CN116973574B - 可溶性生长刺激表达基因2蛋白的测定试剂盒及其检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及可溶性生长刺激表达基因2蛋白的测定试剂盒及其检测方法。该测定试剂盒包括：标记物标记的抗人sST2抗体、解离剂、阻断剂和抗人sST2抗体标记的磁性微粒；其中，解离剂用于解离样本中sST2复合物；阻断剂用于抑制sST2复合物形成。本申请提供的试剂盒及测定方法在传统免疫检测法的基础上引入解离预处理步骤，可以降低IL‑33对sST2测试结果的干扰，进一步，在解离过程中加入阻断剂，防止sST2复合物重新形成，增强了解离效果，提高测试的灵敏度和准确性。

Description

可溶性生长刺激表达基因2蛋白的测定试剂盒及其检测方法
技术领域
本申请属于免疫分析技术领域，涉及可溶性生长刺激表达基因2蛋白的测定试剂盒及其检测方法。
背景技术
生长刺激表达基因2蛋白(ST2)是IL-1受体家族的一员，ST2蛋白与心脏疾病相关的主要有两种亚型，第一种是sST2一种可溶性的、在循环系统中存在的亚型，又称为可溶性ST2。另一种是跨膜结合亚型，称为ST2受体或ST2L。两种亚型是通过选择性剪接和加工形成，都可与IL-33特异性结合。尽管有报道指出血清/血浆中ST2水平与多种疾病相关，但其最受关注的还是在心脏疾病中的作用(Mueller and Jaffe,2015)。IL-33作为ST2的特异性配体于2005年被首次报道(Schmitz,et al,2005)，生理上，IL-33与ST2L结合是心肌应激或损伤后的应对措施，可下调心脏功能。通常情况下，当心肌细胞受损或疾病时，ST2L受体通过与IL-33结合，驱动心肌细胞产生心脏保护作用，患者通常可以康复或对治疗有反应。但是，对于心衰或其他体内可溶性ST2表达水平较高的患者，sST2开始替代ST2L受体与IL-33结合。可溶性ST2与IL-33结合，导致IL-33无法获得受体，从而使应激的心肌细胞不能获得保护作用，进入凋亡通路，引起心肌坏死和纤维化(Liew,et al,2010；Miller and Liew,2011；Villarreal and Weiner,2014；Mueller and Jaffe,2015)。
有研究表明，sST2浓度与心衰严重程度有关，心力衰竭是一种非常复杂的综合征，多种因素影响心力衰竭的生理和疾病发生机制。ST2也参与了疾病的发生，但与利钠肽的生理途径不同。利钠肽仅反映血液动力学状态，ST2反映纤维化和重塑。因此，这两种标志物是非常互补的，并且可用于确认不同类别药物的疗效。可溶性ST2具有生物可变性低的优势，其不受年龄、性别、肾功能、体质指数(BMI)、心房颤动等影响，其适用于连续测量，被誉为是心衰界的“糖化血红蛋白”。检测和定量sST2水平的研究意义在于辅助心衰患者的危险分层和预后评估，同时对急性失代偿性心衰的诊断有重要的参考价值。目前《美国心脏病协会/美国心脏的心衰指南》、《中国心力衰竭诊断和治疗指南》等都推荐将可溶性ST2作为心力衰竭的生物标志物之一。
目前，临床或实验室对于sST2检测的方法有胶体金免疫层析法、荧光免疫层析法、酶联免疫法、酶促化学发光法和胶乳增强免疫比浊法等。
胶体金免疫层析法，具有方便快捷、稳定性强、不需要特殊设备和试剂、结果判断直观等优点。但胶体金产品批间差异较大，其灵敏度、线性、重复性和定量准确性较差，目前更多运用于疾病初步筛查。荧光免疫层析法操作简单、检测快速，但其灵敏度较低，容易出现漏检现象。酶联免疫法技术成熟，检测费用较低，但灵敏度和线性范围较差，操作复杂，重复性较差，检测时间太长，无法满足临床快速定量检测需求。酶促化学发光法具有较好的灵敏度、精密度，但也容易受外界因素如温度等影响，干扰因素较多，且需要底物参与反应，成本较高。目前市面测试sST2的产品，大部分都是基于免疫学原理，使用双抗体夹心免疫法检测可溶性ST2蛋白，但在血清中可溶性ST2往往与IL-33结合形成复合物，两种抗体所识别的sST2抗原表位可能被sST2与IL-33的结合位点掩盖，因此sST2复合物的存在会影响测试结果的灵敏度和准确性。
