WO2021147937A1 - 抗st2抗体及其应用 - Google Patents

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WO2021147937A1
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熊新辉
张弢
仲恺
吴伟
黄倩卉
李醒
潘红
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迈威(上海)生物科技股份有限公司
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    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide

Definitions

  • Interleukin 33 is a cytokine related to IL-1 and IL-18, also known as NF-HEV or IL-1F11.
  • ST2 (ST2L, IL-1RL1, T1, Fit-1, DER-4, IL-1R4, or ST2 ⁇ ) is a binding receptor for IL-33. It is a member of the Toll/IL-1 receptor family.
  • IL-33 has been described as an "alarm factor" because it is present in the nucleus of epithelial cells and endothelial cells in a full-length form during homeostasis, but it can be lysed and released during cell necrosis.
  • Examples of cellular responses induced by IL-33 include the production of inflammatory cytokines such as IL-5, IL-6, IL-13, TNF, IFN- ⁇ and GM-CSF, and chemotaxis such as CXCL8, CCL17 and CCL24 Factor generation.
  • IL-33 has also been shown to enhance acute allergic reactions by enhancing the activation of mast cells and basophils triggered by IgE receptor signal transduction or other mast cell and basophil activators.
  • IL-33 can also enhance the recruitment, survival and adhesion properties of immune cells expressing ST2, and therefore has important significance in stimulating and maintaining cellular inflammation in local tissues.
  • Inhibitors against this pathway mainly include: IL33 antibody (such as: MEDI3506, ANB020, REGN3500, MT-2990, LY-3375880, PF-06817024) and ST2 antibody (such as: CNTO7160, AMG-282), these antibodies under investigation are all It is in clinical phase 1 and phase 2, and its indications include allergic rhinitis, atopic dermatitis, chronic obstructive pulmonary disease, asthma, etc.
  • IL33 antibody such as: MEDI3506, ANB020, REGN3500, MT-2990, LY-3375880, PF-06817024
  • ST2 antibody such as: CNTO7160, AMG-282
  • the technical problem to be solved by the present invention is to immunize mice with human ST2 as an immunogen, obtain mouse antibodies through B cell panning, and further obtain new high-affinity antibodies that bind to ST through antibody engineering and humanization technology, and The antibody is suitable for the treatment of diseases or any indications related to the IL-33/ST2 pathway.
  • the purpose of the present invention is to provide an antibody or functional fragment thereof that specifically binds to ST2, and to provide its use.
  • fragment of the antibody of the present invention encompasses various functional fragments or active fragments of the antibody, for example, its antigen-binding portion, such as Fab, F(ab')2 or scFv fragments.
  • (I-2) The heavy chain variable region shown in SEQ ID NO. 2 and the light chain variable region shown in SEQ ID NO. 30;
  • (II-1) The heavy chain variable region shown in SEQ ID NO. 4 and the light chain variable region shown in SEQ ID NO. 32;
  • VI-2 The heavy chain variable region shown in SEQ ID NO.21 and the light chain variable region shown in SEQ ID NO.47;
  • VI-6 The heavy chain variable region shown in SEQ ID NO.23 and the light chain variable region shown in SEQ ID NO.47;
  • VII-1) The heavy chain variable region shown in SEQ ID NO. 25 and the light chain variable region shown in SEQ ID NO. 49;
  • VII-7 The heavy chain variable region shown in SEQ ID NO.27 and the light chain variable region shown in SEQ ID NO.53;
  • the heavy chain variable region and the light chain variable region comprise a heavy chain CDR and a light chain CDR selected from any one of the following combinations:
  • H-CDR1 GYSITSDYAWN
  • H-CDR2 YIDYSGSTTYNPSLKS
  • H-CDR3 TVIDSMDY
  • SEQ ID NO. 56, 63, 70 shown in SEQ ID NO. 56, 63, 70; and, shown in SEQ ID NO. 85, 93 , 97 L-CDR1 (RASKSVSTSGHSYMH), L-CDR2 (LASNLES), L-CDR3 (QHSREFPFT);
  • H-CDR1 GYTFTDSEMY
  • H-CDR2 AIDPETGDTAFNQKFKG
  • H-CDR3 AFDNDNDDGFAY
  • SEQ ID NO.59, 66, 73 shown in SEQ ID NO.89 , 95, 100 L-CDR1 (SASSSVNYMH), L-CDR2 (DTSKLAS), L-CDR3 (QQWSSNPLT);
  • H-CDR1 GYTFTDSEMY
  • H-CDR2 AIDPETGDTAFNQKFKG
  • H-CDR3 AFDNDNDEGFAY
  • SEQ ID NO.59, 66, 74 shown in SEQ ID NO.89 , 95, 100 L-CDR1 (SASSSVNYMH), L-CDR2 (DTSKLAS), L-CDR3 (QQWSSNPLT);
  • H-CDR1 GYTFTDSEMY
  • H-CDR2 AIDPETGDTAFNQKFKG
  • H-CDR3 AFDNDNDDAFAY
  • SEQ ID NO.59, 66, 75 shown in SEQ ID NO.89 , 95, 100 L-CDR1 (SASSSVNYMH), L-CDR2 (DTSKLAS), L-CDR3 (QQWSSNPLT);
  • V-6 H-CDR1 (GYTFTDYELH), H-CDR2 (TIDPETGDTVYNQKFKA), H-CDR3 (AFYNDYDDAFAY) shown in SEQ ID NO. 60, 67, 78; and, shown in SEQ ID NO. 90 , 95, 102 L-CDR1 (SVSSSVSYMH), L-CDR2 (DTSKLAS), L-CDR3 (QQWNTSPLT);
  • VI-3) H-CDR1 (GYRFTDSEMH), H-CDR2 (TIDPETGGTVYNQKFKG), H-CDR3 (AFYNDFDDAFAY) shown in SEQ ID NO. 61, 68, 81 in sequence; and, shown in SEQ ID NO. 91 , 95, 100 L-CDR1 (SASTSVSYMH), L-CDR2 (DTSKLAS), L-CDR3 (QQWSSNPLT);
  • the light chain variable region comprises an amino acid sequence shown in any one of SEQ ID NO. 29 to SEQ ID NO. 53 or an amino acid sequence having at least 75% identity with the amino acid sequence.
  • the antibody or fragment thereof of the present invention comprises a heavy chain variable region and a light chain variable region selected from any one of the following combinations:
  • (I-1) The heavy chain variable region shown in SEQ ID NO. 1 and the light chain variable region shown in SEQ ID NO. 29;
  • (I-2) The heavy chain variable region shown in SEQ ID NO. 2 and the light chain variable region shown in SEQ ID NO. 30;
  • (II-1) The heavy chain variable region shown in SEQ ID NO. 4 and the light chain variable region shown in SEQ ID NO. 32;
  • V-1) The heavy chain variable region shown in SEQ ID NO. 15 and the light chain variable region shown in SEQ ID NO. 42;
  • V-2) the heavy chain variable region shown in SEQ ID NO.16 and the light chain variable region shown in SEQ ID NO.43;
  • V-7 the heavy chain variable region shown in SEQ ID NO.17 and the light chain variable region shown in SEQ ID NO.45;
  • V-8 the heavy chain variable region shown in SEQ ID NO.18 and the light chain variable region shown in SEQ ID NO.43;
  • V-9 The heavy chain variable region shown in SEQ ID NO.18 and the light chain variable region shown in SEQ ID NO.44;
  • V-11 The heavy chain variable region shown in SEQ ID NO.19 and the light chain variable region shown in SEQ ID NO.43;
  • V-12 The heavy chain variable region shown in SEQ ID NO.19 and the light chain variable region shown in SEQ ID NO.44;
  • V-13 The heavy chain variable region shown in SEQ ID NO.19 and the light chain variable region shown in SEQ ID NO.45;
  • VI-1) The heavy chain variable region shown in SEQ ID NO.20 and the light chain variable region shown in SEQ ID NO.46;
  • VI-2 The heavy chain variable region shown in SEQ ID NO.21 and the light chain variable region shown in SEQ ID NO.47;
  • VI-4 The heavy chain variable region shown in SEQ ID NO. 22 and the light chain variable region shown in SEQ ID NO. 47;
  • VI-7 The heavy chain variable region shown in SEQ ID NO.23 and the light chain variable region shown in SEQ ID NO.48;
  • VI-8 The heavy chain variable region shown in SEQ ID NO. 24 and the light chain variable region shown in SEQ ID NO. 47;
  • VI-9 The heavy chain variable region shown in SEQ ID NO. 24 and the light chain variable region shown in SEQ ID NO. 48;
  • VII-2 The heavy chain variable region shown in SEQ ID NO. 26 and the light chain variable region shown in SEQ ID NO. 52;
  • VII-3) The heavy chain variable region shown in SEQ ID NO.26 and the light chain variable region shown in SEQ ID NO.53;
  • VII-4 The heavy chain variable region shown in SEQ ID NO.26 and the light chain variable region shown in SEQ ID NO.50;
  • VII-5 The heavy chain variable region shown in SEQ ID NO.26 and the light chain variable region shown in SEQ ID NO.51;
  • VII-6) The heavy chain variable region shown in SEQ ID NO. 27 and the light chain variable region shown in SEQ ID NO. 52;
  • VII-9 The heavy chain variable region shown in SEQ ID NO.27 and the light chain variable region shown in SEQ ID NO.51;
  • VII-10) The heavy chain variable region shown in SEQ ID NO. 28 and the light chain variable region shown in SEQ ID NO. 52;
  • VI-11 The heavy chain variable region shown in SEQ ID NO. 28 and the light chain variable region shown in SEQ ID NO. 53;
  • VII-12 The heavy chain variable region shown in SEQ ID NO. 28 and the light chain variable region shown in SEQ ID NO. 50;
  • VI-13 The heavy chain variable region shown in SEQ ID NO.28 and the light chain variable region shown in SEQ ID NO.51.
  • the antibody or fragment thereof provided by the present invention binds ST2, preferably mammalian ST2, more preferably primate ST2, further preferably human or cynomolgus ST2, especially human ST2.
  • ST2 preferably mammalian ST2
  • primate ST2 preferably human or cynomolgus ST2, especially human ST2.
  • the fragment is a functionally active fragment of the antibody that can specifically bind to ST2 or any part thereof; more preferably, the fragment is scFv, BsFv, dsFv, (dsFv) 2 , Fab, Fab of the antibody ', F(ab') 2 or Fv fragment.
  • the antibody or fragment thereof comprises a heavy chain constant region selected from IgG, IgA, IgM, IgD or IgE and/or a kappa or lambda light chain constant region.
  • the antibody further comprises a heavy chain constant region, the heavy chain constant region is of the IgG1, IgG2 or IgG4 subtype; or, the antibody further comprises a light chain constant region, the light chain constant The region is of ⁇ type; further preferably, the heavy chain constant region comprises the amino acid sequence shown in SEQ ID NO. 54 or an amino acid sequence having at least 75% identity with the amino acid sequence; the light chain constant region comprises SEQ The amino acid sequence shown in ID NO. 55 or an amino acid sequence having at least 75% identity with the amino acid sequence.
