CN107422131A - 可溶性st2的检测方法及检测试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种可溶性ST2检测方法，该方法包括：可溶性ST2的特异性抗体联合可溶性ST2配体蛋白作为检测物,其中所述的ST2配体蛋白为白介素‑33及其类似物。此外，本发明还提供一种应用上述方法检测可溶性ST2的试剂盒。本发明的可溶性ST2检测方法及试剂盒中，IL‑33及其类似物可采用基因工程表达或者化学合成获得，生产工艺更容易标准化，且检测准确度获得进一步的提高。

Description

可溶性ST2的检测方法及检测试剂盒
技术领域
本发明涉及体外诊断技术领域，具体涉及生物检测技术领域，特别涉及一种可溶性ST2的检测方法及检测试剂盒。
背景技术
随着生活方式的改变及人口老龄化程度的增加，我国心脑血管疾病患者的数量日益增加；心力衰竭(简称心衰)是由于心脏结构或功能异常导致心室充盈或射血能力受损的一组复杂临床综合征，其主要临床表现为呼吸困难和乏力，活动耐量受限，以及液体潴留，肺淤血和外周水肿。心衰为各种心脏疾病的严重和终末阶段，发病率和病死率高，其五年存活率与恶性肿瘤相近，是当今最重要的心血管疾病之一。
目前临床上对心衰管理存在多种困难，如：早期筛查的检测不普及；病人出院以后难以监控；没有固定的出院指南；无法调整用药的种类以及确定用药的剂量；无法评估再入院的风险；无法鉴别最需要治疗的高风险患者。
现代医学研究通过各种生物标志物来实现对心衰的管理；常见的心衰标志物主要包括以下7类：心肌损伤标志物、心肌牵张标志物、心肌纤维化和重构标志物、炎症标志物、氧化应激标志物、神经内分泌激活标志物以及肾功能标志物；其分别反映不同的病理生理过程。
作为心肌纤维化和重构标志物，可溶性生长刺激表达因子((Growth StimulatingEx-press Gene 2，sST2，或可溶性ST2)在心衰患者管理中的应用越来越受到广泛的关注，《美国心衰指南2013》、《中国心力衰竭诊断和治疗指南2014》中提出可溶性ST2反映心肌纤维化，在急慢性心衰的预测、预后和危险分层中可提供额外信息，是目前临床上最有潜力的、新一代的心衰管理标志物。
综上所述，可溶性ST2检测对心衰患者的临床管理具有重要价值。
目前对可溶性ST2的检测基本上采用双抗体夹心法的免疫学方法进行检测，包括：酶联免疫吸附法(专利：CN106556705A)、胶体金层析法(专利：CN103487586B)、荧光免疫层析法(专利：CN204287196U)、化学发光法(专利：CN106199002A)、免疫比浊(专利：CN106018789A)等。
考虑到临床样本中的可溶性ST2浓度非常低(1ng/mL～200ng/mL)，且存在结构上同源的类似蛋白(如，IL-1受体家族其他蛋白)，因此，可溶性ST2的检测需兼顾灵敏度与特异性；而现有的方法学往往存在特异性或者灵敏度的缺陷。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供一种ST2的检测方法，该方法包括：用标记物标记可溶性ST2的配体蛋白——白介素-33(interleukin-33，IL-33)及其类似物，作为检测物；同时，将1株或多株抗可溶性ST2的抗体结合到固相载体上。检测时，将待测的样本加入到固相载体上，再加入已做标记的IL-33及其类似物，通过检测标记物的方法来检测待检样品中是否存在可溶性ST2。
应当说明的是：此方法中，可以用标记物标记IL-33及其类似物，而将可溶性ST2抗体结合到固相载体上，然后将待检样品加入到固相载体上，再加入已做标记的IL-33及其类似物，通过检测标记物方法来检测待检样品中是否存在可溶性ST2；同样地，也可以用标记物标记可溶性ST2抗体，而将IL-33及其类似物结合到固相载体上，然后将待检样品加入到固相载体上，再加入已做标记的可溶性ST2抗体，通过检测标记物方法来检测待检样品中是否存在可溶性ST2。
较优地，所述可溶性ST2检测方法中，IL-33及其类似物，应至少含有以下的氨基酸序列：
Gln-Tyr-Xaa-Cys-Leu-Ala-Leu-Asn-Leu-His-Gly-Leu-Arg-Arg-His-Thr-Val-Arg-Leu-Ser-Arg-Lys-Asn-Pro-Ser-Lys-Glu-Cys-Phe。
其中，Xaa表示任意的氨基酸。
较优地，所述可溶性ST2检测方法中，所述的IL-33及其类似物，其C末端的氨基酸序
列如下：
Gln-Tyr-Asp-Cys-Leu-Ala-Leu-Asn-Leu-His-Gly-Leu-Arg-Arg-His-Thr-Val-Arg-Leu-Ser-Arg-Lys-Asn-Pro-Ser-Lys-Glu-Cys-Phe。
可想而知的，上述的IL-33及其类似物的偶联有大分子物质，以增强标记效果或是免疫效果。
