CN117054663A - 检测可溶性生长刺激表达基因2蛋白的试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本申请一种检测可溶性生长刺激表达基因2蛋白的试剂盒，该试剂盒包括sST2结合分子、捕获抗体和检测抗体；sST2结合分子与样品中的sST2结合形成sST2复合物；试剂盒采用夹心法检测所述sST2复合物，测定样品中的总sST2的含量；捕获抗体选自抗sST2抗体、抗sST2结合分子抗体、抗sST2结合分子融合蛋白抗体和抗sST2复合物抗体中的一种，检测抗体选自抗sST2抗体、抗sST2结合分子抗体、抗sST2结合分子融合蛋白抗体和抗sST2复合物抗体中的另一种。该试剂盒可减少由所述样品中存在的内源可溶性sST2结合分子引起的测定干扰，提高测试灵敏度，安全高效，具有良好的开发和应用前景。

Description

检测可溶性生长刺激表达基因2蛋白的试剂盒
技术领域
本申请属于免疫分析技术领域，涉及一种检测可溶性生长刺激表达基因2蛋白的试剂盒。
背景技术
生长刺激表达基因2蛋白(ST2)是IL-1受体家族的一员，ST2蛋白与心脏疾病相关的主要有两种亚型，第一种是sST2是一种可溶性的、在循环系统中存在的亚型，又称为可溶性ST2；另一种是跨膜结合亚型，称为ST2受体或ST2L。两种亚型是通过选择性剪接和加工形成，都可与IL-33特异性结合。
白介素-33(IL-33)是一种响应损伤信号或侵害而上调的IL-1家族的细胞因子。当基质细胞损伤或坏死时可释放IL-33，其可激活免疫细胞上的异二聚体ST2L/IL-1RAcP复合物，紧接着相关信号通过Toll-IL-1受体传导，通过激活不同的细胞内激酶，最终产生炎性细胞因子和趋化因子并传播针对受损组织存在的免疫应答(Weinberg,2009)。IL-33作为ST2的特异性配体于2005年被首次报道(Schmitz,et al,2005)，生理上，IL-33与ST2L结合是心肌应激或损伤后的应对措施，可下调心脏功能。此外，可溶性sST2也会竞争结合IL-33，对传递心脏保护性信号产生影响。对于心衰或其他体内可溶性sST2表达水平较高的患者，在与IL-33结合的过程中sST2开始占据优势，导致IL-33与ST2L受体的结合受阻，从而使应激的心肌细胞不能获得保护作用，进入凋亡通路，引起心肌坏死和纤维化(Liew,et al,2010；Miller and Liew,2011；Villarreal and Weiner,2014；Mueller and Jaffe,2015)。
有研究表明，sST2浓度与心衰严重程度有关，研究显示，无论急性心衰还是慢性心衰，sST2水平越高，预示着患者心肌纤维化越严重，心衰程度越高，而心肌纤维化与心肌重构都是导致心衰发病与死亡的重要原因，sST2作为反映心肌纤维化的指标，在评价药物疗效方面同样有着不可忽视的作用。检测和定量sST2水平的研究意义在于辅助心衰患者的危险分层和预后评估，同时在预测急性心力衰竭患者的预后和指导治疗方面显示出非常高的临床价值。目前《美国心脏病协会/美国心脏的心衰指南》、《中国心力衰竭诊断和治疗指南》等都推荐将可溶性ST2作为心力衰竭的生物标志物之一。
可溶性ST2在体内主要有两种存在形式，一种是游离型sST2，另一种是与IL-33结合形成复合物。由于sST2有部分表位在IL-33的结合区域，当sST2与IL-33形成复合物后可能会使部分抗sST2抗体的识别表位被覆盖，在此情况下IL-33的存在会极大程度上干扰sST2的测试准确性。因此，为了得到更加准确的测试结果，亟需一种能够减少测定干扰的sST2检测和定量方法。
发明内容
基于此，本申请提供一种通过sST2复合物来检测和/或定量可溶性生长刺激表达基因2蛋白的试剂盒及方法。相对于可商业购买获得的测定法和/或对照测定法，本申请的测定法具有减少测定干扰的优势，且以本申请所述测试方法为指导制备的sST2测定试剂盒的检测灵敏和准确性更高。
