CN110357963A - 抗人st2抗体及其用途 - Google Patents

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Abstract

本申请公开了结合人ST2的抗体或其抗原结合部分，编码所述抗体或其抗原结合部分的多核苷酸、包含所述多核苷酸的载体、包含所述多核苷酸或载体的宿主细胞、制备和纯化该抗体的方法及所述抗体或其抗原结合部分的应用。

Description

抗人ST2抗体及其用途
技术领域
本申请大体涉及基因工程和抗体药物领域；具体而言，涉及抗人ST2抗体领域及其用途。本申请开发了新的抗人ST2抗体，并提供了该抗体在预防或治疗ST2介导的疾病中的用途。
背景技术
生长刺激表达基因2蛋白(Growth Stimulation Expressed Gene 2，ST2)也被称为IL1RL1、T1、DER4或Fit-1，是IL-1受体家族的成员，属于Toll样受体(TLR)/IL-1R(TIR)超家族，是Th2淋巴细胞的选择标记，是Th2反应的重要的效应分子。ST2基因于1989年由Tominaga等人在研究BALB/c-3T3细胞系时首次被发现，其后很长一段时间一直被认为是孤儿受体，直到Schmitz等人发现了IL-33可特异性激活ST2，并证实其为ST2的功能配体。ST2有4种剪切变体，一种是跨膜蛋白ST2L，主要表达于肥大细胞、Th2淋巴细胞和嗜酸性粒细胞，与IL-1RAcP(也称IL-1R3)形成IL-33受体复合物；一种是短的分泌的剪切变体sST2，C端比ST2L胞外区多9个氨基酸残基，主要表达于胚胎组织、乳腺肿瘤和成纤维细胞，是IL-33的拮抗型伪受体，抑制IL-33介导的信号传导；第三种在胃、小肠和结肠中表达的功能尚不清楚的变体称为ST2V，只有第三个胞外Ig结构域与sST2不同；第四种ST2LV与ST2L相似，但是没有跨膜结构域。
IL-33(也称IL-1F11)是IL-1家族的细胞因子，IL-33主要在皮肤、肠、肺等屏障组织表达，主要存在于非造血细胞中，尤其是基质细胞、上皮细胞和内皮细胞。全长IL-33是核蛋白，发挥转录因子作用，N端有核定位序列和染色质结合结构域，细胞坏死会导致有功能的全长IL-33释放，而当有促炎因子刺激时全长IL-33经蛋白酶切割形成成熟的IL-33释放到胞外，发挥细胞因子功能。IL-33信号传递依赖于特异受体ST2和IL1-RAcP(IL-1receptoraccessory protein)。IL-33结合ST2和IL-1RAcP形成三元信号复合物，募集MYD88(myeloiddifferentiation primary-response protein88)、IRAK(IL-1 receptor-associatedkinase)、TRAF6(TNF receptor associated factor 6)和/或MAPK(mitogen-activatedprotein kinase)，激活下游信号分子如NF-κB(nuclear factor κB)、IκBα(inhibitor ofNF-κB-α)、ERK(extracellular signal regulated kinase)、p38、JNK1(JUN N terminalkinase 1)和AP-1(activation protein 1)。在IL-33的作用下，表达ST2的Th2淋巴细胞分泌IL-5和IL-13，肥大细胞表达IL-4、IL-5和IL-6，角质细胞表达IL-6和TNFα，小神经胶质细胞表达大量促炎因子如TNFα、IL-1β和IL-10，趋化因子如CCL2、CCL3、CCL5和CXCL10，氧化应激分子NO和iNOS。
IL-33/ST2L信号通路在自身免疫性疾病和炎性疾病等中是不良因素，促进了疾病的发生发展。
基于临床需求，探索和研发可以结合ST2分子的药物具有重要的生物学和医学意义。
发明概述
第一方面，本申请提供了一种结合人ST2的抗体，其包含含HCDR1、HCDR2和HCDR3氨基酸序列的重链可变区和含LCDR1、LCDR2和LCDR3氨基酸序列的轻链可变区，其中
所述HCDR1氨基酸序列如SEQ ID NO:36、所述HCDR2氨基酸序列如SEQ ID NO:37所示、所述HCDR3氨基酸序列如SEQ ID NO:38所示、所述LCDR1氨基酸序列如SEQ ID NO:31所示、所述LCDR2氨基酸序列如SEQ ID NO:32所示、所述LCDR3氨基酸序列如SEQ ID NO:33所示；或者
所述HCDR1氨基酸序列如SEQ ID NO:39所示，所述HCDR2氨基酸序列如SEQ ID NO:40所示、所述HCDR3氨基酸序列如SEQ ID NO:41所示、所述LCDR1氨基酸序列如SEQ ID NO:31所示、所述LCDR2氨基酸序列如SEQ ID NO:32所示、所述LCDR3氨基酸序列如SEQ ID NO:33所示；或者
所述HCDR1氨基酸序列如SEQ ID NO:39所示、所述HCDR2氨基酸序列如SEQ ID NO:42所示、所述HCDR3氨基酸序列如SEQ ID NO:43所示、所述LCDR1氨基酸序列如SEQ ID NO:31所示、所述LCDR2氨基酸序列如SEQ ID NO:32所示、所述LCDR3氨基酸序列如SEQ ID NO:33所示；或者
所述HCDR1氨基酸序列如SEQ ID NO:39所示、所述HCDR2氨基酸序列如SEQ ID NO:44所示、所述HCDR3氨基酸序列如SEQ ID NO:45所示、所述LCDR1氨基酸序列如SEQ ID NO:31所示、所述LCDR2氨基酸序列如SEQ ID NO:32所示、所述LCDR3氨基酸序列如SEQ ID NO:33所示；或者
所述HCDR1氨基酸序列如SEQ ID NO:46所示、所述HCDR2氨基酸序列如SEQ ID NO:42所示、所述HCDR3氨基酸序列如SEQ ID NO:47所示、所述LCDR1氨基酸序列如SEQ ID NO:31所示、所述LCDR2氨基酸序列如SEQ ID NO:32所示、所述LCDR3氨基酸序列如SEQ ID NO:33所示；或者
所述HCDR1氨基酸序列如SEQ ID NO:36所示、所述HCDR2氨基酸序列如SEQ ID NO:37所示、所述HCDR3氨基酸序列如SEQ ID NO:38所示、所述LCDR1氨基酸序列如SEQ ID NO:34所示、所述LCDR2氨基酸序列如SEQ ID NO:32所示、所述LCDR3氨基酸序列如SEQ ID NO:35所示；或者
所述HCDR1氨基酸序列如SEQ ID NO:39所示、所述HCDR2氨基酸序列如SEQ ID NO:40所示、所述HCDR3氨基酸序列如SEQ ID NO:41所示、所述LCDR1氨基酸序列如SEQ ID NO:34所示、所述LCDR2氨基酸序列如SEQ ID NO:32所示、所述LCDR3氨基酸序列如SEQ ID NO:35所示；或者
所述HCDR1氨基酸序列如SEQ ID NO:39所示、所述HCDR2氨基酸序列如SEQ ID NO:42所示、所述HCDR3氨基酸序列如SEQ ID NO:43所示、所述LCDR1氨基酸序列如SEQ ID NO:34所示、所述LCDR2氨基酸序列如SEQ ID NO:32所示、所述LCDR3氨基酸序列如SEQ ID NO:35所示；或者
所述HCDR1氨基酸序列如SEQ ID NO:39所示、所述HCDR2氨基酸序列如SEQ ID NO:44所示、所述HCDR3氨基酸序列如SEQ ID NO:45所示、所述LCDR1氨基酸序列如SEQ ID NO:34所示、所述LCDR2氨基酸序列如SEQ ID NO:32所示、所述LCDR3氨基酸序列如SEQ ID NO:35所示；或者
所述HCDR1氨基酸序列如SEQ ID NO:46所示、所述HCDR2氨基酸序列如SEQ ID NO:42所示、所述HCDR3氨基酸序列如SEQ ID NO:47所示、所述LCDR1氨基酸序列如SEQ ID NO:34所示、所述LCDR2氨基酸序列如SEQ ID NO:32所示、所述LCDR3氨基酸序列如SEQ ID NO:35所示；
其中HCDR和LCDR氨基酸氨基酸序列根据Kabat定义。
在一些实施方案中，所述抗体的重链可变区的氨基酸如SEQ ID NO:26、27、28、29或者30所示。
在一些实施方案中，所述抗体的轻链可变区的氨基酸如SEQ ID NO:24或者25所示。
在一些实施方案中，所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:26所示，所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:24所示；或者
所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:27所示，所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:24所示；或者
所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:28所示，所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:24所示；或者
所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:29所示，所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:24所示；或者
所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:30所示，所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:24所示；或者
所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:26所示，所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:25所示；或者
所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:27所示，所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:25所示；或者
所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:28所示，所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:25所示；或者
所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:29所示，所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:25所示；或者
所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:30所示，所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:25所示。
第二方面，本申请提供了一种结合人ST2的抗体，其中所述抗体的重链可变区的氨基酸序列与SEQ ID NO:26、27、28、29和30中任何一项具有至少90％的一致性，并且所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列与SEQ ID NO:24和25中任何一项具有至少90％的一致性。
在第一方面和第二方面的一些实施方案中，所述抗体为单克隆抗体。
在第一方面和第二方面的一些实施方案中，所述抗体为全抗体、Fab片段、F(ab’)2片段或单链Fv片段(scFv)。
在第一方面和第二方面的一些实施方案中，所述抗体为全人源抗体。
在第一方面和第二方面的一些实施方案中，所述抗体还包含选自IgG1亚型、IgG2亚型或IgG4亚型的重链恒定区。
在第一方面和第二方面的一些实施方案中，所述抗体还包含选自κ亚型或者λ亚型的轻链恒定区。
在第一方面和第二方面的一些实施方案中，所述抗体能够结合重组人ST2(SEQ IDNO:1)、重组鼠ST2(SEQ ID NO:2)和重组猴ST2(SEQ ID NO:3)。
在第一方面和第二方面的一些实施方案中，所述抗体能够结合重组人ST2(SEQ IDNO:1)和重组猴ST2(SEQ ID NO:3)。
在第一方面和第二方面的一些实施方案中，所述抗体抑制人ST2与人IL-33结合。
第三方面，本申请提供了核酸分子，其编码第一方面或第二方面所述的抗体或其抗原结合部分。
第四方面，本申请提供了药物组合物，其包含第一方面或第二方面所述的抗体和药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体。
在一些实施方案中，所述药物组合物用于预防或治疗ST2介导的疾病。
在一些实施方案中，所述ST2介导的疾病为自身免疫疾病或炎性疾病，例如硬皮病、系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、Churg-Strauss综合征、韦格纳肉芽肿(Wegener’sgranulomatosis)、肺出血-肾炎综合征、过敏性肺炎、特应性皮炎、哮喘、鼻炎、克罗恩病、强直性脊柱炎、风湿热、纤维肌痛、银屑病关节炎、慢性肾炎、斯耶格伦氏综合征以及多发性硬化等。
第五方面，本申请提供了第一方面或第二方面所述的抗体在制备用于预防或治疗ST2介导的疾病的药物中的用途。
在一些实施方案中，所述ST2介导的疾病为自身免疫疾病或炎性疾病，例如硬皮病、系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、Churg-Strauss综合征、韦格纳肉芽肿(Wegener’sgranulomatosis)、肺出血-肾炎综合征、过敏性肺炎、特应性皮炎、哮喘、鼻炎、克罗恩病、强直性脊柱炎、风湿热、纤维肌痛、银屑病关节炎、慢性肾炎、斯耶格伦氏综合征以及多发性硬化等。
第六方面，本申请提供了预防或治疗ST2介导的疾病的方法，包括向有需要的个体给予第一方面或第二方面所述的抗体或第四方面所述的药物组合物。
在一些实施方案中，所述ST2介导的疾病为自身免疫疾病或炎性疾病，例如硬皮病、系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、Churg-Strauss综合征、韦格纳肉芽肿(Wegener’sgranulomatosis)、肺出血-肾炎综合征、过敏性肺炎、特应性皮炎、哮喘、鼻炎、克罗恩病、强直性脊柱炎、风湿热、纤维肌痛、银屑病关节炎、慢性肾炎、斯耶格伦氏综合征以及多发性硬化等。
附图说明
图1显示ELISA分析抗人ST2单克隆抗体S1A4抑制ST2与IL-33结合的能力。
图2显示ELISA分析不同抗人ST2单克隆抗体抑制ST2与IL-33结合的能力。
图3显示抗人ST2单克隆抗体基于HEK-BlueTM IL-33细胞阻断ST2活性的检测结果。
图4显示抗人ST2单克隆抗体抑制IL-33与IL-12共刺激的PBMC分泌IFNγ的检测结果。
图5显示ELISA分析重组抗hST2单克隆抗体与不同种属ST2的结合能力。
序列说明
SEQ ID NO:1显示人(homo sapiens)ST2胞外区(h ST2)的氨基酸序列。
