CN113049836A - 一种组合物及其脂联素检测试剂盒 - Google Patents

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Abstract

一种组合物及其脂联素检测试剂盒，所述组合物含有有机酸盐。通过向检测试剂中加入有机酸盐，有效提高低浓度反应信号值，进而提高脂联素检测灵敏度。

Description

一种组合物及其脂联素检测试剂盒
技术领域
本发明涉及医学检测技术领域，具体涉及一种组合物及其脂联素检测试剂盒。
背景技术
脂联素(Adiponectin)又被称为ADPN、Acrp30、AdipoQ、apM1或GBP28，是脂肪细胞分泌的脂类或糖类代谢的重要调控因子。ADPN在血液循环中以低分子量三聚体、六聚体和高分子量复合体形式存在，高分子量复合体是ADPN代谢作用的主要活性形式。临床研究发现，正常人血循环中含有丰富的脂联素，其血浆总脂联素浓度为3～30.0mg/L，约占血浆蛋白总量的0.01％。肥胖、糖尿病及冠心病患者脂联素水平显著降低，是冠心病发病的独立危险因素。脂联素是最新发现由脂肪细胞特异性高表达并分泌到血清中的特殊蛋白质，因其具有抗糖尿病、抗动脉粥样硬化、抗炎症，防止肝纤维化、抑制肿瘤生长，影响骨代谢等重要特性，已成为国内外学者研究的热点。
脂联素是新近发现的糖尿病预测指标，低血清脂联素水平说明个体糖尿病患病风险高。动态监测血清脂联素水平可能了解Ⅱ型糖尿病的发展程度，低脂联素水平是排除年龄、血压、血脂、吸烟等因素之外的糖尿病风险预测独立指标。检测脂联素可确定糖尿病高风险人群，并进行生活管理，能够有效降低Ⅱ型糖病发风险。因此，ADPN的临床检测具有巨大的市场潜力。
目前市场上出现的脂联素检测试剂盒有酶联免疫法、化学发光法和胶乳免疫比浊法检测试剂盒等等。酶联免疫法操作步骤繁琐，检测时间长，灵敏度和线性范围有一定局限，不能批量测试；化学发光法需要昂贵的仪器配套，检测用时较长；而作为Ⅱ型糖尿病的早期预测指标，胶乳免疫比浊法配套全自动生化分析仪或特定蛋白分析仪，能实现高通量、快速测试，同时又能兼顾精密度和灵敏度高的优点，有很大市场前景。但市售的脂联素比浊试剂盒灵敏度有限，且无法与特定蛋白分析仪通用。因此，市场上急需灵敏度高、特异性好、检测速度快的脂联素测定试剂盒。
发明内容
根据第一方面，一种实施例中提供一种用于检测脂联素的组合物，所述组合物含有有机酸盐。该组合物可以作为脂联素检测试剂盒的R1试剂，该组合物主要用于免疫比浊法检测脂联素。
根据第二方面，一种实施例中提供一种用于检测脂联素的试剂组合，包括第一方面所述组合物。
根据第三方面，一种实施例中提供一种试剂盒，包括第一方面所述组合物，或第二方面所述试剂组合。
根据第四方面，一种实施例中提供第一方面所述组合物，或第二方面所述试剂组合，或第三方面所述试剂盒在检测脂联素中的应用。
根据第五方面，一种实施例中提供有机酸盐在制备脂联素检测试剂盒中的应用。
根据第六方面，一种实施例中提供封闭剂在制备脂联素检测试剂盒中的应用，所述封闭剂含有如下组分：a)含游离氨基的小分子；以及b)含游离氨基的高分子聚合物，和/或生物大分子或其混合物，和/或生物大分子的可药用盐。
依据上述实施例的组合物及其脂联素检测试剂盒，通过向检测试剂中加入有机酸盐，有效提高低浓度反应信号值，进而提高脂联素检测灵敏度。
附图说明
图1为一种实施例的标准曲线图；
图2为一种实施例的ADPN测试均值与ADPN稀释浓度的线性范围曲线图；
图3为一种实施例中实验组2的试剂盒的ADPN测试值与日本荣研试剂盒的ADPN测试值的相关性曲线图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。其中不同实施方式中类似元件采用了相关联的类似的元件标号。在以下的实施方式中，很多细节描述是为了使得本申请能被更好的理解。然而，本领域技术人员可以毫不费力的认识到，其中部分特征在不同情况下是可以省略的，或者可以由其他元件、材料、方法所替代。在某些情况下，本申请相关的一些操作并没有在说明书中显示或者描述，这是为了避免本申请的核心部分被过多的描述所淹没，而对于本领域技术人员而言，详细描述这些相关操作并不是必要的，他们根据说明书中的描述以及本领域的一般技术知识即可完整了解相关操作。
另外，说明书中所描述的特点、操作或者特征可以以任意适当的方式结合形成各种实施方式。同时，方法描述中的各步骤或者动作也可以按照本领域技术人员所能显而易见的方式进行顺序调换或调整。因此，说明书和附图中的各种顺序只是为了清楚描述某一个实施例，并不意味着是必须的顺序，除非另有说明其中某个顺序是必须遵循的。
本文中为部件所编序号本身，例如“第一”、“第二”等，仅用于区分所描述的对象，不具有任何顺序或技术含义。而本申请所说“连接”、“联接”，如无特别说明，均包括直接和间接连接(联接)。
本文中，“％(w/v)”表示质量体积比，亦可表示为“％w/v”，w/v是指kg/L，例如，1％(w/v)表示0.01kg/L，即10g/L。
目前，传统的用于提高免疫比浊试剂灵敏度的方法包括：1、增加微球粒径；2、减小测试波长；3、R1试剂中添加适量的促凝剂；4、选择亲和力更高的抗体；5、增加样本用量等等。其中方法1会降低R2试剂的稳定性和分散性；方法2只是增强信号值度数，不能从本质上增加灵敏度；方法3会使反应非特异性增强，增大空白吸光度，信噪比降低；方法4受抗体制备工艺的局限，并取决于抗体供应商的质量；方法5虽能提高灵敏度，但也降低了线性范围，增加了HOOK效应的风险。
根据第一方面，在一实施例中，提供一种用于检测脂联素的组合物，所述组合物含有有机酸盐。该组合物可以作为脂联素检测试剂盒的R1试剂。该组合物主要用于免疫比浊法检测脂联素。