发明内容
基于此，本申请有必要提供一种用于检测和定量可溶性生长刺激表达基因2蛋白的试剂盒及方法。相对于可商购获得的测定法和/或对照测定法，本申请试剂盒的检测灵敏和准确性更高，同时可减少测定干扰且避免了高昂原料成本投入。
本申请的核心是先利用解离剂处理待测样品，当sST2复合物全部转化为sST2后加入阻断剂抑制sST2复合物再次形成，再通过所选免疫测定法检测和定量总sST2的浓度，以此改善在IL-33存在的情况下对sST2的检测结果。
为了实现上述目的，本申请采用以下技术方案：
一种可溶性生长刺激表达基因2蛋白的测定试剂盒，所述测定试剂盒包括：标记物标记的抗人sST2抗体、解离剂、阻断剂和抗人sST2抗体标记的磁性微粒；其中，解离剂用于解离样本中sST2复合物；阻断剂用于抑制、减少或阻断样本中sST2复合物重新形成。在试剂盒中，所述阻断剂既可以单独作为一个试剂组分，也可以与标记物标记的抗人sST2抗体或者抗人sST2抗体标记的磁性微粒组合作为一个试剂组分。
在其中一个实施例中，所述标记物标记的抗人sST2抗体的工作浓度为0.1μg/mL～2.0μg/mL，和/或，所述解离剂的工作浓度为10mM～500mM，和/或，所述阻断剂的工作浓度为5ng/mL～5000ng/mL，和/或，所述抗人sST2抗体标记的磁性微粒的工作浓度为0.05mg/mL～2.0mg/mL。
所述测定试剂盒的使用方法，包括以下步骤：
将待测样品与所述解离剂混合，反应一段时间，使所述样品中的sST2复合物解离出sST2，加入所述阻断剂，抑制sST2复合物重新形成，获得预处理样本；将所述标记物标记的抗人sST2抗体、所述抗人sST2抗体标记的磁性微粒和所述预处理样本混合孵育，测定sST2的含量。
相对于现有技术，本申请具备如下有益效果：
本申请提供的试剂盒及测定方法在传统免疫检测法的基础上引入解离预处理步骤，可以降低IL-33对sST2测试结果的干扰，进一步，在解离过程中加入阻断剂，防止sST2复合物重新形成，增强了解离效果，提高测试的灵敏度和准确性。
上述sST2的测定方案适用于任意免疫检测法，包括但不限于化学发光法、酶联免疫法、免疫层析法等，所用抗体的选择范围较广，避免了高昂试剂成本投入，降低了研发成本。
附图说明
图1为实施1中的示例性测定法方案示意图；
图2为可溶性生长刺激表达基因2蛋白测定试剂盒(样本进行解离处理)与市售化学发光法试剂盒测定值的方法学比对示意图；
图3为可溶性生长刺激表达基因2蛋白测定试剂盒(样本不做解离处理)与市售化学发光法试剂盒测定值的方法学比对示意图。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
在体内，可溶性ST2主要有两种存在形式，一种是游离型sST2，另一种是与sST2结合分子结合形成复合物。由于sST2有部分表位在sST2结合分子的结合区域，当sST2与其结合分子形成复合物后可能会使部分抗sST2抗体的识别表位被覆盖，在此情况下sST2结合分子的存在会极大程度上干扰sST2的测试准确性。示例性的sST2结合分子一般指细胞因子IL-33。
基于此，本申请一实施方式提供了一种可溶性生长刺激表达基因2蛋白的测定试剂盒，该试剂盒包括：标记物标记的抗人sST2抗体、解离剂、阻断剂和抗人sST2抗体标记的磁性微粒。其中，解离剂用于解离样本中sST2复合物；阻断剂用于抑制、减少或阻断sST2复合物重新形成。