SEQ ID NO:2显示小鼠(mus musculus)ST2胞外区(m ST2)的氨基酸序列。
SEQ ID NO:3显示猕猴(Macaca mulatta)ST2胞外区(mm ST2)的氨基酸序列。
SEQ ID NO:4显示人(homo sapiens)IL-33胞外区(hIL-33)的氨基酸序列。
SEQ ID NO:5显示His标签(His)的氨基酸序列。
SEQ ID NO:6显示人(homo sapiens)IgG1抗体的Fc段(mFc1)的氨基酸序列。
SEQ ID NO:7显示小鼠(mus musculus)IgG2a抗体的Fc段(mFc)的氨基酸序列。
SEQ ID NO:8显示人(homo sapiens)IgG1亚型重链恒定区的氨基酸序列。
SEQ ID NO:9显示人(homo sapiens)IgG2亚型重链恒定区的氨基酸序列。
SEQ ID NO:10显示人(homo sapiens)IgG4亚型重链恒定区的氨基酸序列。
SEQ ID NO:11显示小鼠(mus musculus)IgG1亚型重链恒定区的氨基酸序列。
SEQ ID NO:12小鼠(mus musculus)IgG2a亚型重链恒定区的氨基酸序列。
SEQ ID NO:13显示人(homo sapiens)κ亚型轻链恒定区的氨基酸序列。
SEQ ID NO:14显示人(homo sapiens)λ亚型轻链恒定区的氨基酸序列。
SEQ ID NO:15显示小鼠(mus musculus)κ亚型轻链恒定区的氨基酸序列。
SEQ ID NO:16显示小鼠(mus musculus)λ亚型轻链恒定区的氨基酸序列。
SEQ ID NO:17显示全人源单链抗体S1A4的氨基酸序列。
SEQ ID NO:18显示全人源单链抗体S1A4的重链可变区(S1A4 VH)的氨基酸序列。
SEQ ID NO:19显示全人源单链抗体S1A4的轻链可变区(S1A4 VK)的氨基酸序列。
SEQ ID NO:20显示抗人ST2对照抗体MSTT1041A的重链可变区(MSTT1041A VH)氨基酸序列。
SEQ ID NO:21显示抗人ST2对照抗体MSTT1041A的轻链可变区(MSTT1041A VK)氨基酸序列。
SEQ ID NO:22显示抗人ST2对照抗体GSK3772847的重链可变区(GSK3772847 VH)氨基酸序列。
SEQ ID NO:23显示抗人ST2对照抗体GSK3772847的轻链可变区(GSK3772847 VK)氨基酸序列。
SEQ ID NO:24显示轻链可变区突变体L1D1的氨基酸序列，其CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:33所示。
SEQ ID NO:25显示轻链可变区突变体L2G2的氨基酸序列，其CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:35所示。
SEQ ID NO:26显示重链可变区突变体H5E10的氨基酸序列，其CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:42和SEQ ID NO:43所示。
SEQ ID NO:27显示重链可变区突变体H5G3的氨基酸序列，其CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37和SEQ ID NO:38所示。
SEQ ID NO:28显示重链可变区突变体H5G10的氨基酸序列，其CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40和SEQ ID NO:41所示。
SEQ ID NO:29显示重链可变区突变体H6D3的氨基酸序列，其CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:44和SEQ ID NO:45所示。
SEQ ID NO:30显示重链可变区突变体H6D6的氨基酸序列，其CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:42和SEQ ID NO:47所示。
SEQ ID NO:48显示人(homo sapiens)IL-12α的氨基酸序列。
SEQ ID NO:49显示人(homo sapiens)IFNγ的氨基酸序列。
发明详细描述
本申请的发明人通过抗体工程技术得到了新的抗人ST2抗体。在本申请的多个方面，提供了新的抗人ST2抗体或其抗原结合片段，编码该抗体或其抗原结合片段的核酸分子、包含所述核酸分子的载体、包含所述核酸分子或载体的宿主细胞、制备和纯化该抗体的方法及所述抗体或其抗原结合片段的医学和生物学应用。根据本申请提供的抗体的可变区的序列，可构建全长的抗体分子作为药物用于治疗临床上由ST2介导的疾病。
除非另外指明，本申请的实施采用本领域常规的分子生物学、微生物学、细胞生物学、生物化学以及免疫学技术。
除非另外指明，本申请中所用的术语具有本领域技术人员通常所理解的含义。
定义
如本文所用术语“抗体”，是指能够经由至少一个位于免疫球蛋白分子的可变区中的抗原识别位点特异性结合到标靶的免疫球蛋白分子。标靶包括但不限于碳水化合物、多聚核苷酸、脂质、多肽等。本文所使用的“抗体”不仅包括完整的(即全长的)抗体，而且还包括其抗原结合片段(例如Fab、Fab'、F(ab')2、Fv)、其变异体、包含抗体部分的融合蛋白、人源化抗体、嵌合抗体、双抗体、线性抗体、单链抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)及任何其他包含所需特异性的抗原识别位点的免疫球蛋白分子的修改配置，包括抗体的糖基化变体、抗体的氨基酸序列变体及共价修饰的抗体。
通常，完整或全长的抗体包含两个重链和两个轻链。每个重链含有重链变异区(VH)和第一、第二及第三恒定区(CH1、CH2及CH3)。每个轻链含有轻链变异区(VL)和恒定区(CL)。全长的抗体可以是任何种类的抗体，例如IgD、IgE、IgG、IgA或IgM(或上述的子类)，但抗体不需要属于任何特定的类别。根据重链的恒定域的抗体氨基酸序列，可以将免疫球蛋白指定为不同的类别。通常，免疫球蛋白有五种主要的类别：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，而且这些类别中有几个可以再被进一步区分成子类(同型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2。对应于不同免疫球蛋白类别的重链恒定域分别称为α、δ、ε、γ、以及μ。不同类别的免疫球蛋白的子单元结构和三维结构是公知的。
如本文所用术语“抗原结合片段或抗原结合部分”，是指负责结合抗原的完整抗体分子的一部分或区域。抗原结合域可以包含重链变异区(VH)、轻链变异区(VL)或上述两者。VH和VL中的每个通常含有三个互补决定区CDR1、CDR2及CDR3。
本领域技术人员公知，互补决定区(CDR，通常有CDR1、CDR2及CDR3)是可变区中对抗体的亲和力和特异性影响最大的区域。VH或VL的CDR序列有两种常见的定义方式，即Chothia定义和kabat定义。(参阅例如Kabat,“Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest”，National Institutes of Health,Bethesda，Md.(1991)；A1-Lazikani等人，J.Mol.Biol.273:927-948(1997)；以及Martin等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:9268-9272(1989)。对于给定抗体的可变区序列，可以根据Chothia定义或者Kabat定义来确定VH和VL序列中的CDR序列。在本申请的实施方案中，利用Chothia定义CDR序列。
对于给定抗体的可变区序列，可以通过多种方式分析可变区序列的中CDR序列，例如可以利用在线软件Abysis确定(http://www.abysis.org/)。
抗原结合片段的实例包括但不限于：(1)Fab片段，其可以是具有VL-CL链和VH-CH1链的单价片段；(2)F(ab')2片段，其可以是具有两个Fab'片段的二价片段，该两个Fab'片段由铰链区的二硫桥(即Fab'的二聚物)连接；(3)具有抗体的单臂的VL和VH域的Fv片段；(4)单链Fv(scFv)，其可以是由VH域和VL域经由胜肽连接符组成的单一多胜肽链；以及(5)(scFv)2，其可以包含两个由胜肽连接符连接的VH域和两个VL域，该两个VL域是经由二硫桥与该两个VH域组合。
在本文描述抗体结构时，涉及氨基酸位置编号的描述参照人IgG1抗体的EUnumbering定义，这是本领域技术人员公知且容易查询到的。此外，在本文结合EUnumbering位置描述突变时，是指相对于天然抗体序列产生的突变。
如本文所用术语“Fc片段”、“Fc结构域”、“Fc部分”或类似的术语是指抗体重链恒定区的一部分，包括铰链区(hinge)、恒定区的CH2片段和CH3片段。参照人IgG1抗体的EUnumbering定义，Fc片段是抗体恒定区中第216-447位的氨基酸序列。
如本文所用术语“特异性结合”，是指两个分子之间的非随机结合反应，例如抗体至抗原表位的结合。
如本文所用术语“单克隆抗体”指由基本同质的抗体群体获得的抗体，即，除了可能在少量个体中存在自然发生的突变以外，组成群体的各个抗体是相同的。本文所述单克隆抗体特别包括“嵌合”抗体，其中重链和/或轻链的一部分与来源于具体物种或属于具体抗体类或亚类的抗体中的对应序列相同或同源，而重链和/或轻链的余下部分与来源于另一物种或属于另一抗体类或亚类的抗体中的对应序列相同或同源，并且还包括这样的抗体的片段，只要它们能表现出所期望的生物学活性(美国专利号4,816,567；和Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:6851-6855(1984)。
如本文所用术语“自身免疫病”是指自机体对自身抗原发生免疫反应而导致自身组织损害所引起的疾病，包括但不限于硬皮病、系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、Churg-Strauss综合征、韦格纳肉芽肿(Wegener’s granulomatosis)和肺出血-肾炎综合征等。
如本文所用术语“炎性疾病”是指炎症作为其主要破坏因子的疾病的统称。炎症为组织对有害刺激的生物反应，其是一种病变，并且伴随有组织退化、循环紊乱和液体渗出三种事件，以及肥大。炎性疾病的实例包括急性和慢性疾病，包括但不限于过敏性肺炎、特应性皮炎、哮喘、鼻炎、克罗恩病、强直性脊柱炎、风湿热、纤维肌痛、银屑病关节炎、慢性肾炎、斯耶格伦氏综合征以及多发性硬化等。
第一方面，本申请提供了一种结合人ST2的抗体，其包含含HCDR1、HCDR2和HCDR3氨基酸序列的重链可变区和含LCDR1、LCDR2和LCDR3氨基酸序列的轻链可变区，其中
所述HCDR1氨基酸序列如SEQ ID NO:36、所述HCDR2氨基酸序列如SEQ ID NO:37所示、所述HCDR3氨基酸序列如SEQ ID NO:38所示、所述LCDR1氨基酸序列如SEQ ID NO:31所示、所述LCDR2氨基酸序列如SEQ ID NO:32所示、所述LCDR3氨基酸序列如SEQ ID NO:33所示；或者
所述HCDR1氨基酸序列如SEQ ID NO:39所示，所述HCDR2氨基酸序列如SEQ ID NO:40所示、所述HCDR3氨基酸序列如SEQ ID NO:41所示、所述LCDR1氨基酸序列如SEQ ID NO:31所示、所述LCDR2氨基酸序列如SEQ ID NO:32所示、所述LCDR3氨基酸序列如SEQ ID NO:33所示；或者
所述HCDR1氨基酸序列如SEQ ID NO:39所示、所述HCDR2氨基酸序列如SEQ ID NO:42所示、所述HCDR3氨基酸序列如SEQ ID NO:43所示、所述LCDR1氨基酸序列如SEQ ID NO:31所示、所述LCDR2氨基酸序列如SEQ ID NO:32所示、所述LCDR3氨基酸序列如SEQ ID NO:33所示；或者
所述HCDR1氨基酸序列如SEQ ID NO:39所示、所述HCDR2氨基酸序列如SEQ ID NO:44所示、所述HCDR3氨基酸序列如SEQ ID NO:45所示、所述LCDR1氨基酸序列如SEQ ID NO:31所示、所述LCDR2氨基酸序列如SEQ ID NO:32所示、所述LCDR3氨基酸序列如SEQ ID NO:33所示；或者
所述HCDR1氨基酸序列如SEQ ID NO:46所示、所述HCDR2氨基酸序列如SEQ ID NO:42所示、所述HCDR3氨基酸序列如SEQ ID NO:47所示、所述LCDR1氨基酸序列如SEQ ID NO:31所示、所述LCDR2氨基酸序列如SEQ ID NO:32所示、所述LCDR3氨基酸序列如SEQ ID NO:33所示；或者
所述HCDR1氨基酸序列如SEQ ID NO:36所示、所述HCDR2氨基酸序列如SEQ ID NO:37所示、所述HCDR3氨基酸序列如SEQ ID NO:38所示、所述LCDR1氨基酸序列如SEQ ID NO:34所示、所述LCDR2氨基酸序列如SEQ ID NO:32所示、所述LCDR3氨基酸序列如SEQ ID NO:35所示；或者
所述HCDR1氨基酸序列如SEQ ID NO:39所示、所述HCDR2氨基酸序列如SEQ ID NO:40所示、所述HCDR3氨基酸序列如SEQ ID NO:41所示、所述LCDR1氨基酸序列如SEQ ID NO:34所示、所述LCDR2氨基酸序列如SEQ ID NO:32所示、所述LCDR3氨基酸序列如SEQ ID NO:35所示；或者
所述HCDR1氨基酸序列如SEQ ID NO:39所示、所述HCDR2氨基酸序列如SEQ ID NO:42所示、所述HCDR3氨基酸序列如SEQ ID NO:43所示、所述LCDR1氨基酸序列如SEQ ID NO:34所示、所述LCDR2氨基酸序列如SEQ ID NO:32所示、所述LCDR3氨基酸序列如SEQ ID NO:35所示；或者
所述HCDR1氨基酸序列如SEQ ID NO:39所示、所述HCDR2氨基酸序列如SEQ ID NO:44所示、所述HCDR3氨基酸序列如SEQ ID NO:45所示、所述LCDR1氨基酸序列如SEQ ID NO:34所示、所述LCDR2氨基酸序列如SEQ ID NO:32所示、所述LCDR3氨基酸序列如SEQ ID NO:35所示；或者
所述HCDR1氨基酸序列如SEQ ID NO:46所示、所述HCDR2氨基酸序列如SEQ ID NO:42所示、所述HCDR3氨基酸序列如SEQ ID NO:47所示、所述LCDR1氨基酸序列如SEQ ID NO:34所示、所述LCDR2氨基酸序列如SEQ ID NO:32所示、所述LCDR3氨基酸序列如SEQ ID NO:35所示；其中HCDR和LCDR氨基酸氨基酸序列根据Kabat定义。
在一些实施方案中，所述抗体的重链可变区的氨基酸如SEQ ID NO:26、27、28、29或者30所示。
在一些实施方案中，所述抗体的轻链可变区的氨基酸如SEQ ID NO:24或者25所示。
