CN113655035B - 一种糖缺失性转铁蛋白分离方法及检测方法与试剂盒 - Google Patents

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Abstract

一种糖缺失性转铁蛋白分离方法及检测方法与试剂盒，分离方法包括：使含有目标物以及非目标物的液体与介质接触，所述介质特异性吸附非目标物，所述液体中保留目标物，所述目标物为糖缺失性转铁蛋白。本发明通过介质吸附非目标物，液体中保留目标物，实现对目标物的快速分离，无需洗脱，可直接对介质处理后的液体进行检测。

Description

一种糖缺失性转铁蛋白分离方法及检测方法与试剂盒
技术领域
本发明涉及医学检测技术领域，具体涉及一种糖缺失性转铁蛋白分离方法及检测方法与试剂盒。
背景技术
酒精性肝病(alcoholic liver disease，ALD)是我国常见的肝脏疾病之一，严重危害人民健康。严重酗酒时可诱发广泛肝细胞坏死，甚至肝功能衰竭。近年来，ALD占同期肝病住院患者的比例在不断上升，初期通常表现为脂肪肝，进而可发展成酒精性肝炎、肝纤维化和肝硬化。其主要临床特征是恶心、呕吐、黄疸、可有肝脏肿大和压痛，并可并发肝功能衰竭和上消化道出血等。
目前，对于ALD实验室诊断，多用的生化指标有γ-谷氨酰转移酶(GGT)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)等，但这些都缺乏敏感性和特异性，表现在：对酒精没有特异性，无法区分病因；在饮酒导致肝损伤前，这些指标水平没有变化；这些指标半衰期较长，无法及时反映饮酒状况的变化等。2001年美国食品和药品管理局(Food andDrug Administration，FDA)批准糖缺失性转铁蛋白(CDT)作为一项用于评估饮酒状况的标志物应用于临床。CDT作为评价饮酒状态的标志物，有较为理想的特异性。尤其是相对于其他肝脏酶类标志物，CDT在肝脏疾病存在时对于酒精摄入表现出更好的特异性和抗干扰能力，更优于其他传统饮酒标志物且特异性更佳。CDT对于由酒精引发的肝脏疾病有较好的特异性和敏感性。
CDT是转铁蛋白(TRF)的异构体，主要是TRF唾液酸(SA)残基的丢失。正常人血清中不同转铁蛋白亚型所占转铁蛋白总量的比例也各不相同，含量最多的是四唾液酸分子亚型，饮酒后体内转铁蛋白所含的唾液酸分子减少，使三唾液酸、双唾液酸、单唾液酸和无唾液酸的转铁蛋白亚型水平升高。有研究表明，占CDT主体部分的无唾液酸转铁蛋白是由于缺失2条糖链所致，临床中将无唾液酸转铁蛋白、单唾液酸转铁蛋白和双唾液酸转铁蛋白亚型并称为CDT。其含量增高多见于嗜酒者体内，并在禁酒一段时间后又会消失，半衰期14d(即14天)。研究表明，与CDT的绝对定量水平相比，CDT与转铁蛋白总量的比值对于饮酒状态的诊断特异性更高。
目前CDT的检测方法主要有等电聚焦电泳法、色谱法及免疫法等。等电聚焦电泳法具体是在具有pH梯度的凝胶上根据不同亚型等电点不同将其分离，在免疫固定和染色步骤之后可见各类转铁蛋白亚型的条带，最后进行密度计量得到CDT结果。可根据定标曲线，得到CDT的绝对浓度。色谱法常用的有阴离子交换色谱分析法，但其敏感性较低；高效液相色谱法也可检测健康人群血样中的遗传性TRF，但柱交换费时且昂贵，限制了其在大规模CDT检测中的应用。近年，通过植物凝集素亲和色谱可从血浆中分离出CDT，随后加入抗人转铁蛋白血清进行定量检测。这种将色谱法和免疫法联合的检测方法很快得到发展，由于其操作简便在实验室被广泛应用。但该方法还未出现商品化的试剂盒。
发明内容
根据第一方面，在一实施例中，提供一种分离糖缺失性转铁蛋白的方法，包括：使含有目标物以及非目标物的液体与介质接触，所述介质特异性吸附非目标物，所述液体中保留目标物，所述目标物为糖缺失性转铁蛋白。该方法无需洗脱步骤，有效提高了分离效率。
根据第二方面，在一实施例中，提供一种检测糖缺失性转铁蛋白的方法，包括：
目标物分离步骤，包括使待测样本与介质接触，待测样本为含有目标物以及非目标物的液体，所述介质吸附待测样本中的非目标物，所述液体中保留目标物；
检测步骤，包括检测所述液体中目标物的含量，所述目标物为糖缺失性转铁蛋白。
根据第三方面，在一实施例中，提供一种介质在检测糖缺失性转铁蛋白中的用途，所述介质与含有目标物以及非目标物的待测样本接触后，所述介质吸附非目标物，目标物保留在液体中，所述目标物为糖缺失性转铁蛋白。通过收集液体，通过比浊法等方法检测液体中目标物的含量，即可得到待测样本中目标物的含量。
根据第四方面，在一实施例中，提供一种试剂盒，包含介质、R1试剂、R2试剂，所述介质用于与待测样本接触，待测样本为含有目标物以及非目标物的液体，所述介质吸附非目标物，目标物保留在所述液体中，通过收集液体，即可检测液体中目标物的含量，从而计算得到待测样本中目标物的含量。
依据上述实施例的一种糖缺失性转铁蛋白分离方法及检测方法与试剂盒，通过介质吸附非目标物，液体中保留目标物，实现对目标物的快速分离，无需洗脱，可直接对介质处理后的液体进行检测。
在一实施例中，还可以进一步结合比浊法检测样本中糖缺失性转铁蛋白的含量，实现样本大批量和高通量测试，满足临床需求。
附图说明
图1为一种实施例的糖缺失性转铁蛋白测定试剂盒标准曲线图；
图2为一种实施例的糖缺失性转铁蛋白测定试剂盒线性范围曲线图；
图3为一种实施例的糖缺失性转铁蛋白测定试剂盒测定的CDT浓度值与西门子试剂测定的CDT浓度值相关性曲线图；
图4为一种实施例的糖缺失性转铁蛋白测定试剂盒测定的CDT比率与西门子试剂测定的CDT比率相关性曲线图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。其中不同实施方式中类似元件采用了相关联的类似的元件标号。在以下的实施方式中，很多细节描述是为了使得本申请能被更好的理解。然而，本领域技术人员可以毫不费力的认识到，其中部分特征在不同情况下是可以省略的，或者可以由其他元件、材料、方法所替代。在某些情况下，本申请相关的一些操作并没有在说明书中显示或者描述，这是为了避免本申请的核心部分被过多的描述所淹没，而对于本领域技术人员而言，详细描述这些相关操作并不是必要的，他们根据说明书中的描述以及本领域的一般技术知识即可完整了解相关操作。
另外，说明书中所描述的特点、操作或者特征可以以任意适当的方式结合形成各种实施方式。同时，方法描述中的各步骤或者动作也可以按照本领域技术人员所能显而易见的方式进行顺序调换或调整。因此，说明书和附图中的各种顺序只是为了清楚描述某一个实施例，并不意味着是必须的顺序，除非另有说明其中某个顺序是必须遵循的。
