CN103769018B - 改性凝集素包裹的磁性大分子脂质体微球、制备方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种改性凝集素包裹的磁性大分子脂质体纳米微球、制备方法及应用。所述凝集素包裹的磁性大分子脂质体纳米微球是由改性凝集素与脂质形成脂质膜后，共同包裹磁性纳米颗粒组成具有双层膜结构的大分子脂质体。与传统的在磁性纳米微球表面接枝改性不同，本发明提供的磁性脂质体直接使用活性物质凝集素的衍生物扁豆凝集素‑十六烷基季铵盐包裹磁性纳米颗粒，该方法可对磁球表面凝集素含量进行控制，提高凝集素等活性物质的含量。所述的凝集素包裹的磁性大分子脂质体可应用于磁共振成像（MRI）、磁性标记、磁性快速诊断、可控药物释放、基因载体、磁高温疗法、免疫磁性微球等领域。
Description
技术领域
本发明涉及改性的功能化磁性纳米微球及相关临床检测及应用，进一步的说是一种改性凝集素包裹的磁性大分子脂质体微球、制备方法及应用，属于功能化磁球及脂质体的制备及应用技术。
背景技术
磁性纳米粒子(MNP)是一类智能型的纳米磁性材料，既具有纳米材料所特有的性质如粒径小，比表面极大，偶连容量高，又具有磁响应性及超顺磁性，可以在恒定磁场下聚集和定位、在交变磁场下吸收电磁波产热。磁性聚合物微球兼具磁性纳米材料和聚合物的特征，己经成为当前纳米材料的研究热点之一。因磁性高分子微球同时兼具高分子微球的众多特性和磁响应性，因此不但能通过共聚及表面改性等方法赋予其表面功能基团，还能在外加磁场作用下方便、迅速地与介质分离。
磁性微球在生物医学上的应用主要包括：(a)磁共振成像(MRI)：在疾病诊断领域的一个众所周知应用是使用MNP来作为造影剂用于磁共振成像MRI，该方式可以更好的区分健康的和病态的组织，并且可以看到人体内各种不同的生物学上的变异。氧化铁磁性纳米颗粒MNP由于具有低毒性已获得美国食品与药品管理局批准，被用于磁共振成像MRI信号的增强。(b)磁性标记：另一种在诊断上的应用是对细胞、DNA和蛋白质等各种生物体来进行磁标记。比如用来标记干细胞以对人体内移植干细胞的分布及其变化情况进行无创伤的监测。(c)可控药物释放:磁性颗粒除了小尺寸和对人体的低毒性之外，所具备的另一个优势是可以在外磁场梯度的作用下运动，从而可渗透进人体组织的深处。(d)磁高温疗法：是基于磁性颗粒能在随时间变化的磁场中被加热的性质。它的这种特性可用来“烧掉”癌细胞(高温疗法)，它通常与化疗配合使用。(e)细胞隔离：外磁场与MNP间的吸引作用可用来分离很多种类的生物体。(f)免疫磁性微球：免疫磁性微球或叫做免疫磁性微珠简称免疫磁珠，是免疫微球的一种，是指连有抗体或抗原的磁性微球，它通过表面的抗体或抗原特异地与靶物质结合，从而赋予其磁响应性，在特定磁场的作用下，通过免疫磁性微球可以发生定向移动，从而实现其免疫学检测，分离纯化，药物导向等方面目的。理想的免疫磁性微球应具有灵敏性高，特异性强，重复性好以及分离检测速度快等优点。
采用高聚物包裹磁性纳米颗粒并与凝集素或亲和素结合制备凝集素修饰的纳米磁球，然后通过生物素-链亲和素系统与抗体和抗原结合，制备不同种类的免疫磁球，可利用磁性材料的快速分离特性，达到方便快捷的操作。有关凝集素或亲和素修饰的磁球，虽然国内外已有产品上市(如Invitrogen Dynal公司，陕西北美基因股份有限公司等)，但仍然存在稳定性不足、功能单一等问题，如：凝集素等活性物质在磁球表面的接枝效率较低，较难保持抗体等的活性，较难满足具有高表面抗体含量磁珠的要求。为解决这一问题，本专利将结合高分子、脂质体、磁分离和生物检测等多项技术，开发一种高稳定性、高活性的凝集素磁球。常津，梁晓飞等人报道的壳聚糖长链烷基季铵盐及阳离子高分子脂质体为本发明提供了相关研究基础(一类双亲性壳聚糖长链烷基季铵盐及其制备方法，申请号：200710056993.4；一种高分子脂质体及其应用，专利申请号：200810052465；梁晓飞等，载药磁性阳离子高聚物脂质体的制备及表征，高等化学学报，第29卷第4期，858-861)，但本专利与以上专利的主要不同在于直接使用活性物质凝集素或亲和素的衍生物来直接包裹磁性纳米颗粒而达到磁球表面的高凝集素含量，专利的侧重点在于活性物质凝集素对磁球的改性方法为包裹，而不是普通的利用磁球表面所含氨基或羧基的偶联或接枝，凝集素对磁球的修饰过程不使用偶联剂；而以上文章“载药磁性阳离子高聚物脂质体的制备及表征”和专利“一种高分子脂质体及其应用”中，若进一步制备凝集素修饰的磁性纳米颗粒，则必须利用高分子脂质体表面所含的氨基或羧基，在偶联剂的作用下与凝集素再结合。