在一些实施方案中，所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:26所示，所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:24所示；或者
所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:27所示，所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:24所示；或者
所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:28所示，所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:24所示；或者
所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:29所示，所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:24所示；或者
所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:30所示，所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:24所示；或者
所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:26所示，所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:25所示；或者
所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:27所示，所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:25所示；或者
所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:28所示，所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:25所示；或者
所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:29所示，所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:25所示；或者
所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:30所示，所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:25所示。
第二方面，本申请提供了一种结合人ST2的抗体，其中所述抗体的重链可变区的氨基酸序列与SEQ ID NO:26、27、28、29和30中任何一项具有至少90％的一致性，并且所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列与SEQ ID NO:24和25中任何一项具有至少90％的一致性。
在第一方面和第二方面的一些实施方案中，所述抗体为单克隆抗体。
在第一方面和第二方面的一些实施方案中，所述抗体为全抗体、Fab片段、F(ab’)2片段或单链Fv片段(scFv)。
在第一方面和第二方面的一些实施方案中，所述抗体为全人源抗体。
在第一方面和第二方面的一些实施方案中，所述抗体还包含选自IgG1亚型、IgG2亚型或IgG4亚型的重链恒定区。
在第一方面和第二方面的一些实施方案中，所述抗体的重链恒定区可以是人IgG1亚型、人IgG2亚型、人IgG4亚型、鼠IgG1亚型或鼠IgG2a亚型。
在第一方面和第二方面的一些具体实施方案中，所述重链恒定区为IgG4亚型。
在第一方面和第二方面的一些具体实施方案中，所述抗体的重链恒定区包含人IgG1亚型重链恒定区的Fc段序列并且所述Fc序列的第234、235和331位的氨基酸序列分别为F、E和S，其中抗体恒定区氨基酸序列顺序按照EU numbering来确定。
在第一方面和第二方面的一些实施方案中，所述抗体还包含选自κ亚型或者λ亚型的轻链恒定区。
在第一方面和第二方面的一些实施方案中，所述抗体的轻链恒定区可以是人κ亚型、人λ亚型、鼠κ亚型或者鼠λ亚型。
在第一方面和第二方面的一些实施方案中，所述抗体能够结合重组人ST2(SEQ IDNO:1)、重组鼠ST2(SEQ ID NO:2)和重组猴ST2(SEQ ID NO:3)。
在第一方面和第二方面的一些实施方案中，所述抗体能够结合重组人ST2(SEQ IDNO:1)和重组猴ST2(SEQ ID NO:3)。
在第一方面和第二方面的一些实施方案中，所述抗体抑制人ST2与人IL-33结合。
第三方面，本申请提供了核酸分子，其编码第一方面或第二方面所述的抗体或其抗原结合部分。
在一些实施方案中，所述核酸分子可操作地连接到调控序列，调控序列可以被用所述载体转化过的宿主细胞识别。
第四方面，本申请提供了药物组合物，其包含第一方面或第二方面所述的抗体和药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体。
在一些实施方案中，所述药物组合物用于预防或治疗ST2介导的疾病。
在一些实施方案中，所述ST2介导的疾病为自身免疫疾病或炎性疾病，例如硬皮病、系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、Churg-Strauss综合征、韦格纳肉芽肿(Wegener’sgranulomatosis)、肺出血-肾炎综合征、过敏性肺炎、特应性皮炎、哮喘、鼻炎、克罗恩病、强直性脊柱炎、风湿热、纤维肌痛、银屑病关节炎、慢性肾炎、斯耶格伦氏综合征以及多发性硬化等。
在一些实施方案中，所述药物组合物还可包含下述中的一种或多种：润滑剂，如滑石粉、硬脂酸镁和矿物油；润湿剂；乳化剂；悬浮剂；防腐剂，如苯甲酸、山梨酸和丙酸钙；增甜剂和/或调味剂等。
在一些实施方案中，可将本申请中的药物组合物配制为片剂、丸剂、粉剂、锭剂、酏剂、悬液、乳剂、溶液、糖浆、栓剂或胶囊等形式。
在一些实施方案中，可以利用任何生理上可接受的给药方式递送本申请的药物组合物，这些给药方式包括但不限于：口服给药、肠胃外给药、经鼻给药、直肠给药、腹膜内给药、血管内注射、皮下给药、经皮给药、吸入给药等。
在一些实施方案中，可以通过混合具有所需纯度的试剂与视情况的药学上可接受的载体、赋形剂等，以冻干制剂或水溶液的形式配制用于治疗用途的药物组合物用于存储。
第五方面，本申请提供了第一方面或第二方面所述的抗体在制备用于预防或治疗ST2介导的疾病的药物中的用途。
在一些实施方案中，所述ST2介导的疾病为自身免疫疾病或炎性疾病，例如硬皮病、系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、Churg-Strauss综合征、韦格纳肉芽肿(Wegener’sgranulomatosis)、肺出血-肾炎综合征、过敏性肺炎、特应性皮炎、哮喘、鼻炎、克罗恩病、强直性脊柱炎、风湿热、纤维肌痛、银屑病关节炎、慢性肾炎、斯耶格伦氏综合征以及多发性硬化等。
第六方面，本申请提供了预防或治疗ST2介导的疾病的方法，包括向有需要的个体给予第一方面或第二方面所述的抗体或第四方面所述的药物组合物。
在一些实施方案中，所述ST2介导的疾病为自身免疫疾病或炎性疾病，例如硬皮病、系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、Churg-Strauss综合征、韦格纳肉芽肿(Wegener’sgranulomatosis)、肺出血-肾炎综合征、过敏性肺炎、特应性皮炎、哮喘、鼻炎、克罗恩病、强直性脊柱炎、风湿热、纤维肌痛、银屑病关节炎、慢性肾炎、斯耶格伦氏综合征以及多发性硬化等。
在其他方面，本申请还提供编码本发明抗体或其轻链或重链的分离的核酸分子以及包含所述核酸分子的载体、包含所述载体的宿主细胞以及产生所述抗体的方法。在一些实施方案中，所述核酸分子可操作地连接到调控氨基酸序列，调控氨基酸序列可以被用所述载体转化过的宿主细胞识别。在一些实施方案中，产生抗体的方法包括培养宿主细胞以便于表达核酸。在一些实施方案中，产生抗体的方法还包括从宿主细胞培养基中回收抗体。
此外，本文所述的特异性结合人ST2的抗体也可用于检测生物样品中ST2的存在。基于抗体的检测方法在本领域是众所周知的，并且包括例为ELISA、免疫印迹、放射免疫试验、免疫荧光、免疫沉淀以及其它相关技术。
应当理解，以上详细描述仅为了使本领域技术人员更清楚地了解本申请的内容，而并非意图在任何方面加以限制。本领域技术人员能够对所述实施方案进行各种改动和变化。
实施例
以下实施例仅用于说明而非限制本申请范围的目的。
实施例1：噬菌体展示抗体库的构建
具体实验流程可参见中国专利申请第201610609651.X号的实施例1以及中国专利申请第201510097117.0号的实施例1，通过引用方式将上述两篇专利申请的全部内容并入本文。
实施例2：重组蛋白的制备
制备抗ST2单克隆抗体的过程中需要用到多种不同的重组蛋白，包括人ST2胞外区(hST2，SEQ ID NO:1)、小鼠ST2胞外区(mST2，SEQ ID NO:2)、猕猴ST2胞外区(mmST2，SEQ IDNO:3)以及人IL-33胞外区(hIL-33，SEQ ID NO:4)。这些蛋白具有大量的翻译后修饰(如糖基化或者二硫键等)，因而利用哺乳动物细胞表达系统将更有利于保持重组蛋白的结构和功能。此外，在这些重组蛋白的C端添加了His标签(His，SEQ ID NO:5)或者人抗体IgG1的Fc段(hFc，SEQ ID NO:6)或者鼠抗体IgG2a的Fc段(mFc，SEQ ID NO:7)，将更有利于重组蛋白的纯化和单克隆抗体功能的鉴定。抗体重链恒定区可以是人IgG1亚型(SEQ ID NO:8)、人IgG2亚型(SEQ ID NO:9)、人IgG4亚型(SEQ ID NO:10)或者鼠IgG1亚型(SEQ ID NO:11)、鼠IgG2a亚型(SEQ ID NO:12)，轻链恒定区可以是人κ亚型(SEQ ID NO:13)、人λ亚型(SEQ IDNO:14)或者鼠κ亚型(SEQ ID NO:15)、鼠λ亚型(SEQ ID NO:16)。
根据Uniprot数据库的各种目的重组蛋白的氨基酸序列，设计并合成上述各种重组蛋白的基因(包含His标签或者hFc、mFc编码基因)。利用常规的分子生物学技术将合成的各种重组蛋白基因克隆至合适的真核表达载体(如invitrogen公司的pcDNA3.1等)，然后利用脂质体(如invitrogen公司的293fectin等)或者其他阳离子转染试剂(如PEI等)将制备的重组蛋白表达质粒转染入HEK293细胞(如invitrogen公司的HEK293F)，在无血清悬浮培养条件下培养3-4天。然后通过离心等方式收获培养上清。
His标签融合表达的重组蛋白利用金属螯合亲和层析柱(如GE公司的HisTrap FF等)对培养上清中的重组蛋白进行一步纯化。hFc和mFc融合表达的重组蛋白用ProteinA/G亲和层析柱(如GE公司的Mabselect SURE等)进行一步纯化。然后利用脱盐柱(如GE公司的Hitrap desaulting等)将重组蛋白保存缓冲液置换为PBS(pH7.0)或者其他合适的缓冲液。必要时，可以对抗体样品进行过滤除菌，然后分装保存于-20℃。
实施例3：利用噬菌体展示抗体库技术筛选抗人ST2单克隆抗体
3.1抗人ST2单克隆抗体的筛选
以实施例2制备的重组人ST2-his为抗原，利用固相筛选策略(实验方案参考噬菌体展示：通用实验指南/(美)克拉克森(Clackson,T.),(美)洛曼(Lowman,H.B.)编；马岚等译。化学工业出版社，2008.5)筛选实施例1制备的展示人单链抗体库的噬菌体库，最终获得1株特异性结合人ST2的全人源单链抗体S1A4。
3.2制备全人源抗体
利用常规的分子生物学手段，将编码S1A4的重链可变区(S1A4 VH，SEQ ID NO:18)和轻链可变区(S1A4 VK，SEQ ID NO:19)的核酸分子分别克隆至融合有编码人重链恒定区和轻链恒定区的核酸分子的真核表达载体，组合表达全抗体。同时，参照专利US9382318B2和US9090694B2，分别制备阳性对照抗体MSTT1041A(MSTT1041A VH，SEQ ID NO:20；MSTT1041A VK，SEQ ID NO:21)和GSK3772847(GSK3772847 VH，SEQ ID NO:22；GSK3772847VK，SEQ ID NO:23)以用于研究。
3.3 S1A4抑制重组人IL-33与重组人ST2结合
将重组蛋白hST2-his包被于96孔板(1μg/mL，100μl/孔)，4℃包被过夜。然后用含有0.5μg/mL重组蛋白hIL33-mFc的PBST-2％牛奶对抗体S1A4、MSTT1041A和GSK3772847进行梯度稀释。抗体的起始浓度均为200μg/mL，3倍梯度稀释，共9个浓度梯度。利用HRP山羊抗鼠IgG((中杉金桥，ZB2305)检测hIL33-mFc的结合信号，然后利用GraphPad Prism 6进行数据分析和作图。ELISA分析结果(图1)显示，S1A4能够有效抑制ST2与IL-33的结合，并且抑制能力与对照抗体MSTT1041A和GSK3772847相当，各抗体的IC50值如表1所示。其中，S1A4、MSTT1041A和GSK3772847的重链恒定区为IgG4亚型。
表1.S1A4抑制ST2与IL33结合的IC50值
S1A4-IgG4 MSTT1041A-IgG4 GSK3772847-IgG4
IC<sub>50</sub>(nM) 4.149 3.794 5.524
3.4 S1A4亲和力测定
利用Biacore X100通过表面等离子共振技术测定抗ST2抗体的亲和力。氨基偶联试剂盒(BR-1000-50)、人抗体捕获试剂盒(BR-1008-39)、CM5芯片(BR100012)和pH7.4的10×HBS-EP(BR100669)等相关试剂和耗材均购自GE healthcare。依照试剂盒中的说明书，用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride，EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(N-Hydroxysuccinimide，NHS)对羧基化CM5芯片表面进行活化，将抗人IgG(Fc)抗体(捕获抗体)用10mM pH5.0乙酸钠溶液稀释至25μg/mL，之后以流速10μL/min注射以实现大约多至10000个响应单位(RU)的偶联量。注射捕获抗体之后，注射1M乙醇胺以封闭未反应的基团。对于动力学测量，稀释抗ST2抗体至0.5-1μg/mL，10μL/min注射，保证100RU左右的抗体被抗人Fc的抗体捕获。然后将hST2-his设置一系列的浓度梯度(例如0.625nM、1.25nM、2.5nM、5nM、10nM)，于25℃下30μL/min从低浓度到高浓度进行注射，结合时间为120s，解离时间为1800s，以10μL/min注射3M的MgCl2溶液30s对芯片表面进行再生。使用Biacore X100评估软件2.0.1版，通过1:1结合模型拟合结合和解离传感图来计算结合速率(Kon)和解离速率(Koff)。以比率Koff/Kon计算解离平衡常数(KD)，拟合结果如表2所示。