在一个具体示例中，所述解离剂包括酸溶液、碱溶液、醇和表面活性剂中的一种或多种。可选地，所述酸溶液包括柠檬酸，乙酸、磷酸、稀盐酸和稀硫酸中的一种或多种。可选地，所述碱溶液包括NaOH溶液、KOH溶液、NaHCO3溶液和Na2CO3溶液中的一种或多种。可选地，所述醇包括甲醇、乙醇、丙醇和异丙醇中的一种或多种。可选地，所述表面活性剂包括脱氧胆酸钠、曲拉通、全氟羧酸和全氟磺酸中的一种或多种。优选地，所述解离剂为NaHCO3溶液，属于弱碱性溶液，提高检测灵敏度效果更优。可选地，NaHCO3溶液中NaHCO3的浓度为10mM～500mM，可选范围，20mM～80mM、50mM～60mM。
在一个具体示例中，所述阻断剂包括抗IL-33抗体，或与IL-33结合的抗体片段。可选地，所述抗IL-33抗体的浓度为5ng/mL～5000ng/mL。可选地，所述抗体包括单克隆或者多克隆的抗体，或者Fab、Fab'、F(ab')2、Fv或scFv片段。进一步可选地，所述抗体选自鼠源抗体、人源化抗体和嵌合抗体中的一种或多种。
在一个具体示例中，所述测定试剂盒包括采用化学发光法、荧光免疫层析法和酶联免疫法中的一种或多种的方法测定样品中sST2含量。在一个优选示例中，所述测定试剂盒采用化学发光法测定样品中sST2含量。
在一个具体示例中，所述标记物选自稀有过渡金属粒子、荧光团、发色团、贵金属纳米粒子或化学发光化合物。优选地，所述标记物选自化学发光化合物，可选地，所述化学发光化合物可以为吖啶酯。
在一个具体示例中，所述抗人sST2抗体标记的磁性微粒的制备方法如下：
1)用EDC和NHS交联剂活化羧基磁珠后，在缓冲液中混合适量磁珠和抗体，在25℃条件下反应管置于旋转混匀器上，连续混合反应，抗体上的氨基和磁珠上的中间体发生化学反应并键合。可选地，反应时间为2小时～3小时。可选地，每毫克磁珠加入的抗体的量为5μg/mg-50μg/mg。可选地，缓冲液选自柠檬酸缓冲液、PBS缓冲液、HEPES缓冲液、Tris缓冲液、MES缓冲液和碳酸盐缓冲液中的一种，pH值为5.0～9.0。
2)清洗包被磁珠，向含有包被磁珠的反应管中加入封闭液，对包被磁珠进行封闭处理。可选，清洗2次。
3)加入磁珠保存液，调制一定浓度，置于2～8℃保存。
在一个具体示例中，所述吖啶酯标记的抗人sST2抗体的制备方法如下：
1)在缓冲液中混合适量吖啶酯和抗人sST2抗体，其中，每毫克抗体使用10-1000μg吖啶酯，所述缓冲液选自柠檬酸缓冲液、PBS缓冲液、HEPES缓冲液、Tris缓冲液、MES缓冲液和碳酸盐缓冲液中的一种，所述缓冲液pH值为5.0～9.0。
2)在24～26℃条件下抗人sST2抗体上的氨基和吖啶上的琥珀酰亚胺发生化学反应并键合。
3)在24～26℃条件下，向反应杯中加入适量赖氨酸以封闭未反应的吖啶酯，赖氨酸溶液的浓度为1.0mg/mL～100mg/mL。经离心脱盐柱纯化，得到吖啶酯标记的抗人sST2抗体。
4)加入甘油，置于-20℃保存。
在一个具体示例中，所述测试试剂盒包括R1试剂、R2试剂、R3试剂和磁分离试剂，其中，R1试剂含有所述标记物标记的抗人sST2抗体，R2试剂含有所述解离剂，R3试剂包含所述阻断剂，磁分离试剂含有抗人sST2抗体标记的磁性微粒。
需要说明的是，所述阻断剂可以作为独立的R3试剂，也可以在R1试剂或者磁分离试剂之中。在一个具体示例中，试剂盒的R1试剂包含吖啶酯标记的抗人sST2抗体和阻断剂，没有独立的R3试剂，R2试剂含有解离剂，磁分离试剂含有抗人sST2抗体标记的磁性微粒；在另一个具体示例中，试剂盒的磁分离试剂包含抗人sST2抗体标记的磁性微粒和阻断剂，没有独立的R3试剂，R1试剂含有所述标记物标记的抗人sST2抗体，R2试剂含有所述解离剂。
在一个具体示例中，R1试剂中所述吖啶酯标记的抗人sST2抗体浓度为0.1μg/mL～2.0μg/mL，可选，其浓度范围为0.1μg/mL～1μg/mL、1μg/mL～2.0μg/mL、0.2μg/mL～0.6μg/mL，可选，浓度值为0.1μg/mL、0.4μg/mL、0.7μg/mL、1μg/mL、1.3μg/mL、1.6μg/mL、2.0μg/mL。
在一个具体示例中，R2试剂中所述解离剂的浓度为10mM～500mM，可选，其浓度范围为20mM～50mM、50mM～100mM、100mM～300mM、300mM～500mM。