发明内容
本发明目的是提供一种改性凝集素包裹的磁性大分子脂质体微球，主要为构建一种制备简单、成本低廉高效的功能化纳米磁球系统。
本发明的目的还是提供一种上述凝集素包裹的磁性大分子脂质体微球的制备方法。
本发明另一目的是提供上述凝集素包裹的磁性大分子脂质体微球的应用。
本发明采用具有双亲性特性的凝集素大分子物质来代替普通脂质体中的磷脂成分，再与普通脂质体的脂质成分胆固醇和磁性纳米颗粒组合来制备凝集素包裹的磁性大分子脂质体微球，该凝集素包裹的磁性大分子脂质体微球具有与普通脂质体相类似的双层膜结构，可应用于磁性诊断、免疫分析、并可包载药物、结合基因，介导DNA/siRNA转染，可转染的细胞种类多，转染效率高，肿瘤靶向性强，制备和分离方便。
本发明所述的凝集素包裹的磁性大分子脂质体微球，其关键特征在于使用具有生物活性特征的凝集素大分子双亲性物质来代替普通脂质体中所含有的磷脂成分，因此可以称之为功能化磁性大分子脂质体。磁性大分子脂质体是将脂质体技术、凝集素及凝集素反应技术和纳米胶束技术相结合所开发的一种与普通脂质体结构相同的功能化脂质体系统，具有更优良的特性。本发明的凝集素包裹的磁性大分子脂质体微球不仅具备小分子脂质体的优点，且制备方法简单，稳定性好，药物渗漏少，同时含有凝集素或亲和素等活性物质，易进行多功能化组装。
改性凝集素包裹的磁性大分子脂质体微球，其特征在于，粒径为1～100000nm的所述改性凝集素包裹的磁性大分子脂质体微球具有如下结构：改性凝集素与脂质成分共同构成具有双层膜结构的脂质体，磁性纳米颗粒被包裹在所述脂质体的双层膜中间；所述改性凝集素、磁性纳米颗粒和脂质成分的质量百分比为0.01～50％：0.05～50％：0.01～50％；所述改性凝集素中凝集素与改性物的质量比为0.01～2：1；所述改性凝集素包裹的磁性大分子脂质体微球具有超顺磁性且其饱和磁化强度为2.0～200.0emu/g；
所述改性凝集素是改性剂与凝集素反应后的产物；所述改性剂是十二烷基三甲基溴化铵、十四烷基三甲基溴化铵、十六烷基三甲基溴化铵、二甲基双十八烷基溴化铵、1，2-二油酰-3-二甲基-羟乙基溴化铵；或者是二甲基十八烷基环氧丙基氯化铵、二甲基十六烷基环氧丙基氯化铵、二甲基十四烷基环氧丙基氯化铵、二甲基十二烷基环氧丙基氯化铵或它们相应的溴化物；
所述凝集素选自扁豆凝集素、大豆凝集素、花生凝集素、刀豆素A、麦胚素、蓖麻凝集素、豌豆凝集素、菜豆凝集素、荆豆凝集素、双花扁豆凝集素、槐凝集素、链霉亲和素、生物素、牛血清白蛋白、Protein A、Protein G中的一种或几种；所述磁性纳米颗粒是Fe3O4磁性纳米颗粒、钇铁氧体磁流体、钴纳米粒子、镍纳米粒子、金纳米粒子或银纳米粒子。
所述改性凝集素在极性有机溶剂或水中的溶解度范围为0.1mg/mL～20.0mg/mL，分子量为2～100KDa，改性凝集素中凝集素的质量含量为所述改性凝聚素包裹的磁性大分子脂质体微球的0.5％～30％。
所述脂质成分选自胆固醇、二油酰脂酰乙醇胺、3β-[N-(N’，N’-二甲基胺乙基)胺基甲酰基]胆固醇、卵磷脂、二硬脂酰磷脂酰胆碱、棕榈酰油酰磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰乙醇胺、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺或棕榈酰油酰磷脂酰乙醇胺中的一种或几种。
上述改性凝集素包裹的磁性大分子脂质体微球的制备方法，包括如下步骤：
1)磁性纳米颗粒的制备：配置质量浓度为1.0～20.0％的含铁溶液，在通氮气条件下机械搅拌，待混匀后，加入质量浓度为25.0％的氨水，氨水体积为反应体系中水相体积百分比为1.0％～10.0％：100.0％，然后加入占整个反应体系总质量浓度为1.0％～10.0％的油酸，室温下继续搅拌反应3～10小时后停止反应，磁分离后得到所述磁性纳米颗粒；
