, 올리고당, 지질단백질, 당단백질, 펩타이드 호르몬 및 알레르겐 또는 이들의 일부로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 마이크로스피어.
  17. 제15항에 있어서, 핵산은 DNA, RNAs, 올리고뉴클레오타이드, 리보자임, 앱타머 및 이들의 일부로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 마이크로스피어.
  18. 제15항에 있어서, 탄수화물은 단당류, 올리고당류 및 다당류, 당지질, 프로테오-다당류 및 이들의 일부로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 마이크로스피어.
  19. 제15항에 있어서, 저분자량 리간드는 바이오틴 또는 바이오틴 유도체, 스테로이드 또는 호르몬, 코팩터 또는 코엔자임, 활성화제, 저해제, 슈도기질 또는 효소, 약물, 알레르겐 또는 합텐의 보결 원자단인 것인 마이크로스피어.
  20. 제15항에 있어서, 제3항을 인용하는 경우, 친화성 분자는 컨쥬게이트되거나 마이크로스피어의 분자에 직접 또는 링커를 경유하여 컨쥬게이트된 것인 마이크로스피어.
  21. 제15항에 있어서, 제3항을 인용하는 경우, 친화성 분자는 물리적 흡착에 의해 마이크로스피어에 컨쥬게이트된 것인 마이크로스피어.
  22. 제21항에 있어서, 링커는 아비딘, 스트렙트아비딘, 탈글리코실화 아비딘, 단백질 A, 단백질 G, 렉틴 또는 저분자량 크로스 링커로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 마이크로스피어.
  23. 전술한 항들 중 어느 하나의 항에 있어서, 그 크기가 10 nm 내지 1 mm 범위인 마이크로스피어.
  24. 제23항에 있어서, 그 크기는 400 nm 내지 10 ㎛ 범위인 것인 마이크로스피어.
  25. 제1항에 있어서, 상기 단백질은 캐리어 단백질이고, 상기 마이크로스피어는 시그널 전구체 분자들을 상기 캐리어 단백질에 결합시킴으로써 형성된 것인 마이크로스피어.
  26. 제25항에 있어서, 상기 캐리어 분자 및 상기 시그널 전구체 분자는 공유적 컨쥬게이션, 물리적 흡착 또는 링커 분자를 경유하여 결합되는 것인 마이크로스피어.
  27. 제25항 또는 제26항에 있어서, 캐리어 단백질은 제5항 내지 제7항 중 어느 하나의 항에 정의된 캐리어 단백질인 것인 마이크로스피어
  28. 제25항 내지 제27항 중 어느 하나의 항에 있어서, 시그널 전구체 분자는 제8항 내지 제13항 중 어느 하나의 항에 정의된 시그널 전구체 분자인 것인 마이크로스피어.
  29. 제25항 내지 제27항 중 어느 하나의 항에 있어서, 마이크로스피어 표면에 친화성 분자를 부착하는 단계를 추가함으로써 생성된 것인 마이크로스피어.
  30. 제29항에 있어서, 친화성 분자는 물리적 흡착 또는 직접 화학 컨쥬게이션에 의해 마이크로스피어에 컨쥬게이트되거나 결합된 것인 마이크로스피어.
  31. 제29항에 있어서, 친화성 분자는 링커 분자를 통해 마이크로스피어에 컨쥬게이트되거나 결합된 것인 마이크로스피어.
  32. 제31항에 있어서, 링커 분자는 아비딘, 스트렙트아비딘, 탈글리코실화 아비딘, 단백질 A, 단백질 G, 렉틴 또는 저분자량의 크로스 링커로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 마이크로스피어.
  33. 제29항 내지 제32항 중 어느 하나의 항에 있어서, 친화성 분자는 제14항 내지 제19항 중 어느 하나의 항에 정의된 것인 마이크로스피어.
  34. 제1항 내지 제33항 중 어느 하나의 항에 있어서, 매트릭스 형성제는 탄산칼슘, 알긴산 칼슘, 다공성 실리카 및 올리고당 또는 다당류로부터 선택된 것인 마이크로스피어.
  35. 제34항에 있어서, 매트릭스 형성제는 탄산칼슘인 것인 마이크로스피어.