在一实施例中，所述有机酸盐包括含游离氨基的有机酸盐。
在一实施例中，所述有机酸盐包括但不限于苄脒盐酸盐、苄胺盐酸盐、2-氨基-2-噻唑啉盐酸盐等等中的至少一种。
在一实施例中，所述组合物中有机酸盐的浓度可以为0.01-1％(w/v)，包括但不限于0.01％(w/v)、0.02％(w/v)、0.03％(w/v)、0.04％(w/v)、0.05％(w/v)、0.06％(w/v)、0.07％(w/v)、0.08％(w/v)、0.09％(w/v)、0.1％(w/v)、0.2％(w/v)、0.3％(w/v)、0.4％(w/v)、0.5％(w/v)、0.6％(w/v)、0.7％(w/v)、0.8％(w/v)、0.9％(w/v)、1％(w/v)等等。
在一实施例中，所述组合物中有机酸盐的浓度可以为0.5-1％(w/v)。
在一实施例中，所述组合物还含有如下组分中的至少一种：缓冲剂、无机盐、表面活性剂、保护剂、促凝剂、防腐剂。
在一实施例中，所述组合物还含有如下浓度的组分中的至少一种：10-100mmol/L缓冲剂、0.2-5％(w/v)无机盐、0.005-1％(w/v)表面活性剂、0.1-5％(w/v)保护剂、0.05-1％(w/v)防腐剂、0.1-3％(w/v)促凝剂。此处各组分的浓度是指各组分在组合物中的浓度。
在一实施例中，所述组合物还含有如下浓度的组分：10-100mmol/L缓冲剂、0.2-5％(w/v)无机盐、0.005-1％(w/v)表面活性剂、0.1-5％(w/v)保护剂、0.05-1％(w/v)防腐剂、0.1-3％(w/v)促凝剂。此处各组分的浓度是指各组分在组合物中的浓度。
浓度“mmol/L”亦可简写为“mM”。
在一实施例中，所述组合物中缓冲剂的浓度包括但不限于10mmol/L、20mmol/L、30mmol/L、40mmol/L、50mmol/L、60mmol/L、70mmol/L、80mmol/L、90mmol/L、100mmol/L等等。缓冲剂的浓度是指缓冲剂溶质在组合物中的终浓度，例如，缓冲剂为Tris-HCl缓冲液时，缓冲剂浓度是指三羟甲基氨基甲烷在组合物中的终浓度。
在一实施例中，所述组合物中无机盐的浓度包括但不限于0.2％(w/v)、0.3％(w/v)、0.4％(w/v)、0.5％(w/v)、0.6％(w/v)、0.7％(w/v)、0.8％(w/v)、0.9％(w/v)、1％(w/v)、2％(w/v)、3％(w/v)、4％(w/v)、5％(w/v)等等。
在一实施例中，所述组合物中表面活性剂的浓度包括但不限于0.005％(w/v)、0.006％(w/v)、0.007％(w/v)、0.008％(w/v)、0.009％(w/v)、0.01％(w/v)、0.02％(w/v)、0.03％(w/v)、0.04％(w/v)、0.05％(w/v)、0.06％(w/v)、0.07％(w/v)、0.08％(w/v)、0.09％(w/v)、0.1％(w/v)、0.2％(w/v)、0.3％(w/v)、0.4％(w/v)、0.5％(w/v)、0.6％(w/v)、0.7％(w/v)、0.8％(w/v)、0.9％(w/v)、1％(w/v)等等。
在一实施例中，所述组合物中保护剂的浓度包括但不限于0.1％(w/v)、0.2％(w/v)、0.3％(w/v)、0.4％(w/v)、0.5％(w/v)、0.6％(w/v)、0.7％(w/v)、0.8％(w/v)、0.9％(w/v)、1％(w/v)、2％(w/v)、3％(w/v)、4％(w/v)、5％(w/v)等等。
在一实施例中，所述组合物中防腐剂的浓度包括但不限于0.05％(w/v)、0.06％(w/v)、0.07％(w/v)、0.08％(w/v)、0.09％(w/v)、0.1％(w/v)、0.2％(w/v)、0.3％(w/v)、0.4％(w/v)、0.5％(w/v)、0.6％(w/v)、0.7％(w/v)、0.8％(w/v)、0.9％(w/v)、1％(w/v)等等。
在一实施例中，所述组合物中促凝剂的浓度包括但不限于0.1％(w/v)、0.2％(w/v)、0.3％(w/v)、0.4％(w/v)、0.5％(w/v)、0.6％(w/v)、0.7％(w/v)、0.8％(w/v)、0.9％(w/v)、1％(w/v)、2％(w/v)、3％(w/v)等等。
在一实施例中，所述缓冲剂可以包括但不限于磷酸盐缓冲液、Tris-HCl缓冲液、甘氨酸氢氧化钠缓冲液、硼酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液、HEPES缓冲液、MES缓冲液等等中的至少一种。
MES缓冲液亦称2-(N-吗啉)乙磺酸缓冲液。
在一实施例中，所述无机盐可以包括但不限于氯化钠、氯化钾、硫酸钠、硫酸钾、硫酸镁等等中的至少一种。
在一实施例中，所述表面活性剂可以包括但不限于非离子表面活性剂、两性离子表面活性剂、阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂等等中的至少一种。
在一实施例中，所述表面活性剂可以包括但不限于聚氧乙烯(20)失水山梨醇单月桂酸酯(Tween-20，亦称吐温-20)、聚乙二醇辛基苯基醚(CAS号：9002-93-1，别名曲拉通X-100)、十二烷基聚乙二醇醚、壬基酚聚氧乙烯醚、十二烷基硫酸钠(阴离子表面活性剂)、N-月桂酰肌氨酸等等中的至少一种。
在一实施例中，所述保护剂可以包括但不限于惰性蛋白、多元醇、多糖等等中的至少一种。
在一实施例中，所述惰性蛋白可以包括但不限于牛血清白蛋白(BSA)、酪蛋白、明胶等等中的至少一种。其中，酪蛋白包括α-酪蛋白、β-酪蛋白，均适用于本发明。
在一实施例中，所述多元醇可以包括但不限于丙三醇(亦称甘油)、山梨糖醇(亦称山梨醇)等等中的至少一种。