表2.S1A4结合ST2的亲和力常数
Kon Koff KD
S1A4-IgG4 1.646*10E6 2.215*10E-4 1.346*10E-10
MSTT1041A-IgG4 3.941*10E5 9.452*10E-5 2.398*10E-10
GSK3772847-IgG4 1.979*10E6 2.159*10E-4 1.091*10E-10
实施例4 S1A4的亲和力成熟
4.1轻链置换
基于双载体噬菌体呈现系统，以单克隆抗体S1A4的重链可变区(S1A4VH)为基础，利用轻链置换(实验技术流程可参见中国专利第201510097117.0号中的实施例4)对抗体S1A4进行体外亲和力成熟，获得了两个高亲和力轻链可变区突变体L1D1(氨基酸序列为SEQID NO:24)和L2G2(氨基酸序列为SEQ ID NO:25)。
4.2轻链突变体亲和力测定
参照实施例3.2将编码S1A4的重链可变区(S1A4VH，SEQ ID NO:18)和轻链可变区突变体L1D1(S1A4VK，SEQ ID NO:24)或L2G2(氨基酸序列为SEQ ID NO:25)的核酸序列分别克隆至融合有编码人重链恒定区和轻链恒定区核酸序列的真核表达载体，组合表达全抗体S1A4VH+L1D1和S1A4VH+L2G2。参照实施例3.4，利用Biacore X100对S1A4新轻链可变区进行亲和力分析，结果如表3所示。其中，S1A4、S1A4VH+L1D1和S1A4VH+L2G2的重链恒定区为IgG4亚型。
表3.轻链突变体结合ST2的亲和力常数
Kon Koff KD
S1A4 1.862E+6 1.892E-4 1.106E-10
S1A4VH+L1D1 2.365E+6 3.59E-4 1.518E-10
S1A4VH+L2G2 2.45E+6 1.944E-4 7.935E-11
4.3 S1A4重链突变库的筛选
利用常规分子生物学手段，通过在重链S1A4VH的CDR3区引入突变，构建基于重链可变区S1A4VH的CDR3突变库，设计的突变方案如表4所示。基于双载体呈现系统(实验技术流程可参见中国专利申请第201510097117.0号中的实施例5)，通过固相筛选的方法，利用hST2-His抗原对构建的S1A4VH-CDR3突变库进行共3轮筛选富集。收集富集得到的第3轮突变库产物，吸取1OD菌液利用天根生物无内毒素质粒大提试剂盒(#DP117)提取质粒。以提取的质粒为模板，设计引物扩增S1A4VH-CDR3突变库的FR3-FR4部分序列备用，以构建的天然人抗体库可变区重链基因为模板(参见中国专利申请第201510097117.0号中的实施例1)，设计引物扩增人重链胚系基因的FR1-FR3部分序列备用。以PCR扩增制备的S1A4VH的FR3-FR4序列和人重链胚系基因的FR1-FR3序列为模板，利用重叠延伸PCR(Overlap PCR)的方法扩增构建基于S1A4VH-CDR3突变体和人重链胚系基因的组合库，构建库容1.5×10E8，正确率为80％。用于组合库设计的扩增引物如下表5、表6所示。
表4.基于S1A4重链可变区VH的CDR3突变库的突变方案
表5.扩增S1A4VH-CDR3突变库的FR3-FR4部分序列所需引物
引物名称 引物序列
PWM34-C1-CDR3-F11a ACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGAAGCGAGGATA
PWM34-C1-HCDR3R12 GGTGACCAGTGTGCCCTGGCCCCAG
表6.扩增重链天然胚系基因FR1-FR3部分序列所需引物
引物名称 引物序列
PhVH1F11a CAGGTTCAGCTGGTGCAGTC
PhVH1F11b CAGGTGCAGCTGGTGCAGTC
PhVH1F11c CARATGCAGCTGGTGCAGTC
PhVH1F11d SAGGTCCAGCTGGTACAGTC
PhVH1F11e CAGGTCCAGCTTGTGCAGTC
PhVH1R13a CTCAGCTCCATGTAGGCTGTG
PhVH1R13b GCTCAGCTCCATGTAGACTGTG
基于双载体噬菌体展示系统，用hST2-his抗原对上述组合库进行筛选，最终得到5个重链可变区突变体H5E10(SEQ ID NO:26)、H5G3(SEQ ID NO:27)、H5G10(SEQ ID NO:28)、H6D3(SEQ ID NO:29)、H6D6(SEQ ID NO:30)。
4.4 S1A4突变体亲和力测定
参照实施例3.2将编码重链可变区突变体H5E10(氨基酸序列为SEQ ID NO:26)、H5G3(氨基酸序列为SEQ ID NO:27)、H5G10(氨基酸序列为SEQ ID NO:28)、H6D3(氨基酸序列为SEQ ID NO:29)或H6D6(氨基酸序列为SEQ ID NO:30)和轻链可变区突变体L2G2(氨基酸序列为SEQ ID NO:25)的核酸分子分别克隆至融合有编码人重链恒定区和轻链恒定区核酸分子的真核表达载体，组合表达全抗体。参照实施例3.4，利用Biacore X100对S1A4突变体进行亲和力分析，结果如表7所示。其中，S1A4、H5G3+L2G2、H5E10+L2G2、H5G10+L2G2、H6D3+L2G2和H6D6+L2G2的重链恒定区为IgG4亚型。
表7.S1A4突变体结合ST2的亲和力常数
Kon Koff KD
S1A4 1.991*10E6 2.76*10E-4 1.386*10E-10
H5G3+L2G2 1.018*10E6 1.116*10E-4 1.146*10E-10
H5E10+L2G2 3.354*10E6 2.378*10E-3 7.091*10E-10
H5G10+L2G2 4.203*10E6 3.581*10E-4 8.522*10E-11
H6D3+L2G2 3.342*10E6 1.245*10E-4 3.726*10E-11
H6D6+L2G2 2.569*10E6 1.785*10E-3 6.949*10E-10
实施例5抗人ST2单克隆抗体竞争IL-33结合ST2
分析不同抗人ST2单克隆抗体(H5G3+L2G2、H5E10+L2G2、H5G10+L2G2、H6D3+L2G2、H6D6+L2G2和H5G3+L1D1)抑制ST2和IL33结合的能力。
将重组蛋白hST2-Fc包被于96孔板(3μg/mL，100μl/孔)，4℃包被过夜。然后用含有0.4μg/mL重组蛋白hIL33-his的PBST-2％牛奶对各抗ST2抗体蛋白(IgG4亚型)进行梯度稀释。抗体的起始浓度为50μg/mL，3倍梯度稀释，共10个浓度梯度。利用HRP鼠抗his IgG(康为世纪，CW0285M)检测IL33-his的结合信号，然后利用GraphPad Prism 6进行数据分析和作图。ELISA分析结果(图2)显示不同抗ST2单克隆抗体都能够有效抑制IL33与ST2的结合，各抗体的IC50值如表8所示。
表8.抗ST2抗体抑制ST2与IL33结合的IC50值
实施例6抗人ST2单克隆抗体基于HEK-BlueTM IL-33细胞阻断ST2的作用
用IL-33刺激HEK-BlueTM IL-33细胞(InvivoGen)，激活NF-κB和AP-1信号通路，启动细胞表达分泌型碱性磷酸酶(SEAP)，通过检测抗体对SEAP表达水平的影响可以判断抗ST2抗体的阻断作用。HEK-BlueTM IL-33细胞表达ST2L，是对人HEK细胞转入IL1RL1基因得到的，同时整合了IFN-β小启动子控制的SEAP报告基因，启动子融合了5个NF-κB和5个AP-1结合位点。HEK-BlueTM IL-33细胞同时阻断TNF-α和IL-1β应答，从而使HEK-BlueTM IL-33细胞只对IL-33产生应答反应。HEK细胞表达内源性IL-1RAcP。
用测试培养基(DMEM+10％FBS+1％P.S.+100μg/mLNormocin)配制60pM的hIL-33(GenScript，Z03198)溶液，用该溶液对抗人ST2单克隆抗体(MSTT1041A、GSK3772847、H5G3+L2G2、H5G10+L2G2、H5G10+L1D1和H5G3+L1D1)进行系列稀释(抗体浓度梯度分别为1、4、16、64、256、1024、4096、16384、65536、262144pM)，抗体溶液与等体积HEK-Blue IL-33细胞(细胞密度5×105个/mL)混合，接种96孔细胞板，每孔200μL，细胞板置于CO2培养箱于37℃正常培养。23小时后细胞板1200rpm离心5分钟，取20μL上清与180μLQUANTI-BlueTM(InvivoGen)在96孔板中混合，37℃显色30分钟，测定OD630，然后利用GraphPad Prism 6进行数据分析和作图。结果显示6种抗人ST2单克隆抗体(MSTT1041A、GSK3772847、H5G3+L2G2、H5G10+L2G2、H5G10+L1D1和H5G3+L1D1)都是剂量依赖型抑制IL-33活性(图3)，各抗体的IC50值如表9所示。其中，MSTT1041A、GSK3772847、H5G3+L2G2、H5G10+L2G2、H5G10+L1D1和H5G3+L1D1的重链恒定区为IgG4亚型，轻链恒定区为κ亚型。
表9.抗人ST2单克隆抗体基于HEK-BlueTM IL-33细胞抑制ST2的IC50值
实施例7抗人ST2单克隆抗体抑制IL-33与IL-12共刺激的PBMC分泌IFNγ
除了报告基因系统，用原代NK细胞也可以检测抗ST2抗体的阻断作用。IL-33和IL-12各自不能单独激活NK细胞，但IL-12可以显著增加NK细胞表面ST2的表达，用IL-33和IL-12刺激新鲜分离的NK细胞，IL-33与NK细胞表面ST2结合，可以激活NK细胞大量释放IFN-γ。通过检测抗体对IFN-γ表达水平的影响可以判断抗ST2抗体的阻断作用
用人PBMC细胞接种96孔细胞板(1.5×106个/mL，1640培养基+10％胎牛血清+1％P.S)，每孔100μL，加入1ng/ml IL-12-His(义翘神州，CT050-H08H)+0.1nM IL-33(GenScript，Z03198)+5倍梯度稀释抗体(MSTT1041A、GSK3772847、H5G3+L1D1和H5G10+L2G2，抗体浓度梯度分别为0.00256、0.0128、0.064、0.32、1.6、8、40、200、1000、5000pM)，反应总体积200μL/孔，37℃在CO2培养箱中作用，24小时后细胞板1200rpm离心5分钟，按照说明书检测上清液中的IFN-γ(人IFN-γELISA试剂盒，达科为，DKW12-1000-096)，然后利用GraphPad Prism 6进行数据分析和作图。H5G3+L1D1和H5G10+L2G2都是剂量依赖型抑制IL-33与IL-12共刺激PBMC分泌IFNγ(图4)，各抗体的IC50值如表10所示。其中，MSTT1041A、GSK3772847、H5G3+L1D1和H5G10+L2G2的重链恒定区为IgG4亚型。
表10.抗人ST2单克隆抗体抑制IL-33与IL-12共刺激PBMC分泌IFNγ的IC50值
MSTT1041A GSK3772847 H5G3+L1D1 H5G10+L2G2
IC<sub>50</sub>(pM) 36.96 15.70 38.00 17.46
实施例8抗人ST2单克隆抗体的种属特异性
将制备的人ST2(hST2-his)、猕猴ST2(mmST2-his)和小鼠ST2(mST2-his)分别包被于96孔ELISA板(1μg/mL，100μl/孔)，同时包被10％BSA作为无关对照，4℃包被过夜。利用封闭液PBS-0.1％Tween20-3％牛奶在37℃封闭1小时后，分别加入各重组抗ST2单克隆抗体(S1A4、H5G3+L2G2、H5E10+L2G2、H5G10+L2G2、H6D3+L2G2、H6D6+L2G2和H5G3+L1D1)，37℃结合1小时。用PBST缓冲液洗涤ELISA板，加入HRP鼠抗人IgG(bioss，bsm-0297M-HRP)，37℃结合1小时。PBST缓冲液洗涤ELISA板，加入OPD底物显色液，5-10分钟后用1M的H2SO4终止显色，酶标仪492nm/630nm双波长测定光密度值。ELISA分析结果(图5)显示，六种抗ST2单克隆抗体(S1A4、H5G3+L2G2、H5E10+L2G2、H6D3+L2G2、H6D6+L2G2和H5G3+L1D1)能特异识别人ST2，并且和猴ST2、鼠ST2存在交叉反应，H5G10+L2G2不结合鼠ST2。七种单克隆抗体的重链恒定区均为IgG4亚型，轻链恒定区为κ亚型。
序列表
<110> 北京智仁美博生物科技有限公司
<120> 抗人ST2抗体及其用途
<160> 49
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 310
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 1
Lys Phe Ser Lys Gln Ser Trp Gly Leu Glu Asn Glu Ala Leu Ile Val
1 5 10 15
Arg Cys Pro Arg Gln Gly Lys Pro Ser Tyr Thr Val Asp Trp Tyr Tyr
20 25 30
Ser Gln Thr Asn Lys Ser Ile Pro Thr Gln Glu Arg Asn Arg Val Phe
35 40 45
Ala Ser Gly Gln Leu Leu Lys Phe Leu Pro Ala Ala Val Ala Asp Ser
50 55 60
Gly Ile Tyr Thr Cys Ile Val Arg Ser Pro Thr Phe Asn Arg Thr Gly
65 70 75 80
Tyr Ala Asn Val Thr Ile Tyr Lys Lys Gln Ser Asp Cys Asn Val Pro
85 90 95
Asp Tyr Leu Met Tyr Ser Thr Val Ser Gly Ser Glu Lys Asn Ser Lys
100 105 110
Ile Tyr Cys Pro Thr Ile Asp Leu Tyr Asn Trp Thr Ala Pro Leu Glu
115 120 125
Trp Phe Lys Asn Cys Gln Ala Leu Gln Gly Ser Arg Tyr Arg Ala His
130 135 140
Lys Ser Phe Leu Val Ile Asp Asn Val Met Thr Glu Asp Ala Gly Asp
145 150 155 160
Tyr Thr Cys Lys Phe Ile His Asn Glu Asn Gly Ala Asn Tyr Ser Val
165 170 175
Thr Ala Thr Arg Ser Phe Thr Val Lys Asp Glu Gln Gly Phe Ser Leu
180 185 190
Phe Pro Val Ile Gly Ala Pro Ala Gln Asn Glu Ile Lys Glu Val Glu
195 200 205