在一个具体示例中，R3试剂或R1试剂或磁分离试剂中所述阻断剂的浓度为5ng/mL～5000ng/mL，可选，其浓度范围为5ng/mL～15ng/mL、15ng/mL～65ng/mL、65ng/mL～100ng/mL、100ng/mL～200ng/mL、200ng/mL～600ng/mL、600ng/mL～1000ng/mL、1000ng/mL～2000ng/mL、2000ng/mL～5000ng/mL。
在一个具体示例中，磁分离试剂中所述抗人sST2抗体标记的磁性微粒的浓度为0.05mg/mL～2.0mg/mL，可选，其浓度值为0.05mg/mL、0.1mg/mL、0.2mg/mL、0.4mg/mL、0.6mg/mL、0.8mg/mL、1.0mg/mL、1.4mg/mL、1.8mg/mL或者2.0mg/mL。
在一个具体示例中，所述R1试剂、R3试剂和磁分离试剂分别还包含牛血清白蛋白、表面活性剂、异噬性抗体阻断剂、防腐剂和缓冲液。可选地，每种所述试剂中，所述牛血清白蛋白的质量百分比浓度为0.5％～5.0％，所述表面活性剂的质量百分比浓度为0.05％～2.0％，所述异噬性抗体阻断剂浓度为10μg/mL～100μg/mL，所述防腐剂的质量百分比浓度为0.02％～1.0％，所述缓冲液的pH为为5.0～9.0。
在一个具体示例中，所述R2试剂还包含0.05％～2.0％表面活性剂和0.02％～1.0％防腐剂。
在一个具体示例中，所述测定试剂盒还包括校准品。
可选地，所述校准品包括sST2抗原、牛血清白蛋白、表面活性剂、防腐剂和缓冲液。可选地，在校准品中，所述sST2抗原的浓度为0ng/mL～500ng/mL，所述牛血清白蛋白的质量百分比浓度为0.5％～5.0％，所述表面活性剂的质量百分比浓度为0.05％～2.0％，所述防腐剂质量百分比浓度为0.02％～1.0％，所述缓冲液的pH值为5.0～9.0。
在一个具体示例中，所述防腐剂选自叠氮化钠、Proclin150、Proclin300、Proclin其他系列、BND中的一种或几种；和/或，所述表面活性剂选自吐温-20、吐温-80、Triton X-405、Triton X-100、甜菜碱中的一种或几种；和/或，所述缓冲液选自柠檬酸缓冲液、PBS缓冲液、HEPES缓冲液、Tris缓冲液、MES缓冲液和碳酸盐缓冲液中的一种。
在一个具体示例中，所述试剂盒的检测样本包括血液，可选地，血液包括全血、血清和血浆中的至少一种。
本申请一实施方式提供了一种检测sST2蛋白的方法，包括以下步骤：
将待测样品与所述解离剂混合，反应一段时间，使所述样品中的sST2复合物解离出sST2，加入所述阻断剂，抑制sST2复合物重新形成，获得预处理样本；将所述标记物标记的抗人sST2抗体、所述抗人sST2抗体标记的磁性微粒以及所述预处理样本混合孵育，免疫检测法测定sST2的含量。
具体地，免疫检测法包括化学发光法、荧光免疫层析法和酶联免疫法中的一种或多种，优选地，化学发光法。
在一个具体示例中，包括以下步骤：
1)样本处理：混合解离剂和待测样本，反应1min-60min，使所述样品中的sST2复合物解离出sST2，加入阻断剂抑制sST2复合物重新形成；
2)孵育：将标记物标记的抗人sST2抗体、抗人sST2抗体标记的磁性微粒和经过解离预处理的样本混合孵育，样本中的sST2抗原和磁性微粒上包被的抗人sST2抗体及吖啶标记的抗人sST2抗体结合物反应，形成夹心(抗体-抗原-抗体)复合物；
3)清洗：在磁场作用下，磁微粒吸附到反应杯壁，未结合的物质被清洗液洗去；
4)激发和读数：在反应复合物中加入预激发液和激发液，通过相对光单位数(RLU)测定化学发光反应，获得sST2的含量。
其中，样本中的sST2的量和测定仪光学系统检测到的相对发光强度(RLU)之间成正比。