在一实施例中，所述多糖可以包括但不限于蔗糖。
在一实施例中，所述促凝剂可以包括但不限于聚乙二醇、葡聚糖等等中的至少一种。
在一实施例中，所述促凝剂可以包括但不限于聚乙二醇-4000、聚乙二醇-6000、聚乙二醇-8000、葡聚糖-20000等等中的至少一种。
在一实施例中，所述防腐剂可以包括但不限于叠氮化钠、硫柳汞、ProClin300等等中的至少一种。
在一实施例中，所述组合物的pH为6.5-8.5，包括但不限于6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5等等。
根据第二方面，在一实施例中，提供一种用于检测脂联素的试剂组合，包括第一方面所述组合物。
在一实施例中，所述试剂组合包括R1试剂、R2试剂，所述R1试剂含有第一方面所述组合物。R1试剂、R2试剂通常独立分装于不同的容器中，或者独立分装于同一容器的不同腔室中，在使用前再进行混合。
在一实施例中，所述R2试剂含有载体，所述载体上偶联有可特异性结合脂联素的抗体。
在一实施例中，所述载体在所述R2试剂中的浓度可以为0.05-0.5％(w/v)，包括但不限于0.05％(w/v)、0.06％(w/v)、0.07％(w/v)、0.08％(w/v)、0.09％(w/v)、0.1％(w/v)、0.2％(w/v)、0.3％(w/v)、0.4％(w/v)、0.5％(w/v)等等。
在一实施例中，所述载体包括胶乳微球。
在一实施例中，所述胶乳微球包括但不限于聚苯乙烯微球、聚丙烯酸微球、聚丙烯酸酯微球中的至少一种。
在一实施例中，所述载体的表面修饰有活性基团。
在一实施例中，所述活性基团包括但不限于羟基、氨基、醛基、氯甲基、巯基、羟基等等中的至少一种。
在一实施例中，所述胶乳微球的粒径为50-500nm，优选为120-300nm。胶乳微球的粒径包括但不限于50nm、60nm、70nm、80nm、90nm、100nm、110nm、120nm、130nm、140nm、150nm、160nm、170nm、180nm、190nm、200nm、210nm、220nm、230nm、240nm、250nm、260nm、270nm、280nm、290nm、300nm、350nm、400nm、450nm、500nm等等。
在一实施例中，将交联剂、载体、抗体混合反应，结束反应后，加入封闭剂，反应得到偶联有抗体的载体。
在一实施例中，偶联有抗体的载体的制备方法如下：将载体与交联剂混合，充分活化，反应结束后，加入抗体，进行缩合反应，反应结束后，加入封闭剂，反应得到偶联有抗体的载体。
在一实施例中，所述封闭剂含有如下组分中的至少一种：a)含游离氨基的小分子；b)含游离氨基的高分子聚合物；c)生物大分子或其混合物，或其可药用盐。偶联封闭的作用是减少血液样本中一些物质和抗体的非特异性反应或干扰，提高测试灵敏度，降低背景值，提高信噪比。封闭剂可以将没反应的羧基中间体反应掉，还可以填充疏水部分，减少杂质吸附，降低非特异性干扰，提高灵敏度。
在一实施例中，所述封闭剂含有如下组分：a)含游离氨基的小分子；以及b)如下组分中的至少一种：含游离氨基的高分子聚合物、生物大分子或其混合物、生物大分子的可药用盐。
在一实施例中，所述含游离氨基的小分子包括但不限于三羟甲基氨基甲烷、甘氨酸、组氨酸、2-羟基乙胺(亦称乙醇胺)等等中的至少一种。
在一实施例中，所述含游离氨基的高分子聚合物的分子量为100-100000道尔顿，优选为1000-10000道尔顿，更优选为2000-5000道尔顿，包括但不限于100道尔顿、200道尔顿、300道尔顿、400道尔顿、500道尔顿、600道尔顿、700道尔顿、700道尔顿、900道尔顿、1000道尔顿、2000道尔顿、3000道尔顿、4000道尔顿、5000道尔顿、6000道尔顿、7000道尔顿、8000道尔顿、9000道尔顿、10000道尔顿、20000道尔顿、30000道尔顿、40000道尔顿、50000道尔顿、60000道尔顿、70000道尔顿、80000道尔顿、90000道尔顿、100000道尔顿等等。
在一实施例中，所述含游离氨基的高分子聚合物是指合成的末端连接游离氨基的高分子聚合物，包括但不限于PEG-NH2(即含有游离氨基的聚乙二醇)，PEG-NH2的分子量为100-100000道尔顿，优选为1000-10000道尔顿，更优选为2000-5000道尔顿。
在一实施例中，所述生物大分子或其混合物可以包括但不限于大分子惰性蛋白、与抗体无交叉反应的动物血清等等中的至少一种。，所述非交叉反应的动物血清是指与抗体无交叉反应的惰性动物血清。
在一实施例中，所述大分子惰性蛋白可以包括但不限于牛血清白蛋白(BSA)、酪蛋白、卵清蛋白、明胶等等中的至少一种。
在一实施例中，所述与抗体无交叉反应的动物血清可以包括但不限于马血清、鱼血清等与抗体无交叉反应的惰性血清中的至少一种。与抗体无交叉反应的动物血清是指动物血清中的生物大分子在脂联素上的抗原结合表位不同于抗体在脂联素上的抗原结合表位。
在一实施例中，所述封闭剂的pH可以为8-10，优选为8-8.5，包括但不限于8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9、10等等。
在一实施例中，所述交联剂包括但不限于碳二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺、N-羟基硫代琥珀酰亚胺、戊二醛、酰肼、异氰酸酯等等中的至少一种。
在一实施例中，所述含游离氨基的小分子在所述封闭剂中的含量为0.1-5mol/L，包括但不限于0.1mol/L、0.2mol/L、0.3mol/L、0.4mol/L、0.5mol/L、0.6mol/L、0.7mol/L、0.8mol/L、0.9mol/L、1mol/L、2mol/L、3mol/L、4mol/L、5mol/L等等。