Ile Gly Lys Asn Ala Asn Leu Thr Cys Ser Ala Cys Phe Gly Lys Gly
210 215 220
Thr Gln Phe Leu Ala Ala Val Leu Trp Gln Leu Asn Gly Thr Lys Ile
225 230 235 240
Thr Asp Phe Gly Glu Pro Arg Ile Gln Gln Glu Glu Gly Gln Asn Gln
245 250 255
Ser Phe Ser Asn Gly Leu Ala Cys Leu Asp Met Val Leu Arg Ile Ala
260 265 270
Asp Val Lys Glu Glu Asp Leu Leu Leu Gln Tyr Asp Cys Leu Ala Leu
275 280 285
Asn Leu His Gly Leu Arg Arg His Thr Val Arg Leu Ser Arg Lys Asn
290 295 300
Pro Ile Asp His His Ser
305 310
<210> 2
<211> 306
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 2
Ser Lys Ser Ser Trp Gly Leu Glu Asn Glu Ala Leu Ile Val Arg Cys
1 5 10 15
Pro Gln Arg Gly Arg Ser Thr Tyr Pro Val Glu Trp Tyr Tyr Ser Asp
20 25 30
Thr Asn Glu Ser Ile Pro Thr Gln Lys Arg Asn Arg Ile Phe Val Ser
35 40 45
Arg Asp Arg Leu Lys Phe Leu Pro Ala Arg Val Glu Asp Ser Gly Ile
50 55 60
Tyr Ala Cys Val Ile Arg Ser Pro Asn Leu Asn Lys Thr Gly Tyr Leu
65 70 75 80
Asn Val Thr Ile His Lys Lys Pro Pro Ser Cys Asn Ile Pro Asp Tyr
85 90 95
Leu Met Tyr Ser Thr Val Arg Gly Ser Asp Lys Asn Phe Lys Ile Thr
100 105 110
Cys Pro Thr Ile Asp Leu Tyr Asn Trp Thr Ala Pro Val Gln Trp Phe
115 120 125
Lys Asn Cys Lys Ala Leu Gln Glu Pro Arg Phe Arg Ala His Arg Ser
130 135 140
Tyr Leu Phe Ile Asp Asn Val Thr His Asp Asp Glu Gly Asp Tyr Thr
145 150 155 160
Cys Gln Phe Thr His Ala Glu Asn Gly Thr Asn Tyr Ile Val Thr Ala
165 170 175
Thr Arg Ser Phe Thr Val Glu Glu Lys Gly Phe Ser Met Phe Pro Val
180 185 190
Ile Thr Asn Pro Pro Tyr Asn His Thr Met Glu Val Glu Ile Gly Lys
195 200 205
Pro Ala Ser Ile Ala Cys Ser Ala Cys Phe Gly Lys Gly Ser His Phe
210 215 220
Leu Ala Asp Val Leu Trp Gln Ile Asn Lys Thr Val Val Gly Asn Phe
225 230 235 240
Gly Glu Ala Arg Ile Gln Glu Glu Glu Gly Arg Asn Glu Ser Ser Ser
245 250 255
Asn Asp Met Asp Cys Leu Thr Ser Val Leu Arg Ile Thr Gly Val Thr
260 265 270
Glu Lys Asp Leu Ser Leu Glu Tyr Asp Cys Leu Ala Leu Asn Leu His
275 280 285
Gly Met Ile Arg His Thr Ile Arg Leu Arg Arg Lys Gln Pro Ile Asp
290 295 300
His Arg
305
<210> 3
<211> 314
<212> PRT
<213> 猕猴(Macaca mulatta)
<400> 3
Ala Lys Phe Ser Lys Gln Ser Trp Gly Leu Glu Asn Glu Ala Leu Ile
1 5 10 15
Val Arg Cys Pro Arg Gln Gly Lys Pro Ser Tyr Ile Val Asp Trp Tyr
20 25 30
Tyr Ser Gln Thr Asn Lys Ser Ile Pro Thr Gln Glu Arg Asn Arg Val
35 40 45
Phe Ala Ser Gly Gln Leu Leu Lys Phe Leu Pro Ala Glu Val Ala Asp
50 55 60
Ser Gly Ile Tyr Thr Cys Ile Val Arg Ser Pro Thr Phe Asn Arg Thr
65 70 75 80
Gly Tyr Ala Asn Val Thr Ile Tyr Lys Lys Gln Pro Asp Cys Asn Val
85 90 95
Pro Asp Tyr Leu Met Tyr Ser Thr Val Ser Gly Ser Glu Lys Asn Ser
100 105 110
Lys Ile Tyr Cys Pro Thr Ile Asp Leu Tyr Asn Trp Thr Ala Pro Leu
115 120 125
Glu Trp Phe Lys Asn Cys Gln Ala Leu Gln Gly Ser Arg Tyr Lys Ala
130 135 140
His Lys Ser Phe Leu Val Ile Asp Asn Val Met Thr Asp Asp Ala Gly
145 150 155 160
Asp Tyr Thr Cys Lys Phe Ile His Asn Glu Asn Gly Ala Asn Tyr Ser
165 170 175
Val Thr Ala Thr Arg Ser Phe Thr Val Lys Asp Glu Gln Gly Phe Ser
180 185 190
Leu Phe Pro Val Ile Arg Ala Pro Ala His Asn Glu Thr Lys Glu Val
195 200 205
Glu Ile Gly Glu Asn Thr Asn Leu Thr Cys Ser Ala Cys Phe Gly Lys
210 215 220
Gly Ala Gln Phe Leu Ala Thr Val Gln Trp Gln Leu Asn Gly Asn Lys
225 230 235 240
Ile Thr Asp Phe Ser Glu Pro Arg Ile Gln Gln Glu Glu Gly Gln Asn
245 250 255
Gln Ser Phe Ser Asn Gly Leu Ala Cys Val Asn Thr Val Leu Arg Ile
260 265 270
Ala Asp Val Lys Glu Glu Asp Leu Leu Leu Arg Tyr Asp Cys Leu Ala
275 280 285
Leu Asn Leu His Gly Leu Arg Arg His Thr Ile Arg Leu Ser Arg Lys
290 295 300
Asn Pro Ile Asp His Gln Ser Thr Tyr Cys
305 310
<210> 4
<211> 159
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 4
Ser Ile Thr Gly Ile Ser Pro Ile Thr Glu Tyr Leu Ala Ser Leu Ser
1 5 10 15
Thr Tyr Asn Asp Gln Ser Ile Thr Phe Ala Leu Glu Asp Glu Ser Tyr
20 25 30
Glu Ile Tyr Val Glu Asp Leu Lys Lys Asp Glu Lys Lys Asp Lys Val
35 40 45
Leu Leu Ser Tyr Tyr Glu Ser Gln His Pro Ser Asn Glu Ser Gly Asp
50 55 60
Gly Val Asp Gly Lys Met Leu Met Val Thr Leu Ser Pro Thr Lys Asp
65 70 75 80
Phe Trp Leu His Ala Asn Asn Lys Glu His Ser Val Glu Leu His Lys
85 90 95
Cys Glu Lys Pro Leu Pro Asp Gln Ala Phe Phe Val Leu His Asn Met
100 105 110
His Ser Asn Cys Val Ser Phe Glu Cys Lys Thr Asp Pro Gly Val Phe
115 120 125
Ile Gly Val Lys Asp Asn His Leu Ala Leu Ile Lys Val Asp Ser Ser
130 135 140
Glu Asn Leu Cys Thr Glu Asn Ile Leu Phe Lys Leu Ser Glu Thr
145 150 155
<210> 5
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
His His His His His His
1 5
<210> 6
<211> 232
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 6
Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
1 5 10 15
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
20 25 30
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
35 40 45
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
50 55 60
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
65 70 75 80
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
85 90 95
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
100 105 110
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
115 120 125
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr
130 135 140
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
145 150 155 160
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
165 170 175
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
180 185 190
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
195 200 205
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
210 215 220
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
225 230
<210> 7
<211> 232
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 7
Pro Arg Gly Pro Thr Ile Lys Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys Pro Ala
1 5 10 15
Pro Asn Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Ile
20 25 30
Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys Val Val
35 40 45
Val Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe Val
50 55 60
Asn Asn Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg Glu Asp
65 70 75 80
Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His Gln
85 90 95
Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp
100 105 110
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly Ser Val
115 120 125
Arg Ala Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu Met Thr
130 135 140
Lys Lys Gln Val Thr Leu Thr Cys Met Val Thr Asp Phe Met Pro Glu
145 150 155 160
Asp Ile Tyr Val Glu Trp Thr Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu Asn Tyr
165 170 175
Lys Asn Thr Glu Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Met Tyr
180 185 190
Ser Lys Leu Arg Val Glu Lys Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn Ser Tyr