  • the present invention provides the following antibodies:
  • variable region of the heavy chain is shown in SEQ ID NO.11
  • variable region of the light chain is shown in SEQ ID NO.41;
  • variable region of the heavy chain is shown in SEQ ID No. 16
  • variable region of the light chain is shown in SEQ ID No. 44;
  • the heavy chain constant regions of the above antibodies are shown in SEQ ID NO.54, and the light chain constant regions are shown in SEQ ID NO.55.
  • the antibody is a monoclonal antibody, comprising two heavy chains and two light chains.
  • the present invention also provides a conjugate or fusion protein comprising the antibody or fragment thereof of the present invention.
  • the conjugate or fusion protein may include other parts that are bound to the antibody or fragments of the present invention by chemical or physical methods, such as cell surface receptors, small molecule compounds such as amino acids and carbohydrates, small molecule polymers, or other parts of the present invention. Any other part of the antibody that is modified, or even an active protein or polypeptide.
  • the present invention also provides a nucleic acid molecule that encodes the heavy chain CDR, light chain CDR, heavy chain variable region, light chain variable region, heavy chain, or light chain in any antibody or fragment thereof of the present invention.
  • the present invention provides a vector comprising the nucleic acid molecule of the present invention.
  • the vector can be a eukaryotic expression vector, a prokaryotic expression vector, an artificial chromosome, a phage vector, and the like.
  • the antibodies or fragments thereof and corresponding conjugates or fusion proteins, nucleic acid molecules, vectors and/or host cells provided by the present invention can be obtained by using any conventional technical methods known in the art.
  • the antibody or fragments thereof, conjugates or fusion proteins, nucleic acid molecules, vectors and/or host cells can be included in the composition, more particularly in a pharmaceutical composition, such as a pharmaceutical preparation, so as to meet actual needs. Used for various purposes.
  • the present invention also provides a composition comprising the antibody or fragments, conjugates or fusion proteins, nucleic acid molecules, vectors and/or host cells of the present invention.
  • the composition is a pharmaceutical composition, which optionally further comprises pharmaceutically acceptable excipients.
  • the present invention provides the use of the antibody or its fragments, conjugates or fusion proteins, nucleic acid molecules, vectors, host cells and/or compositions in the preparation of drugs for the prevention, treatment or amelioration of diseases; preferably
  • the disease is related to ST2 expression or IL-33/ST2 pathway dysregulation; preferably, the disease is an inflammatory disease or an autoimmune disease; more preferably, the disease is heart failure, allergic rhinitis, rhinitis Polyps, atopic dermatitis, chronic obstructive pulmonary disease, asthma, pulmonary fibrosis, sepsis, inflammatory bowel disease, systemic lupus erythematosus, rheumatoid arthritis, systemic sclerosis, Wegener's granuloma or chemotherapy related Sexual diarrhea.
  • the present invention provides a method for preventing, treating or ameliorating a disease, the method comprising administering the antibody or fragment, conjugate or fusion protein, nucleic acid molecule, or nucleic acid molecule of the present invention to a subject in need thereof
  • the vector, host cell and/or composition, and optionally other drugs or means comprising administering the antibody or fragment, conjugate or fusion protein, nucleic acid molecule, or nucleic acid molecule of the present invention to a subject in need thereof.
  • the optional other drugs or means refer to other hormone drugs or immunomodulatory drugs that can be administered in combination with the antibody or fragments, conjugates or fusion proteins, nucleic acid molecules, vectors, host cells and/or compositions of the present invention or Means, such as glucocorticoids, mepolizumab, dupilumab, Tezepelumab, etc.
  • the combined administration of the two can be carried out in any form, for example, simultaneously, continuously or at a certain time interval.
  • the subject is a mammal, preferably a primate, more preferably a human or cynomolgus monkey; preferably, the subject is a human.
  • human ST2 is used to immunize mice, the culture supernatant is obtained by B cell panning, and positive clones are obtained through ELISA screening and further functional screening; further, mouse antibodies are humanized through antibody engineering. Humanized antibody.
  • human ST2 is used to immunize mice, the culture supernatant is obtained by B cell panning, and positive clones are obtained through ELISA screening and further functional screening; further, mouse antibodies are humanized through antibody engineering. Humanized antibody.
  • the affinity determination of antibodies and the in vivo drug metabolism of animals proved Compared with the existing anti-ST2 antibody, the antibody of the present invention has higher biological activity.
  • Figures 1 to 5 show the inhibition rate of KU812 NF- ⁇ B reporter gene activity of B cell clones from mice with different numbers. Among them, Figure 1: 5883 mice; Figure 2: 5884 mice; Figure 3: 5886 mice; Figure 4: 5887 mice; Figure 5: 5888 mice.
  • Figure 7 shows the binding of murine antibodies to cyno ST2.
  • Figure 8 shows the binding of murine antibodies to mouse ST2.
  • Figure 9 shows that the humanized antibody inhibits IL33 binding to human ST2 activity.
  • Figure 11 shows that the humanized antibody inhibits the KU812-IL5 production activity of oxidized IL33.
  • Figure 12 shows that the humanized antibody inhibits the KU812-IL5 production activity of reduced IL33.
  • Figure 14 shows that the humanized antibody inhibits the IL33-promoting HMC-1IL8 production activity.
  • Figure 15 shows the mouse PK curve of the humanized antibody, where 15-1: 5888-116-H0L1; 15-2: 5888-153-H0L1; 15-3: CNTO7160; 15-4: 5886-156- H1L0.
  • Human ST2-his Human ST2 with 6 histidine tags fused to the C-terminus
  • human ST2-fc Human ST2 with human IgG1Fc tag fused to the C-terminus
  • Human IL33-his Human IL33 with 6 histidine tags fused to the C terminal
  • Oxidized human IL33-his Dilute Human IL-33-his with IMDM to 300 ⁇ g/ml, incubate at 37°C for 18 hours, and then use S75 16:600 Superdex column (GE Healthcare) to purify
  • Control antibody CNTO7160 heavy chain is shown in SEQ ID NO.104, light chain is shown in SEQ ID NO.105
  • Cyno ST2-fc Cyno ST2 with human IgG1Fc tag fused to the C-terminus
  • Mouse ST2-fc Mouse ST2 with human IgG1Fc tag fused to the C-terminus
  • CHO-K1 cells were used to express Human ST2-his, and then 6 BALB/c mice were immunized according to the routine Freund's adjuvant immunization procedure. The immunization was carried out in two batches, with 3 mice in each batch, two weeks apart between the two batches. Each batch of mice was immunized 4 times, and the Human ST2-his was used for ELISA detection. If the titer of the mouse serum is greater than 1:100,000, the final immunization was performed, and the spleen was collected 3-4 days later.
  • the collected spleens of the immunized mice were ground, filtered, and centrifuged, and red blood cells were removed with red blood cell lysate, and repeated until there were no obvious red blood cells; then DC cells in the spleen cells were removed.
  • Splenocytes obtained from a spleen were evenly added to the above-mentioned 6-well plate coated with antigen for panning.
  • B cells after antigen panning were collected and counted with trypsin, and then plated on the above-mentioned feeder cells. In a 96-well plate. Incubate at 37°C and 5% CO 2 for about 10-14 days, and take the B cell culture supernatant that has formed obvious clones in the well for the following screening.
  • the test results showed that the negative control (blank medium) OD value of more than 10 times was used as the positive criterion.
  • the B cell clones from the two mice numbered 5883 and 5884 were tested on the mouse anti-binding human ST2-his ELISA screening results. The positive rate is over 97%.
  • Dilute human IL33-his with culture medium to 1 ⁇ g/mL mix it with B cell culture supernatant 1:1 as a test sample, and prepare a negative control sample (diluted human IL33-his is mixed with blank medium 1:1) and Positive control samples (diluted human IL33-his mixed with 1 ⁇ g/mL CNTO7160 1:1) were added to a 384-well plate at 20 ⁇ L/well.
  • mouse antibody The name of the mouse antibody is expressed by the cell clone number from which the light and heavy chains (H+L) are contained.
  • the mouse antibody "5883-105H+L” means the mouse antibody from the 5883-105 cell clone, and its heavy chain is 5883-105H , The light chain is 5883-105L.
  • Human ST2-his was diluted to 1 ⁇ g/mL with coating buffer, 50 ⁇ L/well was added to a 96-well plate, and coated overnight at 4°C; the next day, the coated plate was taken out and washed with PBST for 3 times; then with blocking solution at room temperature Incubate for 1 h, and then wash 3 times with PBST.
  • Use the diluent to dilute human IL33-his to 200ng/mL use the diluent to dilute the mouse-derived antibody to an initial concentration of 200 ⁇ g/mL, and then dilute it 3 times for a total of 8 concentrations.
  • Mouse anti-IL33 activates KU812 NF- ⁇ B reporter gene activity screening
  • the anti-human ST2 antibody was diluted to 10nM and captured on the surface of protein A chip (capture time 60s). After antibody capture, human ST2-his was injected in the form of a solution (diluted two-fold from 11.8 nM to 0.7375 nM, 5 concentrations in total). The association was monitored for 4 minutes, and the dissociation was monitored for 10 minutes. The sensor surface was regenerated by injecting a pH2.0 glycine solution. The data generated for kinetics and affinity determination were analyzed using BIAevaluation software. The kinetic data is analyzed using a simple 1:1 combination model. The results are shown in Table 5.
  • the capture antibody was coated one day in advance (it is a working solution that is 120 times diluted 240 ⁇ g/mL stock solution (PBS) to 2 ⁇ g/mL), and coated overnight at 4°C, 50 ⁇ L/well.
  • the blocking solution was blocked for 1 hour and washed three times. Dilute the 120ng/mL standard solution 400 times to 300pg/mL, and then dilute it 2 times for a total of 7 concentrations. Take each 50 ⁇ L of cell culture supernatant and the diluted standard solution, add them to the ELISA well plate, and incubate for 2h.
  • Cyno ST2-fc was diluted to 1 ⁇ g/mL with coating buffer, added to a 96-well plate at 50 ⁇ L/well, and coated overnight at 4°C; the next day, the coated plate was taken out and washed with PBST for 3 times; then with blocking solution at room temperature Incubate for 1 h, and then wash 3 times with PBST.
  • Antibody EC 50 (ng/mL) Relative activity (%) 5883-105H+L 29.45 45.67 5886-130H2+L2 19.30 69.69 5886-156H+L 20.26 66.39 5887-30H2+L2 2.31 582.76 5887-41H+L 61.51 21.87 5887-257H2+L1 17.33 77.61 5887-537H3+L1 17.14 78.47 5888-209H+L 15.23 88.31 5888-378H+L 11.91 112.93 5887-127H3+L2 15.78 85.23 5887-167H+L 54.87 44.51 5888-15H2+L2 20.95 116.56 5888-116H1+L1 38.36 63.66 5888-120H2+L1 47.71 51.18 5888-153H1+L2 30.26 80.70 5888-297H1+L1 28.17 86.