本文中为部件所编序号本身，例如“第一”、“第二”等，仅用于区分所描述的对象，不具有任何顺序或技术含义。而本申请所说“连接”、“联接，”如无特别说明，均包括直接和间接连接(联接)。
定义
本文中，如无特别说明，“％(w/v)”表示质量体积比，亦可表示为“％w/v，”w/v是指kg/L，例如，1％(w/v)表示0.01kg/L，即10g/L。
本文中，如无特别说明，“mM”是指“mmol/L”，即毫摩尔/升。
本文中，“转铁蛋白”又名运铁蛋白(英文名Transferrin，简称TRF、Tf)，负责运载由消化管吸收的铁和由红细胞降解释放的铁。以三价铁复合物(Tf-Fe3+)的形式进入骨髓中，供成熟红细胞的生成。转铁蛋白主要存在于血浆、血清中，血浆、血清中的转铁蛋白供应机体绝大部分组织的铁，而在其不能到达的部位，由这些组织自己合成的转铁蛋白在局部产生转铁作用。
人转铁蛋白(Human Transferrin)主要在肝脏合成，是由位于同源N-端和C-端的两个叶片(Lobe)组成的一种单链糖蛋白。人转铁蛋白共含678个氨基酸残基，等电点为5.9，分子量为76kD。每分子的转铁蛋白能携带2个三价铁离子(Fe3+)。转铁蛋白与Fe3+的相互作用取决于pH，pH为7.4时，转铁蛋白与Fe3+高效结合，在酸性pH下两者分离。
转铁蛋白结合铁是通过与其受体，即Transferrin Receptor 1(TfR1)相互作用而实现的。T fR1是一种表达于细胞表面的糖蛋白，由两个同源二聚体的亚基通过二硫键连接而成。在细胞表面，Tf与Fe3+相互作用形成全铁-Tf，并与TfR1受体结合，在细胞内吞作用下进入核内体。在偏酸性核内体的环境中，Fe3+与Tf分离，同时STEAP3将Fe3+还原为Fe2+，并被二价金属离子转运蛋白1(DMT1)转运到细胞质中，然后释放了Fe3+的Tf与TfR1组成Tf/TfR1复合物，通过胞吐作用回游到细胞表面。在细胞表面，转铁蛋白(Tf)与受体TfR1分离，成为脱铁-Tf，然后再与Fe3+重新结合参与铁循环。整个过程完成后Tf和TfR1被循环利用，进入细胞摄取铁的下一个周期中。
糖缺失性转铁蛋白
糖缺失性转铁蛋白(英文名carbohydrate-deficient transferrin，简称CDT)是转铁蛋白(T RF)的异构体，主要是TRF唾液酸(SA)残基的丢失。正常人血清中不同转铁蛋白亚型所占转铁蛋白总量的比例也各不相同，含量最多的是四唾液酸分子亚型，饮酒后体内转铁蛋白所含的唾液酸分子减少，使三唾液酸、双唾液酸、单唾液酸和无唾液酸的转铁蛋白亚型水平升高。有研究表明，占CDT主体部分的无唾液酸转铁蛋白是由于缺失2条糖链所致，临床中将无唾液酸转铁蛋白、单唾液酸转铁蛋白和双唾液酸转铁蛋白亚型并称为CDT。其含量增高多见于嗜酒者体内，并在禁酒一段时间后又会消失，半衰期14d。研究表明，与CDT的绝对定量水平相比，CDT与转铁蛋白总量的比值对于饮酒状态的诊断特异性更高。
根据第一方面，在一实施例中，提供一种分离糖缺失性转铁蛋白的方法，包括：使含有目标物以及非目标物的液体与介质接触，所述介质特异性吸附非目标物，所述液体中保留目标物，所述目标物为糖缺失性转铁蛋白。该方法无需洗脱步骤，有效提高了分离效率，实现对CDT的准确检测。
在一实施例中，所述介质偶联有用于特异性吸附非目标物的配基，配基吸附非目标物之后，目标物保留在液体中，从而使得非目标物与目标物从液体中分离。
介质通常预装于样本处理柱中，将待测样本(即含有目标物以及非目标物的液体)加入样本处理柱中，介质上的配基吸附非目标物，而目标物保留在液体中，收集液体，即可检测目标物的含量。
将待测样本加入样本处理柱后，可以通过静置等方式，使得介质上的配基充分吸附非目标物。吸附结束后，可以通过离心(例如，低速离心)等方式收集流穿液。由于血清等样本通常比较粘稠，因此，离心可以加速处理柱中的液体流出。
现有技术中，使用阴离子交换树脂吸附目标物，基于阴阳离子吸附的作用分离目标物与非目标物，然而，阴离子交换树脂对目标物的吸附特异性不强。而本发明还包括亲和层析方式，可特异性分离含糖链和不含(或少含)糖链的蛋白，如CDT和TRF。
在一些实施例中，本发明的介质上偶联的配基吸附的是非CDT(即非目标物)，洗脱的是CDT。本发明使用特异性吸附糖基化蛋白的配基，属于亲和层析法，吸附的是糖基化程度高的转铁蛋白，几乎不吸附CDT。
在一些实施例中，所述配基包括但不限于阴离子交换配基、阳离子交换配基、疏水配基、亲和配基等等中的至少一种。
在一些实施例中，所述阴离子交换配基、阳离子交换配基包括但不限于N,N-二乙基氨基乙基、N,N-二乙基氨基-2-羟丙基、羧甲基、磺丙基等等中的至少一种。
在一些实施例中，所述疏水配基包括但不限于丁基、丁硫基、辛基、苯基等等中的至少一种。
在一些实施例中，所述亲和配基包括但不限于凝集素。
在一些实施例中，所述凝集素可以包括但不限于豌豆凝集素(PSA)、植物血球凝集素(P HA)、刀豆凝集素A(Concanavalin A，缩写ConA)、扁豆凝集素(LCA)等等中的至少一种。
刀豆凝集素A亦称刀豆凝集素A、刀豆球蛋白A、伴刀豆球蛋白、刀豆素，是一种植物血凝素(Phytohemagglutin)。
在一些实施例中，所述介质预装于样本处理柱中，将含有目标物以及非目标物的液体加入样本处理柱中，所述介质特异性吸附非目标物后，样本处理柱的流穿液即为含有目标物的液体。
在一些实施例中，所述介质特异性吸附非目标物后，对样本处理柱进行离心，得到的流穿液即为含有目标物的液体。
在一些实施例中，所述含有目标物以及非目标物的液体可以为人、动物体或其他生物体的体液样本。
在一实施例中，所述含有目标物以及非目标物的液体包括但不限于血液、血清、血浆、脑脊液中的至少一种。
在一实施例中，所述目标物主要包括无唾液酸转铁蛋白、单唾液酸转铁蛋白、双唾液酸转铁蛋白中的至少一种。
在一实施例中，所述目标物主要包括无唾液酸转铁蛋白、单唾液酸转铁蛋白、双唾液酸转铁蛋白中的全部。
在一实施例中，所述非目标物主要包括三唾液酸转铁蛋白、四唾液酸转铁蛋白中的至少一种。非目标物即为无唾液酸转铁蛋白、单唾液酸转铁蛋白、双唾液酸转铁蛋白之外的其他类型的转铁蛋白。
在一实施例中，所述非目标物主要包括三唾液酸转铁蛋白、四唾液酸转铁蛋白中的全部。
在一实施例中，所述介质可以包括但不限于纤维素、葡聚糖、琼脂糖、树脂等等中的至少一种。介质即为载体，其吸附作用的主要是偶联(或称标记)在介质上的配基，配基起到分离TRF、CDT的作用。