195 200 205
Ser Cys Ser Val Val His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Thr Lys
210 215 220
Ser Phe Ser Arg Thr Pro Gly Lys
225 230
<210> 8
<211> 330
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 8
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 9
<211> 326
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 9
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
115 120 125
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
130 135 140
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
145 150 155 160
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn
165 170 175
Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp
180 185 190
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro
195 200 205
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu
210 215 220
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn
225 230 235 240
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
245 250 255
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
260 265 270
Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
275 280 285
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
290 295 300
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
305 310 315 320
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325
<210> 10
<211> 327
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 10
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
115 120 125
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
130 135 140
Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
145 150 155 160
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
165 170 175
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
180 185 190
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
195 200 205
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
210 215 220
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
225 230 235 240
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
245 250 255
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
260 265 270
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
275 280 285
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
290 295 300
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
305 310 315 320
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
325
<210> 11
<211> 324
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 11
Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala
1 5 10 15
Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Glu Ser Asp Leu Tyr Thr Leu
50 55 60
Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Pro Arg Pro Ser Glu Thr Val
65 70 75 80
Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys
85 90 95
Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro
100 105 110
Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu
115 120 125
Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser
130 135 140
Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu
145 150 155 160
Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr
165 170 175
Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn
180 185 190
Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro
195 200 205
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln
210 215 220
Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val
225 230 235 240
Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val
245 250 255
Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln
260 265 270
Pro Ile Met Asn Thr Asn Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn
275 280 285
Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val
290 295 300
Leu His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His
305 310 315 320
Ser Pro Gly Lys
<210> 12
<211> 330
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 12
Ala Lys Thr Thr Ala Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Val Cys Gly
1 5 10 15
Asp Thr Thr Gly Ser Ser Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Leu Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu
50 55 60
Ser Ser Ser Val Thr Val Thr Ser Ser Thr Trp Pro Ser Gln Ser Ile
65 70 75 80
Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys
85 90 95
Ile Glu Pro Arg Gly Pro Thr Ile Lys Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Asn Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp
145 150 155 160
Phe Val Asn Asn Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg
165 170 175
Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln
180 185 190
His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn
195 200 205
Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly
210 215 220
Ser Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Lys Gln Val Thr Leu Thr Cys Met Val Thr Asp Phe Met
245 250 255
Pro Glu Asp Ile Tyr Val Glu Trp Thr Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu
260 265 270
Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe
275 280 285
Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val Glu Lys Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn
290 295 300
Ser Tyr Ser Cys Ser Val Val His Glu Gly Leu His Asn His His Thr
305 310 315 320
Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr Pro Gly Lys
325 330
<210> 13
<211> 107
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 13
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 14
<211> 106
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 14
Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser
1 5 10 15
Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp
20 25 30
Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro
35 40 45
Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn
50 55 60
Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys
65 70 75 80
Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val
85 90 95
Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
100 105
<210> 15
<211> 107
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 15
Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu
1 5 10 15
Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg
35 40 45
Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu
65 70 75 80
Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser
85 90 95
Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys
100 105
<210> 16
<211> 106
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 16
Gly Gln Pro Lys Ser Ser Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser
1 5 10 15
Glu Glu Leu Glu Thr Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Thr Ile Thr Asp
20 25 30
Phe Tyr Pro Gly Val Val Thr Val Asp Trp Lys Val Asp Gly Thr Pro
35 40 45
Val Thr Gln Gly Met Glu Thr Thr Gln Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn
