CN108196063B - 一种功能磁球主导的免疫荧光试纸条定量检测甲胎蛋白变异体（afp-l3）的试剂盒 - Google Patents

一种功能磁球主导的免疫荧光试纸条定量检测甲胎蛋白变异体（afp-l3）的试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种功能磁球主导的免疫荧光试纸条快速检测甲胎蛋白变异体(AFP‑L3)的试剂盒，所述检测AFP‑L3的试剂盒，包括功能磁球溶液，缓冲溶液和甲胎蛋白(AFP)免疫荧光试纸条；所述功能磁球为扁豆凝集素(LCA)修饰的磁珠。利用功能磁球可以特异性结合AFP‑L3的特点，通过AFP免疫荧光试纸条快速定量检测经功能磁球吸附与未经功能磁球吸附两种样品之间AFP浓度的差异，获得AFP‑L3的结果。这种针对临床检测AFP‑L3％特点建立的试剂盒，操作简便、快速、稳定、正确。

Description

一种功能磁球主导的免疫荧光试纸条定量检测甲胎蛋白变异 体（AFP-L3）的试剂盒
技术领域
本发明属于免疫检测技术领域，具体涉及一种功能磁球主导的免疫荧光试纸条定量检测AFP-L3的试剂盒。
背景技术
在世界范围内，乙肝病毒、丙肝病毒肝炎及肝硬化是肝癌(HCC)的重要危险因素，90％以上的HCC患者被检出乙肝病毒。我国是HCC高发国家，临床HCC发现时多已晚期，治疗难度大，手术并发症多，疗效通常不好，生存期短，一般发病后生存时间仅为6个月到一年。因此，肝癌防治中，早期发现、早期诊断及早期治疗就显得尤为重要。
甲胎蛋白(AFP)作为HCC的诊断及疗效随访观察指标已应用多年，虽然AFP对HCC可疑患者(指高危人群中)的筛选是有效的，但是由于AFP 不够特异从而限制了其在HCC早期诊断的价值。上世纪八十年代，上海市肿瘤研究所许凯黎研究员等最早采用扁豆凝集素(LCA)亲和放射免疫电泳方法，检测HCC病人血清中AFP-L3；发现良性肝病时肝细胞坏死后再生时产生的AFP糖链结构，与HCC时产生的AFP糖链结构上有明显差异。进一步研究发现AFP-L3在两支链复合型糖链的还原末端侧的N-乙酰葡萄糖胺上结合着α-1-6-岩藻聚糖，该糖链结构能特异性结合LCA。研究人员将AFP分为 LCA非结合型和LCA结合型，其中LCA非结合型包括：AFP-L1(主要存在于良性肝病中)、AFP-L2(来自孕妇)；LCA结合型为AFP-L3，是HCC细胞所特有，因此AFP-L3是代表HCC恶性程度的一个重要标志。
在HCC的早期诊断中检测AFP-L3是非常有效的。据报道，AFP-L3在小 HCC<2cm检测中可以有35％的阳性率，AFP-L3检测比影像学检查可以提前 9-12个月发现HCC的存在。对良性肝病特异性≥95％。AFP-L3的敏感性与 HCC的临床分期相关：AFP-L3用于检测HCC的平均敏感性大约在60％左右之间。在直径小于2cmHCC中，其敏感性只有35-45％；随着HCC的增大， AFP-L3的敏感性也随之升高。当HCC的直径≥5cm时，AFP-L3的敏感性可高达80～90％。AFP-L3阳性的HCC存在早期血管浸润和肝内转移的倾向。如果α-连环蛋白缺失，那么HCC常常有肝外的转移。影像学研究发现AFP-L3 阳性的HCC通常有丰富的肝动脉血液供给，肿瘤的倍增时间较短。这就提示了AFP-L3阳性的HCC生长的非常快并且容易发生早期转移。AFP-L3对HCC 的诊断具有很高的准确率。HCC的早期发现可以为患者提供更多的治疗机会，如肝癌治疗最有效的外科切除术，介入治疗等。