  36. 제35항에 있어서, 탄산칼슘은 탄산나트륨 용액을 용액 중 단백질과 염화칼슘의 혼합물에 첨가함으로써 형성된 것인 마이크로스피어.
  37. 제1항 내지 제36항 중 어느 하나의 항에 있어서, 매트릭스 제거제는 킬레이팅제, EDTA, 산 또는 염기로부터 선택되는 것인 마이크로스피어.
  38. 제1항 내지 제36항 중 어느 하나의 항에 있어서, 환원제는 디티오쓰레이톨(DTT)인 것인 마이크로스피어.
  39. 단백질 분자를 용액 중에서 매트릭스 형성제와 혼합하는 단계;
    환원제를 상기 혼합물에 첨가하는 단계;
    환원제를 제거하는 단계, 및
    매트릭스를 제거하여 단백질 분자의 마이크로스피어를 남기는 단계
    를 포함하여 이루어지는, 단백질 마이크로스피어의 제조 방법.
  40. 제39항에 있어서, 매트릭스는 고온 처리 또는 pH 변화로부터 선택된 물리적 수단에 의해 제거되는 것인 방법.
  41. 제39항에 이어서, 매트릭스 제거 단계는 매트릭스 제거제를 첨가하는 것을 포함하는 것인 방법.
  42. 제41항에 있어서, 매트릭스 제거제는 킬레이팅제, EDTA, 산 또는 염기로부터 선택된 것인 방법.
  43. 제39항 내지 제42항 중 어느 하나의 항에 있어서, 환원제는 디티오쓰레이톨(DTT)인 것인 방법.
  44. 제39항 내지 제43항 중 어느 하나의 항에 있어서, 매트릭스 형성제는 탄산칼슘, 알긴산칼슘, 다공성 실리카 및 올리고당 또는 다당류로부터 선택된 것인 방법.
  45. 제44항에 있어서, 매트릭스 형성제는 탄산칼슘인 것인 방법.
  46. 제45항에 있어서, 탄산칼슘은 탄산나트륨 용액을 용액 중 단백질과 염화칼슘 혼합물에 첨가함으로써 형성된 것인 방법.
  47. 제39항 내지 제46항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 단백질 분자는 용액 중에서 표적에 결합하기 위한 친화성 분자인 것인 방법.
  48. 제39항 내지 제46항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 단백질은 캐리어 단백질이고 상기 방법은 시그널 전구체 분자를 상기 캐리어 단백질에 결합시키는 것을 추가로 포함하는 것인 방법.
  49. 제48항에 있어서, 상기 캐리어 단백질과 상기 시그널 전구체 분자는 공유적 컨쥬게이션, 물리적 흡착 또는 링커 분자를 통해 결합되는 것인 방법.
  50. 제48항 또는 제49항에 있어서, 캐리어 단백질은 제5항 내지 제7항 중 어느 하나의 항에서 정의된 바와 같은 캐리어 단백질인 것인 방법.
  51. 제48항 내지 제50항 중 어느 하나의 항에 있어서, 시그널 전구체 분자는 제8항 내지 제13항 중 어느 하나의 항에서 정의된 바와 같은 것인 방법.
  52. 제48항 내지 제51항 중 어느 하나의 항에 있어서, 친화성 분자를 마이크로스피어 표면에 부착시키는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
  53. 제52항에 있어서, 친화성 분자를 물리적 흡착 또는 간접 화학 컨쥬게이션에 의해 마이크로스피어에 컨쥬게이트 또는 결합시키는 것인 방법.
  54. 제52항에 있어서, 친화성 분자를 링커 분자를 통해 마이크로스피어에 컨쥬게이트 또는 결합시키는 것을 포함하는 방법.
  55. 제54항에 있어서,링커 분자는 아비딘, 스트렙트아비딘, 탈글리코실화된 아미딘, 단백질 A, 단백질 G, 렉틴 또는 저분자량의 크로스 링커로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
  56. 제47항 또는 제52항 내지 제55항 중 어느 하나의 항에 있어서, 친화성 분자는 제14항 내지 제19항 중 어느 하나의 항에서 정의된 바와 같은 것인 방법.