具体技术方案如下：
一种可溶性生长刺激表达基因2蛋白的检测试剂盒，所述试剂盒包括sST2结合分子、捕获抗体和检测抗体，所述sST2结合分子用于将样本中的游离sST2转化为sST2复合物，采用免疫夹心法检测sST2复合物，测定样品中的总sST2的含量。
在其中一个实施例中，所述捕获抗体选自抗sST2抗体、抗sST2结合分子抗体、抗sST2结合分子融合蛋白抗体或抗sST2复合物抗体中的一种，所述检测抗体选自抗sST2抗体、抗sST2结合分子抗体、抗sST2结合分子融合蛋白抗体或抗sST2复合物抗体中的另一种，所述捕获抗体和所述检测抗体为不同种抗体。
可选地，所述检测抗体和所述捕获抗体分别独立地选自单克隆抗体，多克隆的抗体，和Fab、Fab'、F(ab')2、Fv或scFv片段中的一种或多种。
可选地，所述检测抗体和所述捕获抗体来源选自鼠源抗体、羊源抗体、人源化抗体或者嵌合抗体。
在其中一个实施例中，所述sST2结合分子为IL-33或与sST2结合的IL-33片段。
相对于现有技术，本申请具备如下有益效果：
本申请通过检测sST2复合物的量来确定样本中总sST2的水平，可以降低IL-33对sST2测试结果的干扰，提高了测试灵敏度和准确性。此外，本申请提供的方法不需要对样本进行复杂的处理，操作方便，节约时间；
进一步地本申请提供的sST2的测定方案适用于任意免疫检测法，包括但不限于化学发光法、酶联免疫法、免疫层析法等，所用抗体的选择范围较广，降低了研发成本。
附图说明
图1为本申请的一个实施方案的示例性测定法方案示意图；
图2本申请实施例4中可溶性生长刺激表达基因2蛋白测定试剂盒(样本进行预处理)与市售化学发光法试剂盒测定值的方法学比对示意图；
图3可溶性生长刺激表达基因2蛋白测定试剂盒(样本不进行预处理)与市售化学发光法试剂盒测定值的方法学比对示意图。
具体实施方式
为使本申请的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本申请的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本申请。但是本申请能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本申请内涵的情况下做类似改进，因此本申请不受下面公开的具体实施例的限制。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本申请的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本申请的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本申请。
本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
由于样品中sST2复合物的存在会对sST2的测定结果造成严重干扰，因此发明人将样品中的sST2转化为sST2复合物，再通过检测sST2复合物确定总sST2浓度。
基于此，本申请一实施方式提供了一种sST2免疫测定法，将样品中sST2转化为sST2复合物，并通过测定sST2复合物的信号定量体内总sST2的浓度。该方法可减少由所述样品中存在的内源可溶性sST2结合分子引起的测定干扰，示例性的可溶性sST2结合分子一般指细胞因子IL-33。
上述测定法的核心是利用sST2结合分子处理待测样品，当体内sST2全部转化为sST2复合物时，再通过所选免疫测定法检测和定量总sST2的浓度，以此改善在IL-33存在的情况下对sST2的检测结果。