AFP-L3应用于临床价值是检测AFP-L3的百分浓度。当AFP-L3百分浓度大于或等于AFP总浓度10％时为阳性，百分浓度越高提示恶性程度越高，如果仅检测AFP-L3绝对值的浓度临床意义不是很大。早在2005年FDA批准将AFP-L3应用于HCC的诊断及预警。2009年我国正式纳入医疗保险费检测项目。多年来国内外用于检测AFP-L3方法的报道不少，真正能用于临床检测的试剂盒并不多。现有市售的离心柱吸附法检测AFP-L3的试剂盒。所采用的技术路线：利用AFP-L3与吸附填料(扁豆凝集素交联的琼脂糖微球)可以亲和结合的特点，通过离心柱亲和吸附分离结合AFP定量试剂盒检测AFP-L3。
大致流程如下：将待测样品分成A，B两份：
1、取(A)份样品与缓冲溶液的混合液，用AFP定量试剂盒检测AFP的浓度。
2、取(B)份样品与离心柱内吸附填料混合后装入外置离心套管，经反复清洗、离心、洗脱得到的溶液。用AFP定量试剂盒检测的AFP浓度是AFP-L3。计算公式：AFP-L3％＝(B)÷(A)。
离心柱吸附法检测AFP-L3存在的缺陷是操作烦琐(反复离心)、耗时长 (1.5-2小时)，同时可能存在由于洗脱不够彻底，少量结合物滞留或离心速度控制不当少量结合物脱离等问题，导致回收率降低从而影响检测结果。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种功能磁球主导的免疫荧光试纸条组成的定量检测AFP-L3的试剂盒，用AFP免疫荧光试纸条快速检测未经过功能磁球吸附与经过功能磁球吸附两者样品之间AFP浓度的差异，获得 AFP-L3的结果。这种仅针对检测AFP-L3％特点建立的试剂盒操作简便、快速 (几分钟完成)、稳定。正确。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：一种吸附AFP-L3的功能磁球，所述功能磁球为LCA修饰的磁珠；所述功能磁球能够特异结合 AFP-L3。
优选的，所述功能磁球的粒径为1nm～100000nm。
优选的，所述功能磁球中磁珠与LCA的质量比为1000:(0.5～1)。
优选的，所述磁珠为氨基磁珠或羧基磁珠。
本发明还提供了所述功能磁球的制备方法，包括以下步骤：
1)将磁珠、凝集素与缩合剂混合后反应0.5～48h，获得反应液；
2)磁分离所述的反应液，收集磁性组分获得功能磁球。
优选的，步骤1)中所述磁珠与缩合剂的质量比为(5：1)～(1：20)。
优选的，步骤1)中所述的缩合剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N,N″-羰基二咪唑、二环己基碳二亚胺、4-二甲氨基吡啶和N-羟基琥珀酰亚胺中的一种或几种。
优选的，当步骤1)中所述磁珠为羧基磁珠时，所述缩合剂替换为偶联剂，
优选的，所述羧基磁珠与偶联剂的质量比(15：1)～(1：5)。
优选的，所述偶联剂为EDAC。
本发明还提供了一种检测AFP-L3试剂盒，包括吸附AFP-L3的功能磁球溶液，缓冲溶液和AFP免疫荧光试纸条；通过AFP免疫荧光试纸条定量检测未经过功能磁球吸附与经过功能磁球吸附两者样品中AFP浓度的差异获得 AFP-L3的结果。
优选的，所述缓冲溶液为包括终浓度为20～30mM的Tris-Hcl、20～30mM 的NaCl、1.5～2.5mM的MgCl2和1.8～2.2mM的CaCl2的水溶液；所述缓冲溶液的pH值为7.1～7.9。