本领域的普通技术人员应当知道，所述的字母分别代表相应的氨基酸，字母与氨基酸的对应关系为：
丙氨酸(alanine，Ala)-A，精氨酸(arginine，Arg)-R，天冬酰胺(asparagine，Asn)-N，天冬氨酸(aspartic acid，Asp)-D，亮氨酸(leucine，Leu)-L，赖氨酸(lysine，Lys)-K，甲硫氨酸(methionine，Met)-M，苯丙氨酸(phenylalanine，Phe)-F，半胱氨酸(cysteine，Cys)-C，脯氨酸(proline，Pro)-P，谷氨酰胺(glutanine，Gln)-Q，丝胺酸(serine，Ser)-S，谷氨酸(glutamic acid，Glu)-E，苏氨酸(threonine，Thr)-T，甘氨酸(Glicine，Gly)-G，色氨酸(tryptophan，Tyr)-W，组氨酸(histidine，His)-H，酪氨酸(tyrosine，Tyr)-Y，异亮氨酸(isoleucine，Ile)-I，颉氨酸(valine，Val)-V，等。
较优地，所述的固相载体为至少一种以下的载体：乳胶颗粒、硝酸纤维素膜、尼龙膜、聚偏氟乙烯膜、微孔板或磁性颗粒。
较优地，所述的IL-33及其类似物或可溶性ST2抗体可用至少一种以下的标记物标记：胶乳颗粒、胶体金、荧光、地高辛、生物素、碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、吖啶酯、吖啶酯衍生物、鲁米诺、鲁米诺衍生物或三联吡啶钌。
较优地，所述的检测标记物检测方法为免疫层析法、免疫比浊法、ELISA法、蛋白免疫印迹法、微流控法或化学发光法中的一种或几种。
本发明还提供一种可溶性ST2检测试剂盒，该试剂盒应用了上述方法来检测可溶性ST2。
本发明的有益效果主要有：
(1)本发明专利的IL-33及其类似物可采用基因工程表达或者化学合成获得，无需像传统方法(双抗体夹心法)；另外，生产工艺更易标准化；
(2)准确度进一步提高；传统技术依赖抗体的特异性与灵敏度；由于可溶性ST2在人体标本中的浓度较低，且可溶性ST2存在结构类似的蛋白，因此传统技术往往存在灵敏度或特异性的缺陷；本发明采用可溶性ST2抗体与可溶性ST2配体相结合的方式，解决了灵敏度和特异性的技术难点，准确性显著提高。
具体实施方式
为了能够更清楚地理解本发明专利的技术内容，特举以下实施例详细说明。
本发明专利的可溶性ST2检测方法的试剂盒的制备过程简述如下，应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆技术实验室操作手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press，2005)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1 IL-33及其类似物合成
特异性结合可溶性ST2特有的IL-33及其类似物，其氨基酸序列如下：
Gln-Tyr-Xaa-Cys-Leu-Ala-Leu-Asn-Leu-His-Gly-Leu-Arg-Arg-His-Thr-Val-Arg-Leu-Ser-Arg-Lys-Asn-Pro-Ser-Lys-Glu-Cys-Phe。
委托南京金斯瑞生物科技有限公司进行合成以下三条小肽，其中，XAA分别是：Asp、Ile、Tyr；具体如下：
(1)小肽1，氨基酸序列如下：
Gln-Tyr-Asp-Cys-Leu-Ala-Leu-Asn-Leu-His-Gly-Leu-Arg-Arg-His-Thr-Val-Arg-Leu-Ser-Arg-Lys-Asn-Pro-Ser-Lys-Glu-Cys-Phe；
(2)小肽2，氨基酸序列如下：
Gln-Tyr-Ile-Cys-Leu-Ala-Leu-Asn-Leu-His-Gly-Leu-Arg-Arg-His-Thr-Val-Arg-Leu-Ser-Arg-Lys-Asn-Pro-Ser-Lys-Glu-Cys-Phe；
(3)小肽3，氨基酸序列如下：
Leu-Val-Val-Ser-Tyr-Lys-Tyr-Ala-Leu-Ala-Gln-Tyr-Tyr-Cys-Leu-Ala-Leu-Asn-Leu-His-Gly-Leu-Arg-Arg-His-Thr-Val-Arg-Leu-Ser-Arg-Lys-Asn-Pro-Ser-Lys-Glu-Cys-Phe；其中，前10个氨基酸(Leu-Val-Val-Ser-Tyr-Lys-Tyr-Ala-Leu-Ala)来自于BSA(牛血清白蛋白)；
将可溶性ST2IL-33及其类似物包被在微孔板，采用ELISA方法进行亲和力与特异性测试，上述三个小肽在性能上无显著差异。
实施例2荧光标记IL-33及其类似物1