  • Mouse ST2-fc was diluted to 1 ⁇ g/mL with coating buffer, added 50 ⁇ L/well into 96-well plate, and coated overnight at 4°C; the next day, the coated plate was taken out and washed with PBST for 3 times; then with blocking solution at room temperature Incubate for 1 h, and then wash 3 times with PBST.
  • Mouse-derived antibody was diluted 3 times starting from 1000ng/mL, and a total of 8 concentrations were added to a 96-well plate at 50 ⁇ L/well; incubated for 1h at room temperature, washed three times with PBST, and added goat anti-mouse secondary antibody (1:10000) at 50 ⁇ L /Well into a 96-well plate; incubate for 1h at room temperature, wash three times with PBST, add TMB to a 96-well plate according to 50 ⁇ L/well, shade for 10min, stop with 2M sulfuric acid 100 ⁇ L/well; read the OD450 value on the microplate reader , The result is shown in Figure 8. It can be seen that the mouse antibody binds to Mouse ST2 weakly, which is consistent with the control antibody CNTO7160.
  • the heavy and light chain variable region sequences of seven murine antibodies were compared with human germline sequences.
  • the comparison was a blast search of the IMGT database. Remove redundant genes and those with unpaired cysteines from this set of human germline genes. In both the framework and the CDR regions, the remaining human germline genes that are the closest match are selected as the recipient human framework.
  • FR-4 was selected based on the sequence similarity of IGHJ/IGJK germline genes. Table 9 to Table 15 are 5886-156H+L, 5887-41H+L, 5887-537H3+L1, 5888-116H1+L1, 5888-153H1+L2, 5888-357H+L, 5888-379H1+L2, etc.
  • the heavy chain constant region shown in SEQ ID NO.54 and the light chain constant region shown in SEQ ID NO.55 were used to construct a humanized light and heavy chain derived from the same mouse antibody, paired and transfected into CHO-K1 cells, and transfected After staining for 24 hours, add 10 ⁇ g/mL MSX for pressurization screening. After the cell density and viability are restored, inoculate for feed-batch expression. The centrifuged supernatant after expression is purified by protein A, and the antibody concentration is quantified by the BCA method for quantification filter.
  • the collocation mode of the humanized antibody and its heavy and light chain variable regions is shown in Table 16 to Table 22.
  • the suffix "ix" indicates that the antibody is a corresponding chimeric antibody.
  • Humanized antibody inhibits IL33 from activating KU812 NF- ⁇ B reporter gene activity
  • Antibody IC 50 (ng/mL) Relative activity Maximum inhibition rate 5886-156-H1L0 477.9 41.91% 92.49% 5887-41-H1L0 55.35 361.88% 89.24% 5888-116-H0L1 13.03 1537.22% 95.74% 5888-153-H0L1 43.78 457.51% 88.24% 5888-153-H1L1 12.36 1620.55% 91.36% 5888-153-H1L2 44.07 454.50% 84.98% 5888-153-H3L1 39.42 508.12% 86.11% 5888-153-H3L2 55.28 362.34% 88.11% CNTO7160 200.3 To 88.24%
  • Antibody IC 50 ( ⁇ g/mL) Relative activity Maximum inhibition rate 5886-156-H1L0 0.7524 194.71% 93.38% 5887-41-H1L0 0.7056 207.62% 78.62% 5888-116-H0L1 0.1245 1176.71% 75.06% 5888-153-H0L1 0.3891 376.51% 83.56% 5888-153-H3L1 0.2646 553.67% 86.93% 5888-153-H3L2 0.5218 280.76% 87.24% 5888-379-H1L0 2.8650 51.13% 96.68% 5888-379-H2L1 2.8650 51.13% 96.68% CNTO7160 1.4650 100.00% 97.30%
  • HUVEC cells were incubated for 18-24h under the conditions of 10,000 cells/well, 100 ⁇ L, 37°C and 5% CO 2 for 18-24 hours. Dilute human IL33-his with culture medium to 10ng/mL, humanized antibody with culture medium to 400 ⁇ g/mL, 4-fold dilution, a total of 11 concentrations, mix the two 1:1 and add 100 ⁇ L/well to the above In a 96-well plate, incubate at 37°C and 5% CO 2 for 18-24 hours.
  • Antibody IC50( ⁇ g/mL) Relative activity Maximum inhibition rate 5886-156-H1L0 4.051 67.29% 87.89% 5887-41-H1L0 1.308 208.41% 93.20% 5888-116-H0L1 0.8321 327.60% 92.61% 5888-153-H0L1 0.8435 323.18% 92.99% 5888-153-H3L1 1.636 166.63% 93.05% 5888-153-H3L2 3.688 73.92% 91.85% 5888-379-H1L0 16.1 16.93% 83.05% 5888-379-H2L1 26.14 10.43% 71.60% CNTO7160 2.726 100.00% 66.59%
  • the capture antibody 120-fold diluted (PBS) working solution
  • the blocking solution was blocked for 1 hour and washed three times.
  • the standard solution was diluted 40 times to 2000pg/mL, and then diluted 2 times for a total of 7 concentrations. Take each 50 ⁇ L of cell culture supernatant and the diluted standard solution, add them to the ELISA well plate, and incubate for 2h. Wash three times, add 60-fold diluted working solution of detection antibody, 50 ⁇ L/well, and incubate for 2h.
  • the anti-human ST2 antibody was diluted to 2 ⁇ g/mL and captured on the surface of the Protein A chip for 60s. After antibody capture, human ST2-his in the form of a solution (initial concentration 20nM, 2-fold dilution with 6 concentrations) was injected. The association was monitored for 180s, and the dissociation was monitored for 700s, and the sensor surface was regenerated by injecting a pH2.0 glycine solution. The kinetic data was analyzed using a 1:1 combination model.
  • the difference is that the dissociation is carried out under the condition of pH5.5 HBS-EP (1 ⁇ ) buffer, and the dissociation is monitored for 600s.
  • mice were randomly divided into 4 groups, 5 mice in each group, and the dosing information is shown in Table 31.