根据第二方面，在一实施例中，提供一种检测糖缺失性转铁蛋白的方法，包括：
目标物分离步骤，包括使待测样本与介质接触，待测样本为含有目标物以及非目标物的液体，所述介质吸附待测样本中的非目标物，所述液体中保留目标物；
检测步骤，包括检测所述液体中目标物的含量，所述目标物为糖缺失性转铁蛋白。
本发明的介质起到吸附非目标物的作用，不同于传统方法中用介质吸附目标物，本发明无需洗脱，本发明收集液体后即可检测目标物的含量，简化了操作流程，提高了检测效率。现有技术中，使用阴离子交换树脂吸附目标物，对目标物的特异性不强，本发明以亲和层析的方式，特异性吸附非目标物，可特异性分离含糖链和不含(或少含)糖链的蛋白，如CDT和TRF。
在一实施例中，所述介质偶联有用于特异性吸附非目标物的配基，配基吸附非目标物之后，目标物保留在液体中，从而使得非目标物与目标物从液体中分离。
介质通常预装于样本处理柱中，将待测样本加入样本处理柱中，介质上的配基吸附非目标物，而目标物保留在液体中，收集液体，即可检测目标物的含量。
将待测样本加入样本处理柱后，可以通过静置等方式，使得介质上的配基充分吸附非目标物。吸附结束后，可以通过离心(通常可以是低速离心)等方式收集流穿液。由于血清等样本通常比较粘稠，因此，离心可以加速处理柱中的液体流出。
在一些实施例中，所述配基包括但不限于阴离子交换配基、阳离子交换配基、疏水配基、亲和配基等等中的至少一种。
在一些实施例中，所述阴离子交换配基、阳离子交换配基包括但不限于N,N-二乙基氨基乙基、N,N-二乙基氨基-2-羟丙基、羧甲基、磺丙基等等中的至少一种。
在一些实施例中，所述疏水配基包括但不限于丁基、丁硫基、辛基、苯基等等中的至少一种。
在一些实施例中，所述亲和配基包括但不限于凝集素。
在一些实施例中，所述凝集素可以包括但不限于豌豆凝集素(PSA)、植物血球凝集素(P HA)、刀豆凝集素A(Concanavalin A，缩写ConA)、扁豆凝集素(LCA)等等中的至少一种。
刀豆凝集素A亦称刀豆凝集素A、刀豆球蛋白A、伴刀豆球蛋白、刀豆素，是一种植物血凝素(Phytohemagglutin)。
在一实施例中，所述介质预装于样本处理柱中，将含有目标物以及非目标物的液体加入样本处理柱中，所述介质特异性吸附非目标物后，样本处理柱的流穿液即为含有目标物的液体。
在一实施例中，所述介质特异性吸附非目标物后，对样本处理柱进行离心，得到的流穿液即为含有目标物的液体。
在一实施例中，通过比浊法检测所述液体中目标物的含量。
比浊法又称浊度测定法。为测量透过悬浮质点介质的光强度来确定悬浮物质浓度的方法，这是一种光散射测量技术。比浊法是利用透射光强度(I)与入射光强度(Io)的比值I/Io，或用散射光强度(Is)与入射光强度(Io)的比值Is/Io，测定悬浊物质含量的方法。
在一实施例中，所述比浊法包括透射比浊法、散射比浊法中的至少一种。
在一实施例中，检测经介质吸附非目标物后的液体中目标物的含量，然后计算得到目标物在待测样本中的含量。该计算过程通常可以由生化分析仪或特定蛋白分析仪所带的软件自动计算得到。
在一实施例中，所述待测样本为体液样本。可以是来自人、动物体或其他生物体的体液样本。
在一实施例中，所述待测样本包括但不限于血液、血清、血浆、脑脊液中的至少一种。
在一实施例中，所述目标物主要包括无唾液酸转铁蛋白、单唾液酸转铁蛋白、双唾液酸转铁蛋白中的至少一种。
在一实施例中，所述目标物主要包括无唾液酸转铁蛋白、单唾液酸转铁蛋白、双唾液酸转铁蛋白中的全部。
在一实施例中，所述非目标物主要包括三唾液酸转铁蛋白、四唾液酸转铁蛋白中的至少一种。非目标物即为无唾液酸转铁蛋白、单唾液酸转铁蛋白、双唾液酸转铁蛋白之外的其他类型的转铁蛋白。
在一实施例中，所述非目标物主要包括三唾液酸转铁蛋白、四唾液酸转铁蛋白中的全部。
在一实施例中，所述介质可以包括但不限于纤维素、葡聚糖、琼脂糖、树脂等等中的至少一种。
在一实施例中，通过比浊法检测所述液体中目标物的含量时，使用的试剂盒包含R1试剂、R2试剂中的至少一种。
在一实施例中，所述R1试剂包含如下组分中的至少一种：缓冲剂、无机盐、表面活性剂、保护剂、防腐剂、促凝剂中的至少一种。
在一实施例中，所述R2试剂包含如下组分中的至少一种：缓冲剂、转铁蛋白抗体或转铁蛋白抗体与微球的偶联物、表面活性剂、稳定剂、防腐剂。
R1试剂、R2试剂中的各个组分均可从市场上购买得到。
在一实施例中，所述R1试剂的pH为6.0～9.0，通常可以通过盐酸或氢氧化钠水溶液等试剂调节R1试剂至所需的pH。R1试剂的pH包括但不限于6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0等等。
在一实施例中，所述R1试剂含有如下浓度的组分中的至少一种：10～100mmol/L缓冲剂、0.2～5％(w/v)无机盐、0.005～1％(w/v)表面活性剂、0.1～5％(w/v)保护剂、0.05～1％(w/v)防腐剂、0.1～3％(w/v)促凝剂。前述各浓度均是指对应组分在R1试剂中的终浓度。
R1试剂中缓冲剂的浓度包括但不限于10mmol/L、20mmol/L、30mmol/L、40mmol/L、50mmol/L、60mmol/L、70mmol/L、80mmol/L、90mmol/L、100mmol/L等等。缓冲剂的浓度是指缓冲剂溶质在R1试剂中的终浓度，例如，缓冲剂为Tris-HCl缓冲液时，缓冲剂浓度是指三羟甲基氨基甲烷在R1试剂中的终浓度。
在一实施例中，所述R1试剂中无机盐的浓度包括但不限于0.2％(w/v)、0.3％(w/v)、0.4％(w/v)、0.5％(w/v)、0.6％(w/v)、0.7％(w/v)、0.8％(w/v)、0.9％(w/v)、1％(w/v)、2％(w/v)、3％(w/v)、4％(w/v)、5％(w/v)等等。
在一实施例中，所述R1试剂中表面活性剂的浓度包括但不限于0.005％(w/v)、0.006％(w/v)、0.007％(w/v)、0.008％(w/v)、0.009％(w/v)、0.01％(w/v)、0.02％(w/v)、0.03％(w/v)、0.04％(w/v)、0.05％(w/v)、0.06％(w/v)、0.07％(w/v)、0.08％(w/v)、0.09％(w/v)、0.1％(w/v)、0.2％(w/v)、0.3％(w/v)、0.4％(w/v)、0.5％(w/v)、0.6％(w/v)、0.7％(w/v)、0.8％(w/v)、0.9％(w/v)、1％(w/v)等等。