下面将结合实施例对本申请的实施方案进行详细描述。应理解，这些实施例仅用于说明本申请而不用于限制本申请的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，优先参考本申请中给出的指引，还可以按照本领域的实验手册或常规条件，还可以按照制造厂商所建议的条件，或者参考本领域已知的实验方法。
下述的具体实施例中，涉及原料组分的量度参数，如无特别说明，可能存在称量精度范围内的细微偏差。涉及温度和时间参数，允许仪器测试精度或操作精度导致的可接受的偏差。
实施例1可溶性生长刺激表达基因2蛋白测定试剂盒
本实施例提供了一种用于检测sST2的示例性测定法，如图1所示。所述用于定量sST2的方法是在化学发光平台上进行的夹心免疫测定法。该方法包括用解离剂对生物样品进行预处理以解离样品中存在的sST2—IL-33复合物(后文简称“sST2复合物”)，并改善存在IL-33的情况下检测sST2的准确性，从而提供总sST2水平的定量测量。所述测定法在进行解离预处理后需要加入阻断剂抑制sST2复合物重新形成，且阻断剂和其他试剂不竞争结合sST2。
基于上述测定方法，本实施例还提供了一种可溶性生长刺激表达基因2蛋白测定试剂盒。所述可溶性生长刺激表达基因2蛋白测定试剂盒包括R1试剂、R2试剂、R3试剂、磁分离试剂和校准品。其中，
R1试剂包括吖啶酯标记的抗人sST2抗体、牛血清白蛋白、表面活性剂、防腐剂和缓冲液。吖啶酯标记的抗人sST2抗体的浓度为0.4μg/mL；牛血清白蛋白的质量百分比浓度为0.5％；表面活性剂为质量百分比浓度为0.05％的Triton X-405；防腐剂为质量百分比浓度为0.05％的ProClin300；缓冲液为pH为6.5的MES缓冲液。
R2试剂包括解离剂、表面活性剂、防腐剂，解离剂为碳酸氢钠溶液，浓度为50mM；表面活性剂为质量百分比浓度为0.05％的吐温-20；防腐剂为质量百分比浓度为0.05％的ProClin300。
R3试剂包括抗IL-33抗体、牛血清白蛋白、表面活性剂、防腐剂和缓冲液。抗IL-33抗体的浓度为10ng/mL；牛血清白蛋白的质量百分比浓度为0.5％；表面活性剂为质量百分比浓度为0.05％的吐温-20；防腐剂为质量百分比浓度为0.05％的ProClin300；缓冲液为pH为7.4的PBS缓冲液。
磁分离试剂包括抗人sST2抗体标记的磁性微粒、牛血清白蛋白、表面活性剂、异噬性抗体阻断剂、防腐剂和缓冲液。抗人sST2抗体标记的磁性微粒的浓度为0.1mg/mL；牛血清白蛋白的质量百分比浓度为0.5％；异嗜性抗体阻断剂浓度为50μg/mL；防腐剂为质量百分比浓度为0.05％的ProClin300；表面活性剂为质量百分比浓度为0.05％的吐温-20；缓冲液为pH为7.5的Tris缓冲液。
具体地，吖啶酯标记的抗人sST2抗体的制备方法如下：
1)在磷酸盐反应缓冲液(pH 7.4)中混合适量吖啶酯和抗人sST2抗体(每毫克抗体使用80μg吖啶酯)；
2)在25℃条件下抗人sST2抗体上的氨基和吖啶上的琥珀酰亚胺发生化学反应并键合；
3)在25℃条件下，向反应杯中加入适量赖氨酸以封闭未反应的吖啶酯，赖氨酸溶液的浓度为10mg/mL。经离心脱盐柱纯化(离心速度1000g)，得到吖啶酯标记的抗人sST2抗体；
4)收集脱盐离心后的吖啶酯标记的抗人sST2抗体，加入20％BSA溶液使其终浓度为1％，然后等体积加入甘油，放置于-20℃保存。
具体地，R1试剂的制备方法如下：
1)在容器中添加适量去离子水；
2)依次加入MES(2-(N-吗啡啉)乙磺酸)缓冲对、氯化钠、牛血清白蛋白、Triton X-405以及ProClin300；
3)加入氢氧化钠(片状)调节PH至6.5±0.1(18～28℃)；
4)继续加入适量去离子水至溶液体积为1L；
5)加入吖啶酯标记的抗人sST2抗体后过滤后置于2～8℃保存。
具体地，R2试剂的制备方法如下：
1)在容器中添加去离子水；
2)加入碳酸氢钠(50mM)、吐温-20(0.05％)以及ProClin300(0.05％)，过滤后置于4℃保存。