在一实施例中，所述含游离氨基的高分子聚合物在所述封闭剂中的含量为0.1-5％(w/v)，包括但不限于0.1％(w/v)、0.2％(w/v)、0.3％(w/v)、0.4％(w/v)、0.5％(w/v)、0.6％(w/v)、0.7％(w/v)、0.8％(w/v)、0.9％(w/v)、1％(w/v)、2％(w/v)、3％(w/v)、4％(w/v)、5％(w/v)等等。
在一实施例中，所述生物大分子或其可药用盐在所述封闭剂中的含量为0.1-5％(w/v)，包括但不限于0.1％(w/v)、0.2％(w/v)、0.3％(w/v)、0.4％(w/v)、0.5％(w/v)、0.6％(w/v)、0.7％(w/v)、0.8％(w/v)、0.9％(w/v)、1％(w/v)、2％(w/v)、3％(w/v)、4％(w/v)、5％(w/v)等等。
在一实施例中，封闭剂通常为水溶液，换言之，封闭剂的溶剂通常为水。
在一实施例中，所述R2试剂还含有如下组分中的至少一种：缓冲剂、表面活性剂、稳定剂、防腐剂。
在一实施例中，所述R2试剂还含有如下浓度的组分中的至少一种：10-500mmol/L缓冲剂、0.005-1％(w/v)表面活性剂、0.1-5％(w/v)稳定剂、0.05-1％(w/v)防腐剂。此处各组分的浓度是指各组分在R2试剂中的浓度。缓冲剂的浓度是指缓冲剂溶质在组合物中的终浓度，例如，缓冲剂为Tris-HCl缓冲液时，缓冲剂浓度是指三羟甲基氨基甲烷在组合物中的终浓度。
在一实施例中，所述R2试剂还含有如下浓度的组分：10-500mmol/L缓冲剂、0.005-1％(w/v)表面活性剂、0.1-5％(w/v)稳定剂、0.05-1％(w/v)防腐剂。此处各组分的浓度是指各组分在R2试剂中的浓度。
在一实施例中，所述缓冲剂选自磷酸盐缓冲液、Tris-HCl缓冲液、甘氨酸氢氧化钠缓冲液、硼酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液、HEPES缓冲液、MES缓冲液中的至少一种。
在一实施例中，所述表面活性剂选自聚氧乙烯(20)失水山梨醇单月桂酸酯、聚乙二醇对异辛基苯基醚、十二烷基聚乙二醇醚、壬基酚聚氧乙烯醚中的至少一种。
在一实施例中，所述稳定剂包括但不限于牛血清白蛋白、酪蛋白、明胶、蔗糖、海藻糖中的至少一种。
在一实施例中，所述防腐剂选自选自叠氮化钠、硫柳汞、ProClin300中的至少一种。
在一实施例中，所述R2试剂的pH为7.0-8.5，包括但不限于7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5等等。配制R2试剂时，将偶联有抗体的载体、缓冲剂、表面活性剂、稳定剂、防腐剂等等组分混合后，通常无需再加入酸碱溶液调节pH。
根据第三方面，在一实施例中，提供一种试剂盒，包括第一方面所述组合物，或第二方面所述试剂组合。
在一实施例中，所述试剂盒还包括用于独立分装R1试剂、R2试剂的容器。各试剂分装于不同的容器中，或者各试剂分装于同一容器的各个独立腔室中。
在一实施例中，所述试剂盒还包括使用说明书，用于指导用户使用该试剂盒。
在一实施例中，所述试剂盒是用于检测脂联素。
在一实施例中，所述试剂盒包括免疫比浊法检测试剂盒。
根据第四方面，在一实施例中，提供第一方面所述组合物，或第二方面所述试剂组合，或第三方面所述试剂盒在检测脂联素中的应用。
根据第五方面，在一实施例中，提供有机酸盐在制备脂联素检测试剂盒中的应用。
在一实施例中，所述脂联素检测试剂盒包括免疫比浊法检测试剂盒。
在一实施例中，所述有机酸盐包括含游离氨基的有机酸盐。
在一实施例中，所述有机酸盐包括但不限于苄脒盐酸盐、苄胺盐酸盐、2-氨基-2-噻唑啉盐酸盐等等中的至少一种。
根据第六方面，在一实施例中，提供封闭剂在制备脂联素检测试剂盒中的应用，所述封闭剂含有如下组分：a)含游离氨基的小分子；以及b)如下组分中的至少一种：含游离氨基的高分子聚合物、生物大分子或其混合物、生物大分子的可药用盐。
在一实施例中，本发明通过同时在R1试剂中添加特殊组分，在R2试剂制备过程中使用特殊封闭剂，通过降低背景值，提高测试信噪比，达到提高试剂盒的灵敏度的目的。其制备工艺简单，可放大，成本低，能提高ADPN测试灵敏度的同时，不缩小试剂盒的线性范围，也不减弱试剂盒的稳定性。
在一实施例中，本发明还提供试剂盒的制备方法。
在一实施例中，本发明提供的一种高灵敏度的脂联素免疫比浊法测定试剂盒，包括R1试剂、R2试剂、校准品和质控品。R1试剂包括：缓冲剂、无机盐、有机酸盐、表面活性剂、保护剂、促凝剂、防腐剂等，R2试剂包括：缓冲剂、ADPN抗体微球偶联物、保护剂、防腐剂等。
在一实施例中，所述R1试剂的pH为6.5-8.5。
在一实施例中，所述R1试剂含有如下浓度的组分：
组分 含量
缓冲剂 10-100mM
无机盐 0.2-5％(w/v)
有机酸盐 0.01-1％(w/v)
表面活性剂 0.005-1％(w/v)
保护剂 0.1-5％(w/v)
防腐剂 0.05-1％(w/v)
促凝剂 0.1-3％(w/v)
在一实施例中，试剂R2的pH为7.0-8.5。
在一实施例中，所述R2试剂含有如下浓度的组分：
组分 含量
缓冲剂 10-500mM
ADPN抗体微球偶联物 0.05-0.5％(w/v)
表面活性剂 0.005-1％(w/v)
稳定剂 0.1-5％(w/v)
防腐剂 0.05-1％(w/v)
在一实施例中，本发明提供的一种高灵敏度的脂联素免疫比浊法测定试剂盒的R2试剂中的ADPN抗体微球偶联物，是指ADPN抗体与聚苯乙烯微球以共价交联形成的复合物。