  • mice were administered separately, and the time of administration was recorded.
  • Each group of mice before administration (0hr) and after administration 4hr, 8hr, 24hr (1d), 72hr (3d), 120hr (5d), 168hr (7d), 240hr (10d), 288hr (12d), 336hr (14d) Collect blood separately, collect serum, and store at -60 ⁇ -80°C.
  • mouse PK plasma concentration The detection method of mouse PK plasma concentration is as follows:
  • Stop and read 2M sulfuric acid, 100 ⁇ L/well, tap the plate and mix well. Calculate the concentration of the sample to be tested by reading at 450nm and reference 650nm.

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Abstract

提供了一种结合ST2的抗体或其片段，该抗体或其片段能够特异性结合人ST2，抑制IL-33与人ST2的结合，阻断IL-33/ST2胞内信号通路途径，且抑制不同形式IL-33对细胞IL5、IL6、IL8生成的促进作用，相比于已知抗ST2抗体，具有更高的生物学活性，可用于预防、治疗或改善与ST2表达或IL-33/ST2途径失调相关的疾病。

Description

抗ST2抗体及其应用
本专利申请要求于2020年1月21日提交的申请号为CN202010072085.X的中国发明专利申请的优先权权益，在此将其全部内容引入作为参考。
技术领域
本发明涉及抗体药物领域，具体而言，本发明涉及针对人ST2的抗体及其用于制备药物的用途。
背景技术
白介素33(IL-33)是一种与IL-1和IL-18相关的细胞因子，又被称为NF-HEV或IL-1F11。ST2(ST2L、IL-1RL1、T1、Fit-1、DER-4、IL-1R4或ST2α)是IL-33的一种结合受体，它是Toll/IL-1受体家族成员，在多种免疫细胞的细胞表面上表达，包括淋巴细胞，尤其是表达IL-5和IL-13的辅助性T细胞、天然杀伤(NK)和天然杀伤-T(NKT)细胞，以及很多所谓的先天免疫细胞，例如肥大细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、巨噬细胞和先天辅助性细胞(又名新免疫细胞(nuocyte)(Neill,Wong等人，2010))。
ST2能够下调Toll样受体TLR2、TLR4和TLR9的响应性，但也能经由被其配体IL-33活化及与辅助蛋白IL-1RAcP缔合而诱导2型细胞因子释放。相关文献已提出了ST2、IL-33和IL-1RAcP相互作用以及IL-1R1与IL-1RAcP之间相互作用的模型(Lingel等人，Cell 17:1398-1410，2009；Wang等人，Nat Immunol,11:905-11，2010)。
IL-33已被描述为“警报素”，因为在内稳态过程中其以全长形式存在于上皮细胞和内皮细胞的细胞核中，但在细胞坏死过程中可被裂解并释放。IL-33诱导的细胞反应的实例包括诸如IL-5、IL-6、IL-13、TNF、IFN-γ和GM-CSF的炎性细胞因子的产生，以及诸如CXCL8、CCL17和CCL24的趋化因子的产生。IL-33还展示通过加强由IgE受体信号转导或其它肥大细胞和嗜碱性粒细胞活化剂引发的肥大细胞和嗜碱性粒细胞的活化而增强急性过敏反应。IL-33还会增强表达ST2的免疫细胞的募集、存活和粘附特性，因此在激发和维持局部组织中的细胞炎症方面具有重要意义。
IL-33/ST2途径失调已表明与多种免疫介导的疾病有关，包括哮喘、类 风湿性关节炎、炎性肠病、特应性皮炎、过敏性鼻炎、鼻息肉以及全身性硬化症。因此，治疗性阻断IL-33/ST2途径可有助于克服过免疫反应。针对该通路的抑制剂主要包括：IL33抗体(如：MEDI3506、ANB020、REGN3500、MT-2990、LY-3375880、PF-06817024)和ST2抗体(如：CNTO7160、AMG-282)，这些在研抗体均处于临床1期和2期，针对的适应症包括过敏性鼻炎、特应性皮炎、慢性阻塞性肺病、哮喘等。
目前过敏性炎症和呼吸道疾病发生率逐步增加，而市场上可以提供的药物仍以糖皮质激素和β2受体激动剂为主。目前已报道的抗体虽然都能阻断ST2与配体的相互作用，但所产生的生物学活性有所差异。而生物学活性的不同，可能导致抗体在临床药效和使用剂量上有所差别，因此本领域仍需要提供高亲和力、高稳定性、高生物学活性的ST2抗体。
发明内容
本发明要解决的技术问题是，通过用human ST2作为免疫原免疫小鼠，通过B细胞淘选获得鼠抗体，进一步经抗体工程与人源化技术，获得新的结合ST的高亲和力抗体，并且该抗体适用于治疗与IL-33/ST2途径相关的疾病或任何适应症。
针对上述技术问题，本发明的目的是提供一种特异性结合ST2的抗体或其功能片段，并提供其用途。
本发明的技术方案如下。
本发明所述抗体的“片段”涵盖抗体的各种功能性片段或活性片段，例如其抗原结合部分，如Fab、F(ab’)2或scFv片段。
一方面，本发明提供一种抗体或其片段，所述抗体或其片段包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中所述重链可变区和轻链可变区包含选自以下组合中任一个所示的重链可变区和轻链可变区的重链CDR1(H-CDR1)、CDR2(H-CDR2)、CDR3(H-CDR3)和轻链CDR1(L-CDR1)、CDR2(L-CDR2)、CDR3(L-CDR3)：
(I-1)：SEQ ID NO.1所示的重链可变区和SEQ ID NO.29所示的轻链可变区；
(I-2)：SEQ ID NO.2所示的重链可变区和SEQ ID NO.30所示的轻链可变区；
(I-3)：SEQ ID NO.2所示的重链可变区和SEQ ID NO.31所示的轻链可变区；
(I-4)：SEQ ID NO.3所示的重链可变区和SEQ ID NO.30所示的轻链可变区；
(I-5)：SEQ ID NO.3所示的重链可变区和SEQ ID NO.31所示的轻链可变区；
(II-1)：SEQ ID NO.4所示的重链可变区和SEQ ID NO.32所示的轻链可变区；
(II-2)：SEQ ID NO.5所示的重链可变区和SEQ ID NO.33所示的轻链可变区；
(II-3)：SEQ ID NO.5所示的重链可变区和SEQ ID NO.34所示的轻链可变区；
(II-4)：SEQ ID NO.5所示的重链可变区和SEQ ID NO.35所示的轻链可变区；
(II-5)：SEQ ID NO.6所示的重链可变区和SEQ ID NO.33所示的轻链可变区；
(II-6)：SEQ ID NO.6所示的重链可变区和SEQ ID NO.34所示的轻链可变区；
(II-7)：SEQ ID NO.6所示的重链可变区和SEQ ID NO.35所示的轻链可变区；
(III-1)：SEQ ID NO.7所示的重链可变区和SEQ ID NO.36所示的轻链可变区；
(III-2)：SEQ ID NO.8所示的重链可变区和SEQ ID NO.37所示的轻链可变区；
(III-3)：SEQ ID NO.8所示的重链可变区和SEQ ID NO.38所示的轻链可变区；
(III-4)：SEQ ID NO.9所示的重链可变区和SEQ ID NO.37所示的轻链可变区；
(III-5)：SEQ ID NO.9所示的重链可变区和SEQ ID NO.38所示的轻链可变区；
(IV-1)：SEQ ID NO.10所示的重链可变区和SEQ ID NO.39所示的轻链 可变区；
(IV-2)：SEQ ID NO.11所示的重链可变区和SEQ ID NO.40所示的轻链可变区；
(IV-3)：SEQ ID NO.11所示的重链可变区和SEQ ID NO.41所示的轻链可变区；
(IV-4)：SEQ ID NO.12所示的重链可变区和SEQ ID NO.40所示的轻链可变区；
(IV-5)：SEQ ID NO.12所示的重链可变区和SEQ ID NO.41所示的轻链可变区；
(IV-6)：SEQ ID NO.13所示的重链可变区和SEQ ID NO.40所示的轻链可变区；
(IV-7)：SEQ ID NO.13所示的重链可变区和SEQ ID NO.41所示的轻链可变区；
(IV-8)：SEQ ID NO.14所示的重链可变区和SEQ ID NO.40所示的轻链可变区；
(IV-9)：SEQ ID NO.14所示的重链可变区和SEQ ID NO.41所示的轻链可变区；
(V-1)：SEQ ID NO.15所示的重链可变区和SEQ ID NO.42所示的轻链可变区；
(V-2)：SEQ ID NO.16所示的重链可变区和SEQ ID NO.43所示的轻链可变区；
(V-3)：SEQ ID NO.16所示的重链可变区和SEQ ID NO.44所示的轻链可变区；
(V-4)：SEQ ID NO.16所示的重链可变区和SEQ ID NO.45所示的轻链可变区；
(V-5)：SEQ ID NO.17所示的重链可变区和SEQ ID NO.43所示的轻链可变区；
(V-6)：SEQ ID NO.17所示的重链可变区和SEQ ID NO.44所示的轻链可变区；
(V-7)：SEQ ID NO.17所示的重链可变区和SEQ ID NO.45所示的轻链可变区；
(V-8)：SEQ ID NO.18所示的重链可变区和SEQ ID NO.43所示的轻链可变区；
(V-9)：SEQ ID NO.18所示的重链可变区和SEQ ID NO.44所示的轻链可变区；
(V-10)：SEQ ID NO.18所示的重链可变区和SEQ ID NO.45所示的轻链可变区；
(V-11)：SEQ ID NO.19所示的重链可变区和SEQ ID NO.43所示的轻链可变区；
(V-12)：SEQ ID NO.19所示的重链可变区和SEQ ID NO.44所示的轻链可变区；
(V-13)：SEQ ID NO.19所示的重链可变区和SEQ ID NO.45所示的轻链可变区；
(VI-1)：SEQ ID NO.20所示的重链可变区和SEQ ID NO.46所示的轻链可变区；
(VI-2)：SEQ ID NO.21所示的重链可变区和SEQ ID NO.47所示的轻链可变区；
(VI-3)：SEQ ID NO.21所示的重链可变区和SEQ ID NO.48所示的轻链可变区；
(VI-4)：SEQ ID NO.22所示的重链可变区和SEQ ID NO.47所示的轻链可变区；
(VI-5)：SEQ ID NO.22所示的重链可变区和SEQ ID NO.48所示的轻链可变区；
(VI-6)：SEQ ID NO.23所示的重链可变区和SEQ ID NO.47所示的轻链可变区；
(VI-7)：SEQ ID NO.23所示的重链可变区和SEQ ID NO.48所示的轻链可变区；
(VI-8)：SEQ ID NO.24所示的重链可变区和SEQ ID NO.47所示的轻链可变区；
(VI-9)：SEQ ID NO.24所示的重链可变区和SEQ ID NO.48所示的轻链可变区；
(VII-1)：SEQ ID NO.25所示的重链可变区和SEQ ID NO.49所示的轻 链可变区；
(VII-2)：SEQ ID NO.26所示的重链可变区和SEQ ID NO.52所示的轻链可变区；
(VII-3)：SEQ ID NO.26所示的重链可变区和SEQ ID NO.53所示的轻链可变区；
(VII-4)：SEQ ID NO.26所示的重链可变区和SEQ ID NO.50所示的轻链可变区；
(VII-5)：SEQ ID NO.26所示的重链可变区和SEQ ID NO.51所示的轻链可变区；
(VII-6)：SEQ ID NO.27所示的重链可变区和SEQ ID NO.52所示的轻链可变区；
(VII-7)：SEQ ID NO.27所示的重链可变区和SEQ ID NO.53所示的轻链可变区；