本申请一实施方式还提供了一种可溶性生长刺激表达基因2蛋白的检测试剂盒，该试剂盒包括sST2结合分子、捕获抗体和检测抗体；所述sST2结合分子与样品中sST2结合形成sST2复合物；所述试剂盒采用夹心法通过检测所述sST2复合物，测定样品中的总sST2的含量。
在一个具体示例中，所述捕获抗体选自抗sST2抗体、抗sST2结合分子抗体、抗sST2结合分子融合蛋白抗体或抗sST2复合物抗体中的一种，所述检测抗体选自抗sST2抗体、抗sST2结合分子抗体、抗sST2结合分子融合蛋白抗体或抗sST2复合物抗体中的另一种。需要说明的是，所述捕获抗体和所述检测抗体为不同种抗体，且捕获抗体、检测抗体能与sST2复合物抗原形成夹心(抗体-抗原-抗体)复合物。
本领域技术人员可以通过商业购买途径获得上述捕获抗体或检测抗体，或通过本领域的常规技术手段制备上述捕获抗体或检测抗体。
在一个具体示例中，所述检测抗体和所述捕获抗体分别独立地选自单克隆抗体，多克隆的抗体，Fab、Fab'、F(ab')2、Fv和scFv片段中的一种或多种。
在一个具体示例中，所述检测抗体和所述捕获抗体来源选自鼠源抗体、羊源抗体、人源化抗体或者嵌合抗体。
在一个优选具体示例中，所述捕获抗体为抗sST2单克隆抗体，所述检测抗体为抗sST2复合物单克隆抗体。
在一个具体示例中，所述sST2结合分子为IL-33或与sST2结合的IL-33片段。
在一个具体示例中，所述抗sST2复合物抗体能特异性识别sST2和IL-33复合物。
在一个具体示例中，所述sST2结合分子融合蛋白能与IL-33结合的蛋白，所述sST2结合分子融合蛋白为IL-33融合蛋白。可选地，所述IL-33融合蛋白包括IL-33融合鼠或羊免疫球蛋白的Fc段。
在一个具体示例中，所述试剂盒还包括固相载体，所述捕获抗体与所述固相载体缀合，和/或，所述检测抗体与标记物缀合。
在一个具体示例中，缀合包括直接或间接地进行缀合。
利用结合配偶体，如生物素/链霉亲和素之一，可以实现间接缀合，例如抗体与生物素缀合，链霉亲和素与固相载体缀合，进而使抗体与固相载体缀合。
术语“结合配偶体”是指作为特异性结合对的成员的分子，其是特异性结合另一分子并因此被定义为与另一分子互补的两种不同分子之一。
在一个具体示例中，所述固相载体包括磁性微粒、微球、胶乳颗粒或微孔板，磁性微粒为磁珠，可选地，羧基磁珠、Tosyl(甲苯磺酰基)磁珠、SA(链霉亲和素)磁珠。
在一个具体示例中，捕获抗体与磁珠性微粒缀合的方法，包括如下步骤：制备活化后的磁性微粒；在缓冲液中混合所述活化后的磁性微粒和捕获抗体，获得捕获抗体与磁性微粒的缀合物。
在一个具体示例中，每毫克所述磁性微粒加入所述捕获抗体的量为5μg～50μg。在一个具体示例中，所述缓冲液选自柠檬酸缓冲液、PBS缓冲液、HEPES缓冲液、Tris缓冲液、MES缓冲液和碳酸盐缓冲液中的一种，可选地，所述缓冲液的pH值为5.0～9.0。
在一个具体示例中，所述标记物选自稀有过渡金属粒子、荧光团、发色团、贵金属纳米粒子或化学发光化合物。进一步可选地，所述化学发光化合物包括吖啶酯、碱性磷酸酶、HRP、异鲁米诺和三联吡啶钌中的一种，优选地，吖啶酯。
在一个具体示例中，标记物与检测抗体缀合的方法，包括如下步骤：在缓冲液中混合吖啶酯和所述检测抗体，获得检测抗体与标记物的缀合物。
具体地，每毫克所述检测抗体加入10μg-1000μg的吖啶酯。可选地，所述缓冲液选自柠檬酸缓冲液、PBS缓冲液、HEPES缓冲液、Tris缓冲液、MES缓冲液和碳酸盐缓冲液中的一种，进一步可选地，所述缓冲液的pH值为5.0～9.0。
在一个具体示例中，检测抗体与标记物的缀合物的工作浓度为0.1μg/mL～2.0μg/mL；所述sST2结合分子的工作浓度为50ng/mL～1000ng/mL。
在一个具体示例中，捕获抗体与磁性微粒的缀合物的工作浓度为0.05mg/mL～2.0mg/mL。