本发明的有益效果：本发明提供的吸附AFP-L3的功能磁球能够快速特异结合AFP-L3；所述的AFP-L3检测试剂盒，包括功能磁球溶液，缓冲溶液和AFP 免疫荧光试纸条；利用功能磁球可以特异性结合AFP-L3的特点，通过AFP 免疫荧光试纸条定量检测未经过功能磁球吸附与经过功能磁球吸附两者样品之间AFP浓度的差异获得AFP-L3的结果。这种仅针对检测AFP-L3％特点建立的试剂盒操作简便、快速、稳定、正确、干扰因素小。
附图说明
图1为本发明所述试剂盒中的免疫荧光试纸条。
具体实施方式
本发明提供了一种吸附AFP-L3的功能磁球主导的免疫荧光试纸条定量快速检测AFP-3试剂盒，所述功能磁球为LCA修饰的磁珠；所述功能磁球能够特异结合AFP-L3。所述的免疫荧光试纸条为AFP免疫荧光定量检测试纸条；所述的检测AFP-3为AFP免疫荧光试纸条快速定量检测未经过功能磁球吸附与经过功能磁球吸附两者样品之间AFP浓度的差异获得AFP-3的结果。
所述功能磁球的粒径优选的为1nm～100000nm，更优选的为 300～30000nm；最优选的为15000～25000nm。在本发明中，所述功能磁球为凝集素修饰的磁珠，所述功能磁球中磁珠与LCA的质量比为1000:(0.5～1)，更优选的为1000：(0.6～0.9)，最优选的为1000：(00.7～0.8)；在本发明具体实施过程中优选的以g计，每g功能磁球含有500μg～1mg的LCA。在本发明中所述磁珠优选的为氨基磁珠或羧基磁珠；本发明对所述氨基磁珠与羧基磁珠的来源还没有特殊限定，采用市售的氨基磁珠或羧基磁珠即可；所述氨基磁珠或羧基磁珠的固含量优选的为2～30％，更优选为5～25％。在本发明中所述功能磁球具有超顺磁和相应的磁场响应性，所述功能磁球在水溶液中稳定的存在；所述功能磁球的作用是特异性结合样品中的AFP-L3。
本发明还提供了上述功能磁球的制备方法，包括以下步骤：1)将磁珠、 LCA与缩合剂混合后反应0.5～48h获得反应液；2)磁分离所述的反应液，收集磁性组分获得功能磁球。
在本发明中，将磁珠、LCA与缩合剂混合后反应0.5～48h获得反应液，所述磁珠与LCA的质量比为1000:(0.5～1)，更优选的为1000：(0.6～0.9)，最优选的为1000：(00.7～0.8)；所述磁珠与缩合剂的质量比为(5：1)～(1： 20)。本发明按照上述比例将磁珠、LCA与缩合剂混合后反应，所述反应时间优选的为1～40h，更优选的为2～30h。本发明中所述缩合剂优选的为1-(3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N,N”-羰基二咪唑、二环己基碳二亚胺、 4-二甲氨基吡啶和N-羟基琥珀酰亚胺中的一种或几种。本发明中所述缩合剂的作用是促进磁珠与LCA通过酯键连接。
在本发明中，当所述磁珠为羧基磁珠时，所述的缩合剂替换为偶联剂，所述羧基磁珠与偶联剂的质量比优选的(15：1)～(1：5)。在本发明中所述偶联剂优选的为EDAC；所述EDAC的作用是活化羧基磁珠，促进羧基磁珠与凝集素偶联。
本发明在获得反应液后，磁分离所述的反应液，收集磁性组分获得功能磁球。在本发明中所述磁分离具体的为将反应液放置在磁铁表面，待溶液澄清后，去除未被磁铁吸附的液体，剩余组分即为功能磁珠；本发明在磁分离后，优选的向功能磁球中加入超纯水进行洗脱，洗脱后收集功能磁球。
本发明还提供了一种检测AFP-L3试剂盒，包括吸附AFP-L3的功能磁球溶液，缓冲溶液和AFP免疫荧光定量检测试纸条。
本发明所述的试剂盒中包括上述吸附AFP-L3的功能磁球；所述功能磁球的性质和制备方法在此不再赘述。