2)改性凝集素的制备：将凝集素溶解到去离子水和醇的混合溶液中，再将改性物缓慢地加入到反应体系中，其中去离子水和醇的质量比为1：0～3；体系中凝集素和改性物的质量比为1：0.01～100；在室温下搅拌24小时后将反应液透析1～500小时，最后冻干，得改性凝集素的白色粉末；所述醇为甲醇、乙醇、或异丙醇；
3)步骤2)得到的改性凝集素与磁性纳米颗粒和脂质进行组装得到所述凝集素包裹的磁性大分子脂质体微球，组装的方法为薄膜分散法、逆向蒸发法、复乳法、离心法、pH梯度法、注入法或混溶法，其中薄膜分散法或逆向蒸发法具体如下：薄膜分散法的基本步骤为：
将步骤1)得到的磁性纳米颗粒和步骤2)得到的改性凝集素和脂质体共溶于极性有机溶剂中，所述改性凝集素、磁性纳米颗粒和脂质体的质量百分组成比为0.01％～50％：0.05％～50％：0.01％～50％；所述的极性有机溶剂是二氯甲烷、氯仿或丙酮；混匀后作为有机相，再除去所述极性有机溶剂使成薄膜，然后加入水相使所述薄膜水化，所述水相为0.9％的生理盐水或pH＝5～9的磷酸盐缓冲溶液；
逆向蒸发法的基本步骤为：
将步骤1)得到的磁性纳米颗粒和步骤2)得到的改性凝集素和脂质体共溶于极性有机溶剂中，所述改性凝集素、磁性纳米颗粒和脂质体的质量百分组成比为0.01％～50％：0.05％～50％：0.01％～50％；所述极性有机溶剂指二氯甲烷、氯仿或丙酮；混匀后作为有机相，水相为0.9％的生理盐水或pH＝6～9的磷酸盐缓冲溶液；将所述水相与有机相混合，超声乳化后，旋转蒸发除去有机溶剂；其中，水相和有机相的体积比为1：6～6：1。
所述改性凝集素是改性剂与凝集素反应后的产物；所述改性剂是十二烷基三甲基溴化铵、十四烷基三甲基溴化铵、十六烷基三甲基溴化铵、二甲基双十八烷基溴化铵、1，2-二油酰-3-二甲基-羟乙基溴化铵、1，2-二油酰氧丙基-3-二甲基-羟乙基溴化铵、1，2-二油酰氧丙基-3-二甲基-羟丙基溴化铵、1，2-二油酰氧丙基-3-二甲基-羟丁基溴化铵、1，2-二油酰氧丙基-3-二甲基-羟戊基溴化铵、1，2-二棕榈酰氧丙基-3-二甲基-羟乙基溴化铵、1，2-二硬脂酰氧丙基-3-二甲基-羟乙基溴化铵、1，2-二肉豆蔻酰氧丙基-3-二甲基-羟乙基溴化铵或者是它们相应的氯化物；或者是二甲基十八烷基环氧丙基氯化铵、二甲基十六烷基环氧丙基氯化铵、二甲基十四烷基环氧丙基氯化铵、二甲基十二烷基环氧丙基氯化铵或它们相应的溴化物；
所述凝集素选自扁豆凝集素、大豆凝集素、花生凝集素、刀豆素A、麦胚素、蓖麻凝集素、豌豆凝集素、菜豆凝集素、荆豆凝集素、双花扁豆凝集素、槐凝集素、链霉亲和素、生物素、牛血清白蛋白、Protein A、Protein G中的一种或几种；所述脂质成分选自胆固醇、二油酰脂酰乙醇胺、3β-[N-(N’，N’-二甲基胺乙基)胺基甲酰基]胆固醇、卵磷脂、二硬脂酰磷脂酰胆碱、棕榈酰油酰磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰乙醇胺、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺或棕榈酰油酰磷脂酰乙醇胺中的一种或几种。
步骤1)所述的磁性纳米颗粒的粒径为1.0nm～500.0nm，具有超顺磁性，饱和磁化强度为2.0～200.0emu/g。
所述磁性纳米颗粒是Fe3O4磁性纳米颗粒、钇铁氧体磁流体、钴纳米粒子、镍纳米粒子、金纳米粒子或银纳米粒子。
所述含铁溶液是FeSO4·7H2O和FeCl3的共混物溶液，其中FeSO4·7H2O和FeCl3的质量比为1～2：1。
上述的改性凝集素包裹的磁性大分子脂质体微球的应用，作为凝集素-抗体反应系统，应用于磁共振成像、磁性标记、磁性快速诊断、可控药物释放、基因载体、磁高温疗法或免疫磁性微球领域。
其中用于制备基因药物时，所述的基因药物可为有机药物、水溶性药物、水不溶性药物、基因DNA/siRNA、探针和诊断试剂，如抑癌基因(如乙酰胆碱酯酶基因)、RB基因和p53基因、紫杉醇、消炎痛、抗叶酸类(如甲氨蝶呤)、抗嘌呤类(如巯嘌呤)、抗嘧啶类(如氟尿嘧啶、替加氟)、核苷酸还原酶抑制药(如羟基脲)、脱氧核糖核苷酸多聚酶抑制药(如环胞苷)等。
本发明所述的凝集素包裹的磁性大分子脂质体微球与目前存在的凝集素磁球相比，具有以下特点：