需要说明的是，在本申请中，试剂盒中的sST2结合分子既可以单独作为一个单独的试剂，也可以与其他组分如捕获抗体与磁性微粒的缀合物或检测抗体与标记物的缀合物。例如，试剂盒包括磁分离试剂，R1试剂和R2试剂，其中，所述磁分离试剂包含捕获抗体与磁性微粒的缀合物，所述R1试剂包含检测抗体与标记物的缀合物，所述R2试剂包含sST2结合分子。
在一个具体示例中，所述R1试剂和所述R2试剂分别还包括蛋白保护剂、表面活性剂、防腐剂和缓冲液。其中，所述蛋白保护剂的质量百分比浓度为0.5％～5.0％。所述表面活性剂选自吐温、Triton X-405、Triton X-100、甜菜碱、Brij中的一种或几种，所述表面活性剂的质量百分比浓度为0.05％～2.0％。所述防腐剂选自叠氮化钠、Proclin150、Proclin300、Proclin其他系列、BND中的一种或几种，所述防腐剂的质量百分比浓度为0.02％～1.0％。
在一个具体示例中，所述磁分离试剂还包括蛋白保护剂、表面活性剂、异嗜性抗体阻断剂、防腐剂和缓冲液。其中，所述蛋白保护剂的质量百分比浓度为0.5％～5.0％。所述表面活性剂选自吐温、Triton X-405、Triton X-100、甜菜碱、Brij中的一种或几种，所述表面活性剂的质量百分比浓度为0.05％～2.0％。所述异嗜性抗体阻断剂浓度为10μg/mL～100μg/mL。所述防腐剂选自叠氮化钠、Proclin150、Proclin300、Proclin其他系列、BND中的一种或几种，所述防腐剂的质量百分比浓度为0.02％～1.0％。
在一个具体示例中，所述试剂盒还包括校准品，所述校准品包括预设浓度的sST2抗原、蛋白保护剂、表面活性剂、防腐剂和缓冲液，所述sST2抗原的浓度范围为0ng/mL～500ng/mL。其中，所述蛋白保护剂的质量百分比浓度为0.5％～5.0％。在一个具体示例中，所述防腐剂选自叠氮化钠、Proclin150、Proclin300、Proclin其他系列、BND中的一种或几种，所述防腐剂的质量百分比浓度为0.02％～1.0％。在一个具体示例中，所述表面活性剂选自吐温、Triton X-405、Triton X-100、甜菜碱、Brij中的一种或几种，所述表面活性剂的质量百分比浓度为0.05％～2.0％。
在一个具体示例中，所述缓冲液选自柠檬酸缓冲液、PBS缓冲液、HEPES缓冲液、Tris缓冲液、MES缓冲液和碳酸盐缓冲液中的一种，所述缓冲液的pH值为5.0～9.0。
在一个具体示例中，所述试剂盒采用的免疫检测方法包括化学发光法、荧光免疫层析法和酶联免疫法中一种或多种。
本申请一实施方式还提供了上述试剂盒的使用方法，包括将试剂盒中所述的sST2结合分子、捕获抗体和检测抗体与待测样本混合反应，检测样本中的sST2含量的步骤。
具体地，该试剂盒检测待测样本中的sST2含量，包括如下步骤：
所述sST2结合分子和待测样本混合反应，使所述样本中的sST2转化为sST2复合物；
向待测样本中加入所述捕获抗体和所述检测抗体，测定其发光强度，获得样本中的sST2含量。
下面将结合实施例对本申请的实施方案进行详细描述。应理解，这些实施例仅用于说明本申请而不用于限制本申请的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，优先参考本申请中给出的指引，还可以按照本领域的实验手册或常规条件，还可以按照制造厂商所建议的条件，或者参考本领域已知的实验方法。
下述的具体实施例中，涉及原料组分的量度参数，如无特别说明，可能存在称量精度范围内的细微偏差。涉及温度和时间参数，允许仪器测试精度或操作精度导致的可接受的偏差。
实施例1可溶性生长刺激表达基因2蛋白测定试剂盒的组成