清洗：取荧光微球(2014年购自Bangs Lab，货号：11233)至离心管中，加0.1M MES(2-吗啉代乙磺酸)(pH 5.0)缓冲液混匀，并以13000rpm，15min，4℃条件离心，弃上清，用0.1M MES(pH 5.0)缓冲液重悬待用。活化并清洗：将活化剂EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)、NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)和荧光微球按照质量比比2:1:2的量进行活化，具体操作如下：
称取EDC、NHS加入0.1M MES(pH 5.0)缓冲液中溶解，迅速取适量至4.3.3.1清洗完毕的荧光微球中，用封口膜封好放置在200rpm摇床上室温摇匀30min，取出后13000rpm，30min，4℃离心除去上清，用等量0.1M MES(pH 6.5)缓冲液重悬超声混匀并清洗，重复一次以上操作即清洗两次。离心完成后弃掉上清待用。
标记：将活化后的胶乳重悬至0.1M MES(pH 6.5)缓冲液中，迅速分别加入特异性结合IL-33及其类似物(IL-33及其类似物的氨基酸序列如下：Gln-Tyr-Asp-Cys-Leu-Ala-Leu-Asn-Leu-His-Gly-Leu-Arg-Arg-His-Thr-Val-Arg-Leu-Ser-Arg-Lys-Asn-Pro-Ser-Lys-Glu-Cys-Phe，实施例1中的小肽1)，混匀，放置室温，200rpm摇床上摇匀4小时。
封闭：取上述标记好的微球于13000rpm，30min，4℃离心除去上清，立即向微球中加入等量封闭液，超声重悬后再放置室温，200rpm摇床上摇匀1小时。反应完成后13000rpm，20min，4℃离心，取上清待检。
清洗&重悬：加入重悬液，超声吹打重悬，用高速冷冻离心机13000rpm，20min，4℃离心，弃掉上清；加入重悬液，超声吹打重悬。
重悬好的微球溶液做好标记，备用。
实施例3荧光标记IL-33及其类似物2
清洗：取荧光微球(2014年购自Bangs Lab，货号：11233)至离心管中，加0.1M MES(2-吗啉代乙磺酸)(pH 5.0)缓冲液混匀，并以13000rpm，15min，4℃条件离心，弃上清，用0.1M MES(pH 5.0)缓冲液重悬待用。活化并清洗：将活化剂EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)、NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)和荧光微球按照质量比比2:1:2的量进行活化，具体操作如下：
称取EDC、NHS加入0.1M MES(pH 5.0)缓冲液中溶解，迅速取适量至4.3.3.1清洗完毕的荧光微球中，用封口膜封好放置在200rpm摇床上室温摇匀30min，取出后13000rpm，30min，4℃离心除去上清，用等量0.1M MES(pH 6.5)缓冲液重悬超声混匀并清洗，重复一次以上操作即清洗两次。离心完成后弃掉上清待用。
标记：将活化后的胶乳重悬至0.1M MES(pH 6.5)缓冲液中，迅速分别加入特异性结合IL-33及其类似物(IL-33及其类似物的氨基酸序列如下：Gln-Tyr-Ile-Cys-Leu-Ala-Leu-Asn-Leu-His-Gly-Leu-Arg-Arg-His-Thr-Val-Arg-Leu-Ser-Arg-Lys-Asn-Pro-Ser-Lys-Glu-Cys-Phe，实施例1中的小肽2)，混匀，放置室温，200rpm摇床上摇匀4小时。
封闭：取上述标记好的微球于13000rpm，30min，4℃离心除去上清，立即向微球中加入等量封闭液，超声重悬后再放置室温，200rpm摇床上摇匀1小时。反应完成后13000rpm，20min，4℃离心，取上清待检。
清洗&重悬：加入重悬液，超声吹打重悬，用高速冷冻离心机13000rpm，20min，4℃离心，弃掉上清；加入重悬液，超声吹打重悬。
重悬好的微球溶液做好标记，备用。
实施例4荧光标记IL-33及其类似物3
清洗：取荧光微球(2014年购自Bangs Lab，货号：11233)至离心管中，加0.1M MES(2-吗啉代乙磺酸)(pH 5.0)缓冲液混匀，并以13000rpm，15min，4℃条件离心，弃上清，用0.1M MES(pH 5.0)缓冲液重悬待用。活化并清洗：将活化剂EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)、NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)和荧光微球按照质量比比2:1:2的量进行活化，具体操作如下：