  57. 시그널 전구체 분자들에 결합된 캐리어 단백질을 포함하는 마이크로스피어를 이용하여 샘플 중에서 1 이상의 표적 분자들을 검출하는 방법으로서, 여기서 상기 시그널 전구체 분자들은 캐리어 단백질에 결합되어 있는 채로 검출가능한 시그널을 생성시키도록 활성화될 수 있으며, 상기 마이크로스피어는 그 표면에 상기 표적 분자를 특이적으로 인식하여 상기 표적 분자에 결합하기 위한 친화성 분자를 갖는 것으로서, 상기 방법은:
    (a) 표적 분자들을 상기 마이크로스피어와 함께 인큐베이션시키는 단계;
    (b) 그 표면에 친화성 분자-표적 분자 복합체를 갖는 마이크로스피어들을 친화성 분자-표적 분자 복합체를 갖지 않는 마이크로스피어들로부터 분리하는 단계;
    (c) 그 표면에 친화성 분자-표적 분자 복합체를 갖는, 분리된 마이크로스피어들을 발달 시약(developing areagent)으로 처리하여 시그널 전구체 분자를 활성화시켜 시그널을 생성시키는 단계, 및
    (d) 시그널을 검출 또는 정량하는 단계
    를 포함하여 이루어지는 것인, 샘플 중에서 1 이상의 표적 분자들을 검출하는 방법.
  58. 제57하에 있어서, 마이크로스피어는 제3항 또는 제3항을 인용하는 경우의 제4항 내지 제24항 중 어느 한 항에서 정의된 바와 같은 것인 방법.
  59. 제57항 또는 제58항에 있어서, 캐리어 단백질은 소의 혈청 알부민(BSA)이고 시그널 전구체 분자는 플루오레신 디아세테이트(FDA)인 것인 방법.
  60. 제59항에 있어서, 발달 시약은 염기 또는 에스테라제인 것인 방법.
  61. 시그널 전구체 분자들에 결합된 캐리어 단백질을 포함하는 제1 마이크로스피어를 이용하여 샘플 중에서 1 이상의 표적 분자들을 검출하는 시그널 증폭 방법으로서, 여기서 상기 시그널 전구체 분자들은 캐리어 단백질에 결합되어 있는 채로 검출가능한 시그널을 생성시키도록 활성화될 수 있으며, 상기 마이크로스피어는 그 표면에 상기 표적 분자를 특이적으로 인식하여 상기 표적 분자에 결합하기 위한 친화성 분자를 갖는 것으로서, 상기 방법은:
    (a) 표적 분자들을 상기 마이크로스피어와 함께 인큐베이션시키는 단계;
    (b) 그 표면에 친화성 분자-표적 분자 복합체를 갖는 마이크로스피어들을 친화성 분자-표적 분자 복합체를 갖지 않는 마이크로스피어들로부터 분리하는 단계;
    (c) 그 표면에 친화성 분자-표적 분자 복합체를 갖는, 분리된 마이크로스피어들을 처리하여 마이크로스피어를 해체시켜 시그널 전구체 분자들을 방출시키는 단계;
    (d) 상기 방출된 시그널 전구체 분자들을, 방출된 시그널 전구체 분자들에 대해 친화성을 갖는 또 다른 친화성 분자들로 관능화된 제2의 마이크로스피어로 처리하는 단계로서, 여기서 상기 마이크로스피어는 또 다른 시그널 전구체 분자들과 결합된 캐리어 단백질을 포함하는 것이고, 여기서 상기 또 다른 시그널 전구체 분자들은 캐리어 단백질에 결합되어 있는 채로 검출가능한 시그널을 생성하도록 활성화될 수 있는 것인 단계;
    (e) 그 표면에 또 다른 친화성 분자-시그널 전구체 분자 복합체가 있는 마이크로스피어들을 또 다른 친화성 분자-시그널 전구체 분자 복합체가 없는 마이크로스피어들로부터 분리하는 단계;
    (f) 그 표면에 또 다른 친화성 분자-시그널 전구체 분자 복합체가 있는, 분리된 마이크로스피어들을 발달 시약으로 처리하여 또 다른 제2 시그널 전구체 분자들을 활성화시켜 시그널을 생성하는 단계, 및
    (g) 시그널을 검출 또는 정량하는 단계
    를 포함하여 이루어지는 것인, 시그널 증폭 방법.