在一实施例中，所述ADPN抗体可以是鼠或兔的单克隆抗体，也可以是羊或兔的多克隆抗体。
在一实施例中，所述聚苯乙烯微球是表面带官能团的聚苯乙烯微球，官能团可以是羧基、氨基、醛基、氯甲基等。
在一实施例中，所述聚苯乙烯微球粒径可以是50-500nm，优选为120-300nm。
在一实施例中，所述校准品或质控品中的ADPN抗原，是指人ADPN天然抗原或重组抗原。
在一实施例中，所述R2试剂中的ADPN抗体微球偶联物的制备方法主要是通过抗体与聚苯乙烯微球以直接或间接方式共价偶联，所述的共价偶联方法包括但不限于碳二亚胺法、戊二醛法、过碘酸钠法、N-羟基琥珀酰亚胺酯法、马来酰亚胺法等。
在一实施例中，ADPN抗体微球偶联物的制备方法包括：用10-100mM MES pH6.0缓冲液将羧基聚苯乙烯微球清洗2-3次，然后用上述缓冲液定容至0.5-2％(w/v)，向其中加入碳二亚胺和N-羟基硫代琥珀酰亚胺，室温搅拌15-40分钟进行活化，用10-100mM MES或HEPES缓冲液清洗2-3次，定容至0.5-2％(w/v)，将活化清洗后的微球悬液加入等体积的0.01-0.2％的ADPN抗体溶液中，室温搅拌2-4小时，加入封闭剂，继续室温搅拌2-4小时，用10-100mM MES或HEPES缓冲液清洗2-3次，最终分散在合适的储存液中，制得ADPN抗体微球偶联物。
为解决现有技术存在的问题，在一实施例中，本发明提供一种高灵敏度的脂联素免疫比浊法测定试剂盒。在一实施例中，所述高灵敏度的脂联素免疫比浊法测定试剂盒包括R1试剂、R2试剂和校准品、质控品，其检测的方法为胶乳增强免疫比浊法，其检测原理是：样本中的ADPN抗原与试剂中ADPN抗体在液相中结合成抗原抗体复合物，产生浊度变化，胶乳试剂可以特异的增大该浊度变化，增大反应的灵敏度。该浊度变化的大小与样本中ADPN的含量成正比。测定该浊度变化，与标准物比较，即能得出样本中ADPN的含量。
在一实施例中，本发明提供的一种高灵敏度的脂联素免疫比浊法测定试剂盒应用于测定血液样本中的脂联素含量，测定方法具体为：血液样本和R1试剂混匀，孵育1-5分钟后，加入R2试剂，仪器读点记为A1，继续孵育1-5分钟后仪器读点记为A2，在540-800nm的特定波长下检测透射或散射光信号，记录加入反应终点A2和和反应起始A1幅度的差值，带入标准曲线中，即可计算样本中脂联素的含量。本发明可应用于脂联素免疫比浊法测定试剂盒，检测原理可以是透射比浊法或散射比浊法，检验仪器可适用但不限于生化分析仪和特定蛋白分析仪。
在一实施例中，本发明涉及的聚苯乙烯微球、偶联封闭剂、偶联活化剂等均可以从市场上购买获得。
在一实施例中，本发明提供的一种高灵敏度的脂联素免疫比浊法测定试剂盒，通过同时在R1试剂中添加特殊组分，具体可以是有机酸盐，能提高低浓度反应信号值，增加灵敏度；在R2试剂制备过程中使用特殊封闭剂，能够通过降低背景值，提高测试信噪比来提高试剂盒的灵敏度。
在一实施例中，本发明提供的一种高灵敏度的脂联素免疫比浊法测定试剂盒，应用于生化分析仪或特定蛋白分析仪中，实现样本大批量和高通量测试，满足临床需求。
在一实施例中，本发明提供的一种高灵敏度的脂联素免疫比浊法测定试剂盒，原料获取容易，制备工艺成熟，可大规模生产，批次稳定，成本低廉，试剂盒性能稳定。
以下实施例中，如无特别说明，调节pH所用的酸溶液为2-3mol/L盐酸，所用的碱溶液为1mol/L氢氧化钠水溶液。
以下实施例中，检测实验都是在生化反应最适浓度(37℃±2℃)条件下进行。
实施例1
本实施例提供封闭剂的制备。
本实施例的封闭剂的配方如下：
表1
组分 每升用量
甘氨酸 75g(约1mol)
乙醇胺 50mL(约0.82mol)
BSA 50g
表1中，“每升用量”是指每升封闭剂中各个组分的用量。
在烧杯中先加入部分纯化水于磁力搅拌器上，中速搅拌，按上表投入上述物料，搅拌至物料完全溶解，用2或3mol/L盐酸或1mol/L氢氧化钠水溶液调节pH值至8.0-8.5之间，并用纯化水定容至1升。
实施例2
本实施例提供封闭剂的制备。
本实施例的封闭剂的配方如下：
表2
组分 每升用量
三羟甲基氨基甲烷 121g(约1mol)
乙醇胺 50mL
酪蛋白钠盐 20g
在烧杯中先加入部分纯化水于磁力搅拌器上，中速搅拌，按上表投入上述物料，搅拌至物料完全溶解，调节pH值至8.0-8.5之间，并用纯化水定容至1L。
实施例3
本实施例提供封闭剂的制备。
本实施例的封闭剂的配方如下：
表3
组分 每升用量
甘氨酸 75g
PEG-NH<sub>2</sub> 20g
在烧杯中先加入部分纯化水于磁力搅拌器上，中速搅拌，按上表投入上述物料，搅拌至物料完全溶解，调节pH值至8.0-8.5之间，并用纯化水定容至1L。PEG-NH2的生产商为JSR Life Sciences株式会社(亦称JSR生命科学株式会社)，产品名称Blockmaster CE510/CE210，CE510的分子量为5000，CE210的分子量为2000。CE510与CE210按照体积比1：1混合。
实施例4
本实施例提供高灵敏度的脂联素免疫比浊法测定试剂盒R1试剂的配制方法。
R1试剂的组成如下：
表4
Figure BDA0002970276230000111
在烧杯中先加入部分纯化水于磁力搅拌器上，中速搅拌，按上表投入上述物料，搅拌至物料完全溶解，调节pH值至7.5，并用纯化水定容至1L。
实施例5
本实施例提供高灵敏度的脂联素免疫比浊法测定试剂盒R1试剂的配制方法。
R1试剂的组成如下：
表5
Figure BDA0002970276230000112
在烧杯中先加入部分纯化水于磁力搅拌器上，中速搅拌，按上表投入各物料，搅拌至物料完全溶解，调节pH值至7.5，并用纯化水定容至1L。