(VII-8)：SEQ ID NO.27所示的重链可变区和SEQ ID NO.50所示的轻链可变区；
(VII-9)：SEQ ID NO.27所示的重链可变区和SEQ ID NO.51所示的轻链可变区；
(VII-10)：SEQ ID NO.28所示的重链可变区和SEQ ID NO.52所示的轻链可变区；
(VII-11)：SEQ ID NO.28所示的重链可变区和SEQ ID NO.53所示的轻链可变区；
(VII-12)：SEQ ID NO.28所示的重链可变区和SEQ ID NO.50所示的轻链可变区；
(VII-13)：SEQ ID NO.28所示的重链可变区和SEQ ID NO.51所示的轻链可变区。
基于上述给定轻、重链可变区的氨基酸序列，本领域技术人员可以常规地确定其中包含的重链CDR和轻链CDR的氨基酸序列。例如，根据本发明的具体实施方式，采用Kabat、IMGT、ABM及Chotia编码方法划分可变区氨基酸序列中的CDR。以本领域其他已知方法划分得到的轻重链CDR及其组合也被涵盖在本发明的范围内。
优选地，所述重链可变区和所述轻链可变区包含选自以下组合中任一个 所示的重链CDR和轻链CDR：
(I)：依次示于SEQ ID NO.56、63、70的H-CDR1(GYSITSDYAWN)、H-CDR2(YIDYSGSTTYNPSLKS)、H-CDR3(TVIDSMDY)；和，依次示于SEQ ID NO.85、93、97的L-CDR1(RASKSVSTSGHSYMH)、L-CDR2(LASNLES)、L-CDR3(QHSREFPFT)；
(II-1)：依次示于SEQ ID NO.57、64、71的H-CDR1(GYSITSDYAWD)、H-CDR2(YIRYSGDTYYNPSLKS)、H-CDR3(TMMDTMDY)；和，依次示于SEQ ID NO.86、93、98的L-CDR1(RASKSVSTSGNSYMH)、L-CDR2(LASNLES)、L-CDR3(QHSREFPLT)；
(II-2)：依次示于SEQ ID NO.57、64、71的H-CDR1(GYSITSDYAWD)、H-CDR2(YIRYSGDTYYNPSLKS)、H-CDR3(TMMDTMDY)；和，依次示于SEQ ID NO.87、93、98的L-CDR1(RASKSVSTSGNTYMH)、L-CDR2(LASNLES)、L-CDR3(QHSREFPLT)；
(III)：依次示于SEQ ID NO.58、65、72的H-CDR1(GFSLSTSGMGVG)、H-CDR2(HIWWDDVKQYNPALKS)、H-CDR3(IGGDYDYFDF)；和，依次示于SEQ ID NO.88、94、99的L-CDR1(RASESVEYSGTSLMQ)、L-CDR2(VASNVES)、L-CDR3(QQSRKVPWT)；
(IV-1)：依次示于SEQ ID NO.59、66、73的H-CDR1(GYTFTDSEMY)、H-CDR2(AIDPETGDTAFNQKFKG)、H-CDR3(AFDNDNDDGFAY)；和，依次示于SEQ ID NO.89、95、100的L-CDR1(SASSSVNYMH)、L-CDR2(DTSKLAS)、L-CDR3(QQWSSNPLT)；
(IV-2)：依次示于SEQ ID NO.59、66、74的H-CDR1(GYTFTDSEMY)、H-CDR2(AIDPETGDTAFNQKFKG)、H-CDR3(AFDNDNDEGFAY)；和，依次示于SEQ ID NO.89、95、100的L-CDR1(SASSSVNYMH)、L-CDR2(DTSKLAS)、L-CDR3(QQWSSNPLT)；
(IV-3)：依次示于SEQ ID NO.59、66、75的H-CDR1(GYTFTDSEMY)、H-CDR2(AIDPETGDTAFNQKFKG)、H-CDR3(AFDNDNDDAFAY)；和，依次示于SEQ ID NO.89、95、100的L-CDR1(SASSSVNYMH)、L-CDR2(DTSKLAS)、L-CDR3(QQWSSNPLT)；
(V-1)：依次示于SEQ ID NO.60、67、76的H-CDR1(GYTFTDYELH)、H-CDR2(TIDPETGDTVYNQKFKA)、H-CDR3(AFYNDYDDGFAY)；和， 依次示于SEQ ID NO.90、95、101的L-CDR1(SVSSSVSYMH)、L-CDR2(DTSKLAS)、L-CDR3(QQWNSSPLT)；
(V-2)：依次示于SEQ ID NO.60、67、76的H-CDR1(GYTFTDYELH)、H-CDR2(TIDPETGDTVYNQKFKA)、H-CDR3(AFYNDYDDGFAY)；和，依次示于SEQ ID NO.90、95、102的L-CDR1(SVSSSVSYMH)、L-CDR2(DTSKLAS)、L-CDR3(QQWNTSPLT)；
(V-3)：依次示于SEQ ID NO.60、67、77的H-CDR1(GYTFTDYELH)、H-CDR2(TIDPETGDTVYNQKFKA)、H-CDR3(AFYNDYDEGFAY)；和，依次示于SEQ ID NO.90、95、101的L-CDR1(SVSSSVSYMH)、L-CDR2(DTSKLAS)、L-CDR3(QQWNSSPLT)；
(V-4)：依次示于SEQ ID NO.60、67、77的H-CDR1(GYTFTDYELH)、H-CDR2(TIDPETGDTVYNQKFKA)、H-CDR3(AFYNDYDEGFAY)；和，依次示于SEQ ID NO.90、95、102的L-CDR1(SVSSSVSYMH)、L-CDR2(DTSKLAS)、L-CDR3(QQWNTSPLT)；
(V-5)：依次示于SEQ ID NO.60、67、78的H-CDR1(GYTFTDYELH)、H-CDR2(TIDPETGDTVYNQKFKA)、H-CDR3(AFYNDYDDAFAY)；和，依次示于SEQ ID NO.90、95、101的L-CDR1(SVSSSVSYMH)、L-CDR2(DTSKLAS)、L-CDR3(QQWNSSPLT)；
(V-6)：依次示于SEQ ID NO.60、67、78的H-CDR1(GYTFTDYELH)、H-CDR2(TIDPETGDTVYNQKFKA)、H-CDR3(AFYNDYDDAFAY)；和，依次示于SEQ ID NO.90、95、102的L-CDR1(SVSSSVSYMH)、L-CDR2(DTSKLAS)、L-CDR3(QQWNTSPLT)；
(VI-1)：依次示于SEQ ID NO.61、68、79的H-CDR1(GYRFTDSEMH)、H-CDR2(TIDPETGGTVYNQKFKG)、H-CDR3(AFYNDFDDGFAY)；和，依次示于SEQ ID NO.91、95、100的L-CDR1(SASTSVSYMH)、L-CDR2(DTSKLAS)、L-CDR3(QQWSSNPLT)；
(VI-2)：依次示于SEQ ID NO.61、68、80的H-CDR1(GYRFTDSEMH)、H-CDR2(TIDPETGGTVYNQKFKG)、H-CDR3(AFYNDFDEGFAY)；和，依次示于SEQ ID NO.91、95、100的L-CDR1(SASTSVSYMH)、L-CDR2(DTSKLAS)、L-CDR3(QQWSSNPLT)；
(VI-3)：依次示于SEQ ID NO.61、68、81的H-CDR1(GYRFTDSEMH)、 H-CDR2(TIDPETGGTVYNQKFKG)、H-CDR3(AFYNDFDDAFAY)；和，依次示于SEQ ID NO.91、95、100的L-CDR1(SASTSVSYMH)、L-CDR2(DTSKLAS)、L-CDR3(QQWSSNPLT)；
(VII-1)：依次示于SEQ ID NO.62、69、82的H-CDR1(GYTFINYGMN)、H-CDR2(WINTYIGEPTYGDNFKG)、H-CDR3(EGDGFAY)；和，依次示于SEQ ID NO.92、96、103的L-CDR1(KSSQSLLYSGNQNNYLA)、L-CDR2(GASTRES)、L-CDR3(QNDHSYPYT)；
(VII-2)：依次示于SEQ ID NO.62、69、83的H-CDR1(GYTFINYGMN)、H-CDR2(WINTYIGEPTYGDNFKG)、H-CDR3(EGEGFAY)；和，依次示于SEQ ID NO.92、96、103的L-CDR1(KSSQSLLYSGNQNNYLA)、L-CDR2(GASTRES)、L-CDR3(QNDHSYPYT)；
(VII-3)：依次示于SEQ ID NO.62、69、84的H-CDR1(GYTFINYGMN)、H-CDR2(WINTYIGEPTYGDNFKG)、H-CDR3(EGDAFAY)；和，依次示于SEQ ID NO.92、96、103的L-CDR1(KSSQSLLYSGNQNNYLA)、L-CDR2(GASTRES)、L-CDR3(QNDHSYPYT)。
特别地，本发明的抗体或其片段至少包含重链可变区和轻链可变区，二者均包括上述CDR以及间隔的框架区(frame work)，重链可变区和轻链可变区中各个结构域的排列方式分别为：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。进一步可选地，所述“至少75％同一性”导致的氨基酸序列的至多25％差异可存在于重链可变区或轻链可变区中的任意框架区中，或者存在于本发明的抗体或其片段中重链可变区和轻链可变区以外的任意结构域或序列中。所述差异可以由任何位置的氨基酸缺失、添加或置换产生，其中置换可以是保守置换或非保守置换。
优选地，所述重链可变区包含SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.28中任一个所示的氨基酸序列或者与所述氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；和/或，
所述轻链可变区包含SEQ ID NO.29至SEQ ID NO.53中任一个所示的氨基酸序列或者与所述氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列。
根据本发明的具体实施方式，本发明的抗体或其片段包含选自以下组合中任一个所示的重链可变区和轻链可变区：
(I-1)：SEQ ID NO.1所示的重链可变区和SEQ ID NO.29所示的轻链可 变区；
(I-2)：SEQ ID NO.2所示的重链可变区和SEQ ID NO.30所示的轻链可变区；
(I-3)：SEQ ID NO.2所示的重链可变区和SEQ ID NO.31所示的轻链可变区；
(I-4)：SEQ ID NO.3所示的重链可变区和SEQ ID NO.30所示的轻链可变区；
(I-5)：SEQ ID NO.3所示的重链可变区和SEQ ID NO.31所示的轻链可变区；
(II-1)：SEQ ID NO.4所示的重链可变区和SEQ ID NO.32所示的轻链可变区；
(II-2)：SEQ ID NO.5所示的重链可变区和SEQ ID NO.33所示的轻链可变区；
(II-3)：SEQ ID NO.5所示的重链可变区和SEQ ID NO.34所示的轻链可变区；
(II-4)：SEQ ID NO.5所示的重链可变区和SEQ ID NO.35所示的轻链可变区；
(II-5)：SEQ ID NO.6所示的重链可变区和SEQ ID NO.33所示的轻链可变区；
(II-6)：SEQ ID NO.6所示的重链可变区和SEQ ID NO.34所示的轻链可变区；
(II-7)：SEQ ID NO.6所示的重链可变区和SEQ ID NO.35所示的轻链可变区；
(III-1)：SEQ ID NO.7所示的重链可变区和SEQ ID NO.36所示的轻链可变区；
(III-2)：SEQ ID NO.8所示的重链可变区和SEQ ID NO.37所示的轻链可变区；
(III-3)：SEQ ID NO.8所示的重链可变区和SEQ ID NO.38所示的轻链可变区；
(III-4)：SEQ ID NO.9所示的重链可变区和SEQ ID NO.37所示的轻链可变区；
(III-5)：SEQ ID NO.9所示的重链可变区和SEQ ID NO.38所示的轻链可变区；
(IV-1)：SEQ ID NO.10所示的重链可变区和SEQ ID NO.39所示的轻链可变区；
(IV-2)：SEQ ID NO.11所示的重链可变区和SEQ ID NO.40所示的轻链可变区；