(1)凝集素对磁性纳米颗粒的修饰是通过活性物质凝集素的直接修饰而实现，凝集素在磁性纳米微球中的存在状态为对磁性纳米微球的包裹，磁球内外均有凝集素的存在；而不是一般的接枝改性后凝集素存在于磁球的表面；
(2)凝集素是指一种从各种植物、无脊椎动物和高等动物中提纯的糖蛋白或结合糖的蛋白，其具有一定的生物活性，与亲和素及抗体类似，凝集素容易失去活性而失去其存在的价值。因此以前的凝集素磁球的制备方法多为表面改性，而非包裹；再者，凝集素的使用不同于以前报道的壳聚糖高分子脂质体中的壳聚糖，壳聚糖可在酸性、碱性、高温高压条件下使用，且存在很多衍生物而不会减弱其具有的特性；
(3)本发明更注重于凝集素包裹的磁性大分子脂质体微球的应用，其应用范围广泛，包括肝癌诊断(实施例6)、基因药物的递送(实施例7、8)等；而这些应用都与其特殊的包裹方法相关，这种包裹方法的最主要优点为可大幅度提高磁球表面的凝集素含量而不降低凝集素的活性，并对凝集素含量根据需要进行控制。
附图说明
图1是扁豆凝集素-十六烷基季铵盐的红外光谱图；
图2是改性凝集素包裹的磁性大分子脂质体微球的结构示意图；
图3是使用薄膜蒸发法所制备的扁豆凝集素包裹的磁性大分子脂质体微球的原子力显微镜照片；
图4是扁豆凝集素包裹的磁性大分子脂质体的粒径分布图和表面电位图谱；
图5是Fe3O4磁性纳米颗粒和扁豆凝集素包裹的磁性大分子脂质体的磁回滞曲线；
图6是扁豆凝集素包裹的磁性大分子脂质体进行肝癌检测时对甲胎蛋白变异体L3(AFP-L3)的测试结果。
具体实施方式
下面的实施例中将对本发明作进一步的阐述，但本发明不限于此。
实施例中，英文符号的含义如下：DOPE：二油酰脂酰乙醇胺；DC-Chol：3β-[N-(N’，N’-二甲基胺乙基)胺基甲酰基]胆固醇。
实施例1扁豆凝集素-十六烷基三甲基氯化铵的制备
将扁豆凝集素(LCA)10mg溶解到去离子水和异丙醇的混合溶液10ml(水和异丙醇的体积比为1：1)中；再将二甲基十六烷基环氧丙基氯化铵100mg缓慢的加入到该体系中；用NaOH调节pH值在7.0～12.0之间，室温下搅拌24小时后将反应液用去离子水透析3天，冻干，得扁豆凝集素-十六烷基季铵盐(LCA-HQ)的白色粉末12.0mg。由图1可见扁豆凝集素和十六烷基季铵盐的特征吸收峰均存在，说明扁豆凝集素-十六烷基季铵盐的成功制备。
其中二甲基十六烷基环氧丙基氯化铵可用其他长链烷基季铵盐代替，其它的长链烷基季铵盐成分包括二甲基十八烷基环氧丙基氯化铵、二甲基二十二烷基环氧丙基氯化铵、二甲基十四烷基环氧丙基氯化铵、二甲基十二烷基环氧丙基氯化铵。
实施例2采用逆向蒸发法时扁豆凝集素-十六烷基季铵盐(LCA-HQ)和胆固醇的不同配比对扁豆凝集素大分子脂质体粒径产生的影响将不同配比的LCA-HQ和胆固醇共溶于二氯甲烷中，混匀得溶液Ⅰ；准备去离子水溶液Ⅱ，其中溶液Ⅰ和溶液Ⅱ的比例为1：2；将两种溶液混合后，充分超声乳化，在旋转蒸发仪上减压蒸馏除尽二氯甲烷得扁豆凝集素大分子脂质体溶液。由表1可见，调整LCA-HQ和胆固醇的质量配比可以得到不同粒径大小的扁豆凝集素大分子脂质体，所得的扁豆凝集素大分子脂质体在水溶液中的粒径大小分布也都比较均匀。
表1
| 脂质体组成(W/W) | 平均粒径(nm) | 多分散指数(μ/Γ2) |
| LCA-HQ/胆固醇(1∶0) | 356.4 | 0.243 |
| LCA-HQ/胆固醇(1∶0.3) | 139.0 | 0.218 |
| LCA-HQ/胆固醇(1∶0.8) | 88.5 | 0.252 |
| LCA-HQ/胆固醇(1∶2.0) | 644.6 | 0.381 |
表格中W/W表示质量比。
实施例3扁豆凝集素包裹的磁性大分子脂质体的制备
(1)Fe3O4磁性纳米颗粒的制备
配置质量浓度为1.0％～20.0％的FeSO4·7H2O和FeCl3的共混物，其中FeSO4·7H2O和FeCl3的质量比为1～2∶1，在通N2气条件下机械搅拌，待混匀后，加入质量浓度为25.0％的氨水，氨水体积为反应体系水相体积百分比为1.0％～10.0％∶100.0％，然后加入占整个反应体系总质量浓度为1.0％～10.0％油酸，室温继续搅拌反应3～10小时后停止反应，磁分离后得Fe3O4磁性纳米颗粒。所制备的Fe3O4磁性纳米颗粒的粒径为15.0nm，具有超顺磁性，饱和磁化强度为30.0emu/g；其中Fe3O4磁性纳米颗粒可用其它钇铁氧体磁流体、钴纳米粒子、镍纳米粒子、金纳米粒子、银纳米粒子代替。