参阅图1所示，本实施例提供了一种用于检测sST2的示例性测定法。这种用于定量sST2的方法是在化学发光平台上进行的夹心免疫测定法。该方法包括用sST2结合分子(IL-33)对生物样品进行预处理使样品中sST2与IL-33结合形成sST2—IL-33复合物(简称“sST2复合物”)，通过检测sST2复合物的量来改善IL-33对sST2的检测干扰，从而提供总sST2水平的定量测量方法。基于上述测定方法，本实施例还提供了一种可溶性生长刺激表达基因2蛋白测定试剂盒，该测定试剂盒包括R1试剂、R2试剂、磁分离试剂、校准品。
R1试剂包括吖啶酯标记的抗sST2—IL-33复合物抗体、牛血清白蛋白、表面活性剂、防腐剂和缓冲液。吖啶酯标记抗体的浓度为0.4μg/mL；牛血清白蛋白的质量百分比浓度为0.5％；表面活性剂为质量百分比浓度为0.05％的Triton X-405；防腐剂为质量百分比浓度为0.05％的ProClin300；缓冲液为pH为6.5的MES缓冲液。
R2试剂包括重组人IL-33蛋白分子、表面活性剂、牛血清白蛋白、防腐剂和缓冲液，重组人IL-33浓度为500ng/mL；表面活性剂为质量百分比浓度为0.05％的吐温-20；防腐剂为质量百分比浓度为0.05％的ProClin300；缓冲液为pH为7.4的PBS缓冲液。
磁分离试剂包括抗人sST2抗体标记的磁性微粒、牛血清白蛋白、表面活性剂、异嗜性抗体阻断剂、防腐剂和缓冲液。抗人sST2抗体标记的磁性微粒的浓度为0.1mg/mL；牛血清白蛋白的质量百分比浓度为0.5％；异嗜性抗体阻断剂浓度为50μg/mL；防腐剂为质量百分比浓度为0.05％的ProClin300；表面活性剂为质量百分比浓度为0.05％的吐温-20；缓冲液为pH为7.5的Tris缓冲液。
吖啶酯标记的抗人sST2—IL-33复合物抗体的制备方法如下：
1)在磷酸盐反应缓冲液(pH 7.4)中混合适量吖啶酯和抗sST2—IL-33复合物抗体(每毫克抗体使用80μg吖啶酯)；
2)在25℃条件下抗sST2—IL-33复合物抗体上的氨基和吖啶上的琥珀酰亚胺发生化学反应并键合；
3)在25℃条件下，向反应杯中加入适量赖氨酸以封闭未反应的吖啶酯，赖氨酸溶液的浓度为10mg/mL。经离心脱盐柱纯化(离心速度1000g)，得到吖啶酯标记的抗sST2—IL-33复合物抗体；
4)收集脱盐离心后的吖啶酯标记的抗sST2—IL-33复合物抗体，加入20％BSA溶液使其终浓度为1％，然后等体积加入甘油，放置于-20℃保存。
R1试剂的制备方法如下：
1)在容器中添加适量去离子水；
2)依次加入MES缓冲对、氯化钠、牛血清白蛋白、Triton X-405以及ProClin300；
3)加入氢氧化钠(片状)调节PH至6.5±0.1(18～28℃)；
4)继续加入适量去离子水至溶液体积为1L；
5)加入吖啶酯标记的抗sST2—IL-33复合物抗体后过滤后置于2～8℃保存。
R2试剂的制备方法如下：
1)在容器中添加适量去离子水；
2)依次加入PBS缓冲对、氯化钠、牛血清白蛋白、吐温-20以及ProClin300；
3)加入1M氢氧化钠或者1M盐酸溶液调节PH至7.4±0.1(18～28℃)；
4)继续加入适量去离子水至溶液体积为1L；
5)加入重组人IL-33，使其浓度为500ng/mL，过滤后置于2～8℃保存。
抗人sST2抗体标记的磁性微粒的制备方法如下：
1)用EDC和NHS交联剂活化羧基磁珠后，在MES缓冲液(pH6.0)中混合适量磁珠和抗体，在25℃条件下反应管置于旋转混匀器上，连续混合反应，抗体上的氨基和磁珠上的中间体发生化学反应并键合(反应时间为3小时)；
2)每毫克磁珠加入的抗体的量为20μg；
3)包被反应结束后，将包被反应管置于磁分离架上静置，待悬浮液澄清后移除上清液。反应管中加入洗涤液后，在25℃条件下将反应管置于旋转混匀器上，连续混合反应(反应时间为10分钟)，反应结束后再进行磁分离。
4)反复2次对包被磁珠进行洗涤处理；向反应管中加入封闭液，在25℃条件下将反应管置于旋转混匀器上，连续混合反应(反应时间为2小时)对包被磁珠进行封闭处理。