称取EDC、NHS加入0.1M MES(pH 5.0)缓冲液中溶解，迅速取适量至4.3.3.1清洗完毕的荧光微球中，用封口膜封好放置在200rpm摇床上室温摇匀30min，取出后13000rpm，30min，4℃离心除去上清，用等量0.1M MES(pH 6.5)缓冲液重悬超声混匀并清洗，重复一次以上操作即清洗两次。离心完成后弃掉上清待用。
标记：将活化后的胶乳重悬至0.1M MES(pH 6.5)缓冲液中，迅速分别加入特异性结合IL-33及其类似物(IL-33及其类似物的氨基酸序列如下：Leu-Val-Val-Ser-Tyr-Lys-Tyr-Ala-Leu-Ala-Gln-Tyr-Tyr-Cys-Leu-Ala-Leu-Asn-Leu-His-Gly-Leu-Arg-Arg-His-Thr-Val-Arg-Leu-Ser-Arg-Lys-Asn-Pro-Ser-Lys-Glu-Cys-Phe，实施例1中的小肽3)，混匀，放置室温，200rpm摇床上摇匀4小时。
封闭：取上述标记好的微球于13000rpm，30min，4℃离心除去上清，立即向微球中加入等量封闭液，超声重悬后再放置室温，200rpm摇床上摇匀1小时。反应完成后13000rpm，20min，4℃离心，取上清待检。
清洗&重悬：加入重悬液，超声吹打重悬，用高速冷冻离心机13000rpm，20min，4℃离心，弃掉上清；加入重悬液，超声吹打重悬。
重悬好的微球溶液做好标记，备用。
实施例5荧光标记特异性抗体
清洗：取荧光微球(2014年购自Bangs Lab，货号：11233)至离心管中，加0.1M MES(pH 5.0)缓冲液混匀，并以13000rpm，15min，4℃条件离心，弃上清，用0.1M MES(pH 5.0)缓冲液重悬待用。活化并清洗：将活化剂EDC、NHS和荧光微球按照质量比比2:1:2的量进行活化，具体操作如下：
称取EDC、NHS加入0.1M MES(pH 5.0)缓冲液中溶解，迅速取适量至4.3.3.1清洗完毕的荧光微球中，用封口膜封好放置在200rpm摇床上室温摇匀30min，取出后13000rpm，30min，4℃离心除去上清，用等量0.1M MES(pH 6.5)缓冲液重悬超声混匀并清洗，重复一次以上操作即清洗两次。离心完成后弃掉上清待用。
标记：将活化后的胶乳重悬至0.1M MES(pH 6.5)缓冲液中，迅速分别加入特异性结合可溶性ST2的抗体(鼠单抗，2016年购自英国BBI Solutions，货号：102321)和特异性结合可溶性ST2的抗体(鼠单抗，2016年购自英国BBI Solutions，货号：102322)，两种抗体按照1：1比例混匀，放置室温，200rpm摇床上摇匀4小时。
封闭：取上述标记好的微球于10000rpm，30min，4℃离心除去上清，立即向微球中加入等量封闭液，超声重悬后再放置室温，200rpm摇床上摇匀1小时。反应完成后10000rpm，20min，4℃离心，取上清待检。
检测内容 质量标准 检测方法
包被量 包被量≥100μg抗体/mg微球 BCA蛋白浓度测定法
清洗&重悬：加入重悬液，超声吹打重悬，用高速冷冻离心机10000rpm，20min，4℃离心，弃掉上清；加入重悬液，超声吹打重悬。
重悬好的微球溶液做好标记，备用。
实施例6荧光标记羊抗兔IgG
清洗：取荧光微球(2014年购自Bangs Lab，货号：11233)至离心管中，加0.1M MES(pH 5.0)缓冲液混匀，并以13000rpm，15min，4℃条件离心，弃上清，用0.1M MES(pH 5.0)缓冲液重悬待用。活化并清洗：将活化剂EDC、NHS和荧光微球按照质量比比2:1:2的量进行活化，具体操作如下：
称取EDC、NHS加入0.1M MES(pH 5.0)缓冲液中溶解，迅速取适量至4.3.3.1清洗完毕的荧光微球中，用封口膜封好放置在200rpm摇床上室温摇匀30min，取出后13000rpm，30min，4℃离心除去上清，用等量0.1M MES(pH 6.5)缓冲液重悬超声混匀并清洗，重复一次以上操作即清洗两次。离心完成后弃掉上清待用。
标记：将活化后的胶乳重悬至0.1M MES(pH 6.5)缓冲液中，迅速分别加入羊抗兔IgG(2012年购自成都双龙生化，货号：J0711-6，1mg)，混匀，放置室温，200rpm摇床上摇匀4小时。
封闭：取上述标记好的微球于10000rpm，30min，4℃离心除去上清，立即向微球中加入等量封闭液，超声重悬后再放置室温，200rpm摇床上摇匀1小时。反应完成后10000rpm，20min，4℃离心，取上清待检。
检测内容 质量标准 检测方法
包被量 包被量≥200μg抗体/mg微球 BCA蛋白浓度测定法
清洗&重悬：加入重悬液，超声吹打重悬，用高速冷冻离心机10000rpm，20min，4℃离心，弃掉上清；加入重悬液，超声吹打重悬。