具体地，R3试剂的制备方法如下：
1)在容器中添加适量去离子水；
2)依次加入PBS缓冲对、氯化钠、牛血清白蛋白、吐温-20以及ProClin300；
3)加入1M氢氧化钠或者1M盐酸溶液调节PH至7.4±0.1(18～28℃)；
4)继续加入适量去离子水至溶液体积为1L；
5)加入抗IL-33抗体，使其浓度为10ng/mL，过滤后置于2～8℃保存。
具体地，抗人sST2抗体标记的磁性微粒的制备方法如下：
1)用EDC(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐)和NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)交联剂活化羧基磁珠后，在MES缓冲液(pH6.0)中混合适量磁珠和抗体，在25℃条件下反应管置于旋转混匀器上，连续混合反应，抗体上的氨基和磁珠上的中间体发生化学反应并键合(反应时间为3小时)；
2)每毫克磁珠加入的抗体的量为20μg；
3)包被反应结束后，将包被反应管置于磁分离架上静置，待悬浮液澄清后移除上清液。反应管中加入洗涤液后，在25℃条件下将反应管置于旋转混匀器上，连续混合反应(反应时间为10分钟)，反应结束后再进行磁分离。
4)反复2次对包被磁珠进行洗涤处理；向反应管中加入封闭液，在25℃条件下将反应管置于旋转混匀器上，连续混合反应(反应时间为2小时)对包被磁珠进行封闭处理。
5)加入磁珠保存液定容至10mg/mL，封口膜封口，置于4℃置于2-8℃保存。
具体地，磁分离试剂的制备方法如下：
1)在容器中添加适量去离子水；
2)依次加入Tris缓冲对、氯化钠、牛血清白蛋白、吐温-20、MOSG以及ProClin300；
3)使用1M氢氧化钠或者1M盐酸溶液调节PH至7.4±0.1(18～28℃)；
4)继续加入适量去离子水至溶液体积为1L后过滤；
5)加入抗人sST2抗体标记的磁性微粒后置于2～8℃保存。
具体地，校准品的制备方法如下：
1)在容器中添加适量去离子水；
2)依次加入Tris缓冲对、氯化钠、牛血清白蛋白、吐温-20以及ProClin300；
3)使用1M氢氧化钠或者1M盐酸溶液调节PH至7.4±0.1(18～28℃)；
4)继续加入适量去离子水至溶液体积为1L后过滤得到校准品稀释液；
5)向上述校准品稀释液中加入ST2抗原，得到ST2抗原分别为0ng/mL、35ng/mL和300ng/mL的校准品，置于2～8℃保存。
实施例2抗IL-33干扰测试
1.测定方法
配制浓度为35ng/mL(低值样本)和300ng/mL(高值样本)的sST2样本，作为对照样本；取一定量的白介素-33(IL-33)标准品，分别添加到5组浓度为35ng/mL和300ng/mL的sST2样本中，使IL-33的浓度分别为5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、30ng/mL、50ng/mL，并以此为干扰样本。使用实施例1中的试剂盒分别测定对照样本和干扰样本(表1)，各测定3次，计算平均值。同时使用实施例1所述试剂盒但不用R2和R3试剂预处理样本(表2)，分别测定对照样本和干扰样本，各测定3次，计算平均值。根据下列公式计算相对偏差。
式中：Bi——相对偏差；
——干扰样本测量结果平均值；
——对照样本测量结果平均值。
接受标准：相对偏差不超过±10％。
2.实验结果
表1抗IL-33干扰评估结果(样本进行解离预处理)
表2抗IL-33干扰评估结果(样本不做解离预处理)
通过分析表1和表2数据可知，当不使用R2和R3试剂对样本进行解离预处理时，可以明显发现IL-33会对sST2的测试结果产生较大干扰，且对低值样本的干扰尤为明显。而在对样本进行解离预处理后，可以观察到不管是低值还是高值样本浓度偏差都在10％以内，IL-33对测试的干扰明显减弱。