实施例6
本实施例提供高灵敏度的脂联素免疫比浊法测定试剂盒R1试剂的配制方法。
R1试剂的组成如下：
表6
Figure BDA0002970276230000113
Figure BDA0002970276230000121
在烧杯中先加入部分纯化水于磁力搅拌器上，中速搅拌，按上表投入各物料，搅拌至物料完全溶解，调节pH值至7.5，并用纯化水定容至1L。
实施例7
本实施例提供高灵敏度的脂联素免疫比浊法测定试剂盒R2试剂的制备方法。
用50mM MES pH6.0缓冲液将羧基聚苯乙烯微球清洗3次，然后用上述缓冲液定容至羧基聚苯乙烯微球的浓度为1％(w/v)，向其中加入过量于羧基密度的碳二亚胺和N-羟基硫代琥珀酰亚胺，室温搅拌30分钟进行活化，用50mM MES或HEPES缓冲液清洗3次，定容至混合液中羧基聚苯乙烯微球的浓度为1％(w/v)，将活化清洗后的微球悬液加入等体积的0.05％的ADPN抗体溶液中，室温搅拌2-4小时，加入十分之一体积(加入封闭剂前，封闭剂的体积为混合液体积的十分之一)实施例1～3任一所述的封闭剂，继续室温搅拌2-4小时，用50mM HEPES缓冲液(pH为7.5)清洗3次，最终分散在含1％(w/v)BSA、0.1％(w/v)Tween-20、0.1％(w/v)叠氮化钠、50mM HEPES缓冲液(pH为7.5)的混合液中(不需再调节pH)，所得分散液中羧基聚苯乙烯微球的终浓度为0.12％(w/v)，所得分散液即为R2试剂。本实施例的ADPN抗体为ADPN鼠抗人单克隆抗体，生产商：R&D SYSTEMS，名称：Human Adiponectin/Acrp30Antibody，货号：MAB1065。
实施例8
按上述实施例制得的各个实验组、对照组组成如下表7所示。分别使用9个实验组和7个对照组配制的试剂分别测试各校准品，观察各点反应幅度，测试检出限(limit ofdetection,LoD)评价灵敏度，测试5μg/mL的样品，计算变异系数CV(％)评价，重复性。
以生理盐水为样本，分别用各组试剂重复测试20次。计算20次测试结果的平均值(Xave)和标准差(SD)。计算Xave+2SD为检出限，检出限数值越低，说明试剂配方的灵敏度越高。
用各组试剂测试脂联素浓度为5μg/mL的样品，分别重复测试10次，计算测量值的平均值(Xave)和标准差(SD)，并计算变异系数(CV)。CV＝(SD/Xave)×100％，变异系数数值越低，说明试剂配方的重复性越佳。其中5μg/mL样品可溯源至日本荣研ADPN检测系统。
表7实验组、对照组汇总表
Figure BDA0002970276230000122
Figure BDA0002970276230000131
各实验组的R2试剂均参照实施例7的组分及方法配制得到。
使用各组试剂测试校准品的结果如下：
表8
校准品浓度(μg/mL) 0 5 10 20 40
实验组1反应度 -6 897 2174 4319 6025
实验组2反应度 14 851 2264 4373 6188
实验组3反应度 -9 924 2144 4178 6474
实验组4反应度 6 896 2394 4337 6075
实验组5反应度 2 872 2002 4143 6050
实验组6反应度 14 989 2065 4161 6135
实验组7反应度 9 979 2320 4290 6484
实验组8反应度 4 966 2194 4091 6408
实验组9反应度 1 883 2390 4191 6229
对照组1反应度 77 630 1503 3528 5428
对照组2反应度 68 641 1815 3611 5320
对照组3反应度 70 633 1711 3772 5352
对照组4反应度 141 738 1787 3606 5497
对照组5反应度 153 724 1738 3737 5497
对照组6反应度 146 731 1890 3675 5409
对照组7反应度 203 528 1302 2865 3341
可见，实验组测得校准品的反应度均高于对照组，且低浓度校准品的反应度较高。使用各组试剂检测生理盐水样本，检出限测试结果如下：
表9
Figure BDA0002970276230000132
Figure BDA0002970276230000141
可见，实验组测得生理盐水样本检出限值均低于对照组，说明实验组的试剂灵敏度优于对照组。
使用各组试剂检测脂联素浓度为5μg/mL的样品，重复性测试结果如下：
表10
组别 X<sub>ave</sub> SD CV
实验组1 5.01 0.17 3.45％
实验组2 5.04 0.17 3.40％
实验组3 5.10 0.17 3.33％
实验组4 4.99 0.17 3.46％
实验组5 5.04 0.16 3.13％
实验组6 5.08 0.17 3.32％
实验组7 5.10 0.19 3.81％
实验组8 5.03 0.16 3.12％
实验组9 4.93 0.16 3.32％
对照组1 5.09 0.29 5.67％
对照组2 5.07 0.28 5.58％
对照组3 4.97 0.30 6.08％
对照组4 4.95 0.31 6.33％
对照组5 4.99 0.37 7.47％
对照组6 4.84 0.31 6.48％
对照组7 5.12 0.44 8.68％
可见，实验组测试结果的CV值均低于对照组，说明实验组的试剂重复性优于对照组。
实施例9
本实施例对实验组2制备的高灵敏度脂联素免疫比浊法测定试剂盒进行性能评估，具体地，使用实验组2所配制的脂联素试剂盒，对线性范围、方法学比对和重复性的性能进行评估。