重悬好的微球溶液做好标记，备用。
实施例7结合垫的喷点
特异性结合可溶性ST2结合垫的喷点方法如下：荧光标记溶液稀释：用荧光标记重悬液将上述制备的荧光标记结合物(来自实施例1或实施例2或实施例3或实施例4)以及荧光标记羊抗兔IgG结合物(来自实施例6)混合后稀释2倍；设定点膜仪，开启点膜仪的电源，设定喷点程序，喷点量为8ul/cm；1号管道为喷点通道；点膜仪初始化：将1号管道置于荧光标记重悬溶液中，选择初始化程序，初始化6个循环；喷点：将结合垫按固定位置平放在点膜仪上，按控制面板上“GO”键开始喷点，点完后取下，检查喷点好的结合垫，喷点的荧光标记IL-33及其类似物条带均匀、连续和贯通整个结合垫的直线为合格喷点品，两条直线中出现断点为不合格喷点品；每放一片结合垫，按一次控制面板上的“GO”键为喷点一次(一片)；喷点结束，将喷点的结合垫置于室温中自然干燥1小时，膜上应看不到喷点痕迹。
实施例8结合垫的喷点
抗可溶性ST2的抗体结合垫的喷点方法如下：荧光标记溶液稀释：用荧光标记重悬液将上述制备的荧光标记抗体结合物(来自实施例5)稀释4倍；设定点膜仪，开启点膜仪的电源，设定喷点程序，喷点量为8ul/cm；1号管道为喷点通道；点膜仪初始化：将1号管道置于荧光标记重悬溶液中，选择初始化程序，初始化6个循环；喷点：将结合垫按固定位置平放在点膜仪上，按控制面板上“GO”键开始喷点，点完后取下，检查喷点好的结合垫，喷点的荧光标记IL-33及其类似物条带均匀、连续和贯通整个结合垫的直线为合格喷点品，两条直线中出现断点为不合格喷点品；每放一片结合垫，按一次控制面板上的“GO”键为喷点一次(一片)；喷点结束，将喷点的结合垫置于室温中自然干燥1小时，膜上应看不到喷点痕迹。
实施例9硝酸纤维素膜的制备(特异性抗体)
特异性结合可溶性ST2的抗体(鼠单抗，2016年购自英国BBI Solutions，货号：102321)和特异性结合可溶性ST2的抗体(鼠单抗，2016年购自英国BBI Solutions，货号：102322)按照1：1比例混合，备用。
硝酸纤维素膜制备方法如下：取鼠抗可溶性ST2的抗体500ug，加到5ml刻度离心管中，抗体稀释液至1ml，容器标记T标志。取兔IgG(2016年购自杭州启泰，货号：B103-GMI01)10ul，加到5ml刻度离心管中，抗体稀释液至1ml，容器标记C标志。设定点膜仪，开启点膜仪的电源，设定喷点程序，喷点量为1ul/cm；1号管道为检测带喷点通道，2号管道为对照带喷点通道；点膜仪初始化：将1号管道置于检测带溶液中，将2号管道置于对照带溶液中，选择初始化程序，初始化6个循环；喷点：将硝酸纤维素膜按固定位置平放在点膜仪上，按控制面板上“GO”键开始喷点，点完后取下，检查喷点好的硝酸纤维素膜，检测带和对照带为两条均匀、连续和贯通整个硝酸纤维素膜的直线为合格喷点品，两条直线中出现断点为不合格喷点品；每放一片硝酸纤维素膜，按一次控制面板上的“GO”键为喷点一次(一片)；喷点结束，将喷点的硝酸纤维素膜置于室温中自然干燥1小时，膜上应看不到喷点痕迹。
实施例10硝酸纤维素膜的制备(IL-33及其类似物)
特异性结合IL-33及其类似物硝酸纤维素膜制备方法如下：取特异性结合IL-33及其类似物200ug(实施例1中的小肽1或小肽2或小肽3)，加到5ml刻度离心管中，稀释至1ml，容器标记T标志。取兔IgG(2016年购自杭州启泰，货号：B103-GMI01)10ul，加到5ml刻度离心管中，抗体稀释液至1ml，容器标记C标志。设定点膜仪，开启点膜仪的电源，设定喷点程序，喷点量为1ul/cm；1号管道为检测带喷点通道，2号管道为对照带喷点通道；点膜仪初始化：将1号管道置于检测带溶液中，将2号管道置于对照带溶液中，选择初始化程序，初始化6个循环；喷点：将硝酸纤维素膜按固定位置平放在点膜仪上，按控制面板上“GO”键开始喷点，点完后取下，检查喷点好的硝酸纤维素膜，检测带和对照带为两条均匀、连续和贯通整个硝酸纤维素膜的直线为合格喷点品，两条直线中出现断点为不合格喷点品；每放一片硝酸纤维素膜，按一次控制面板上的“GO”键为喷点一次(一片)；喷点结束，将喷点的硝酸纤维素膜置于室温中自然干燥1小时，膜上应看不到喷点痕迹。
实施例11组装
将底板上较宽部分的保护纸除去，沿上面保护纸的下边缘，将划好线的硝酸纤维素膜(来自实施例9)，以C线在上方的方式贴到底板板上；将结合垫(来自实施例7)贴在T线下方，与NC膜少许接触；将样品垫贴在结合垫下方，与结合垫少许接触；接着除去上方保护纸，将吸水纸贴在NC膜的上方，与NC膜少许接触；将保护纸及指示带纸逐一贴在组装好的试纸条外面，组装成大卡。
实施例12组装