在一实施例中，所述R1试剂中保护剂的浓度包括但不限于0.1％(w/v)、0.2％(w/v)、0.3％(w/v)、0.4％(w/v)、0.5％(w/v)、0.6％(w/v)、0.7％(w/v)、0.8％(w/v)、0.9％(w/v)、1％(w/v)、2％(w/v)、3％(w/v)、4％(w/v)、5％(w/v)等等。
在一实施例中，所述R1试剂中防腐剂的浓度包括但不限于0.05％(w/v)、0.06％(w/v)、0.07％(w/v)、0.08％(w/v)、0.09％(w/v)、0.1％(w/v)、0.2％(w/v)、0.3％(w/v)、0.4％(w/v)、0.5％(w/v)、0.6％(w/v)、0.7％(w/v)、0.8％(w/v)、0.9％(w/v)、1％(w/v)等等。
在一实施例中，所述R1试剂中促凝剂的浓度包括但不限于0.1％(w/v)、0.2％(w/v)、0.3％(w/v)、0.4％(w/v)、0.5％(w/v)、0.6％(w/v)、0.7％(w/v)、0.8％(w/v)、0.9％(w/v)、1％(w/v)、2％(w/v)、3％(w/v)等等。
在一实施例中，所述R2试剂的pH为7.0～9.0，通常可以通过盐酸或氢氧化钠水溶液等试剂调节R1试剂至所需的pH。R2试剂的pH包括但不限于7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0等等。
在一实施例中，所述R2试剂含有如下浓度的组分中的至少一种：10～500mmol/L缓冲剂、0.05～5％(w/v)转铁蛋白抗体或转铁蛋白抗体与微球的偶联物、0.005～1％(w/v)表面活性剂、0.1～5％(w/v)稳定剂、0.05～1％(w/v)防腐剂。此处各组分的浓度均是指各组分在R2试剂中的终浓度。缓冲剂的浓度是指缓冲剂溶质在组合物中的终浓度，例如，缓冲剂为Tris-HCl缓冲液时，缓冲剂浓度是指三羟甲基氨基甲烷在R2试剂中的终浓度。
在一实施例中，所述R2试剂中的转铁蛋白抗体与微球的偶联物是指转铁蛋白抗体与胶乳微球共价交联形成的复合物。其中所述转铁蛋白抗体可以是鼠或兔的单克隆抗体，也可以是羊或兔的多克隆抗体；所述胶乳微球可以是表面带官能团的胶乳微球，官能团可以包括但不限于羧基、氨基、醛基、氯甲基、巯基、羟基等等中的至少一种。
在一实施例中，所述胶乳微球包括但不限于聚苯乙烯微球、聚丙烯酸微球、聚丙烯酸酯微球中的至少一种。
在一实施例中，所述胶乳微球的粒径可以是50～500nm，优选150-300nm。胶乳微球的粒径包括但不限于50nm、60nm、70nm、80nm、90nm、100nm、110nm、120nm、130nm、140nm、150nm、160nm、170nm、180nm、190nm、200nm、210nm、220n m、230nm、240nm、250nm、260nm、270nm、280nm、290nm、300nm、350nm、400nm、450nm、500nm等等。
在一实施例中，R2试剂中的转铁蛋白抗体与胶乳微球的偶联物的制备方法主要包括通过抗体与聚苯乙烯微球以直接或间接方式共价偶联，共价偶联方法包括但不限于碳二亚胺法、戊二醛法、过碘酸钠法、N-羟基琥珀酰亚胺酯法、马来酰亚胺法等。
在一实施例中，转铁蛋白抗体与胶乳微球的偶联物的制备步骤包括：用10～100mMME S缓冲液(pH为6.0)将羧基聚苯乙烯微球清洗2-3次，然后用上述缓冲液定容至0.5～2％(w/v)，向其中加入碳二亚胺和N-羟基硫代琥珀酰亚胺，室温搅拌15～40分钟进行活化，用10～100mM MES或HEPES缓冲液清洗2-3次，定容至0.5～2％(w/v)，将活化清洗后的微球悬液加入等体积的0.01～0.2％的ADP抗体溶液中，室温搅拌2～4小时，加入封闭剂，继续室温搅拌2-4小时，用10-100mM MES或HEPES缓冲液清洗2～3次，最终分散在合适的储存液中，制得转铁蛋白抗体微球偶联物。
在一实施例中，所述封闭剂包括但不限于牛血清白蛋白、酪蛋白、脱脂奶粉等等中的至少一种。
在一实施例中，所述储存液可以为10～100mM MES或HEPES缓冲液，pH6.5～7.5，添加0.1～2％BSA。
在一实施例中，所述R1试剂、R2试剂中的缓冲剂独立地包括但不限于如下组分中的至少一种：磷酸盐缓冲液、Tris-HCl缓冲液、甘氨酸氢氧化钠缓冲液、硼酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液、HEPES缓冲液、MES缓冲液等等。
MES缓冲液亦称2-(N-吗啉)乙磺酸缓冲液。
在一实施例中，所述R1试剂中的保护剂包括但不限于惰性蛋白、多元醇、多糖等等中的至少一种。
在一实施例中，所述惰性蛋白包括但不限于如下蛋白中的至少一种：牛血清白蛋白(BS A)、酪蛋白、明胶。其中，酪蛋白包括α-酪蛋白、β-酪蛋白，均适用于本发明。
在一实施例中，所述多元醇可以包括但不限于丙三醇(亦称甘油)、山梨糖醇(亦称山梨醇)等等中的至少一种。
在一实施例中，所述多糖可以包括但不限于蔗糖。
在一实施例中，所述R1试剂、R2试剂中的防腐剂独立地包括但不限于叠氮化钠、硫柳汞、ProClin300等等中的至少一种。
在一实施例中，所述R1试剂中的无机盐可以包括但不限于氯化钠、氯化钾、硫酸钠、硫酸钾、硫酸镁等等中的至少一种。
在一实施例中，所述R1试剂、R2试剂中的表面活性剂可以独立地包括但不限于非离子表面活性剂、两性离子表面活性剂、阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂等等中的至少一种。
在一实施例中，所述非离子表面活性剂包括但不限于曲拉通-100、吐温-20、曲拉通-308等等中的至少一种。
吐温-20亦称聚氧乙烯(20)失水山梨醇单月桂酸酯，亦称Tween-20。
在一实施例中，所述R1试剂中的促凝剂包括但不限于聚乙二醇4000、聚乙二醇6000、聚乙二醇8000、葡聚糖20000等等中的至少一种。
在一实施例中，转铁蛋白抗体是指可以与转铁蛋白特异性结合的抗体。该抗体可以从市场上购买得到，可以是分离的天然抗体，也可以是重组抗体。转铁蛋白抗体可以结合各种亚型的转铁蛋白，主要包括无唾液酸转铁蛋白、单唾液酸转铁蛋白、双唾液酸转铁蛋白、三唾液酸转铁蛋白、四唾液酸转铁蛋白。
在一实施例中，所述试剂盒还包含校准品、质控品中的至少一种。
在一实施例中，所述校准品、质控品独立地含有如下组分：缓冲剂、糖缺失性转铁蛋白抗原。缓冲剂包括但不限于如下组分中的至少一种：磷酸盐缓冲液、Tris-HCl缓冲液、甘氨酸氢氧化钠缓冲液、硼酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液、HEPES缓冲液、MES缓冲液等等的至少一种。