5)加入磁珠保存液定容至10mg/mL，封口膜封口，置于4℃置于2-8℃保存。
磁分离试剂的制备方法如下：
1)在容器中添加适量去离子水；
2)依次加入Tris缓冲对、氯化钠、牛血清白蛋白、吐温-20、MOSG(人抗鼠IgG抗体阻断剂，是一种异嗜性抗体阻断剂)以及ProClin300；
3)使用1M氢氧化钠或者1M盐酸溶液调节PH至7.4±0.1(18～28℃)；
4)继续加入适量去离子水至溶液体积为1L后过滤；
5)加入抗人sST2抗体标记的磁性微粒后置于2～8℃保存。
校准品的制备方法如下：
1)在容器中添加适量去离子水；
2)依次加入Tris缓冲对、氯化钠、牛血清白蛋白、吐温-20以及ProClin300；
3)使用1M氢氧化钠或者1M盐酸溶液调节PH至7.4±0.1(18～28℃)；
4)继续加入适量去离子水至溶液体积为1L后过滤得到校准品稀释液；
5)向上述校准品稀释液中加入ST2抗原，得到ST2抗原分别为0ng/mL、35ng/mL和300ng/mL的校准品，置于2～8℃保存。
实施例2抗IL-33干扰测试
1.实验材料和方法
配制浓度为35ng/mL和300ng/mL的sST2样本中，作为对照样本；取一定量的白介素-33(IL-33)标准品，分别添加到5份浓度为35ng/mL和300ng/mL的sST2样本中，使IL-33的浓度分别为5、10、20、30、50ng/mL，并以此为干扰样本。使用实施例1中的试剂盒分别测定对照样本和干扰样本，具体地，样本先经R2试剂进行预处理，将样本中的sST2转化为sST2复合物，再测定sST2复合物信号值来定量总sST2浓度，各测定3次，计算平均值。样本中总sST2的量和测定仪光学系统测定到的相对发光强度(RLU)呈正相关。测试结果通过校准曲线确定。校准曲线由分析仪通过3点定标并根据二维码扫描到仪器的主曲线校正而来。
同时使用实施例1所述试剂盒的磁分离试剂，并用吖啶酯标记的抗人sST2抗体重新制备R1试剂，对样本不进行预处理，用上述磁分离试剂和新制R1试剂分别测定对照样本和干扰样本，各测定3次，计算平均值。根据下列公式计算相对偏差。
式中：Bi——相对偏差；
——干扰样本测量结果平均值；
——对照样本测量结果平均值。
接受标准：相对偏差不超过±10％。
2.实验结果
表1抗IL-33干扰评估结果(样本进行预处理，测sST2复合物)
表2抗IL-33干扰评估结果(样本不做预处理，只测sST2)
通过分析表1～2数据可知，当只检测sST2且不使用R2试剂对样本进行预处理时，可以明显发现IL-33会对sST2的测试结果产生较大干扰，且对低值样本的干扰尤为明显。而在用sST2结合分子对样本进行预处理后形成sST2复合物，通过测试复合物的量来反映总sST2的量，可以观察到不管是低值还是高值样本浓度偏差都在10％以内，IL-33对测试的干扰明显减弱。上述结果说明依靠sST2—IL-33复合物检测总sST2的量确实可以减少IL-33所带来的干扰。
实施例3检出限评估
1.样本准备
空白限(LoB)样本的制备：空白样本应不含被测物，但其基质应与临床样本相同。如空白样本难以得到，可采用5％牛血清或人血清白蛋白溶液。或根据测定项目选用相应基质的样本，如参考品稀释液，但应注意将基质效应减至最小。本实施例的LoB样本为校准品稀释液。
检出限(LoD)样本的制备：选择浓度约在LoB～4LoB之间的临床样本，或者与临床样本无基质效应的样本。本实施例采用的检出限样本为浓度约在LoB～4LoB之间的样本。
2.建立LoB
使用实施例1所述sST2测定试剂盒进行LoB评估，检测5个空白样本，每天测试4次，共测试3天，记录测试浓度。确认测试的60个数据是否成正态分布，若数据符合正态分布，则按式(1)计算其LoB，若数据不符合正态分布，则按式(2)计算其LoB。