(IV-3)：SEQ ID NO.11所示的重链可变区和SEQ ID NO.41所示的轻链可变区；
(IV-4)：SEQ ID NO.12所示的重链可变区和SEQ ID NO.40所示的轻链可变区；
(IV-5)：SEQ ID NO.12所示的重链可变区和SEQ ID NO.41所示的轻链可变区；
(IV-6)：SEQ ID NO.13所示的重链可变区和SEQ ID NO.40所示的轻链可变区；
(IV-7)：SEQ ID NO.13所示的重链可变区和SEQ ID NO.41所示的轻链可变区；
(IV-8)：SEQ ID NO.14所示的重链可变区和SEQ ID NO.40所示的轻链可变区；
(IV-9)：SEQ ID NO.14所示的重链可变区和SEQ ID NO.41所示的轻链可变区；
(V-1)：SEQ ID NO.15所示的重链可变区和SEQ ID NO.42所示的轻链可变区；
(V-2)：SEQ ID NO.16所示的重链可变区和SEQ ID NO.43所示的轻链可变区；
(V-3)：SEQ ID NO.16所示的重链可变区和SEQ ID NO.44所示的轻链可变区；
(V-4)：SEQ ID NO.16所示的重链可变区和SEQ ID NO.45所示的轻链可变区；
(V-5)：SEQ ID NO.17所示的重链可变区和SEQ ID NO.43所示的轻链可变区；
(V-6)：SEQ ID NO.17所示的重链可变区和SEQ ID NO.44所示的轻链 可变区；
(V-7)：SEQ ID NO.17所示的重链可变区和SEQ ID NO.45所示的轻链可变区；
(V-8)：SEQ ID NO.18所示的重链可变区和SEQ ID NO.43所示的轻链可变区；
(V-9)：SEQ ID NO.18所示的重链可变区和SEQ ID NO.44所示的轻链可变区；
(V-10)：SEQ ID NO.18所示的重链可变区和SEQ ID NO.45所示的轻链可变区；
(V-11)：SEQ ID NO.19所示的重链可变区和SEQ ID NO.43所示的轻链可变区；
(V-12)：SEQ ID NO.19所示的重链可变区和SEQ ID NO.44所示的轻链可变区；
(V-13)：SEQ ID NO.19所示的重链可变区和SEQ ID NO.45所示的轻链可变区；
(VI-1)：SEQ ID NO.20所示的重链可变区和SEQ ID NO.46所示的轻链可变区；
(VI-2)：SEQ ID NO.21所示的重链可变区和SEQ ID NO.47所示的轻链可变区；
(VI-3)：SEQ ID NO.21所示的重链可变区和SEQ ID NO.48所示的轻链可变区；
(VI-4)：SEQ ID NO.22所示的重链可变区和SEQ ID NO.47所示的轻链可变区；
(VI-5)：SEQ ID NO.22所示的重链可变区和SEQ ID NO.48所示的轻链可变区；
(VI-6)：SEQ ID NO.23所示的重链可变区和SEQ ID NO.47所示的轻链可变区；
(VI-7)：SEQ ID NO.23所示的重链可变区和SEQ ID NO.48所示的轻链可变区；
(VI-8)：SEQ ID NO.24所示的重链可变区和SEQ ID NO.47所示的轻链可变区；
(VI-9)：SEQ ID NO.24所示的重链可变区和SEQ ID NO.48所示的轻链可变区；
(VII-1)：SEQ ID NO.25所示的重链可变区和SEQ ID NO.49所示的轻链可变区；
(VII-2)：SEQ ID NO.26所示的重链可变区和SEQ ID NO.52所示的轻链可变区；
(VII-3)：SEQ ID NO.26所示的重链可变区和SEQ ID NO.53所示的轻链可变区；
(VII-4)：SEQ ID NO.26所示的重链可变区和SEQ ID NO.50所示的轻链可变区；
(VII-5)：SEQ ID NO.26所示的重链可变区和SEQ ID NO.51所示的轻链可变区；
(VII-6)：SEQ ID NO.27所示的重链可变区和SEQ ID NO.52所示的轻链可变区；
(VII-7)：SEQ ID NO.27所示的重链可变区和SEQ ID NO.53所示的轻链可变区；
(VII-8)：SEQ ID NO.27所示的重链可变区和SEQ ID NO.50所示的轻链可变区；
(VII-9)：SEQ ID NO.27所示的重链可变区和SEQ ID NO.51所示的轻链可变区；
(VII-10)：SEQ ID NO.28所示的重链可变区和SEQ ID NO.52所示的轻链可变区；
(VII-11)：SEQ ID NO.28所示的重链可变区和SEQ ID NO.53所示的轻链可变区；
(VII-12)：SEQ ID NO.28所示的重链可变区和SEQ ID NO.50所示的轻链可变区；
(VII-13)：SEQ ID NO.28所示的重链可变区和SEQ ID NO.51所示的轻链可变区。
本发明提供的抗体或其片段结合ST2，优选哺乳动物ST2，更优选灵长类动物ST2，进一步优选人或食蟹猴ST2，特别是人ST2。实验证明，本发明提供的抗体具有以下活性：
(1)特异性结合human ST2；
(2)抑制IL-33与human ST2的结合；
(3)阻断IL-33/ST2胞内信号通路途径；
(4)抑制不同形式IL-33对细胞IL5生成的促进作用；
(5)抑制IL-33对细胞IL5、IL6、IL8生成的促进作用；
(6)具有较长体内半衰期。
一般而言，本发明提供的抗体或其片段为单克隆抗体、单链抗体、双功能抗体、单域抗体、纳米抗体、完全或部分人源化的抗体或者嵌合抗体等任意形式或其片段；优选地，所述抗体为IgA、IgD、IgE、IgG或IgM，更优选为IgG1、IgG2或IgG4；
优选地，所述片段为所述抗体能够特异性结合ST2或其任何部分的功能活性片段；更优选地，所述片段为所述抗体的scFv、BsFv、dsFv、(dsFv) 2、Fab、Fab'、F(ab') 2或Fv片段。
进一步优选地，所述抗体或其片段还包含人或鼠源的恒定区，优选包含人或鼠源的重链恒定区(CH)和/或轻链恒定区(CL)。优选地，所述抗体或其片段包含重链和轻链；更优选地，所述抗体包含两条重链和两条轻链。
优选地，所述抗体或其片段包含选自IgG、IgA、IgM、IgD或IgE的重链恒定区和/或κ或λ型轻链恒定区。根据本发明的具体实施方式，所述抗体还包含重链恒定区，所述重链恒定区为IgG1、IgG2或IgG4亚型；或者，所述抗体还包含轻链恒定区，所述轻链恒定区为κ型；进一步优选地，所述重链恒定区包含SEQ ID NO.54所示的氨基酸序列或者与所述氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；所述轻链恒定区包含SEQ ID NO.55所示氨基酸序列或者与所述氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列。
本发明上下文所述的“至少75％同一性”可以为至少75％、至少80％、优选至少85％、更优选至少90％、进一步优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或甚至99％同一性等≥75％的任何百分比的同一性。
根据本发明的具体实施方式，特别优选地，本发明提供如下抗体：
命名为“5888-116-H0L1”的抗体，重链可变区示于SEQ ID NO.11，轻链可变区示于SEQ ID NO.41；
命名为“5888-153-H0L1”的抗体，重链可变区示于SEQ ID NO.16，轻链可变区示于SEQ ID NO.44；
命名为“5886-156-H1L0”的抗体，重链可变区示于SEQ ID NO.3，轻链可变区示于SEQ ID NO.30；
上述抗体的重链恒定区均示于SEQ ID NO.54，轻链恒定区均示于SEQ ID NO.55。所述抗体为单克隆抗体，包含两条重链和两条轻链。
基于本发明的抗体或其片段，本发明还提供包含本发明的抗体或其片段的缀合物或融合蛋白。该缀合物或融合蛋白可包含通过化学或物理方法结合于本发明所述抗体或其片段的其他部分，例如细胞表面受体、小分子化合物如氨基酸和糖类、小分子聚合物或对本发明所述抗体进行修饰的任何其它部分，或者甚至是活性蛋白或多肽。
另一方面，本发明还提供一种核酸分子，其编码本发明任意抗体或其片段中的重链CDR、轻链CDR、重链可变区、轻链可变区、重链或轻链。
还一方面，本发明提供一种载体，其包含本发明的核酸分子。所述载体可以为真核表达载体、原核表达载体、人工染色体及噬菌体载体等。
本发明的载体或核酸分子可以用于转化或转染宿主细胞或以任何方式进入宿主细胞内，用于保存或表达抗体等目的。因此，另一方面，本发明提供一种宿主细胞，所述宿主细胞包含本发明的核酸分子和/或载体，或者所述宿主细胞被本发明的核酸分子和/或载体转化或转染。宿主细胞可以是任何原核或真核细胞，例如细菌或昆虫、真菌、植物或动物细胞。
基于本发明的公开内容，本发明提供的抗体或其片段以及相应的缀合物或融合蛋白、核酸分子、载体和/或宿主细胞可以通过使用本领域已知的任何常规技术方法获得。所述抗体或其片段、缀合物或融合蛋白、核酸分子、载体和/或宿主细胞可以被包含在组合物中，更特别地被包含在药物组合物、例如药物制剂中，从而根据实际需要用于各种目的。
因此，在又一方面，本发明还提供一种组合物，所述组合物包含本发明所述的抗体或其片段、缀合物或融合蛋白、核酸分子、载体和/或宿主细胞。优选地，所述组合物为药物组合物，其任选地还包含药学上可接受的辅料。
作为特异性结合ST2或其任何部分的抗体或其片段，本发明还提供上述主题的相关应用。包括：
再一方面，本发明提供所述抗体或其片段、缀合物或融合蛋白、核酸分子、载体、宿主细胞和/或组合物在制备用于预防、治疗或改善疾病的药物中的用途；优选地，所述疾病与ST2表达或IL-33/ST2途径失调相关；优选地， 所述疾病为炎性疾病或自身免疫性疾病；更优选地，所述疾病为心力衰竭、过敏性鼻炎、鼻息肉、特应性皮炎、慢性阻塞性肺病、哮喘、肺纤维化、败血症、炎性肠病、系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、全身性硬化症、韦格纳氏肉芽肿或化疗相关性腹泻。
另外，本发明提供一种用于预防、治疗或改善疾病的方法，所述方法包括给有此需要的受试者施用本发明所述抗体或其片段、缀合物或融合蛋白、核酸分子、载体、宿主细胞和/或组合物，以及任选的其他药物或手段。优选地，所述疾病与ST2表达或IL-33/ST2途径失调相关；优选地，所述疾病为炎性疾病或自身免疫性疾病；更优选地，所述疾病为心力衰竭、过敏性鼻炎、鼻息肉、特应性皮炎、慢性阻塞性肺病、哮喘、肺纤维化、败血症、炎性肠病、系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、全身性硬化症、韦格纳氏肉芽肿或化疗相关性腹泻。该任选的其他药物或手段是指可以与本发明抗体或其片段、缀合物或融合蛋白、核酸分子、载体、宿主细胞和/或组合物联合施用的其他激素类药物或免疫调节药物或手段，例如糖皮质激素、美泊利单抗、dupilumab、Tezepelumab等。二者的联合施用可以采取任意形式进行，例如同时、连续或间隔一定时间进行。所述受试者为哺乳类动物，优选灵长类动物，进一步优选人或食蟹猴；优选地，所述受试者为人。
相应地，本发明还提供一种药物组合，其包含本发明所述抗体或其片段、缀合物或融合蛋白、核酸分子、载体、宿主细胞和/或组合物，和任选的其他药物。该任选的其他药物是指可以与本发明抗体或其片段、缀合物或融合蛋白、核酸分子、载体、宿主细胞和/或组合物联合施用的其他激素类药物或免疫调节药物，例如糖皮质激素、美泊利单抗、dupilumab、Tezepelumab等。
本发明还提供一种检测或诊断疾病的方法，所述方法包括使所述抗体或其片段、缀合物或融合蛋白、核酸分子、载体、宿主细胞和/或组合物与来自受试者的样品相接触。优选地，所述疾病与ST2表达或IL-33/ST2途径失调相关；优选地，所述疾病为炎性疾病或自身免疫性疾病；更优选地，所述疾病为心力衰竭、过敏性鼻炎、鼻息肉、特应性皮炎、慢性阻塞性肺病、哮喘、肺纤维化、败血症、炎性肠病、系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、全身性硬化症、韦格纳氏肉芽肿或化疗相关性腹泻。所述受试者为哺乳类动物，优选灵长类动物，进一步优选人或食蟹猴；优选地，所述受试者为人。