在本发明中，在本发明中所述试剂盒还包括缓冲溶液，所述缓冲溶液优选的为包括终浓度为20～30mM的Tris-Hcl、20～30mM的NaCl、1.5～2.5mM 的MgCl2和1.8～2.2mM的CaCl2的水溶液，更优选的为包括终浓度为25mM 的Tris-Hcl、25mM的NaCl、2.0mM的MgCl2和2.0mM的CaCl2的水溶液。
在本发明中所述缓冲溶液的制备方法优选的为称取三羟甲基氨基甲烷 (Tris)、NaCl、MgCl2、CaCl2溶解于蒸馏水中，调节pH值，最后再加蒸馏水定容。在本发明具体实施过程中以1000ml计，最优选的称取3.0g三羟甲基氨基甲烷(Tris)、1.45g氯化钠、0.4g氯化镁、0.22g氯化钙溶解于950ml蒸馏水中，调节pH值，最后再加蒸馏水定容至1000ml；本发明优选的采用浓盐酸所述调节pH值，所述pH值优选的为7.1～7.9；更优选的为7.2～7.8。本发明中，优选的将所述缓冲溶液与功能磁球混合后处理样品。
本发明所述的试剂盒中还包括AFP免疫荧光试纸条。在本发明中所述 AFP免疫荧光试纸条为快速定量检测样品中的AFP；本发明对所述的AFP免疫荧光试纸条没有特殊限定，具体为AFP定量检测试纸条，例如AFP免疫荧光定量检测试纸条、AFP化学发光定量检测试纸条、可替换为时间分辨AFP 免疫荧光测定方法以及各种自动化高通量AFP定量检测方法；所述自动化高通量AFP定量检测条件包括液态条件下通过ELISA、化学发光法、萤光法等完成AFP的定量检测。
本发明所述的检测AFP-L3试剂盒的检测过程及原理如下：将含有 AFP-L3的待测样品分为A、B两份，A份样品加入缓冲溶液；B份样品加入功能磁球溶液。用AFP试纸条定量检测A、B两份样品中AFP的浓度，将A 份样品中获得AFP的浓度减去B份样品中AFP的浓度即为AFP-L3的浓度；将AFP-L3的浓度除去A份样品中AFP的浓度，获得AFP中AFP-L3的百分含量。
本发明利用功能磁球可以特异性结合AFP-L3的特点建立的检测AFP-L3 的试剂盒(每份检测中功能磁球可以吸附1-3ug浓度的AFP-L3，可以充分吸附一般待测样品中AFP-L3浓度范围(5ng-500ng)的能力，通过AFP免疫荧光试纸条快速定量检测未经过功能磁球吸附与经过功能磁球吸附两者样品之间AFP浓度的差异获得AFP-L3的结果。是针对临床检测AFP-L3％特点建立的试剂盒,操作简便、快速(几分钟完成)、稳定、正确。
本发明中所述AFP-L3检测试剂盒的使用方法，包括以下步骤：
1)先将功能磁球溶液充分混合；2)将待测样品均分为A、B两份，将A 份样品加入缓冲溶液组成的溶液：将B份样品加入功能磁球溶液混合、反应 1-2分钟，通过磁分离架分离得到上清溶液；3)用AFP免疫荧光试纸条定量检测A份样品的溶液与B份样品的上清溶液中AFP的浓度。检测AFP-L3。计算公式为：AFP-L3％＝(A-B)/A。
在本发明中所述功能磁球溶液的质量浓度优选的为4～6％，更优选的为 5％；所述功能磁球溶液是将功能磁球与所述缓冲溶液混合后获得的；在本发明具体实施过程中，优选的以100ml功能磁球溶液计，称取4～6g功能磁球溶解于100ml缓冲溶液中获得功能磁球溶液。在本发明具体实施过程中功能磁球溶液与样品混合前优选的进行预混匀；所述预混匀为将功能磁球溶液充分振荡，使得功能磁球均匀分布与功能磁球溶液中，更有利于功能磁球与样品中的AFP-L3充分结合。
下面结合实施例对本发明提供的一种AFP-L3检测试剂盒进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