(2)扁豆凝集素-十六烷基三甲基氯化铵与脂质成分进行组装；组装的方法为薄膜分散法或逆向蒸发法，其中薄膜分散法的基本步骤为：
称取扁豆凝集素-十六烷基季铵盐(LCA-HQ)(季铵盐取代度为90.0％)15.0mg、步骤(1)中的Fe3O4磁性纳米颗粒5mg和胆固醇12.0mg共溶于3.0ml二氯甲烷中，振荡均匀得溶液I，放入茄形瓶中，在旋转蒸发仪上减压蒸馏，并不时的通入氮气，直至二氯甲烷挥发完全，然后室温下用5.0mL PBS(pH＝7.4)缓冲溶液II超声水化10min(薄膜法)；得扁豆凝集素包裹的磁性大分子脂质体溶液。该扁豆凝集素包裹的磁性大分子脂质体的水溶液中粒径为243.9nm，多分散指数为0.170，磁性脂质体分布均匀；其表面电位为34.1mV±5.83mV，见图4。Fe3O4磁性纳米颗粒的最大饱和磁化强度为61emu/g，扁豆凝集素包裹的磁性大分子脂质体的最大饱和磁化强度为28emu/g，见图5，由图5可见Fe3O4磁性纳米颗粒和扁豆凝集素包裹的磁性大分子脂质体均具有较好的超顺磁性。图2是凝集素包裹的磁性大分子脂质体微球的结构示意图。图3为使用薄膜蒸发法所制备的扁豆凝集素包裹的磁性大分子脂质体微球的原子力显微镜照片。
类似的可用其他脂质成分代替胆固醇制备扁豆凝集素包裹的磁性大分子脂质体，其他的脂质成分包括DOPE、3β-[N-(N’，N’-二甲基胺乙基)胺基甲酰基]胆固醇(DC-Chol)、卵磷脂、二硬脂酰磷脂酰胆碱、棕榈酰油酰磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰油酰磷脂酰乙醇胺、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺或棕榈酰油酰磷脂酰乙醇胺中的一种或2～3种。
实施例4其它长链烷基季铵盐制备扁豆凝集素包裹的磁性大分子脂质体称取扁豆凝集素-十四烷基三甲基溴化铵(LCA-TQ)(季铵盐取代度为90.0％)15.0mg、Fe3O4磁性纳米颗粒5mg和胆固醇12.0mg共溶于3.0ml二氯甲烷中，振荡均匀得溶液Ⅰ，放入茄形瓶中，在旋转蒸发仪上减压蒸馏，并不时的通入氮气，直至二氯甲烷挥发完全，然后室温下用5.0mL PBS(pH＝7.4)缓冲溶液Ⅱ超声水化10min(薄膜法)；得扁豆凝集素-十四烷基三甲基溴化铵包裹的磁性大分子脂质体溶液。该扁豆凝集素包裹的磁性大分子脂质体的水溶液中粒径为143.9nm，多分散指数为0.270，磁性脂质体分布均匀；其表面电位为24.1mV±5.83mV。
类似的可用其他长链烷基季铵盐代替十四烷基三甲基溴化铵制备大分子转铁蛋白脂质体，其它的长链烷基季铵盐成分包括十二烷基三甲基溴化铵、十六烷基三甲基溴化铵、二甲基双十八烷基溴化铵、1，2-二油酰-3-二甲基-羟乙基溴化铵、1，2-二油酰氧丙基-3-二甲基-羟乙基溴化铵、1，2-二油酰氧丙基-3-二甲基-羟丙基溴化铵、1，2-二油酰氧丙基-3-二甲基-羟丁基溴化铵、1，2-二油酰氧丙基-3-二甲基-羟戊基溴化铵、1，2-二棕榈酰氧丙基-3-二甲基-羟乙基溴化铵、1，2-二硬脂酰氧丙基-3-二甲基-羟乙基溴化铵、1，2-二肉豆蔻酰氧丙基-3-二甲基-羟乙基溴化铵及其上述季铵盐相应的氯化物。
实施例5
本实施例主要提供使用其它种类凝集素或链霉亲和素制备凝集素包裹的磁性大分子脂质体的实例。
称取花生凝集素-十四烷基三甲基溴化铵(LCA-TQ)(季铵盐取代度为70.0％)15.0mg、Fe3O4磁性纳米颗粒5mg和胆固醇6.0mg共溶于3.0ml二氯甲烷中，振荡均匀得溶液Ⅰ，放入茄形瓶中，在旋转蒸发仪上减压蒸馏，并不时的通入氮气，直至二氯甲烷挥发完全，然后室温下用5.0mL PBS(pH＝7.4)缓冲溶液Ⅱ超声水化10min(薄膜法)；得花生凝集素-十四烷基三甲基溴化铵包裹的磁性大分子脂质体溶液。该花生凝集素包裹的磁性大分子脂质体的水溶液中粒径为313.2nm，多分散指数为0.180，磁性脂质体分布均匀；其表面电位为29.1mV±3.83mV。
类似的可用其他大豆凝集素、刀豆素A、麦胚素、蓖麻凝集素、豌豆凝集素、菜豆凝集素、荆豆凝集素、双花扁豆凝集素、槐凝集素、链霉亲和素代替。