上述结果说明依靠解离法处理sST2样本确实可以减少由IL-33与sST2形成复合物所带来的干扰，且当IL-33的浓度为50ng/mL时本发明提供的测定方法依然能准确的测出样本中总sST2的含量。
实施例3检出限评估
1.样本准备
空白限(LoB)样本的制备：空白样本应不含被测物，但其基质应与临床样本相同。如空白样本难以得到，可采用5％牛血清或人血清白蛋白溶液。或根据测定项目选用相应基质的样本，如参考品稀释液，但应注意将基质效应减至最小。本实施例的LoB样本为校准品稀释液。
检出限(LoD)样本的制备：选择浓度约在LoB～4LoB之间的临床样本，或者与临床样本无基质效应的样本。本实施例采用的检出限样本为浓度约在LoB～4LoB之间的样本。
2.建立LoB
使用实施例1所述sST2测定试剂盒进行LoB评估，检测5个空白样本，每天测试4次，共测试3天，记录测试浓度。确认测试的60个数据是否成正态分布，若数据符合正态分布，则按式(1)计算其LoB，若数据不符合正态分布，则按式(2)计算其LoB。
LoB＝μB+1.653*SDS……………………(1)
LoB＝第95百分位数的结果……………………(2)
式中：
μB——空白样本平均值。
SDS——样本标准偏差。
3.建立LoD
使用实施例1所述sST2测定试剂盒进行进行LoD评估，检测5个LoD样本，每天测试4次，共测试3天，记录测试浓度。确认各批试剂测试的60个数据是否成正态分布，若数据符合正态分布，则按式(3)计算其LoD，若数据不符合正态分布，进行先验决策，选择等于预估LoD的5个样本，每天测试4次，共测试3天，记录测试浓度，计算小于LoB的个数比例是否小于Type II(β)error＝5％，如果小于，则按式(4)计算其LoD。如果大于，则需要提高浓度重新进行评估。
LoD＝LoB+1.653*SDS……………………(3)
LoD＝μS……………………(4)
式中：
SDS——样本标准偏差。
μD——LoD样本中位数。
3.测试结果
表3空白限-LoB评估结果
单位：ng/mL
对以上数据进行正态性检验，检验结果显示数据为非正态分布，根据LoB公式(2)进行计算，得出本发明提供的sST2测定试剂盒的LoB＝0.27ng/mL。
表4检出限-LoD评估结果单位：ng/mL
对以上数据进行正态性检验，检验结果显示数据为非正态分布，根据公式(4)进行计算，得出本发明所提供的sST2测定试剂盒的LoD＝0.98ng/mL。
虽然正常人体内IL-33含量较低，其对高浓度sST2的影响可能很小，但对sST2的低端信号有较大干扰。本发明提供一种sST2的测定方法，通过加入解离试剂对生物样品进行预处理以解离样品中存在的sST2—IL-33复合物，以此来降低IL-33的干扰，提高测试灵敏度。根据上述测试结果可知本发明所提供的sST2测定试剂盒的LoB为0.27ng/mL、LoD为0.98ng/mL，与市售sST2测定试剂盒相比极大的提高了测试灵敏度。
实施例4方法学比对测试
用实施例1中的试剂盒和市售重症监护诊断公司的酶联免疫试剂盒对40份覆盖试剂盒检测浓度范围的人血清样品同时进行检测，其检测结果如表5所示。用实施例1中的试剂盒但不用R2和R3试剂预处理样本和市售化学发光法试剂盒对40份覆盖试剂盒检测浓度范围的人血清样品同时进行检测，其检测结果如表6所示。以市售试剂盒测定的sST2浓度值为X轴(横坐标)，以本发明提供试剂盒所测sST2浓度值为Y轴(纵坐标)，作Passing-bablok回归，计算其斜率和相关系数r，应满足，斜率0.9-1.1，相关系数r≥0.95。
表5实施例1试剂盒(样本进行解离处理)与市售试剂盒的方法学比对结果
/>
表6实施例1试剂盒(样本不做解离处理)与市售试剂盒的方法学比对结果
/>