在一实施例中，所述校准品、质控品还可以独立地含有保护剂、防腐剂等等。所述校准品、质控品中的保护剂、防腐剂可以与R1试剂、R2试剂中对应的保护剂、防腐剂相同或不同。校准品、质控品中的保护剂独立地包括但不限于惰性蛋白、多元醇、多糖等等中的至少一种。校准品、质控品中的防腐剂包括但不限于叠氮化钠、硫柳汞、ProClin300等等中的至少一种。
在一实施例中，校准品、质控品中的转铁蛋白抗原可以独立地为人转铁蛋白天然抗原或重组抗原。
在一实施例中，本发明提供的糖缺失性转铁蛋白免疫比浊法测定试剂盒可用于测定血清、血浆或脑脊液样本中的糖缺失性转铁蛋白含量，还可用于测定糖缺失性转铁蛋白占转铁蛋白的比率。
在一实施例中，转铁蛋白的含量的测定方法可以包括如下步骤：取适量的血清、血浆或脑脊液样本和R1试剂混匀，孵育1～5分钟后，加入R2试剂，仪器读点记为A1，在340～800nm的特定波长下检测透射或散射光信号，继续孵育1～5分钟，仪器读点记为A2，在340～800nm的特定波长下检测透射或散射光信号，记录加入R2试剂后的反应终点A2和反应起始点A1的光信号差值，即反应终点A2与反应起始点A1的透射或散射光信号变化幅度，带入标准曲线中，即可计算样本中转铁蛋白的含量。此处的转铁蛋白包含无唾液酸转铁蛋白、单唾液酸转铁蛋白、双唾液酸转铁蛋白、三唾液酸转铁蛋白、四唾液酸转铁蛋白等各种类型的转铁蛋白。在一实施例中，糖缺失性转铁蛋白的含量的测定方法可以包括如下步骤：取适量的血清、血浆或脑脊液样本50～300μL加到样本处理柱中，室温放置10～20分钟，低速离心10s～1min后，收集流穿液再和R1试剂混匀，孵育1～5分钟后，加入R2试剂，仪器读点记为A3，在340～800nm的特定波长下检测透射或散射光信号，继续孵育1～5分钟后，仪器读点记为A4，在340～800nm的特定波长下检测透射或散射光信号，记录加入R2试剂后的反应终点A4和加入R2试剂的反应起始点A3的光信号差值，即反应终点A4与反应起始点A3的透射或散射光信号变化幅度，带入标准曲线中，即可计算样本中糖缺失性转铁蛋白的含量。本发明可应用于糖缺失性转铁蛋白免疫比浊法测定试剂盒，检测原理可以是透射比浊法或散射比浊法，检验仪器可适用但不限于生化分析和特定蛋白分析仪。
吸附结束后，还可以通过离心，使得流穿液快速流出。由于血清通常比较粘稠，因此，离心的目的在于加速样本处理柱中液体样本的流出，如果样本不粘稠，也可以不离心，换言之，离心为非必需步骤，可根据样本的粘稠程度确定是否需要离心。装柱和平衡是已经处理好放在试剂盒里，使用者只需上样，简单离心后获取流穿液，即为含CDT的样本。通常，由于血清通常比较粘稠，因此，离心可以加速样本流出，使用者使用方便。
根据第三方面，在一实施例中，提供一种介质在检测糖缺失性转铁蛋白中的用途，所述介质与含有目标物以及非目标物的待测样本接触后，所述介质吸附非目标物，目标物保留在液体中，所述目标物为糖缺失性转铁蛋白。通过收集液体，通过比浊法等方法检测液体中目标物的含量，即可得到待测样本中目标物的含量。
在一实施例中，非目标物即为糖缺失性转铁蛋白之外的其他类型的转铁蛋白。
在一实施例中，所述介质所述介质可以包括但不限于纤维素、葡聚糖、琼脂糖、树脂等等。
在一实施例中，所述介质偶联有配基。配基起到特异性吸附非目标物，从而使得非目标物与目标物分离的作用。
介质通常预装于样本处理柱中，将待测样本加入样本处理柱中，介质上的配基吸附非目标物，而目标物保留在液体中，收集液体，即可检测目标物的含量。
将待测样本加入样本处理柱后，可以通过静置等方式，使得介质上的配基充分吸附非目标物。吸附结束后，可以通过低速离心等方式收集流穿液。由于血清等样本通常比较粘稠，因此，离心可以加速处理柱中的液体流出。
在一些实施例中，所述配基包括但不限于阴离子交换配基、阳离子交换配基、疏水配基、亲和配基等等中的至少一种。
在一些实施例中，所述阴离子交换配基、阳离子交换配基包括但不限于N,N-二乙基氨基乙基、N,N-二乙基氨基-2-羟丙基、羧甲基、磺丙基等等中的至少一种。
在一些实施例中，所述疏水配基包括但不限于丁基、丁硫基、辛基、苯基等等中的至少一种。
在一些实施例中，所述亲和配基包括但不限于凝集素。
在一些实施例中，所述凝集素可以包括但不限于豌豆凝集素(PSA)、植物血球凝集素(P HA)、刀豆凝集素A(Concanavalin A，缩写ConA)、扁豆凝集素(LCA)等等中的至少一种。
刀豆凝集素A亦称刀豆凝集素A、刀豆球蛋白A、伴刀豆球蛋白、刀豆素，是一种植物血凝素(Phytohemagglutin)。
在一些实施例中，所述目标物、非目标物如第一方面或第二方面所定义。
根据第四方面，在一实施例中，提供一种试剂盒，包含介质、R1试剂、R2试剂，所述介质用于与待测样本接触，待测样本为含有目标物以及非目标物的液体，所述介质吸附非目标物，目标物保留在所述液体中，通过收集液体，即可检测液体中目标物的含量，从而计算得到待测样本中目标物的含量。
在一实施例中，所述介质、R1试剂、R2试剂如第一方面或第二方面所定义。
在一实施例中，所述试剂盒还包含标准品、质控品中的至少一种。
在一实施例中，所述标准品、质控品如第二方面所定义。
在一实施例中，本发明提供一种糖缺失性转铁蛋白定量检测试剂盒、制备方法及其应用。本发明提供的糖缺失性转铁蛋白检测试剂盒，是利用普通免疫比浊法或胶乳增强免疫比浊法，配套全自动生化分析仪或特定蛋白分析仪进行检测。
在一实施例中，本发明可测试血清、血浆或脑脊液等样本中转铁蛋白和糖缺失性转铁蛋白的含量，可进行高通量的测试。
在一实施例中，本发明通过直接测试样本可得到转铁蛋白的含量，通过对样本一步法简单处理，可获得样本中糖缺失性转铁蛋白的含量，从而计算得到糖缺失性转铁蛋白占转铁蛋白的比率。
在一实施例中，本发明涉及的聚苯乙烯微球、偶联封闭剂、偶联活化剂(如碳二亚胺和N-羟基硫代琥珀酰亚胺等等)、样本处理介质等均可以通过购买获得。
在一实施例中，本发明提供的糖缺失性转铁蛋白免疫比浊法测定试剂盒，通过使用同一样本，未经处理的样本中含有转铁蛋白(包括无唾液酸转铁蛋白、单唾液酸转铁蛋白、双唾液酸转铁蛋白、三唾液酸转铁蛋白、四唾液酸转铁蛋白等各种亚型的转铁蛋白)，处理后的样本几乎只含有糖缺失性转铁蛋白(主要包括无唾液酸转铁蛋白、单唾液酸转铁蛋白、双唾液酸转铁蛋白)，通过检测糖缺失性转铁蛋白的含量和糖缺失性转铁蛋白占转铁蛋白的比率两个指标，可准确评价酒精性肝病的状态。