测试仪器：日立7180生化分析仪；测试条件：取3μL血清样本和160μL R1试剂，混匀，孵育5分钟后，加入40μL R2试剂，继续孵育5分钟，在600nm的特定波长下检测透射光信号，记录加入R2试剂后反应终点和反应起始点幅度的差值，带入图1的标准曲线中，即可计算样本中脂联素的含量。
质控品的缓冲液组成同校准品中的缓冲液。
配制校准品、质控品所使用的ADP抗原购自武汉华美生物工程有限公司，货号：CSB-DP120B，名称：人脂联素(ADPN)。
校准品、质控品是由ADP抗原溶解在缓冲液中配制而成，缓冲液的组成如下：20mMPBS缓冲液、1％BSA，pH为7.4。
图1为本实施例根据校准品浓度与测得的反应度拟合得到的校准曲线，图1中，纵坐标为反应度，具体是由日立7180生化分析仪计算得到的透射光信号值，横坐标为各个校准品的浓度，即溯源后的抗原浓度(脂联素浓度)。
试剂评估结果如下：
1、线性范围
用低浓度ADPN血清样本和高浓度ADPN血清样本按下表混合成6个稀释浓度。用实验组2的试剂盒分别对混合样本进行测试，每个浓度测试3次，计算相关系数和偏差。
表11
稀释梯度 浓度1 浓度2 浓度3 浓度4 浓度5 浓度6
低浓度样本体积 1mL 0.8mL 0.6mL 0.4mL 0.2mL 0
高浓度样本体积 0 0.2 mL 0.4mL 0.6 mL 0.8mL 1mL
其中低浓度样本的浓度为1.2μg/mL，高浓度样本的浓度为40μg/mL，均可溯源至ADPN日本荣研检测系统。
测试结果如下：
表12
Figure BDA0002970276230000151
其中绝对偏差＝|均值-回归值|；相对偏差＝[(均值-回归值)/回归值]×100％。“/”表示不统计，稀释浓度小于10μg/mL时考察绝对偏差，大于10μg/mL时考察相对偏差。
图2所示为各稀释浓度与测试均值的线性范围曲线，试剂盒在[1.2，40.0]μg/mL区间内，k为1.0155，b为-0.1522，线性相关系数R为0.9998，在[1.2，10.0]μg/mL区间内，线性绝对偏差未超过0.5μg/mL，在(10.0，40.0]μg/mL范围内，线性相对偏差未超过±5％。
2、方法学比对
取40例新鲜血清，用日本荣研试剂盒测试，该试剂盒购自日本荣研化学株式会社(简称荣研公司)，公司英文名称为EIKEN CHEMICAL CO.LTD，产品名称：LZ-AND-R1C、LZ-AND-R2C，批号：2019.02，制作日本荣研试剂盒校准曲线所使用的校准品为荣研公司试剂盒自带的校准品(校准品英文名称为ADN Calibrator set)，产品说明书显示，校准品生产商为LSI Medience Corporation。同时用实验组2的脂联素测定试剂盒测试，用线性回归法计算两组测试值的相关系数。
表13
Figure BDA0002970276230000152
Figure BDA0002970276230000161
图3显示了日本荣研测试值与本发明实验组2的试剂盒测试值的线性回归分析结果，其中R2＝0.9888，相关性R＝0.994。
3、重复性实验
使用实验组2的脂联素测定试剂盒分别对质控L(浓度为5μg/mL)和质控H(浓度为20μg/mL)重复测试10次，计算变异系数。
表14
Figure BDA0002970276230000162
可见，质控L的变异系数为3.6％，质控的H变异系数为1.8％。
以上结果表明，应用本发明实验组2制备的高灵敏度脂联素免疫比浊法测定试剂盒性能良好，线性相关系数R＝0.9998；40例样本与日本荣研比对的相关性R＝0.994；重复测试质控品10次，变异系数在5％以内。并且，本发明的试剂盒具有良好的稳定性。
以上应用了具体个例对本发明进行阐述，只是用于帮助理解本发明，并不用以限制本发明。对于本发明所属技术领域的技术人员，依据本发明的思想，还可以做出若干简单推演、变形或替换。

Claims (10)

1.一种用于检测脂联素的组合物，其特征在于，所述组合物含有有机酸盐。
2.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述有机酸盐包括含游离氨基的有机酸盐；
和/或，所述有机酸盐选自苄脒盐酸盐、苄胺盐酸盐、2-氨基-2-噻唑啉盐酸盐中的至少一种；
和/或，所述组合物中有机酸盐的浓度为0.01-1％(w/v)；
和/或，所述组合物中有机酸盐的浓度为0.5-1％(w/v)；
和/或，所述组合物还含有如下组分中的至少一种：缓冲剂、无机盐、表面活性剂、保护剂、促凝剂、防腐剂；
和/或，所述组合物还含有如下浓度的组分中的至少一种：10-100mmol/L缓冲剂、0.2-5％(w/v)无机盐、0.005-1％(w/v)表面活性剂、0.1-5％(w/v)保护剂、0.05-1％(w/v)防腐剂、0.1-3％(w/v)促凝剂；
和/或，所述组合物还含有如下浓度的组分：10-100mmol/L缓冲剂、0.2-5％(w/v)无机盐、0.005-1％(w/v)表面活性剂、0.1-5％(w/v)保护剂、0.05-1％(w/v)防腐剂、0.1-3％(w/v)促凝剂；
和/或，所述缓冲剂选自磷酸盐缓冲液、Tris-HCl缓冲液、甘氨酸氢氧化钠缓冲液、硼酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液、HEPES缓冲液、MES缓冲液中的至少一种；
和/或，所述无机盐选自氯化钠、氯化钾、硫酸钠、硫酸钾、硫酸镁中的至少一种；
和/或，所述表面活性剂选自非离子表面活性剂、两性离子表面活性剂、阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂中的至少一种；
和/或，所述表面活性剂选自聚氧乙烯(20)失水山梨醇单月桂酸酯、聚乙二醇对异辛基苯基醚、十二烷基聚乙二醇醚、壬基酚聚氧乙烯醚、十二烷基硫酸钠、N-月桂酰肌氨酸中的至少一种；