将底板上较宽部分的保护纸除去，沿上面保护纸的下边缘，将划好线的硝酸纤维素膜(来自实施例10)，以C线在上方的方式贴到底板板上；将结合垫(来自实施例8)贴在T线下方，与NC膜少许接触；将样品垫贴在结合垫下方，与结合垫少许接触；接着除去上方保护纸，将吸水纸贴在NC膜的上方，与NC膜少许接触；将保护纸及指示带纸逐一贴在组装好的试纸条外面，组装成大卡。
实施例13切条
接通切割机电源，设定切膜程序，设定切割宽度为4mm；将大卡(来自实施例11或实施例12)平放入切割机平台轨道中，正面朝上，按操作面板上“GO”键，开始切割；每放一片大卡合格品，按操作面板上“GO”键一次，直至切割完所有大卡合格品；切割完成后，将试纸条并列黏贴于底板上，组成检测试纸条。
实施例14试剂盒组装
将上述的试纸条(来自实施例13)装入卡盒中，形成检测卡。
取铝箔袋和干燥剂；打开热封机，预热；将待装袋的检测卡、1袋干燥剂装入铝箔袋中；按照规定的长度切断装有检测卡和干燥剂的铝箔袋；用热封机封好铝箔袋；贴上标签。
实施例15 HRP标记特异性抗体
特异性结合可溶性ST2的抗体(鼠单抗，2016年购自英国BBI Solutions，货号：102321)和特异性结合可溶性ST2的抗体(鼠单抗，2016年购自英国BBI Solutions，货号：102322)按照1：1比例混合，备用。
将5mg HRP(2013年购自罗氏，货号：1464325，规格：25mg/瓶)溶于0.5ml 0.1MNaHCO3溶液中；加0.5ml 10mM NaIO4溶液，混匀，盖紧瓶塞，室温避光作用2小时；加0.75ml0.1M Na2CO3混匀；加入上述的特异性结合可溶性ST2的抗体，混匀。
HRP抗体结合物的保存：加入等量甘油后，小量分装-20℃存放，防止反复冻融。
实施例16 HRP标记IL-33及其类似物1
将5mg HRP(2013年购自罗氏，货号：1464325，规格：25mg/瓶)溶于0.5ml 0.1MNaHCO3溶液中；加0.5ml 10mM NaIO4溶液，混匀，盖紧瓶塞，室温避光作用2小时；加0.75ml0.1M Na2CO3混匀；加入0.75mlIL-33及其类似物(来自实施例1，IL-33及其类似物的氨基酸序列为：Gln-Tyr-Asp-Cys-Leu-Ala-Leu-Asn-Leu-His-Gly-Leu-Arg-Arg-His-Thr-Val-Arg-Leu-Ser-Arg-Lys-Asn-Pro-Ser-Lys-Glu-Cys-Phe)，混匀。
HRP标记IL-33及其类似物结合物的保存：加入等量甘油后，小量分装-20℃存放，防止反复冻融。
实施例17 HRP标记IL-33及其类似物2
将5mg HRP(2013年购自罗氏，货号：1464325，规格：25mg/瓶)溶于0.5ml 0.1MNaHCO3溶液中；加0.5ml 10mM NaIO4溶液，混匀，盖紧瓶塞，室温避光作用2小时；加0.75ml0.1M Na2CO3混匀；加入0.75mlIL-33及其类似物(来自实施例1，IL-33及其类似物的氨基酸序列为：Gln-Tyr-Ile-Cys-Leu-Ala-Leu-Asn-Leu-His-Gly-Leu-Arg-Arg-His-Thr-Val-Arg-Leu-Ser-Arg-Lys-Asn-Pro-Ser-Lys-Glu-Cys-Phe)，混匀。
HRP标记IL-33及其类似物结合物的保存：加入等量甘油后，小量分装-20℃存放，防止反复冻融。
实施例18 HRP标记IL-33及其类似物3
将5mg HRP(2013年购自罗氏，货号：1464325，规格：25mg/瓶)溶于0.5ml 0.1MNaHCO3溶液中；加0.5ml 10mM NaIO4溶液，混匀，盖紧瓶塞，室温避光作用2小时；加0.75ml0.1M Na2CO3混匀；加入0.75mlIL-33及其类似物(来自实施例1，IL-33及其类似物的氨基酸序列为：Leu-Val-Val-Ser-Tyr-Lys-Tyr-Ala-Leu-Ala-Gln-Tyr-Tyr-Cys-Leu-Ala-Leu-Asn-Leu-His-Gly-Leu-Arg-Arg-His-Thr-Val-Arg-Leu-Ser-Arg-Lys-Asn-Pro-Ser-Lys-Glu-Cys-Phe)，混匀。
HRP标记IL-33及其类似物结合物的保存：加入等量甘油后，小量分装-20℃存放，防止反复冻融。
实施例19特异性抗体包被
特异性结合可溶性ST2的抗体(鼠单抗，2016年购自英国BBI Solutions，货号：102321)和特异性结合可溶性ST2的抗体(鼠单抗，2016年购自英国BBI Solutions，货号：102322)按照1：1比例混合，备用。
采用0.01M，pH 10的CBS(碳酸盐缓冲液)将上述的特异性结合可溶性ST2的抗体稀释至1μg/ml；取96孔微孔板，每孔加入100ul上述包被抗体；37℃温育1h；甩掉包被液，加入200ul的封闭缓冲液(2％牛血清白蛋白，pH7.4)，37℃温育1h，甩掉封闭液；于室温自然干燥12h，放入干燥剂，封入铝箔袋，2～8℃备用。