50 55 60
Lys Tyr Met Ala Ser Ser Tyr Leu Thr Leu Thr Ala Arg Ala Trp Glu
65 70 75 80
Arg His Ser Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly His Thr Val
85 90 95
Glu Lys Ser Leu Ser Arg Ala Asp Cys Ser
100 105
<210> 17
<211> 246
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Leu Thr Glu Leu
20 25 30
Ser Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Phe Gly Pro Glu Asp Gly Glu Thr Ile Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Glu Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ile Asn Glu Asp Ser Gly Gly Leu Phe Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu
130 135 140
Ala Val Ser Leu Gly Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln
145 150 155 160
Ser Val Leu Tyr Ser Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln
165 170 175
Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr
180 185 190
Arg Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr
195 200 205
Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val
210 215 220
Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ser Thr Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly
225 230 235 240
Thr Lys Leu Glu Ile Lys
245
<210> 18
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Leu Thr Glu Leu
20 25 30
Ser Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Phe Gly Pro Glu Asp Gly Glu Thr Ile Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Glu Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ile Asn Glu Asp Ser Gly Gly Leu Phe Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 19
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser
20 25 30
Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Tyr Tyr Ser Thr Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 20
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asn Ser Asp Thr Arg Phe Ser Pro Ser Phe
50 55 60
Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Thr Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg His Gly Thr Ser Ser Asp Tyr Tyr Gly Leu Asp Val Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 21
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asp Asp Asn Phe Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 22
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ile Tyr
20 25 30
Asp Met Ile Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Arg Gly Glu Gly Gly Gly Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Pro Trp Ser Thr Glu Gly Ser Phe Phe Val Leu Asp Tyr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 23
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Asp Asp Asp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ile Thr Ala Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 24
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser
20 25 30
Phe Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Asn Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Ala Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Tyr Tyr Gly Val Pro Gln Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 25
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Asn Leu Leu Trp Asn
20 25 30
Phe Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Tyr Tyr Ser Thr Pro Pro Ser Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Asp Ile
100 105 110
Lys
<210> 26
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Leu Thr Glu Leu
20 25 30
Ser Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Phe Asp Pro Glu Asp Gly Glu Thr Ile Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Ile Thr Leu Thr Glu Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Asn Glu Asp Ser Ser Gly Leu Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 27
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Val Phe Gly Tyr Thr Leu Thr Glu Leu
20 25 30
Ser Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ser Phe Asp Arg Gly Asp Gly Lys Thr Ile Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Leu Gly Arg Val Thr Met Thr Glu Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Asn Glu Asp Ser Ser Gly Leu Phe Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 28
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Leu Thr Glu Leu
20 25 30
Ser Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Phe Gly Pro Glu Asp Gly Glu Ala Ile Tyr Ala Gln Lys Val
50 55 60
Gln Gly Arg Val Ile Leu Ser Glu Asp Thr Ala Thr Asp Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Asn Glu Asp Ser Gly Gly Leu Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 29
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Val Ser Gly His Thr Leu Thr Glu Leu
20 25 30
Ser Ile His Trp Val Arg Gln Thr Pro Gly Lys Gly Leu Val Trp Leu
35 40 45
Gly Gly Phe Glu Ser Glu Asp Gly Glu Ala Ile Tyr Ala Gln Asn Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Ile Met Thr Glu Asp Thr Phe Thr Asp Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Thr Glu Asp Ser Ser Gly Leu Ile Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 30
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
Gln Met Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Phe Asp Pro Glu Asp Gly Glu Thr Ile Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Glu Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Thr Glu Asp Ser Ser Gly Leu Leu Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 31
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser Phe Asn Asn Lys Asn Tyr Leu
1 5 10 15
Ala
<210> 32
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser
1 5
<210> 33
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
Gln Gln Tyr Tyr Gly Val Pro Gln Thr
1 5
<210> 34
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
Lys Ser Ser Gln Asn Leu Leu Trp Asn Phe Asn Asn Lys Asn Tyr Leu
1 5 10 15
Ala
<210> 35
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
Gln Gln Tyr Tyr Ser Thr Pro Pro Ser
1 5
<210> 36
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
Glu Leu Ser Met His
1 5
<210> 37
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
Ser Phe Asp Arg Gly Asp Gly Lys Thr Ile Tyr Ala Gln Lys Phe Leu
1 5 10 15
Gly
<210> 38
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
Glu Asp Ser Ser Gly Leu Phe Asp Phe
1 5
<210> 39
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
Glu Leu Ser Ile His
1 5
<210> 40
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
Gly Phe Gly Pro Glu Asp Gly Glu Ala Ile Tyr Ala Gln Lys Val Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 41
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 41
Glu Asp Ser Gly Gly Leu Phe Asp Tyr
1 5
<210> 42
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 42
Gly Phe Asp Pro Glu Asp Gly Glu Thr Ile Tyr Ala Gln Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 43