取固含量为20％的氨基或羧基化磁珠(粒径300nm)溶液1mL与含有2mg 扁豆凝集素的溶液1mL混合，加入5mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，混合均匀，室温搅拌反应48小时后，磁分离洗涤后获得功能磁球。
配置缓冲溶液：称取3.0g三羟甲基氨基甲烷(Tris)、1.45g氯化钠、0.4g 氯化镁、0.22g氯化钙溶解于950ml蒸馏水中，调节pH值为7.5，最后再加蒸馏水定容至1000ml，获得缓冲溶液。
将所述功能磁球、缓冲溶液、AFP免疫荧光定量试纸条组装为AFP-L3检测试剂盒。
实施例2
取固含量为20％的氨基或羧基化磁珠(粒径10000nm)溶液1mL与含有2mg 扁豆凝集素的溶液1mL混合，加入5mg二环己基碳二亚胺，混合均匀，室温搅拌反应24小时后，磁分离洗涤后获得功能磁球。
配置缓冲溶液：称取3.0g三羟甲基氨基甲烷(Tris)、1.45g氯化钠、0.4g 氯化镁、0.22g氯化钙溶解于950ml蒸馏水中，调节pH值为7.4，最后再加蒸馏水定容至1000ml，获得缓冲溶液。
将所述功能磁球、缓冲溶液、AFP免疫荧光定量试纸条组装为AFP-L3检测试剂盒。
实施例3
取固含量为2％的羧基磁珠用EDAC
(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide)活化，每mg羧基活化磁球在MES缓冲溶液条件下反应16h可以偶联20μg的LCA，磁分离洗涤后获得功能磁球。
配置缓冲溶液：称取3.0g三羟甲基氨基甲烷(Tris)、1.45g氯化钠、0.4g 氯化镁、0.22g氯化钙溶解于950ml蒸馏水中，调节pH值为7.6，最后再加蒸馏水定容至1000ml，获得缓冲溶液。
将所述功能磁球、缓冲溶液、AFP免疫荧光定量试纸条组装为AFP-L3检测试剂盒。
实施例4
取固含量为2％的羧基磁珠用EDAC
(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide)活化，每mg羧基活化磁球在MES缓冲溶液条件下反应20h可以偶联35μg的LCA磁分离洗涤后获得功能磁球。
配置缓冲溶液：称取3.0g三羟甲基氨基甲烷(Tris)、1.45g氯化钠、0.4g 氯化镁、0.22g氯化钙溶解于950ml蒸馏水中，调节pH值为7.9，最后再加蒸馏水定容至1000ml，获得缓冲溶液。
将所述功能磁球、缓冲溶液、AFP荧光定量试纸条组装为AFP-L3检测试剂盒。
实施例5
取固含量为2％的羧基磁珠用EDAC
(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide)活化，每mg羧基活化磁球在MES缓冲溶液条件下反应24h可以偶联50μg的LCA，磁分离洗涤后获得功能磁球。
配置缓冲溶液：称取3.0g三羟甲基氨基甲烷(Tris)、1.45g氯化钠、0.4g 氯化镁、0.22g氯化钙溶解于950ml蒸馏水中，调节pH值为7.5，最后再加蒸馏水定容至1000ml，获得缓冲溶液。
将所述功能磁球、缓冲溶液、AFP荧光定量试纸条组装为AFP-L3检测试剂盒。
实施例6
荧光免疫定量检测AFP试纸条采用双抗体夹心法。样品中的AFP与试纸条加样孔处硝酸纤维素膜结合垫的荧光标记抗体(1)发生免疫反应，经过试纸条膜上划有抗体(2)的T线形成复合物；用荧光仪检测T线的荧光强度与样品中的AFP浓度呈正比例，通过抗原浓度的标准曲线可得到样品中AFP的浓度。检测范围1-1000ng。