实施例20 IL-33及其类似物1包被
采用0.01M，pH 10的CBS(碳酸盐缓冲液)将IL-33及其类似物1(来自实施例1，IL-33及其类似物的氨基酸序列为：Gln-Tyr-Asp-Cys-Leu-Ala-Leu-Asn-Leu-His-Gly-Leu-Arg-Arg-His-Thr-Val-Arg-Leu-Ser-Arg-Lys-Asn-Pro-Ser-Lys-Glu-Cys-Phe)稀释至0.2μg/ml；取96孔微孔板，每孔加入100ul上述包被IL-33及其类似物；37℃温育1h；甩掉包被液，加入200ul的封闭缓冲液(2％牛血清白蛋白，pH7.4)，37℃温育1h，甩掉封闭液；于室温自然干燥12h，放入干燥剂，封入铝箔袋，2～8℃备用。
实施例21 IL-33及其类似物2包被
采用0.01M，pH 10的CBS(碳酸盐缓冲液)将IL-33及其类似物2(来自实施例1，IL-33及其类似物的氨基酸序列为：Gln-Tyr-Ile-Cys-Leu-Ala-Leu-Asn-Leu-His-Gly-Leu-Arg-Arg-His-Thr-Val-Arg-Leu-Ser-Arg-Lys-Asn-Pro-Ser-Lys-Glu-Cys-Phe)稀释至0.2μg/ml；取96孔微孔板，每孔加入100ul上述包被IL-33及其类似物；37℃温育1h；甩掉包被液，加入200ul的封闭缓冲液(2％牛血清白蛋白，pH7.4)，37℃温育1h，甩掉封闭液；于室温自然干燥12h，放入干燥剂，封入铝箔袋，2～8℃备用。
实施例22 IL-33及其类似物3包被
采用0.01M，pH 10的CBS(碳酸盐缓冲液)将IL-33及其类似物3(来自实施例1，IL-33及其类似物的氨基酸序列为：Leu-Val-Val-Ser-Tyr-Lys-Tyr-Ala-Leu-Ala-Gln-Tyr-Tyr-Cys-Leu-Ala-Leu-Asn-Leu-His-Gly-Leu-Arg-Arg-His-Thr-Val-Arg-Leu-Ser-Arg-Lys-Asn-Pro-Ser-Lys-Glu-Cys-Phe)稀释至0.2μg/ml；取96孔微孔板，每孔加入100ul上述包被IL-33及其类似物；37℃温育1h；甩掉包被液，加入200ul的封闭缓冲液(2％牛血清白蛋白，pH7.4)，37℃温育1h，甩掉封闭液；于室温自然干燥12h，放入干燥剂，封入铝箔袋，2～8℃备用。
实施例23 ELISA试剂盒组装
将HRP标记抗体(来自实施例15)与IL-33及其类似物包被板(来自实施例20或实施例21或实施例22)，组装成可溶性ST2检测的ELISA试剂盒。
实施例24 ELISA试剂盒组装
将HRP标记IL-33及其类似物(来自实施例16或实施例17或实施例18)与抗体包被板(来自实施例19)，组装成可溶性ST2检测的ELISA试剂盒。
实施例25试剂盒检测可溶性ST2
将上述的检测卡(来自实施例14)，用临床样本进行验证。
将待测样本滴加到检测卡的样本孔中，然后置于荧光检测仪中进行读数。
检测结果与可溶性ST2检测的金标准(双抗体夹心ELISA法，美国CriticalDiagnos-tics公司)如下：
金标准法阳性 金标准法阴性 合计
检测卡检测阳性 72 1 73
检测卡检测阴性 0 24 24
合计 72 25 97
根据上表可得：
该试纸条的检测灵敏度为：72/(72+0)×100％＝100％；
该试纸条的检测特异性为：24/(24+1)＝96％。
实施例26试剂盒检测可溶性ST2
将上述的ELISA试剂盒(来自实施例23)，用临床样本进行验证。
将待测样本滴加到ELISA检测孔中，然后置于酶标仪仪中进行读数。
检测结果与可溶性ST2检测的金标准(双抗体夹心ELISA法，美国CriticalDiagnos-tics公司)如下：
金标准法阳性 金标准法阴性 合计
ELISA阳性 83 4 87
ELISA阴性 2 52 54
合计 85 56 141
根据上表可得：
该ELISA的检测灵敏度为：83/(83+2)×100％＝97.6％；
该ELISA的检测特异性为：52/(52+4)＝92.8％。
实施例27试剂盒检测可溶性ST2
将上述的ELISA试剂盒(来自实施例24)，用临床样本进行验证。
将待测样本滴加到ELISA检测孔中，然后置于酶标仪仪中进行读数。
检测结果与可溶性ST2检测的金标准(双抗体夹心ELISA法，美国CriticalDiagnos-tics公司)如下：
金标准法阳性 金标准法阴性 合计
ELISA阳性 36 3 39
ELISA阴性 2 66 68
合计 38 69 107
根据上表可得：
该ELISA的检测灵敏度为：36/(36+3)×100％＝92.3％；
该ELISA的检测特异性为：66/(66+3)＝95.6％。