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 43
Glu Asp Ser Ser Gly Leu Phe Asp Tyr
1 5
<210> 44
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 44
Gly Phe Glu Ser Glu Asp Gly Glu Ala Ile Tyr Ala Gln Asn Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 45
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 45
Glu Asp Ser Ser Gly Leu Ile Asp Tyr
1 5
<210> 46
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 46
Ser Tyr Ala Ile Ser
1 5
<210> 47
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 47
Glu Asp Ser Ser Gly Leu Leu Asp Phe
1 5
<210> 48
<211> 197
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 48
Arg Asn Leu Pro Val Ala Thr Pro Asp Pro Gly Met Phe Pro Cys Leu
1 5 10 15
His His Ser Gln Asn Leu Leu Arg Ala Val Ser Asn Met Leu Gln Lys
20 25 30
Ala Arg Gln Thr Leu Glu Phe Tyr Pro Cys Thr Ser Glu Glu Ile Asp
35 40 45
His Glu Asp Ile Thr Lys Asp Lys Thr Ser Thr Val Glu Ala Cys Leu
50 55 60
Pro Leu Glu Leu Thr Lys Asn Glu Ser Cys Leu Asn Ser Arg Glu Thr
65 70 75 80
Ser Phe Ile Thr Asn Gly Ser Cys Leu Ala Ser Arg Lys Thr Ser Phe
85 90 95
Met Met Ala Leu Cys Leu Ser Ser Ile Tyr Glu Asp Leu Lys Met Tyr
100 105 110
Gln Val Glu Phe Lys Thr Met Asn Ala Lys Leu Leu Met Asp Pro Lys
115 120 125
Arg Gln Ile Phe Leu Asp Gln Asn Met Leu Ala Val Ile Asp Glu Leu
130 135 140
Met Gln Ala Leu Asn Phe Asn Ser Glu Thr Val Pro Gln Lys Ser Ser
145 150 155 160
Leu Glu Glu Pro Asp Phe Tyr Lys Thr Lys Ile Lys Leu Cys Ile Leu
165 170 175
Leu His Ala Phe Arg Ile Arg Ala Val Thr Ile Asp Arg Val Met Ser
180 185 190
Tyr Leu Asn Ala Ser
195
<210> 49
<211> 138
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 49
Gln Asp Pro Tyr Val Lys Glu Ala Glu Asn Leu Lys Lys Tyr Phe Asn
1 5 10 15
Ala Gly His Ser Asp Val Ala Asp Asn Gly Thr Leu Phe Leu Gly Ile
20 25 30
Leu Lys Asn Trp Lys Glu Glu Ser Asp Arg Lys Ile Met Gln Ser Gln
35 40 45
Ile Val Ser Phe Tyr Phe Lys Leu Phe Lys Asn Phe Lys Asp Asp Gln
50 55 60
Ser Ile Gln Lys Ser Val Glu Thr Ile Lys Glu Asp Met Asn Val Lys
65 70 75 80
Phe Phe Asn Ser Asn Lys Lys Lys Arg Asp Asp Phe Glu Lys Leu Thr
85 90 95
Asn Tyr Ser Val Thr Asp Leu Asn Val Gln Arg Lys Ala Ile His Glu
100 105 110
Leu Ile Gln Val Met Ala Glu Leu Ser Pro Ala Ala Lys Thr Gly Lys
115 120 125
Arg Lys Arg Ser Gln Met Leu Phe Arg Gly
130 135

Claims (10)

1.一种结合人ST2的抗体，其包含含HCDR1、HCDR2和HCDR3氨基酸序列的重链可变区和含LCDR1、LCDR2和LCDR3氨基酸序列的轻链可变区，其中
所述HCDR1氨基酸序列如SEQ ID NO:36、所述HCDR2氨基酸序列如SEQ ID NO:37所示、所述HCDR3氨基酸序列如SEQ ID NO:38所示、所述LCDR1氨基酸序列如SEQ ID NO:31所示、所述LCDR2氨基酸序列如SEQ ID NO:32所示、所述LCDR3氨基酸序列如SEQ ID NO:33所示；或者
所述HCDR1氨基酸序列如SEQ ID NO:39所示，所述HCDR2氨基酸序列如SEQ ID NO:40所示、所述HCDR3氨基酸序列如SEQ ID NO:41所示、所述LCDR1氨基酸序列如SEQ ID NO:31所示、所述LCDR2氨基酸序列如SEQ ID NO:32所示、所述LCDR3氨基酸序列如SEQ ID NO:33所示；或者
所述HCDR1氨基酸序列如SEQ ID NO:39所示、所述HCDR2氨基酸序列如SEQ ID NO:42所示、所述HCDR3氨基酸序列如SEQ ID NO:43所示、所述LCDR1氨基酸序列如SEQ ID NO:31所示、所述LCDR2氨基酸序列如SEQ ID NO:32所示、所述LCDR3氨基酸序列如SEQ ID NO:33所示；或者
所述HCDR1氨基酸序列如SEQ ID NO:39所示、所述HCDR2氨基酸序列如SEQ ID NO:44所示、所述HCDR3氨基酸序列如SEQ ID NO:45所示、所述LCDR1氨基酸序列如SEQ ID NO:31所示、所述LCDR2氨基酸序列如SEQ ID NO:32所示、所述LCDR3氨基酸序列如SEQ ID NO:33所示；或者
所述HCDR1氨基酸序列如SEQ ID NO:46所示、所述HCDR2氨基酸序列如SEQ ID NO:42所示、所述HCDR3氨基酸序列如SEQ ID NO:47所示、所述LCDR1氨基酸序列如SEQ ID NO:31所示、所述LCDR2氨基酸序列如SEQ ID NO:32所示、所述LCDR3氨基酸序列如SEQ ID NO:33所示；或者
所述HCDR1氨基酸序列如SEQ ID NO:36所示、所述HCDR2氨基酸序列如SEQ ID NO:37所示、所述HCDR3氨基酸序列如SEQ ID NO:38所示、所述LCDR1氨基酸序列如SEQ ID NO:34所示、所述LCDR2氨基酸序列如SEQ ID NO:32所示、所述LCDR3氨基酸序列如SEQ ID NO:35所示；或者
所述HCDR1氨基酸序列如SEQ ID NO:39所示、所述HCDR2氨基酸序列如SEQ ID NO:40所示、所述HCDR3氨基酸序列如SEQ ID NO:41所示、所述LCDR1氨基酸序列如SEQ ID NO:34所示、所述LCDR2氨基酸序列如SEQ ID NO:32所示、所述LCDR3氨基酸序列如SEQ ID NO:35所示；或者
所述HCDR1氨基酸序列如SEQ ID NO:39所示、所述HCDR2氨基酸序列如SEQ ID NO:42所示、所述HCDR3氨基酸序列如SEQ ID NO:43所示、所述LCDR1氨基酸序列如SEQ ID NO:34所示、所述LCDR2氨基酸序列如SEQ ID NO:32所示、所述LCDR3氨基酸序列如SEQ ID NO:35所示；或者
所述HCDR1氨基酸序列如SEQ ID NO:39所示、所述HCDR2氨基酸序列如SEQ ID NO:44所示、所述HCDR3氨基酸序列如SEQ ID NO:45所示、所述LCDR1氨基酸序列如SEQ ID NO:34所示、所述LCDR2氨基酸序列如SEQ ID NO:32所示、所述LCDR3氨基酸序列如SEQ ID NO:35所示；或者
所述HCDR1氨基酸序列如SEQ ID NO:46所示、所述HCDR2氨基酸序列如SEQ ID NO:42所示、所述HCDR3氨基酸序列如SEQ ID NO:47所示、所述LCDR1氨基酸序列如SEQ ID NO:34所示、所述LCDR2氨基酸序列如SEQ ID NO:32所示、所述LCDR3氨基酸序列如SEQ ID NO:35所示；
其中HCDR和LCDR氨基酸氨基酸序列根据Kabat定义。
2.根据权利要求1所述的抗体，所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:26、27、28、29或者30所示。
3.根据权利要求1所述的抗体，所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:24或者25所示。
4.根据权利要求1所述的抗体，其中
所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:26所示，所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:24所示；或者
所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:27所示，所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:24所示；或者
所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:28所示，所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:24所示；或者
所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:29所示，所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:24所示；或者
所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:30所示，所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:24所示；或者
所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:26所示，所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:25所示；或者
所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:27所示，所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:25所示；或者
所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:28所示，所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:25所示；或者
所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:29所示，所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:25所示；或者
所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:30所示，所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:25所示。
5.一种结合人ST2的抗体，其中所述抗体的重链可变区的氨基酸序列与SEQ ID NO:26、27、28、29和30中任何一项具有至少90％的一致性，并且所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列与SEQ ID NO:24和25中任何一项具有至少90％的一致性。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的抗体，其中
所述抗体为全抗体、Fab片段、F(ab’)2片段或单链Fv片段(scFv)，优选地，所述抗体为全人源抗体；和/或
所述抗体为单克隆抗体；和/或
所述抗体还包含选自IgG1亚型、IgG2亚型或IgG4亚型的重链恒定区；优选地，所述重链恒定区包含人IgG1亚型重链恒定区的Fc段序列并且所述Fc序列的第234、235和331位的氨基酸序列分别为F、E和S，其中抗体恒定区氨基酸序列顺序按照EU numbering来确定；和/或
所述抗体还包含选自κ亚型或者λ亚型的轻链恒定区。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的抗体所示，其中
所述抗体能够结合重组人ST2(SEQ ID NO:1)、重组鼠ST2(SEQ ID NO:2)和重组猴ST2(SEQ ID NO:3)；和/或
所述抗体能够结合重组人ST2(SEQ ID NO:1)和重组猴ST2(SEQ ID NO:3)；和/或
所述抗体抑制人ST2与人IL-33结合。
8.核酸分子，其编码权利要求1-7中任一项所述的抗体或其抗原结合部分。
9.药物组合物，其包含权利要求1-7中任一项所述的抗体和药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体。
10.权利要求1-7中任一项所述的抗体或权利要求9所述的药物组合物在制备用于预防或治疗ST2介导的疾病的药物中的用途；优选地，所述ST2介导的疾病为自身免疫性疾病或炎性疾病，例如硬皮病、系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、Churg-Strauss综合征、韦格纳肉芽肿(Wegener’s granulomatosis)、肺出血-肾炎综合征、过敏性肺炎、特应性皮炎、哮喘、鼻炎、克罗恩病、强直性脊柱炎、风湿热、纤维肌痛、银屑病关节炎、慢性肾炎、斯耶格伦氏综合征以及多发性硬化等。
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