  62. 제61항에 있어서, 단계 (f) 및 (g)를 수행하기에 앞서서, 단계 (c) 내지 단계 (e)를 1 내지 n회 반복(여기서 n은 양의 정수임) 하는 것을 추가로 포함하는 것인 방법.
  63. 시그널 전구체 분자들에 결합된 캐리어 단백질을 포함하는 제1 마이크로스피어를 이용하여 샘플 중에서 1 이상의 표적 분자들을 검출하는 시그널 증폭 방법으로서, 여기서 상기 마이크로스피어는 그 표면에 상기 표적 분자를 특이적으로 인식하여 상기 표적 분자에 결합하기 위한 친화성 분자를 갖는 것으로서, 상기 방법은:
    (a) 표적 분자들을 상기 마이크로스피어와 함께 인큐베이션시키는 단계;
    (b) 그 표면에 친화성 분자-표적 분자 복합체를 갖는 마이크로스피어들을 친화성 분자-표적 분자 복합체를 갖지 않는 마이크로스피어들로부터 분리하는 단계;
    (c) 그 표면에 친화성 분자-표적 분자 복합체를 갖는, 분리된 마이크로스피어들을 처리하여 마이크로스피어를 해체하여 시그널 전구체 분자들을 방출시키는 단계;
    (d) 상기 방출된 시그널 전구체 분자들을, 상기 시그널 전구체 분자들에 대해 친화성을 갖는 또 다른 친화성 분자들로 관능화된 또 다른 마이크로스피어로 처리하는 단계로서, 여기서 상기 마이크로스피어는 또 다른 시그널 전구체 분자들과 결합된 캐리어 단백질을 포함하는 것인 단계;
    (e) 그 표면에 또 다른 친화성 분자-시그널 전구체 분자 복합체가 있는 마이크로스피어들을 또 다른 친화성 분자-시그널 전구체 분자 복합체가 없는 마이크로스피어들로부터 분리하는 단계;
    (f) 그 표면에 또 다른 친화성 분자-시그널 전구체 분자 복합체가 있는, 방출된 마이크로스피어들을 발달 시약으로 처리하여 또 다른 시그널 전구체 분자들을 활성화시켜 시그널을 생성하는 단계, 및
    (g) 시그널을 검출 또는 정량하는 단계
    를 포함하여 이루어지는 것인, 시그널 증폭 방법.
  64. 제63항에 있어서, 단계 (f) 및 (g)를 수행하기에 앞서서, 단계 (c) 내지 단계 (e)를 1 내지 n회 반복(여기서 n은 양의 정수임) 하는 것을 추가로 포함하고, 여기서 적어도 최종 반복 사이클 중의 상기 시그널 전구체 분자는 검출가능한 시그널을 생성하도록 활성화될 수 있는 것인 방법.
  65. 제61항 내지 제64항 중 어느 하나의 항에 있어서, 마이크로스피어의 해체는 화학적, 물리적 또는 열적 수단에 의해 수행되는 것인 방법.
  66. 제65항에 있어서, 마이크로스피어의 해체는 마이크로스피어 내의 분자간 결합들을 절단하는 방출 시약을 이용하는 화학적 수단에 의해 수행되는 것인 방법.
  67. 제66항에 있어서, 방출 시약은 마이크로스피어 중의 단백질 분자들 간의 분자간 황-황 결합을 절단하는 것인 방법.
  68. 제66항 또는 제67항에 있어서, 방출 시약은 소형 분자 환원제인 것인 방법.
  69. 제68항에 있어서, 방출 시약은 디티로쓰레이톨(DTT)인 것인 방법.
  70. 제65항에 있어서, 마이크로스피어의 해체는 초음파처리, 가열, 광조사 또는 pH 변화에 의해 수행되는 것인 방법.
  71. 제61항 내지 제70항 중 어느 하나의 항에 있어서, 적어도 상기 제1 마이크로스피어는 제3항 또는 제3항을 인용하는 경우의 제4항 내지 제24항 중 어느 하나의 항에 정의된 것과 같은 것인 방법.