LoB＝μB+1.653*SDS……………………(1)
LoB＝第95百分位数的结果……………………(2)
式中：
μB——空白样本平均值。
SDS——样本标准偏差。
3.建立LoD
使用实施例1所述sST2测定试剂盒进行进行LoD评估，检测5个LoD样本，每天测试4次，共测试3天，记录测试浓度。确认各批试剂测试的60个数据是否成正态分布，若数据符合正态分布，则按式(3)计算其LoD，若数据不符合正态分布，进行先验决策，选择等于预估LoD的5个样本，每天测试4次，共测试3天，记录测试浓度，计算小于LoB的个数比例是否小于Type II(β)error＝5％，如果小于，则按式(4)计算其LoD。如果大于，则需要提高浓度重新进行评估。
LoD＝LoB+1.653*SDS……………………(3)
LoD＝μS……………………(4)
式中：
SDS——样本标准偏差。
μD——LoD样本中位数。
3.测试结果
表3空白限-LoB评估结果
单位：ng/mL
对以上数据进行正态性检验，检验结果显示数据为非正态分布，根据LoB公式(2)进行计算，得出本发明所提供的sST2测定试剂盒的LoB＝0.29ng/mL。
表4检出限-LoD评估结果单位：ng/mL
对以上数据进行正态性检验，检验结果显示数据为非正态分布，根据公式(4)进行计算，得出本发明所提供的sST2测定试剂盒的LoD＝0.97ng/mL。
虽然正常人体内IL-33含量较低，其对高浓度sST2的影响可能很小，但对sST2的低端信号有较大干扰。本发明提供一种sST2的测定方法，通过加入sST2结合分子对样本进行预处理后形成sST2复合物，通过测试复合物的量来反映总sST2的量，以此来降低IL-33的干扰，提高测试灵敏度。根据上述测试结果可知本发明所提供的sST2测定试剂盒的LoB为0.29ng/mL、LoD为0.97ng/mL，与市售sST2测定试剂盒相比极大的提高了测试灵敏度。
实施例4方法学比对测试
1.测定方法
用实施例1中的试剂盒和市售化学发光法试剂盒对40份覆盖试剂盒检测浓度范围的人血清样品同时进行检测，其检测结果如表5所示；同时使用实施例1所述试剂盒的磁分离试剂，并用吖啶酯标记的抗人sST2抗体重新制备R1试剂，对样本不进行预处理，用上述磁分离试剂和新制R1试剂对40份覆盖试剂盒检测浓度范围的人血清样品进行检测，其检测结果如表6所示。以市售试剂盒测定的sST2浓度值为X轴(横坐标)，以本发明提供试剂盒所测sST2浓度值为Y轴(纵坐标)，作Passing-bablok回归，计算其斜率和相关系数r，应满足，斜率0.9-1.1，相关系数r≥0.95。
2.测试结果
表5实施例1试剂盒(样本进行预处理，测sST2复合物)与市售试剂盒的方法学比对结果
/>
表6对照试剂盒(样本不做处理，只测sST2)与市售试剂盒的方法学比对结果
/>
上述方法学比对数据经统计学处理，结果表明用sST2结合分子对样本进行预处理后形成sST2复合物，通过测试复合物的量来反映总sST2的量，此时实施例1试剂盒同市售试剂盒测定的临床样本浓度值具有良好的相关性(图2-3)，进一步说明了依靠检测sST2—IL-33复合物来测定总sST2的量，可以有效减少由IL-33带来的干扰。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本申请的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本申请的保护范围。因此，本申请专利的保护范围应以所附权利要求为准，说明书及附图可以用于解释权利要求的内容。

Claims (10)

1.一种可溶性生长刺激表达基因2蛋白的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括sST2结合分子、捕获抗体和检测抗体；
所述sST2结合分子与样品中的sST2结合形成sST2复合物；