实施例6
本实施例主要提供扁豆凝集素包裹的磁性大分子脂质体在肝癌诊断方面应用的实例。
使用方法：
(1)取0.5ml～1.0ml的扁豆凝集素包裹的磁性大分子脂质体溶液，其中磁球的固含量为5.0％～10.0％，磁分离1～2分钟后，弃上清液；加入0.5ml～1.0ml结合缓冲液(25mM Tris-Hcl、25mM NaCl,、2mM MnCl、2mM CaCl2，pH7.1～pH7.9)平衡反应系统，磁分离2～5分钟后，弃上清液；
(2)加入0.5ml结合缓冲液，得混合液A。将病人血清0.05ml～1.0ml加入到混合液A中，混合均匀，静置10分钟；磁分离，弃上清；
(3)加入0.5ml～1.0ml清洗缓冲液(50mM Tris-Hcl、2mM MnCl2、2mM CaCl2，pH7.1～pH7.9)，清洗5～6次，加入0.25ml～0.5ml洗脱缓冲液液(0.25MEthyl-a-mannopyranoside、25mM Tris-Hcl、50mMf NaCl，pH6.5～pH7.0)，混匀，室温静置5分钟。磁分离，收集上清，该上清为甲胎蛋白变异体L3(AFP-L3)分离液；
(4)金标试纸条进行定性或半定量的检测AFP-L3分离液中AFP-L3含量(或用化学发光法定量检测)；金标试纸条检测结果可见图6，由图6可见使用金标试纸条测试时，扁豆凝集素包裹的磁性大分子脂质体可以检测到AFP-L3的阳性结果。
其中部分检测结果分析如下：
磁性微球法分离AFP-L3(70例)，其中：20例：AFP 50ng-200ng；18例：AFP-L3<10％；2例：AFP-L3≥10％；20例：200ng<AFP<400ng；15例：AFP-L3<10％；5例：AFP-L3≥10％；30例：AFP>400ng；6例：AFP-L3<10％；19例：AFP-L3≥10％<25％；5例：AFP-L3≥25％。
注：这里AFP阳性是指AFP浓度均超过50ng/ml以上；AFP阳性的病人当中，通过扁豆凝集素包裹的磁性大分子脂质体可测定AFP-L3在AFP中所占的比例，其中AFP-L3＜5％为肝癌阴性；5％＜AFP-L3＜10％为可疑，需进一步观察；AFP-L3≥10％为阳性，可高度怀疑肝细胞癌HCC的存在、转移或复发的可能。
实施例7
本实施例主要提供凝集素包裹的磁性大分子脂质体包载抗肿瘤药物进行药物缓控释方面的应用。
称取LCA-HQ(季铵盐取代度为80.0％)15.0mg、Fe3O4磁性纳米颗粒5mg和胆固醇6.0mg共溶于3.0ml二氯甲烷中，振荡均匀得溶液Ⅰ，然后放入茄形瓶中，在旋转蒸发仪上减压蒸馏，并不时的通入氮气，直至二氯甲烷挥发完全，然后室温真空干燥24hour；称取3.0mg长春新碱溶于5ml磷酸盐PBS(pH＝7.4)缓冲溶液中，摇匀使长春新碱充分溶解得水溶液Ⅱ；然后将上述5.0ml长春新碱溶液Ⅱ加入茄形瓶中，在超声的条件让脂质薄膜充分水化，超声10min后，磁分离2～3次得载长春新碱的凝集素包裹的磁性大分子脂质体(LCA-HQ/胆固醇)。使用此方法制备的长春新碱蛋白脂质体的包封率可达90.0％以上，且在Tris-HCl(pH＝7.4)缓冲溶液中具有良好的缓控释功能；扁豆凝集素包裹的载药磁性大分子脂质体的水溶液中粒径为143.9nm，多分散指数为0.310；其表面电位为24.1mV±5.83mV；产品可应用于肿瘤的磁热疗和化疗。
用类似方法也可分别制得包载其它水溶性或脂溶性抗肿瘤药物，只须将需要的水溶性物质溶于相应的水溶液Ⅱ，脂溶性药物溶于相应的二氯甲烷Ⅰ既可。
实施例8
本实施例为制备载基因凝集素包裹的磁性大分子脂质体的探讨，并提供其作为基因载体的应用。
配置质量浓度为1mg/mL的扁豆凝集素包裹的磁性大分子脂质体(LCA-HQ/胆固醇)溶液备用，其中LCA-HQ中季铵盐取代度为70.0％；配置质量浓度为1.0g/L的绿色荧光蛋白(pEGFP)质粒的溶液备用；在室温下，将二者按质量比为8：1进行混合，孵育20～30min后得到荷载基因的LCA-HQ/胆固醇磁性大分子脂质体溶液。该荷载基因的LCA-HQ/胆固醇磁性大分子脂质体可用于基因的靶向递送及疾病的基因治疗。
然后可进行基因转染实验，具体过程如下：