上述实施例结果表明，本检测试剂盒检测可溶性ST2的准确率非常高，能够满足临床应用的要求。
应当说明的是，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用于限制本发明的范围，凡在本发明的精神和原则之内所作出的任何修改、等同的替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 江苏龙维生物科技有限公司
江苏凯基生物技术股份有限公司
<120> 可溶性ST2的检测方法及检测试剂盒
<141> 2017-07-27
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 2
<211> 29
<212> PRT
<400> 2
Gln Tyr Xaa Cys Leu Ala Leu Asn Leu His Gly Leu Arg Arg His Thr
1 5 10 15
Val Arg Leu Ser Arg Lys Asn Pro Ser Lys Glu Cys Phe
20 25
<210> 2
<211> 29
<212> PRT
<400> 2
Gln Tyr Asp Cys Leu Ala Leu Asn Leu His Gly Leu Arg Arg His Thr
1 5 10 15
Val Arg Leu Ser Arg Lys Asn Pro Ser Lys Glu Cys Phe
20 25

Claims (10)

1.一种可溶性ST2检测方法，其特征在于，该方法包括：可溶性ST2的特异性抗体联合可溶性ST2配体蛋白作为检测物,其中所述的ST2配体蛋白为白介素-33及其类似物。
2.根据权利要求1所述的可溶性ST2检测方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：
1）用标记物标记可溶性ST2的配体蛋白白介素-33及其类似物，作为检测物；
2）将至少一株抗可溶性ST2的抗体结合到固相载体上；
3）将待测的样本加入到固相载体上，再加入已做标记的及其类似物，通过检测标记物的方法来检测待检样品中是否存在可溶性ST2。
3.根据权利要求1所述的可溶性ST2检测方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：
1）用标记物标记可溶性ST2抗体，将白介素-33及其类似物结合到固相载体上；
2）将待检样品加入到固相载体上，再加入已做标记的可溶性ST2抗体，通过检测标记物方法来检测待检样品中是否存在可溶性ST2。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的可溶性ST2检测方法，其特征在于，所述的白介素-33及其类似物，至少含有以下的氨基酸序列：
Gln-Tyr-Xaa-Cys-Leu-Ala-Leu-Asn-Leu-His-Gly-Leu-Arg-Arg-His-Thr-Val-Arg-Leu-Ser-Arg-Lys-Asn-Pro-Ser-Lys-Glu-Cys-Phe，
其中，Xaa表示任意的氨基酸。
5.根据权利要求4所述的可溶性ST2检测方法，其特征在于，所述的白介素-33及其类似物，其C末端的氨基酸序列如下：
Gln-Tyr-Xaa-Cys-Leu-Ala-Leu-Asn-Leu-His-Gly-Leu-Arg-Arg-His-Thr-Val-Arg-Leu-Ser-Arg-Lys-Asn-Pro-Ser-Lys-Glu-Cys-Phe，
其中，Xaa表示任意的氨基酸。
6.根据权利要求4所述的可溶性ST2检测方法，其特征在于，所述的白介素-33及其类似物的偶联有牛血清白蛋白、人血清白蛋白或匙孔型血蓝蛋白中的一种或几种。
7.根据权利要求4中任一项所述的可溶性ST2检测方法，其特征在于，所述的固相载体为至少一种以下的载体：乳胶颗粒、硝酸纤维素膜、尼龙膜、聚偏氟乙烯膜、微孔板或磁性颗粒。
8.根据权利要求4所述的可溶性ST2检测方法，其特征在于，所述的IL-33及其类似物或可溶性ST2特异性抗体用至少一种以下的标记物标记：胶乳颗粒、胶体金、荧光、地高辛、生物素、碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、吖啶酯、吖啶酯衍生物、鲁米诺、鲁米诺衍生物或三联吡啶钌。
9.根据权利要求4所述的可溶性ST2检测方法，其特征在于，所述的检测标记物检测方法为免疫层析法、免疫比浊法、ELISA法、蛋白免疫印迹法、微流控法或化学发光法中的一种或几种。
10.一种可溶性ST2检测试剂盒，应用了权利要求1-9中任一项所述的方法来检测可溶性ST2。
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