在一实施例中，也可以不对未经样本处理柱处理的样本进行转铁蛋白检测，直接将待测样本加入样本处理柱中进行处理，收集流穿液，检测流穿液中的糖缺失性转铁蛋白得含量，从而得到待测样本中糖缺失性转铁蛋白的含量。
在一实施例中，本发明提供的糖缺失性转铁蛋白免疫比浊法测定试剂盒，应用于生化分析仪或特定蛋白分析仪中，实现样本大批量和高通量测试，满足临床需求。
在一实施例中，本发明提供的糖缺失性转铁蛋白免疫比浊法测定试剂盒，原料获取容易、制备工艺成熟、可大规模生产、批次稳定、成本低廉，试剂盒性能稳定。
以下实施例中，如无特别说明，调节pH所用的酸溶液为2～3mol/L盐酸，所用的碱溶液为1mol/L氢氧化钠水溶液。
以下实施例中，如无特别说明，R1试剂、R2试剂均是在室温(23℃±2℃)下配制，样本中加入R2试剂后的检测实验均是在生化反应最适温度(37℃±0.5℃)条件下进行，检测过程中的温度由生化分析仪自动控制。
实施例1
本实施例制备糖缺失性转铁蛋白免疫比浊法测定试剂盒1
本实施例提供的样本处理柱购自Solarbio LIFE SCIENCES，货号：S8801，样本处理柱中的介质为DEAE-琼脂糖凝胶FF。DEAE为N,N-二乙基氨基乙基，此为可特异性吸附非目标物的配基。
R1试剂的组成如下：
表1
组分 每升用量
无水磷酸氢二钠 1.15g
二水磷酸二氢钠 0.23g
氯化钠 0.9g
曲拉通X-100 0.1mL(约0.11g)
叠氮化钠 0.95g
聚乙二醇-8000 5g
在烧杯中先加入部分纯化水，然后将烧杯置于磁力搅拌器上，中速搅拌，按上表1投入上述物料，搅拌至物料完全溶解，并用纯化水定容至1L，制得的R1试剂的pH约为7.4。
R2试剂的组成如下：
表2
组分 每升用量
无水磷酸氢二钠 1.15g
二水磷酸二氢钠 0.23g
吐温-20 0.1mL
牛血清白蛋白 1g
叠氮化钠 0.95g
转铁蛋白抗体 2g
在烧杯中先加入部分纯化水，然后将加有部分纯化水的烧杯置于磁力搅拌器上，中速搅拌，按上表投入上述物料，搅拌至物料完全溶解，并用纯化水定容至1L，制得的R2试剂的pH约为7.4。
实施例2
本实施例制备糖缺失性转铁蛋白免疫比浊法测定试剂盒2
本实施例提供的样本处理柱购自Sigma-Aldrich，货号：L0511，样本处理柱中的介质为扁豆凝集素琼脂糖凝胶。
R1试剂的组成如下：
表3
组分 每升用量
无水磷酸氢二钠 1.15g
二水磷酸二氢钠 0.23g
氯化钠 2g
曲拉通X-100 0.05mL
叠氮化钠 0.95g
聚乙二醇-6000 4.5g
在烧杯中先加入部分纯化水，然后将加有部分纯化水的烧杯置于磁力搅拌器上，中速搅拌，按上表投入上述物料，搅拌至物料完全溶解，并用纯化水定容至1L，制得的R1试剂的pH约为7.4。
R2试剂的组成如下：
表4
在烧杯中先加入部分纯化水，然后将加有部分纯化水的烧杯置于磁力搅拌器上，中速搅拌，按上表投入上述物料，搅拌至物料完全溶解，并用纯化水定容至1L，制得的R2试剂的pH约为7.4。
实施例3
本实施例制备糖缺失性转铁蛋白免疫比浊法测定试剂盒3
本实施例提供的样本处理柱购自Solarbio LIFE SCIENCES，货号：S8771，样本处理柱中的介质为ConA-琼脂糖凝胶4B。
R1试剂的组成如下：
表5
组分 每升用量
无水磷酸氢二钠 1.15g
二水磷酸二氢钠 0.23g
氯化钠 2g
曲拉通X-100 0.05mL
叠氮化钠 0.95g
聚乙二醇-6000 4.5g
在烧杯中先加入部分纯化水于磁力搅拌器上，中速搅拌，按上表投入上述物料，搅拌至物料完全溶解，并用纯化水定容至1L，制得的R1试剂的pH约为7.4。
R2试剂的组成如下：
表6
组分 每升用量
三羟甲基氨基甲烷 12.1g
蔗糖 10g
吐温-20 0.05mL
牛血清白蛋白 1g
叠氮化钠 0.95g
转铁蛋白抗体偶联物 1.3g
在烧杯中先加入部分纯化水于磁力搅拌器上，中速搅拌，按上表投入上述物料，搅拌至物料完全溶解，用盐酸调节pH值至7.5，并用纯化水定容至1L，制得的R2试剂的pH约为7.4。
转铁蛋白抗体偶联物的制备方法如下：
本实施例的羧基聚苯乙烯微球平均粒径约为244nm，购自JSR公司，货号P0220。
用50mM MES缓冲液(pH为6.0)将羧基聚苯乙烯微球清洗3次，然后用上述缓冲液定容至羧基聚苯乙烯微球的浓度为1％(w/v)，向其中加入过量于羧基密度的碳二亚胺和N-羟基硫代琥珀酰亚胺，室温搅拌30分钟进行活化，用50mM MES缓冲液(pH6.0)清洗3次，定容至混合液中羧基聚苯乙烯微球的浓度为1％(w/v)。将活化清洗后的微球悬液加入等体积的0.05％的转铁蛋白抗体溶液(即转铁蛋白抗体浓度为0.5mg/mL)中，室温搅拌2小时，加入十分之一体积(加入封闭剂前，封闭剂的体积为混合液体积的十分之一)的封闭剂，继续室温搅拌2小时，用50mM HEPES缓冲液(pH为7.5)清洗3次，最终分散在合适的缓冲液中，所得分散液中羧基聚苯乙烯微球的终浓度为0.13％(w/v)，所得分散液即为转铁蛋白抗体偶联物。本实施例的转铁蛋白抗体为转铁蛋白羊抗人多克隆抗体，生产商：北京阿匹斯生物科技有限公司，货号：CA0013C。封闭剂可以为牛血清白蛋白、酪蛋白、脱脂奶粉等，本实施例具体为牛血清白蛋白。
实施例4
本实施例进行糖缺失性转铁蛋白免疫比浊法测定试剂盒性能评估
本实施例从实施例1、2、3中随机选择一个实施例，具体选择实施例1的糖缺失性转铁蛋白免疫比浊法测定试剂盒进行性能评估，具体地对线性范围、方法学比对和重复性的性能进行评估。
测试仪器：日立7180生化分析仪。
测试条件(CDT)：取100μL血清样本加入样本处理柱中，室温孵育10分钟，离心10秒后收集流穿液，取2μL流穿液和200μL R1试剂混匀，孵育5分钟后，加入50μL R2试剂，继续孵育5分钟，在600nm的特定波长下检测透射光信号(信号值由日立7180生化分析仪根据反应液的浊度自动检测计算得到)，记录加入R2试剂后反应终点和反应起始点幅度的差值，带入图1的标准曲线中，即可计算样本中糖缺失性转铁蛋白的含量。
离心时，整个处理柱放置于离心机中，处理柱下部套设有收集液体的收集管。
本实施例使用的离心机为低速离心机，货号：DM0412，生产商：大龙兴创实验仪器(北京)股份公司，2mL离心管，转数1000rpm-5000rpm，室温离心。
保留在介质上的是三、四唾液酸CDT，其他亚型的转铁蛋白在流穿液中。
单独检测血清样本中的CDT浓度，或者检测血清样本中，CDT占转铁蛋白的百分比(即％CDT)，均可以评价酒精肝的病情，通常，用％CDT进行评价更准确。