(1)转染前24h，将生长状态良好的肝癌SMMC-7721细胞常规消化后种板，无抗生素全培养基培养过夜，在转染时细胞融合度应达到80％；(2)播种细胞24h之后，移除培养孔中的全培养基，洗后，每孔加入无血清的培养基使细胞处于饥饿状态；(3)将与DNA孵育后的LCA-HQ/胆固醇磁性大分子脂质体及阳性对照加入细胞培养版中，前后晃动培养板使其充分混匀；(4)将细胞培养版置于37℃细胞培养箱中培养24～48h；在此过程中可根据不同的纳米粒样品采取不同的处理方法，如阳离子磁性LCA-HQ/胆固醇大分子脂质体则可在培养板下使用磁场；(5)24h之后取出培养板置于荧光显微镜下进行观察拍照，并将转染后的细胞常规消化并清洗后，用流式细胞仪进行定量分析或用化学发光仪进行定量。
实施例9
本实施例提供扁豆凝集素包裹的磁性大分子脂质体应用于磁共振成像(MRI)、磁性标记、磁性快速诊断、磁高温疗法、免疫磁性微球等领域的实例。
使用包载磁共振成像造影剂的扁豆凝集素包裹的磁性大分子脂质体(LCA-HQ/DOPE)根据剂量通过静脉注射后可应用于MRI造影，并对疾病进行临床诊断和分析。
本发明公开和揭示的一种凝集素包裹的磁性大分子脂质体微球、制备方法及应用，可通过借鉴本文公开内容。尽管本发明的一种凝集素包裹的磁性大分子脂质体微球、制备方法及应用已通过较佳实施例进行了描述，但是本领域技术人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法改动，更具体地说，所有相类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，他们都被视为包括在本发明精神、范围和内容中。
Claims (8)
1.改性凝集素包裹的磁性大分子脂质体微球，其特征在于，粒径为1～100000nm的所述改性凝集素包裹的磁性大分子脂质体微球具有如下结构：改性凝集素与脂质成分共同构成具有双层膜结构的脂质体，磁性纳米颗粒被包裹在所述脂质体的双层膜中间；所述改性凝集素、磁性纳米颗粒和脂质成分的质量百分比为0.01～50％：0.05～50％：0.01～50％；所述改性凝集素中凝集素与改性物的质量比为0.01～2：1；所述改性凝集素包裹的磁性大分子脂质体微球具有超顺磁性且其饱和磁化强度为2.0～200.0emu/g；
所述改性凝集素是改性剂与凝集素反应后的产物；所述改性剂是十二烷基三甲基溴化铵、十四烷基三甲基溴化铵、十六烷基三甲基溴化铵、二甲基双十八烷基溴化铵、1，2-二油酰-3-二甲基-羟乙基溴化铵；或者是二甲基十八烷基环氧丙基氯化铵、二甲基十六烷基环氧丙基氯化铵、二甲基十四烷基环氧丙基氯化铵、二甲基十二烷基环氧丙基氯化铵或它们相应的溴化物；
所述凝集素选自扁豆凝集素、大豆凝集素、花生凝集素、刀豆素A、麦胚素、蓖麻凝集素、豌豆凝集素、菜豆凝集素、荆豆凝集素、双花扁豆凝集素、槐凝集素、Protein A、Protein G中的一种或几种；
所述磁性纳米颗粒是Fe3O4磁性纳米颗粒、钇铁氧体磁流体、钴纳米粒子、镍纳米粒子、金纳米粒子或银纳米粒子。
2.根据权利要求1所述的改性凝集素包裹的磁性大分子脂质体微球，其特征在于，所述改性凝集素在极性有机溶剂或水中的溶解度范围为0.1mg/mL～20.0mg/mL，分子量为2～100KDa，改性凝集素中凝集素的质量含量为所述改性凝聚素包裹的磁性大分子脂质体微球的0.5％～30％。
3.根据权利要求1所述的改性凝集素包裹的磁性大分子脂质体微球，其特征在于，所述脂质成分选自胆固醇、二油酰脂酰乙醇胺、3β-[N-(N’，N’-二甲基胺乙基)胺基甲酰基]胆固醇、卵磷脂、二硬脂酰磷脂酰胆碱、棕榈酰油酰磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰乙醇胺、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺或棕榈酰油酰磷脂酰乙醇胺中的一种或几种。
4.一种权利要求1至3任一所述的改性凝集素包裹的磁性大分子脂质体微球的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)磁性纳米颗粒的制备：配置质量浓度为1.0～20.0％的含铁溶液，在通氮气条件下机械搅拌，待混匀后，加入质量浓度为25.0％的氨水，氨水体积为反应体系中水相体积百分比为1.0％～10.0％：100.0％，然后加入占整个反应体系总质量浓度为1.0％～10.0％的油酸，室温下继续搅拌反应3～10小时后停止反应，磁分离后得到所述磁性纳米颗粒；