所述试剂盒采用免疫夹心法检测所述sST2复合物，测定样品中的总sST2的含量；
所述捕获抗体选自抗sST2抗体、抗sST2结合分子抗体、抗sST2结合分子融合蛋白抗体和抗sST2复合物抗体中的一种，所述检测抗体选自抗sST2抗体、抗sST2结合分子抗体、抗sST2结合分子融合蛋白抗体和抗sST2复合物抗体中的另一种，所述捕获抗体和所述检测抗体为不同种抗体。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述检测抗体和所述捕获抗体分别独立地选自单克隆抗体，多克隆的抗体，Fab、Fab'、F(ab')2、Fv和scFv片段中的一种或多种；
可选地，所述检测抗体和所述捕获抗体来源选自鼠源抗体、羊源抗体、人源化抗体或者嵌合抗体；
可选地，所述捕获抗体为抗sST2单克隆抗体，所述检测抗体为抗sST2复合物单克隆抗体。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒采用包括如下至少一种免疫检测法测定样本中的可溶性生长刺激表达基因2蛋白的含量：检测法化学发光法、荧光免疫层析法和酶联免疫法。
4.根据权利要求1～3任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述sST2结合分子的工作浓度为50ng/mL～1000ng/mL；
可选地，所述sST2结合分子为IL-33或能够与sST2结合的IL-33片段；
可选地，所述抗sST2复合物抗体能特异性识别sST2和IL-33复合物；
可选地，所述sST2结合分子融合蛋白为能与IL-33结合的蛋白，所述sST2结合分子融合蛋白为IL-33融合蛋白；
可选地，所述IL-33融合蛋白包括IL-33融合鼠或羊免疫球蛋白的Fc段。
5.根据权利要求1～3任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括固相载体，所述捕获抗体与所述固相载体缀合；和/或
所述检测抗体与标记物缀合；
可选地，所述缀合为直接或间接地进行缀合。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述固相载体包括磁珠、微球、胶乳颗粒或微孔板，优选地，所述固相载体为磁珠。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述捕获抗体与所述固相载体缀合后所得缀合物的工作浓度为0.05mg/mL～2.0mg/mL。
8.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述标记物选自稀有过渡金属粒子、荧光团、发色团、贵金属纳米粒子或化学发光化合物；
可选地，所述化学发光化合物包括吖啶酯、碱性磷酸酶、HRP、异鲁米诺和三联吡啶钌中的一种，优选地，所述化学发光化合物为吖啶酯。
9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述检测抗体与所述标记物缀合后所得缀合物的工作浓度为0.1μg/mL～2.0μg/mL。
10.根据权利要求1～3,6～9中任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述的sST2结合分子、捕获抗体和检测抗体与待测样本混合反应，检测样本中的sST2含量；
可选地，所述试剂盒检测待测样本中的sST2含量，包括如下步骤：
所述sST2结合分子和待测样本混合反应，使所述样本中的sST2转化为sST2复合物；
向待测样本中加入所述捕获抗体和所述检测抗体，测定其发光强度，获得样本中的sST2含量。
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