测试条件(TRF)：取2μL血清样本和200μL R1试剂混匀，孵育5分钟后，加入50μL R2试剂，继续孵育5分钟，在600nm的特定波长下检测透射光信号(信号值由日立7180生化分析仪根据反应液的浊度自动检测计算得到)，记录加入R2试剂后反应终点和反应起始点幅度的差值，带入图1的标准曲线中，即可计算样本中转铁蛋白的含量。
质控品的缓冲液组成同校准品中的缓冲液。
配制校准品、质控品所使用的转铁蛋白抗原购自Sigma-Aldrich，货号：T3309。
校准品、质控品是由转铁蛋白抗原溶解在缓冲液中配制而成，缓冲液的组成如下：20mM PBS缓冲液、1％BSA，pH为7.4。
图1为本实施例根据校准品浓度与测得的反应度拟合得到的校准曲线，图1中，纵坐标为反应度，具体是由日立7180生化分析仪计算得到的透射光信号值，横坐标为各个校准品的浓度。
试剂评估结果如下：
1、线性范围
用经样本处理柱处理后的低浓度糖缺失性转铁蛋白血清样本和高浓度糖缺失性转铁蛋白血清样本按下表混合成6个稀释浓度。用实施例1制备的试剂盒分别对混合样本进行测试，每个浓度测试3次，计算相关系数和偏差。
表7
稀释梯度 浓度1 浓度2 浓度3 浓度4 浓度5 浓度6
低浓度样本体积 1mL 0.8mL 0.6mL 0.4mL 0.2mL 0
高浓度样本体积 0 0.2 mL 0.4mL 0.6 mL 0.8mL 1mL
其中低浓度样本的浓度为20mg/L，高浓度样本的浓度为660mg/L。
测试结果如下：
表8
其中绝对偏差＝|均值-回归值|；相对偏差＝[(均值-回归值)/回归值]×100％。“/”表示不统计，稀释浓度小于100mg/L时考察绝对偏差，大于100mg/L时考察相对偏差。
图2所示为各稀释浓度与测试均值的线性范围曲线，试剂盒在[20.0，660.0]mg/L区间内，k为1.0092，b为2.8662，线性相关系数R为0.9998，在[20.0，100.0]mg/L区间内，线性绝对偏差未超过±5mg/L，在(100.0，660.0]mg/L范围内，线性相对偏差未超过±5％。
2、方法学比对
取40例新鲜血清，用糖缺失转铁蛋白测定试剂盒(乳胶增强散射比浊法)测试，该试剂盒购自德国西门子医学诊断产品有限公司(简称西门子公司)，试剂盒名称为N LatexCDT Kit，参照其产品说明书进行测试。同时用本发明实施例1的试剂盒结合实施例4的方法(表9、表10中简称本发明法)测定试剂盒测试，用线性回归法计算两组测试值的相关系数。
西门子试剂盒是直接测血清中的CDT，该试剂盒中有特异性的CDT抗体。西门子试剂盒的测试方法是分别测试CDT和TRF，用免疫比浊法，分别得到CDT和TRF测试值，再计算比值。
表9
表10
表10中，“％CDT”表示血清样本中糖缺失性转铁蛋白占转铁蛋白的比率，该比率具体为质量百分比。
图3和图4显示了西门子测试值与本发明实施例1的试剂盒结合实施例4的方法所得的测试值的线性回归分析结果，其中CDT浓度的相关性R2＝0.9962，R＝0.9981；％CDT相关性R2＝0.9912，R＝0.9956。上述结果表明，本发明实施例1的试剂盒测值准确性高。
3、重复性实验
使用实施例1的糖缺失性转铁蛋白测定试剂盒分别对低、中、高3个浓度的血清样本重复测试10次，计算变异系数。
表11
可见，低、中、高浓度血清测试10次的变异系数分别为2.08％、1.06％、1.55％，说明试剂盒具有良好的重复性。
以上结果表明，应用本发明任意一实施例制备的糖缺失性转铁蛋白免疫比浊法测定试剂盒性能良好，线性相关系数R＝0.9998；40例样本与西门子试剂比对的相关性R＝0.9981；重复测试样品10次，变异系数在5％以内。
实施例2、3的试剂盒检测结果类似于实施例1。
以上应用了具体个例对本发明进行阐述，只是用于帮助理解本发明，并不用以限制本发明。对于本发明所属技术领域的技术人员，依据本发明的思想，还可以做出若干简单推演、变形或替换。

Claims (10)

1.一种分离糖缺失性转铁蛋白的方法，其特征在于，包括：使含有目标物以及非目标物的液体与介质接触，接触后不对介质进行洗脱直接收集液体，所述介质特异性吸附非目标物，所述液体中保留目标物，所述目标物为糖缺失性转铁蛋白；所述介质偶联有用于特异性吸附非目标物的配基，所述配基包括阴离子交换配基、阳离子交换配基、疏水配基、亲和配基中的至少一种；
所述阴离子交换配基、阳离子交换配基包括N,N-二乙基氨基乙基、N,N-二乙基氨基-2-羟丙基、羧甲基、磺丙基中的至少一种；
所述疏水配基包括丁基、丁硫基、辛基、苯基中的至少一种；
所述亲和配基包括凝集素，所述凝集素包括豌豆凝集素、植物血球凝集素、刀豆凝集素A、扁豆凝集素中的至少一种。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述介质预装于样本处理柱中，将含有目标物以及非目标物的液体加入样本处理柱中，所述介质特异性吸附非目标物后，样本处理柱的流穿液即为含有目标物的液体；
和/或，所述介质特异性吸附非目标物后，对样本处理柱进行离心，得到的流穿液即为含有目标物的液体。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述含有目标物以及非目标物的液体包括人、动物体或其他生物体的体液样本；
和/或，所述含有目标物以及非目标物的液体包括血液、血清、血浆、脑脊液中的至少一种；
和/或，所述目标物包括无唾液酸转铁蛋白、单唾液酸转铁蛋白、双唾液酸转铁蛋白中的至少一种；
和/或，所述非目标物包括三唾液酸转铁蛋白、四唾液酸转铁蛋白中的至少一种；
和/或，所述目标物包括无唾液酸转铁蛋白、单唾液酸转铁蛋白、双唾液酸转铁蛋白中的全部；
和/或，所述非目标物包括三唾液酸转铁蛋白、四唾液酸转铁蛋白中的全部；
和/或，所述介质包括纤维素、葡聚糖、琼脂糖、树脂中的至少一种。
4.一种检测糖缺失性转铁蛋白的方法，其特征在于，包括：
目标物分离步骤，包括使待测样本与介质接触，所述待测样本为含有目标物以及非目标物的液体，接触后不对介质进行洗脱直接收集液体，所述介质吸附待测样本中的非目标物，所述液体中保留目标物；所述介质偶联有用于特异性吸附非目标物的配基，所述配基吸附非目标物之后，目标物保留在液体中，从而使得非目标物与目标物从液体中分离；所述配基包括阴离子交换配基、阳离子交换配基、疏水配基、亲和配基中的至少一种；所述阴离子交换配基、阳离子交换配基包括N,N-二乙基氨基乙基、N,N-二乙基氨基-2-羟丙基、羧甲基、磺丙基中的至少一种；所述疏水配基包括丁基、丁硫基、辛基、苯基中的至少一种；所述亲和配基包括凝集素，所述凝集素包括豌豆凝集素、植物血球凝集素、刀豆凝集素A、扁豆凝集素中的至少一种；