和/或，所述保护剂选自惰性蛋白、多元醇、多糖中的至少一种；
和/或，所述保护剂选自牛血清白蛋白、酪蛋白、明胶、丙三醇、山梨糖醇、蔗糖中的至少一种；
和/或，所述促凝剂选自聚乙二醇、葡聚糖中的至少一种；
和/或，所述促凝剂选自聚乙二醇-4000、聚乙二醇-6000、聚乙二醇-8000、葡聚糖-20000中的至少一种；
和/或，所述防腐剂选自叠氮化钠、硫柳汞、ProClin300中的至少一种；
和/或，所述组合物的pH为6.5-8.5。
3.一种用于检测脂联素的试剂组合，包括如权利要求1至2中任一项所述的组合物。
4.如权利要求3所述的试剂组合，其特征在于，所述试剂组合包括R1试剂、R2试剂，所述R1试剂含有如权利要求1至2中任一项所述的组合物；
和/或，所述R2试剂含有载体，所述载体上偶联有可特异性结合脂联素的抗体；
和/或，所述载体在所述R2试剂中的浓度为0.05-0.5％(w/v)；
和/或，所述载体包括胶乳微球；
和/或，所述胶乳微球选自聚苯乙烯微球、聚丙烯酸微球、聚丙烯酸酯微球中的至少一种；
和/或，所述载体的表面修饰有活性基团；
和/或，所述活性基团选自羟基、氨基、醛基、氯甲基、巯基、羟基中的至少一种；
和/或，所述胶乳微球的粒径为50-500nm；
和/或，偶联有抗体的载体的制备方法如下：将交联剂、载体、抗体混合反应，结束反应后，加入封闭剂，反应得到偶联有抗体的载体；
和/或，偶联有抗体的载体的制备方法如下：将载体与交联剂混合，充分活化，反应结束后，加入抗体，进行缩合反应，反应结束后，加入封闭剂，反应得到偶联有抗体的载体；
和/或，所述封闭剂含有如下组分中的至少一种：a)含游离氨基的小分子；b)含游离氨基的高分子聚合物；c)生物大分子或其混合物，或其可药用盐；
和/或，所述封闭剂含有如下组分：a)含游离氨基的小分子；以及b)如下组分中的至少一种：含游离氨基的高分子聚合物、生物大分子或其混合物、生物大分子的可药用盐；
和/或，所述含游离氨基的小分子选自三羟甲基氨基甲烷、甘氨酸、组氨酸、2-羟基乙胺中的至少一种；
和/或，所述含游离氨基的高分子聚合物包括PEG-NH2；
和/或，所述含游离氨基的高分子聚合物的分子量为100-100000道尔顿，优选为1000-10000道尔顿，更优选为2000-5000道尔顿；
和/或，所述生物大分子或其混合物选自大分子惰性蛋白、非交叉反应的动物血清中的至少一种，所述非交叉反应的动物血清是指与抗体无交叉反应的惰性动物血清；
和/或，所述大分子惰性蛋白选自牛血清白蛋白、酪蛋白、卵清蛋白、明胶中的至少一种；
和/或，所述非交叉反应的动物血清选自马血清、鱼血清中的至少一种；
和/或，所述封闭剂的pH为8-10；
和/或，所述封闭剂的pH为8-8.5；
和/或，所述交联剂选自碳二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺、N-羟基硫代琥珀酰亚胺、戊二醛、酰肼、异氰酸酯中的至少一种；
和/或，所述含游离氨基的小分子在所述封闭剂中的含量为0.1-5mol/L；
和/或，所述含游离氨基的高分子聚合物在所述封闭剂中的含量为0.1-5％(w/v)；
和/或，所述生物大分子或其可药用盐在所述封闭剂中的含量为0.1-5％(w/v)；
和/或，所述R2试剂还含有如下组分中的至少一种：缓冲剂、表面活性剂、稳定剂、防腐剂；
和/或，所述R2试剂还含有如下浓度的组分中的至少一种：10-500mmol/L缓冲剂、0.005-1％(w/v)表面活性剂、0.1-5％(w/v)稳定剂、0.05-1％(w/v)防腐剂；
和/或，所述R2试剂还含有如下浓度的组分：10-500mmol/L缓冲剂、0.005-1％(w/v)表面活性剂、0.1-5％(w/v)稳定剂、0.05-1％(w/v)防腐剂；
和/或，所述缓冲剂选自磷酸盐缓冲液、Tris-HCl缓冲液、甘氨酸氢氧化钠缓冲液、硼酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液、HEPES缓冲液、MES缓冲液中的至少一种；
和/或，所述表面活性剂选自聚氧乙烯(20)失水山梨醇单月桂酸酯、聚乙二醇辛基苯基醚、十二烷基聚乙二醇醚、壬基酚聚氧乙烯醚中的至少一种；
和/或，所述稳定剂选自牛血清白蛋白、酪蛋白、明胶、蔗糖、海藻糖中的至少一种；
和/或，所述防腐剂选自选自叠氮化钠、硫柳汞、ProClin300中的至少一种；
和/或，所述R2试剂的pH为7.0-8.5。
5.一种试剂盒，包括如权利要求1至2中任一项所述组合物，或权利要求3至4任意一项所述试剂组合。
6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括用于独立分装R1试剂、R2试剂的容器；
和/或，所述试剂盒还包括使用说明书。
7.如权利要求1至2中任一项所述组合物，或权利要求3至4任意一项所述试剂组合，或权利要求5至6任意一项所述试剂盒在检测脂联素中的应用。
8.有机酸盐在制备脂联素检测试剂盒中的应用。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述有机酸盐包括含游离氨基的有机酸盐；
和/或，所述有机酸盐选自苄脒盐酸盐、苄胺盐酸盐、2-氨基-2-噻唑啉盐酸盐中的至少一种。
10.封闭剂在制备脂联素检测试剂盒中的应用，其特征在于，所述封闭剂含有如下组分：a)含游离氨基的小分子；以及b)如下组分中的至少一种：含游离氨基的高分子聚合物、生物大分子或其混合物、生物大分子的可药用盐。
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