采用本申请提供sST2测定试剂盒测定的血清人sST2浓度为纵坐标，以市售化学发光法试剂盒测定的结果为横坐标作回归分析(图2-3)，经统计学处理结果表明，只有当样进行解离预处理时实施例1试剂盒同市售试剂盒测定的临床样本浓度值具有良好的相关性，进一步说明了依靠解离法处理sST2样本可以有效减少由IL-33与sST2形成复合物所带来的干扰。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准，说明书及附图可以用于解释权利要求的内容。

Claims (14)

1.一种可溶性生长刺激表达基因2蛋白的测定试剂盒，其特征在于，所述测定试剂盒包括：标记物标记的抗人sST2抗体、R2试剂、阻断剂和抗人sST2抗体标记的磁性微粒；
其中，解离剂用于解离样本中sST2复合物；阻断剂用于抑制、减少或阻断样本中sST2复合物重新形成；
R2试剂由以下组分组成：解离剂、表面活性剂和防腐剂；
其中，解离剂为NaHCO3溶液；
所述表面活性剂选自吐温-20和/或吐温-80；
所述解离剂的工作浓度为50mM；
所述表面活性剂的质量百分比浓度为0.05％；
所述阻断剂为抗IL-33抗体，或与IL-33结合的抗体片段。
2. 根据权利要求1所述的测定试剂盒，其特征在于，所述标记物标记的抗人sST2抗体的工作浓度为0.1 μg/mL~2.0 μg/mL。
3. 根据权利要求1所述的测定试剂盒，其特征在于，所述阻断剂的工作浓度为5 ng/mL~5000 ng/mL。
4. 根据权利要求1所述的测定试剂盒，其特征在于，所述抗人sST2抗体标记的磁性微粒的工作浓度为0.05 mg/mL~2.0 mg/mL。
5.根据权利要求1所述的测定试剂盒，其特征在于，所述试剂盒采用包括如下至少一种免疫检测法测定样本中的可溶性生长刺激表达基因2蛋白的含量：化学发光法、荧光免疫层析法和酶联免疫法。
6.根据权利要求1所述的测定试剂盒，其特征在于，所述标记物选自稀有过渡金属粒子、荧光团、贵金属纳米粒子或化学发光化合物。
7.根据权利要求6所述的测定试剂盒，其特征在于，所述化学发光化合物包括吖啶酯。
8.根据权利要求1所述的测定试剂盒，其特征在于，所述测定试剂盒包括R1试剂、所述R2试剂和磁分离试剂，其中，所述R1试剂含有所述标记物标记的抗人sST2抗体，所述磁分离试剂含有所述阻断剂和所述抗人sST2抗体标记的磁性微粒。
9.根据权利要求1所述的测定试剂盒，其特征在于，所述测定试剂盒包括R1试剂、所述R2试剂和磁分离试剂，其中，所述R1试剂含有所述标记物标记的抗人sST2抗体和所述阻断剂，所述磁分离试剂含有抗人sST2抗体标记的磁性微粒。
10.根据权利要求1所述的测定试剂盒，其特征在于，所述测定试剂盒包括R1试剂、所述R2试剂、阻断剂和磁分离试剂，其中，所述R1试剂含有所述标记物标记的抗人sST2抗体，所述磁分离试剂含有抗人sST2抗体标记的磁性微粒。
11.根据权利要求1所述的测定试剂盒，其特征在于，所述测定试剂盒还包括校准品。
12.根据权利要求11所述的测定试剂盒，其特征在于，所述校准品包括预设浓度的sST2抗原、牛血清白蛋白、表面活性剂、防腐剂和缓冲液。
13. 根据权利要求12所述的测定试剂盒，其特征在于，在所述校准品中，所述sST2抗原的浓度为0 ng/mL~500 ng/mL，所述牛血清白蛋白的质量百分比浓度为0.5％~5.0％，所述表面活性剂的质量百分比浓度为0.05%~2.0％，所述防腐剂质量百分比浓度为0.02%~1.0％，所述缓冲液的pH值为5.0~9.0。
14. 根据权利要求12~13任一项所述的测定试剂盒，其特征在于，所述R2试剂和校准品的防腐剂分别选自叠氮化钠、Proclin150、Proclin300、BND中的一种或几种；和/或
所述表面活性剂选自吐温-20、吐温-80、Triton X-405、Triton X-100、甜菜碱中的一种或几种；和/或
所述缓冲液选自柠檬酸缓冲液、PBS缓冲液、HEPES缓冲液、Tris缓冲液、MES缓冲液和碳酸盐缓冲液中的一种。
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