又一方面，本发明提供一种试剂盒，所述试剂盒包括本发明所述的抗 体或其片段、缀合物或融合蛋白、核酸分子、载体、宿主细胞和/或组合物。所述试剂盒可用于检测或诊断目的，例如用于上述检测或诊断疾病的方法中。
在本发明中，利用人ST2免疫小鼠，通过B细胞淘选获得培养上清，并经由ELISA筛选与进一步的功能筛选获得阳性克隆；进一步地，经由抗体工程对鼠抗进行人源化获得了人源化抗体。通过抗体的体外与配体结合、体外抑制配体激活效应细胞、体外抑制配体促效应细胞产生IL5、IL6和IL8等活性筛选实验，对抗体的亲和力测定以及动物体内药物代谢等实验，证明了与现有抗ST2抗体相比，本发明的抗体具有更高的生物学活性。
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
图1至图5示出了来自不同编号的小鼠的B细胞克隆的KU812 NF-κB报告基因活性抑制率。其中，图1：5883小鼠；图2：5884小鼠；图3：5886小鼠；图4：5887小鼠；图5：5888小鼠。
图6示出了鼠源抗体抑制IL33促KU812-IL5生成活性。
图7示出了鼠源抗体与cyno ST2的结合。
图8示出了鼠源抗体与mouse ST2的结合。
图9示出了人源化抗体抑制IL33结合human ST2活性。
图10示出了人源化抗体抑制IL33促KU812-IL5生成活性。
图11示出了人源化抗体抑制氧化型IL33促KU812-IL5生成活性。
图12示出了人源化抗体抑制还原型IL33促KU812-IL5生成活性。
图13示出了人源化抗体抑制IL33促HUVEC-IL6生成活性。
图14示出了人源化抗体抑制IL33促HMC-1IL8生成活性。
图15示出了人源化抗体的小鼠PK曲线，其中15-1：5888-116-H0L1；15-2：5888-153-H0L1；15-3：CNTO7160；15-4：5886-156-H1L0。
实施发明的最佳方式
以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施 例中所用的药材原料、试剂材料等，如无特殊说明，均为市售购买产品。
Human ST2：NP_003847.2(Met1-Phe328)
Human ST2-his：C末端融合了6个组氨酸标签的Human ST2
human ST2-fc：C末端融合了human IgG1Fc标签的Human ST2
Human IL33：NP_254274.1(Ser112-Thr270)
Human IL33-his：C末端融合了6个组氨酸标签的Human IL33
氧化型human IL33-his：将Human IL-33-his使用IMDM稀释到300μg/ml，在37℃下孵育18小时，然后使用S75 16:600Superdex column(GE Healthcare)纯化
还原型human IL33-his：Human IL33-his，具有Cys208Ser和Cys259Ser
对照抗体CNTO7160：重链示于SEQ ID NO.104，轻链示于SEQ ID NO.105
Cyno ST2：XP_005575214.1(Met1-Cys331)
Cyno ST2-fc：C末端融合了human IgG1Fc标签的Cyno ST2
Mouse ST2：NP_001020773.1(Met1-Arg332)
Mouse ST2-fc：C末端融合了human IgG1Fc标签的Mouse ST2
实施例1：鼠源抗体筛选
1.1动物免疫
采用CHO-K1细胞表达Human ST2-his，然后按照常规弗氏佐剂免疫程序免疫6只BALB/c小鼠。分两批进行免疫，每批免疫3只小鼠，两批之间间隔两周。每批小鼠进行4次免疫，用该Human ST2-his进行ELISA检测，如果小鼠血清效价>1:100,000，则进行终免，3-4天之后收集脾脏。
1.2 B细胞淘选及培养
在进行正式实验前2d将饲养细胞使用培养基铺到4个10cm培养皿(Corning,cat.430167)中，在正式实验前1d使用25μg/mL MMC对饲养细胞处理6h，然后按照10000个细胞/孔铺96孔板(Corning,cat.3599)，100μL/孔；同时使用6孔板包被抗原Human ST2-his，4℃包被过夜。
将收集的免疫后小鼠脾脏研磨过滤离心，采用红细胞裂解液去除红细胞，多次反复直到无明显红细胞；然后去除脾细胞中的DC细胞。将一个脾脏获得的脾细胞均匀加入铺到上述已经包被抗原的6孔板中进行淘选，用胰 酶将经过抗原淘选后的B细胞收集下来计数，并铺到上述已经铺有饲养细胞的96孔板中。37℃、5％CO 2培养10-14d左右，取孔内已经形成明显克隆的B细胞培养上清进行以下筛选。
1.3鼠抗上清筛选
(1)鼠抗结合Human ST2-his ELISA筛选：
将上述的免疫原Human ST2-his采用包被缓冲液稀释到1μg/mL，50μL/孔，4℃包被过夜；第二天将包被板取出用PBST洗涤3次，再用封闭液室温孵育1h，PBST再洗涤3次，将B细胞上清加入到ELISA板中；室温孵育1h，PBST洗涤三次，加入羊抗鼠二抗(1:10000)，50μL/孔；室温孵育1h，PBST洗涤三次，加入TMB 50μL/孔，避光显色10min，2M硫酸100μL/孔终止；在酶标仪上读取OD450值。
检测结果显示，以阴性对照(空白培养基)OD值10倍以上作为阳性判定标准，来自编号为5883和5884的两只小鼠的B细胞克隆在鼠抗结合human ST2-his ELISA筛选结果上的阳性率达到97％以上。
1.4 KU812 NF-κB报告基因法筛选
取对数生长期的1×10 6个KU812细胞，离心洗涤1次，用Neon Transfection System 10μL Kit中的buffer R 20μL重悬，加入1μg pGL4.32[luc2P/NF-κB-RE/Hygro]质粒，在1000V、50ms、1次条件下进行电击转染；转染后采用Hygromycin B进行加压筛选，最终获得KU812/NF-κB-1#细胞株。
将human IL33-his用培养基稀释到1μg/mL，与B细胞培养上清1:1混合为测试样品，另外制备阴性对照样品(稀释的human IL33-his与空白培养基1:1混合)和阳性对照样品(稀释的human IL33-his与1μg/mL CNTO7160 1:1混合)，各自以20μL/孔加入到384孔板中。取对数生长期的KU812/NF-κB-1#细胞，按照20000个/孔、20μL/孔，加入到上述384孔板中，37℃、5％CO 2孵育过夜(16-24h)，然后按照40μL/孔加入显色剂Bright-glo，振荡3min，在酶标仪上进行检测，读取RLU值。
根据阴性对照和阳性对照的值计算各克隆的抑制率，结果见图1至图5。
实施例2：抗体工程
2.1 B细胞测序
按照PureLink TM RNA Mini Kit说明书提取B细胞克隆mRNA，并分装保存于-80℃；以提取的mRNA作为模板采用PrimeScript TM II 1st Strand cDNA Synthesis Kit方案逆转录成cDNA，并分装保存于-80℃。
采用表1-1和表1-2所示的重链VH钓取引物和轻链VL钓取引物，以上述cDNA为模板，采用Ex Taq酶扩增VH和VL，然后连接到pMD18T载体送测序。
表1-1 重链VH钓取引物
Figure PCTCN2021073009-appb-000001
Figure PCTCN2021073009-appb-000002
表1-2 轻链VL钓取引物
Figure PCTCN2021073009-appb-000003
Figure PCTCN2021073009-appb-000004
2.2鼠抗的重组表达及筛选
(1)鼠抗重组表达
将来自相同克隆(例如图1至图5中所示)的轻重链搭配转染CHO-K1细胞，转染24h后加入10μg/mL MSX加压筛选，待细胞密度和活力恢复后接种进行Feed-batch表达，将表达完成后的上清离心并经protein A纯化，采用BCA法定量抗体浓度后用于定量筛选。
鼠抗的命名以包含的轻重链(H+L)所来自的细胞克隆编号表示，例如鼠抗“5883-105H+L”表示来自5883-105细胞克隆的鼠抗，其重链为5883-105H，轻链为5883-105L。
(2)鼠抗结合human ST2活性筛选
human ST2-his用包被缓冲液稀释到1μg/mL，按照50μL/孔加入96孔板内，4℃包被过夜；第二天将包被板取出用PBST洗涤3次；再用封闭液室温孵育1h，PBST再洗涤3次。鼠源抗体从100ng/mL起始3倍稀释，共8 个浓度，按照50μL/孔加入该96孔板内；室温孵育1h，PBST洗涤三次，加入羊抗鼠二抗(1:10000)，按照50μL/孔加入96孔板内；室温孵育1h，PBST洗涤三次，按照50μL/孔加TMB到96孔板内，避光显色10min，2M硫酸100μL/孔终止；在酶标仪上读取OD450值，结果见表2。
表2 鼠源抗体结合human ST2活性以及相较于CNTO7160的相对活性
Figure PCTCN2021073009-appb-000005
Figure PCTCN2021073009-appb-000006
Figure PCTCN2021073009-appb-000007
(3)鼠抗抑制IL33结合human ST2活性筛选
将human ST2-fc蛋白使用包被液稀释到10μg/mL，按照50μL/孔包到96孔板中，4℃冰箱孵育过夜；PBST洗涤三次，按照100μL/孔加入封闭液，室温孵育1h；PBST洗涤三次。使用稀释液将human IL33-his稀释到200ng/mL，使用稀释液将鼠源抗体稀释到起始浓度200μg/mL，然后3倍稀释，共8个浓度，将稀释好的human IL33-his与稀释好的鼠源抗体1:1混合，按照50μL/孔加入到96孔板中，室温孵育1h；PBST洗涤三次，加入组氨酸标签二抗(1:2500)，50μL/孔，室温孵育1h；PBST洗涤三次，TMB按照50μL/孔加到96孔板中，避光显色10min，2M硫酸100μL/孔终止；在酶标仪上读取OD450值和OD650值，结果见表3。
表3 鼠源抗体抑制IL33结合human ST2活性以及相较于CNTO7160的相对活性
Figure PCTCN2021073009-appb-000008
Figure PCTCN2021073009-appb-000009
Figure PCTCN2021073009-appb-000010
Figure PCTCN2021073009-appb-000011
(4)鼠抗抑制IL33激活KU812 NF-κB报告基因活性筛选
将human IL33-his用培养基稀释到1μg/mL，鼠源抗体及对照抗体CNTO7160用培养基稀释到50μg/mL，然后3倍稀释，共12个浓度，将抗体与稀释的human IL33-his 1:1混合为测试样品，另外制备阴性对照(空白培养基与稀释的human IL33-his 1:1混合)和阳性对照(空白培养基)，各自以20μL/孔加入到384孔板中。
取对数生长期的KU812/NF-κB-1#细胞离心换液，按照20000个/孔，20μL/孔，加入到上述384孔板中，37℃、5％CO 2孵育过夜(16-24h)，然后按照40μL/孔加入显色剂Bright-glo，振荡3min，在酶标仪上进行检测，读取RLU值，结果见表4。
表4 鼠源抗体抑制IL33激活KU812 NF-κB报告基因活性以及相较于CNTO7160的相对活性
Figure PCTCN2021073009-appb-000012
Figure PCTCN2021073009-appb-000013
Figure PCTCN2021073009-appb-000014
(5)鼠抗亲和力筛选
综合以上鼠源抗体定量筛选结果，选择19个鼠源抗体进行亲和力测定和体外药理研究。抗human ST2抗体与human ST2-his相互作用实验使用Biacore X100进行。实验均在25℃下在HBS-EP(1×)缓冲液(pH7.4)中操作。
抗human ST2抗体稀释至10nM，捕获于protein A芯片表面(捕获时间60s)。抗体捕获之后，注射溶液形式的human ST2-his(自11.8nM起2倍稀释至0.7375nM，共5个浓度)。监测缔合4分钟，监测解离10分钟，通过注射pH2.0的甘氨酸溶液获得传感器表面的再生。针对动力学和亲和力测定所生成的数据使用BIAevaluation软件分析。动力学数据使用简单1:1结合模 型分析，结果见表5。