检测步骤，包括检测所述液体中目标物的含量，所述目标物为糖缺失性转铁蛋白。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述介质预装于样本处理柱中，将含有目标物以及非目标物的液体加入样本处理柱中，所述介质特异性吸附非目标物后，样本处理柱的流穿液即为含有目标物的液体；
和/或，所述介质特异性吸附非目标物后，对样本处理柱进行离心，得到的流穿液即为含有目标物的液体。
6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，检测步骤中，通过比浊法检测所述液体中目标物的含量；
和/或，所述比浊法包括透射比浊法、散射比浊法中的至少一种；
和/或，检测步骤中，检测经介质吸附非目标物后的液体中目标物的含量，然后计算得到目标物在待测样本中的含量；
和/或，所述待测样本为体液样本；
和/或，所述待测样本包含血液、血清、血浆、脑脊液中的至少一种；
和/或，所述目标物包括无唾液酸转铁蛋白、单唾液酸转铁蛋白、双唾液酸转铁蛋白中的至少一种；
和/或，所述目标物包括无唾液酸转铁蛋白、单唾液酸转铁蛋白、双唾液酸转铁蛋白中的全部；
和/或，所述非目标物主要包括三唾液酸转铁蛋白、四唾液酸转铁蛋白中的至少一种；
和/或，所述非目标物主要包括三唾液酸转铁蛋白、四唾液酸转铁蛋白中的全部；
和/或，所述介质包括纤维素、葡聚糖、琼脂糖、树脂中的至少一种；
和/或，通过比浊法检测所述液体中目标物的含量时，使用的试剂盒包含R1试剂、R2试剂中的至少一种；
和/或，所述R1试剂包含如下组分中的至少一种：缓冲剂、无机盐、表面活性剂、保护剂、防腐剂、促凝剂中的至少一种；
和/或，所述R1试剂含有如下浓度的组分中的至少一种：10～100mmol/L缓冲剂、0.2～5％(w/v)无机盐、0.005～1％(w/v)表面活性剂、0.1～5％(w/v)保护剂、0.05～1％(w/v)防腐剂、0.1～3％(w/v)促凝剂；
和/或，所述R2试剂包含如下组分中的至少一种：缓冲剂、转铁蛋白抗体或转铁蛋白抗体与微球的偶联物、表面活性剂、稳定剂、防腐剂；
和/或，所述R2试剂含有如下浓度的组分中的至少一种：10～500mmol/L缓冲剂、0.05～5％(w/v)转铁蛋白抗体或转铁蛋白抗体与微球的偶联物、0.005～1％(w/v)表面活性剂、0.1～5％(w/v)稳定剂、0.05～1％(w/v)防腐剂；
和/或，所述R1试剂的pH为6.0～9.0；
和/或，所述R2试剂的pH为7.0～9.0；
和/或，所述R2试剂中的转铁蛋白抗体与微球的偶联物是指转铁蛋白抗体与胶乳微球共价交联形成的复合物；
和/或，所述胶乳微球包括聚苯乙烯微球、聚丙烯酸微球、聚丙烯酸酯微球中的至少一种；
和/或，所述胶乳微球的粒径为50～500nm；
和/或，所述R1试剂、R2试剂中的缓冲剂独立地包括如下组分中的至少一种：磷酸盐缓冲液、Tris-HCl缓冲液、甘氨酸氢氧化钠缓冲液、硼酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液、HEPES缓冲液、MES缓冲液；
和/或，所述R1试剂中的保护剂包括惰性蛋白、多元醇、多糖中的至少一种；
和/或，所述惰性蛋白包括如下蛋白中的至少一种：牛血清白蛋白(BSA)、酪蛋白、明胶；
和/或，所述多元醇包括丙三醇、山梨糖醇中的至少一种；
和/或，所述多糖包括蔗糖；
和/或，所述R1试剂、R2试剂中的防腐剂独立地包括叠氮化钠、硫柳汞、ProClin300中的至少一种；
和/或，所述R1试剂中的无机盐包括氯化钠、氯化钾、硫酸钠、硫酸钾、硫酸镁中的至少一种；
和/或，所述R1试剂、R2试剂中的表面活性剂独立地包含非离子表面活性剂、两性离子表面活性剂、阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂中的至少一种；
和/或，所述非离子表面活性剂包括曲拉通-100、吐温-20、曲拉通-308中的至少一种；
和/或，所述R1试剂中的促凝剂包含聚乙二醇4000、聚乙二醇6000、聚乙二醇8000、葡聚糖20000中的至少一种；
和/或，所述转铁蛋白抗体为可与转铁蛋白特异性结合的抗体；
和/或，所述试剂盒还包含校准品、质控品中的至少一种。
7.一种介质在检测糖缺失性转铁蛋白中的用途，其特征在于，所述介质与含有目标物以及非目标物的待测样本接触后，不对介质进行洗脱直接收集液体，所述介质吸附非目标物，目标物保留在液体中，所述目标物为糖缺失性转铁蛋白；所述介质偶联有用于特异性吸附非目标物的配基，所述配基吸附非目标物之后，目标物保留在液体中，从而使得非目标物与目标物从液体中分离；所述配基包括阴离子交换配基、阳离子交换配基、疏水配基、亲和配基中的至少一种；所述阴离子交换配基、阳离子交换配基包括N,N-二乙基氨基乙基、N,N-二乙基氨基-2-羟丙基、羧甲基、磺丙基中的至少一种；所述疏水配基包括丁基、丁硫基、辛基、苯基中的至少一种；所述亲和配基包括凝集素，所述凝集素包括豌豆凝集素、植物血球凝集素、刀豆凝集素A、扁豆凝集素中的至少一种。
8.如权利要求7所述的用途，其特征在于，所述介质为权利要求1～3任意一项所述方法中的介质。
9.一种试剂盒，其特征在于，包含介质、R1试剂、R2试剂，所述介质用于与待测样本接触，接触后不对介质进行洗脱直接收集液体，所述待测样本为含有目标物以及非目标物的液体，所述介质用于吸附非目标物，目标物保留在所述液体中；所述介质偶联有用于特异性吸附非目标物的配基，所述配基吸附非目标物之后，目标物保留在液体中，从而使得非目标物与目标物从液体中分离；所述配基包括阴离子交换配基、阳离子交换配基、疏水配基、亲和配基中的至少一种；所述阴离子交换配基、阳离子交换配基包括N,N-二乙基氨基乙基、N,N-二乙基氨基-2-羟丙基、羧甲基、磺丙基中的至少一种；所述疏水配基包括丁基、丁硫基、辛基、苯基中的至少一种；所述亲和配基包括凝集素，所述凝集素包括豌豆凝集素、植物血球凝集素、刀豆凝集素A、扁豆凝集素中的至少一种。
10.如权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述介质为权利要求1～3任意一项所述方法中的介质；
和/或，所述R1试剂、R2试剂为权利要求6所述方法中的R1试剂、R2试剂；
和/或，所述试剂盒还包含校准品、质控品中的至少一种。
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