2)改性凝集素的制备：将凝集素溶解到去离子水和醇的混合溶液中，再将改性物缓慢地加入到反应体系中，其中去离子水和醇的质量比为1：0～3；体系中凝集素和改性物的质量比为1：0.01～100；在室温下搅拌24小时后将反应液透析1～500小时，最后冻干，得改性凝集素的白色粉末；所述醇为甲醇、乙醇、或异丙醇；
3)步骤2)得到的改性凝集素与磁性纳米颗粒和脂质进行组装得到所述凝集素包裹的磁性大分子脂质体微球，组装的方法为薄膜分散法、逆向蒸发法、复乳法、离心法、pH梯度法、注入法或混溶法，其中薄膜分散法或逆向蒸发法具体如下：
薄膜分散法的基本步骤为：
将步骤1)得到的磁性纳米颗粒和步骤2)得到的改性凝集素和脂质体共溶于极性有机溶剂中，所述改性凝集素、磁性纳米颗粒和脂质体的质量百分组成比为0.01％～50％：0.05％～50％：0.01％～50％；所述的极性有机溶剂是二氯甲烷、氯仿或丙酮；混匀后作为有机相，再除去所述极性有机溶剂使成薄膜，然后加入水相使所述薄膜水化，所述水相为0.9％的生理盐水或pH＝5～9的磷酸盐缓冲溶液；
逆向蒸发法的基本步骤为：
将步骤1)得到的磁性纳米颗粒和步骤2)得到的改性凝集素和脂质体共溶于极性有机溶剂中，所述改性凝集素、磁性纳米颗粒和脂质体的质量百分组成比为0.01％～50％：0.05％～50％：0.01％～50％；所述极性有机溶剂指二氯甲烷、氯仿或丙酮；混匀后作为有机相，水相为0.9％的生理盐水或pH＝6～9的磷酸盐缓冲溶液；将所述水相与有机相混合，超声乳化后，旋转蒸发除去有机溶剂；其中，水相和有机相的体积比为1：6～6：1。
5.根据权利要求4的制备方法，其特征在于，所述改性凝集素是改性剂与凝集素反应后的产物；所述改性剂是十二烷基三甲基溴化铵、十四烷基三甲基溴化铵、十六烷基三甲基溴化铵、二甲基双十八烷基溴化铵、1，2-二油酰-3-二甲基-羟乙基溴化铵、1，2-二油酰氧丙基-3-二甲基-羟乙基溴化铵、1，2-二油酰氧丙基-3-二甲基-羟丙基溴化铵、1，2-二油酰氧丙基-3-二甲基-羟丁基溴化铵、1，2-二油酰氧丙基-3-二甲基-羟戊基溴化铵、1，2-二棕榈酰氧丙基-3-二甲基-羟乙基溴化铵、1，2-二硬脂酰氧丙基-3-二甲基-羟乙基溴化铵、1，2-二肉豆蔻酰氧丙基-3-二甲基-羟乙基溴化铵或者是它们相应的氯化物；或者是二甲基十八烷基环氧丙基氯化铵、二甲基十六烷基环氧丙基氯化铵、二甲基十四烷基环氧丙基氯化铵、二甲基十二烷基环氧丙基氯化铵或它们相应的溴化物；
所述凝集素选自扁豆凝集素、大豆凝集素、花生凝集素、刀豆素A、麦胚素、蓖麻凝集素、豌豆凝集素、菜豆凝集素、荆豆凝集素、双花扁豆凝集素、槐凝集素、Protein A、Protein G中的一种或几种；
所述脂质成分选自胆固醇、二油酰脂酰乙醇胺、3β-[N-(N’，N’-二甲基胺乙基)胺基甲酰基]胆固醇、卵磷脂、二硬脂酰磷脂酰胆碱、棕榈酰油酰磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰乙醇胺、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺或棕榈酰油酰磷脂酰乙醇胺中的一种或几种。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤1)所述的磁性纳米颗粒的粒径为1.0nm～500.0nm，具有超顺磁性，饱和磁化强度为2.0～200.0emu/g。
7.根据权利要求4、5或6任一所述的制备方法，其特征在于，所述含铁溶液是FeSO4·7H2O和FeCl3的共混物溶液，其中FeSO4.7H2O和FeCl3的质量比为1～2：1。
8.一种权利要求1至4任一所述的改性凝集素包裹的磁性大分子脂质体微球的应用，其特征在于，作为凝集素-抗体反应系统，应用于磁共振成像、磁性标记、磁性快速诊断、可控药物释放、基因载体、磁高温疗法或免疫磁性微球领域的药物或载体。
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