将所述功能磁球、缓冲溶液、AFP荧光定量试纸条组装为AFP-L3检测试剂盒。
AFP荧光免疫试纸条可以自己制备，市场也有供应。
实施例7
应用实施例1中所述的试剂盒检测样品中的AFP-L3。
1)标本：
正常人血清标本82例来源于上海市肿瘤研究所体检血清；慢性乙肝125 例及肝硬化98例标本来自上海市徐汇区大华医院；肝癌标本66份来自解放军四五五医院、上海市徐汇区大华医院、启东肝癌防冶研究所。所有新鲜血清分离后置-20℃保存至检测。
2)测试方法：
检测前准备工作：缓冲溶液、功能磁球溶液、离心管、磁分离架、试纸条、检测仪等耗材。
(1)将功能磁球溶液充分混匀。
(2)取100～200μl缓冲溶液放入1号离心管内，再取100～200μl功能磁球溶液放入2号离心管内。
(3)取50～200μl血清二份分别加入1号、2号离心管内，与管内溶液混合。
(4)取100μl 1号离心管内溶液加入A试纸条加样孔内定量检测AFP的浓度。
(5)将2号离心管放入磁分离架，反应1-2分钟。取100μl磁分离的上清液加入B试纸条加样孔内定量检测AFP的浓度。
3)计算公式：AFP-L3％＝(A-B)/A
4)功能磁球主导的免疫荧光试纸条检测AFP-L3结果的分析见表1。
表1 374例正常人与不同类型肝病患者的检测结果
Figure BDA0001524096120000091
Figure BDA0001524096120000101
由上述实施例可知，本发明所述的功能磁球主导的免疫荧光试纸条快速检测AFP-L3％的试剂盒，完全达到临床检测AFP-L3％的要求。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (3)

1.一种检测AFP-L3的试剂盒，其特征在于，由吸附AFP-L3的功能磁球溶液，缓冲溶液和AFP免疫荧光试纸条组成；通过AFP免疫荧光试纸条快速定量检测未经过功能磁球吸附与经过功能磁球吸附两种样品之间AFP浓度的差异，获得AFP-L3的结果；
所述功能磁球为LCA修饰的磁珠；所述功能磁球能够特异结合AFP-L3；所述磁珠为氨基磁珠或羧基磁珠；
所述功能磁球的粒径为1nm～100000nm；
所述功能磁球中磁珠与LCA的质量比为1000：(0.7～0.8)；
所述缓冲溶液为包括终浓度为20～30mM的Tris-Hcl、20～30mM的NaCl、1.5～2.5mM的MgCl2和1.8～2.2mM的CaCl2的水溶液；所述缓冲溶液的pH值为7.1～7.9；
所述功能磁球的制备方法，包括以下步骤：
1)将磁珠、LCA与缩合剂混合后反应0.5～48h，获得反应液；
2)磁分离所述的反应液，收集磁性组分获得功能磁球；
步骤1)中所述磁珠与缩合剂的质量比为(5：1)～(1：20)。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，步骤1)中所述的缩合剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N,N”-羰基二咪唑、二环己基碳二亚胺、4-二甲氨基吡啶和N-羟基琥珀酰亚胺中的一种或几种。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，当步骤1)中所述磁珠为羧基磁珠时，所述缩合剂替换为偶联剂，所述偶联剂为EDAC，所述羧基磁珠与偶联剂的质量比(15：1)～(1：5)。
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