  72. 제61항 내지 제70항 중 어느 하나의 항에 있어서, 적어도 1회의 증폭 사이클은 시그널 생성 유기 물질의 고체 입자들이 캡슐화되어 있고, 표적 분자들을 특이적으로 인식하여 표적 분자에 결합하기 위한 친화성 분자를 표면에 담지하고 있는 캡슐을 사용하는 것인 방법.
  73. 제62항 및 제64항 내지 제71항 중 어느 하나의 항에 있어서, 적어도 최종적인 마이크로스피어에 있어서, 캐리어 단백질은 소의 혈청 알부민(BSA)이고 시그널 전구체 분자는 플루오레신 디아세테이트(FDA)인 것인 방법.
  74. 제73항에 있어서, 발달 시약은 염기 또는 에스테라제인 것인 방법.
  75. 샘플 중의 표적 분자를 검출하기 위한 키트로서, 상기 키트는 제1항 또는 제1항을 인용하는 경우의 제4항 내지 제13항 중 어느 하나의 항에 기재된 마이크로스피어를 포함하고, 여기서 상기 시그널 전구체 분자는 검출가능한 시그널을 생성하도록 활성화될 수 있는 것이며, 상기 마이크로스피어는 그 표면에 표적 분자를 특이적으로 인식하여 표적 분자에 결합하기 위한 친화성 분자들을 담지하는 것인 키트.
  76. 제75항에 있어서, 친화성 분자들을 마이크로스피어의 표면에 결합할 수 있도록 친화성 분자들을 변형시키기 위한 시약 및 마이크로스피어와 친화성 분자들 사이에서 결합 반응을 수행하기 위한 시약을 추가로 포함하는 것인 키트.
  77. 제75항 또는 제76항에 있어서, 막, 마이크로타이터 플레이트, 비드, 튜브 및 슬라이드로 이루어진 군으로부터 선택된 고체 기질을 포함하는 것인 키트.
  78. 제75항 내지 제77항 중 어느 하나의 항에 있어서, 시그널 전구체 분자는 형광 염료, 가시 염료, 생물발광성 또는 화학발광성 물질, 자성 물질 또는 효소를 포함하는 것인 키트.
  79. 연구 조사 분야; 인간을 대상으로 하거나 수의학 분야의 진단 분야, 법의학적 진단; 환경 분석; 식품 분석; 및 표적 물질에 대한 바이오디펜스 스크리닝에 있어서, 샘플 중 1 이상의 표적 분자를 검출 및/또는 존재여부를 판정하기 위한 분석 공정에 있어서의 제1항 내지 제24항 중 어느 하나의 항에 기재된 마이크로스피어의 용도.
  80. 이종(heterogeneous) 및 고체상 막 분석법에 있어서의 제1항 내지 제24항 중 어느 하나의 항에 기재된 마이크로스피어의 용도.
  81. 면역조직화학에 있어서의 제1항 내지 제24항 중 어느 하나의 항에 기재된 마이크로스피어의 용도.
  82. 특이적인 단백질 밴드, DNA 및 RNA-서열의 존재 여부를 가시화하기 위한 도트 기술 및 웨스턴-, 노던-, 및 서던-블라팅에 있어서의 제1항 내지 제24항 중 어느 하나의 항에 기재된 마이크로스피어의 용도.
  83. 분석 감도를 증폭시키기 위한 제1항 내지 제24항 중 어느 하나의 항에 기재된 마이크로스피어의 순차적 용도.
  84. 제1항에 있어서, 첨부된 도 3에 실질적으로 기재된 바와 같은 것인 마이크로스피어.
  85. 제39항에 있어서, 실질적으로 실시예 1에 설명된 바와 같은 것인 마이크로스피어의 제조 방법.
  86. 제57항에 있어서, 첨부된 도 4 또는 도 5에 실질적으로 기재된 바와 같은 것인, 샘플 중 1 이상의 표적 분자를 검출하기 위한 방법.
  87. 제61항 또는 제63항에 있어서, 첨부된 도 6에 실질적으로 기재된 바와 같은 것인, 샘플 중 1 이상의 표적 분자를 검출하기 위한 시그널 증폭 방법.
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