表5 鼠源抗体亲和力测定结果
抗体 ka(1/Ms) kd(1/s) KD(M)
5883-105H+L 1.59E+07 3.79E-03 2.39E-10
5886-130H2+L2 2.62E+06 1.78E-03 6.79E-10
5886-156H+L 2.37E+06 1.09E-03 4.61E-10
5887-30H2+L2 6.95E+06 1.10E-02 1.58E-09
5887-41H+L 1.10E+06 6.13E-04 5.60E-10
5887-257H2+L1 1.09E+06 7.50E-04 6.89E-10
5887-537H3+L1 5.01E+06 8.40E-04 1.68E-10
5888-209H+L 9.85E+06 2.73E-03 2.77E-10
5888-378H+L 1.07E+07 1.42E-03 1.34E-10
5887-127H3+L2 4.23E+06 1.05E-03 2.47E-10
5887-167H+L 1.24E+06 6.99E-04 5.63E-10
5888-15H2+L2 5.16E+06 1.09E-03 2.10E-10
5888-116H1+L1 9.87E+06 1.11E-03 1.13E-10
5888-120H2+L1 1.29E+07 1.13E-03 8.75E-11
5888-153H1+L2 9.17E+06 8.64E-04 9.43E-11
5888-297H1+L1 1.02E+07 1.71E-03 1.68E-10
5888-357H+L 4.38E+06 7.00E-04 1.60E-10
5888-379H1+L2 9.57E+05 5.46E-04 5.71E-10
5888-380H1+L2 7.13E+06 1.03E-03 1.45E-10
CNTO7160 8.27E+05 5.39E-04 6.98E-10
(6)鼠抗体外药理研究
将human IL33-his用培养基稀释到80ng/mL，抗体用培养基稀释到40μg/mL，4倍稀释，共8个浓度，将二者1:1混合后50μL/孔加到96孔板中。取对数生长期的KU812细胞离心，按照100000个/孔，50μL/孔加到上述96孔板中，孵育48h。
按照Human IL-5 DuoSet ELISA试剂盒说明书提前一天包被捕捉抗体(为将240μg/mL储液120倍稀释(PBS)到2μg/mL的工作液)，4℃包被过夜，50μL/孔。封闭液封闭1h，洗涤三次。将120ng/mL的标准液400倍稀 释到300pg/mL，然后2倍稀释，共7个浓度。吸取各50μL的细胞培养上清和稀释好的标准液，加入到ELISA孔板中，孵育2h。洗涤三次，加入检测抗体(7.5μg/mL储液)60倍稀释到125ng/mL的工作液，50μL/孔，孵育2h。洗涤三次，加入SA-HRP 40倍稀释到125ng/mL的工作液，50μL/孔，孵育20-30min。加入50μL/孔显色液，闭光显色5-10min，加入100μL/孔2M硫酸终止，采用酶标仪读取OD450和OD650值，结果见表6和图6。
表6 鼠源抗体抑制IL33促KU812-IL5生成活性结果
抗体 相对活性(％) 最大抑制率(％)
5883-105H+L 342.64 80.33
5886-130H2+L2 344.54 71.06
5886-156H+L 303.78 84.16
5887-30H2+L2 490.35 41.40
5887-41H+L 128.40 79.25
5887-257H2+L1 40.03 82.17
5887-537H3+L1 766.96 62.25
5888-209H+L 254.91 74.38
5888-378H+L 466.20 84.53
5887-127H3+L2 126.96 73.54
5887-167H+L 26.14 66.68
5888-15H2+L2 80.56 80.22
5888-116H1+L1 238.00 81.40
5888-120H2+L1 21.72 82.02
5888-153H1+L2 115.09 86.00
5888-297H1+L1 246.30 80.38
5888-357H+L 98.54 71.03
5888-379H1+L2 19.17 92.72
5888-380H1+L2 69.84 77.33
CNTO7160   89.00
(7)鼠抗对鼠源和猴源ST2交叉实验
cyno ST2-fc用包被缓冲液稀释到1μg/mL，按照50μL/孔加入96孔板内，4℃包被过夜；第二天将包被板取出用PBST洗涤3次；再用封闭液室温孵 育1h，PBST再洗涤3次。鼠源抗体从1000ng/mL起始3倍稀释，共8个浓度，按照50μL/孔加入该96孔板内；室温孵育1h，PBST洗涤三次，加入羊抗鼠二抗(1:10000)，按照50μL/孔加入96孔板内；室温孵育1h，PBST洗涤三次，按照50μL/孔加TMB到96孔板内，避光显色10min，2M硫酸100μL/孔终止；在酶标仪上读取OD450值，结果见表7和图7。可知鼠抗可以结合cyno ST2，且结合趋势与human ST2一致。
表7 鼠源抗体与cyno ST2结合实验结果
抗体 EC 50(ng/mL) 相对活性(％)
5883-105H+L 29.45 45.67
5886-130H2+L2 19.30 69.69
5886-156H+L 20.26 66.39
5887-30H2+L2 2.31 582.76
5887-41H+L 61.51 21.87
5887-257H2+L1 17.33 77.61
5887-537H3+L1 17.14 78.47
5888-209H+L 15.23 88.31
5888-378H+L 11.91 112.93
5887-127H3+L2 15.78 85.23
5887-167H+L 54.87 44.51
5888-15H2+L2 20.95 116.56
5888-116H1+L1 38.36 63.66
5888-120H2+L1 47.71 51.18
5888-153H1+L2 30.26 80.70
5888-297H1+L1 28.17 86.69
5888-357H+L 19.25 126.86
5888-379H1+L2 60.18 40.58
5888-380H1+L2 30.59 79.83
抗human ST2抗体与human ST2-his相互作用实验使用Biacore X100进行。实验均在25℃下在HBS-EP(1.1×)缓冲液(pH7.4)中操作。使用氨基偶联试剂盒将抗体固定于CM5芯片表面。固定后，注射溶液形式的cyno ST2-fc(初始浓度8nM，2倍稀释6个浓度，个别样品信号值太低可提升初始浓度)。 监测缔合2分钟，监测解离10分钟，通过注射pH 1.5的甘氨酸溶液获得传感器表面的再生。动力学数据使用简单1:1结合模型分析，结果可见表8。
表8 鼠源抗体与cyno ST2亲和力测定结果
抗体 ka(1/Ms) kd(1/s) KD(M)
CNTO7160 1.63E+06 2.21E-04 1.36E-10
5886-156H+L 3.62E+06 7.47E-04 2.06E-10
5887-41H+L 7.98E+06 7.21E-04 9.03E-11
5887-537H3+L1 6.33E+06 5.11E-04 8.07E-11
5888-116H1+L1 8.14E+06 3.82E-04 4.69E-11
5888-153H1+L2 9.68E+06 1.39E-03 1.43E-10
5888-357H+L 6.41E+06 8.26E-04 1.29E-10
5888-379H1+L2 4.78E+06 1.52E-04 3.17E-11
mouse ST2-fc用包被缓冲液稀释到1μg/mL，按照50μL/孔加入96孔板内，4℃包被过夜；第二天将包被板取出用PBST洗涤3次；再用封闭液室温孵育1h，PBST再洗涤3次。鼠源抗体从1000ng/mL起始3倍稀释，共8个浓度，按照50μL/孔加入96孔板内；室温孵育1h，PBST洗涤三次，加入羊抗鼠二抗(1:10000)，按照50μL/孔加入96孔板内；室温孵育1h，PBST洗涤三次，按照50μL/孔加TMB到96孔板内，避光显色10min，2M硫酸100μL/孔终止；在酶标仪上读取OD450值，结果见图8。可知鼠抗对Mouse ST2结合较弱，与对照抗体CNTO7160一致。
2.3人源化
选择5886-156H+L、5887-41H+L、5887-537H3+L1、5888-116H1+L1、5888-153H1+L2、5888-357H+L、5888-379H1+L2这7个鼠抗进行人源化设计。
将7个鼠源抗体的重链和轻链可变区序列与人种系序列进行比较，该比较是对IMGT数据库进行的blast搜索。从该组人种系基因中去除冗余基因以及那些具有未配对半胱氨酸的基因。在框架和CDR区两者中选择其余最接近匹配人种系基因作为受体人框架。基于IGHJ/IGJK种系基因的序列相似性选择FR-4。表9至表15分别是5886-156H+L、5887-41H+L、5887-537H3+L1、5888-116H1+L1、5888-153H1+L2、5888-357H+L、5888-379H1+L2等7个鼠源抗体的人源化序列形式，其中HZ0版本代表仅 CDR移植的，HZ1版本引入了回复突变，HZ2及以上是对序列中出现的PTM位点做了突变尝试。人源化后的具体序列见表9至表15，其中以下划线示出了相应的CDR(根据增强Chothia/AbM CDR的定义)。
表9 5886-156重轻链可变区的人源化序列形式
Figure PCTCN2021073009-appb-000015
表10 5887-41重轻链可变区的人源化序列形式
Figure PCTCN2021073009-appb-000016
Figure PCTCN2021073009-appb-000017
表11 5887-537重轻链可变区的人源化序列形式
Figure PCTCN2021073009-appb-000018
Figure PCTCN2021073009-appb-000019
表12 5888-116重轻链可变区的人源化序列形式
Figure PCTCN2021073009-appb-000020
Figure PCTCN2021073009-appb-000021
表13 5888-153重轻链可变区的人源化序列形式
Figure PCTCN2021073009-appb-000022
Figure PCTCN2021073009-appb-000023
表14 5888-357重轻链可变区的人源化序列形式
Figure PCTCN2021073009-appb-000024
Figure PCTCN2021073009-appb-000025
表15 5888-379重轻链可变区的人源化序列形式
Figure PCTCN2021073009-appb-000026
Figure PCTCN2021073009-appb-000027
2.4人源化抗体重组表达及筛选
(1)人源化抗体重组表达
以SEQ ID NO.54所示重链恒定区和SEQ ID NO.55所示轻链恒定区，构建源自于相同鼠抗的人源化轻重链，进行搭配并转染CHO-K1细胞，转染 24h后加入10μg/mL MSX进行加压筛选，待细胞密度和活力恢复后接种进行Feed-batch表达，将表达完成后的离心上清经protein A纯化，采用BCA法定量抗体浓度后用于定量筛选。
人源化抗体及其重轻链可变区的搭配方式见表16至表22，后缀“ix”表示该抗体为相应的嵌合抗体。
表16 5886-156人源化抗体的轻重链可变区序列搭配
Figure PCTCN2021073009-appb-000028
表17 5887-41人源化抗体的轻重链可变区序列搭配
Figure PCTCN2021073009-appb-000029
表18 5887-537人源化后抗体的轻重链可变区序列搭配
Figure PCTCN2021073009-appb-000030
Figure PCTCN2021073009-appb-000031
表19 5888-116人源化后抗体的轻重链可变区序列搭配
Figure PCTCN2021073009-appb-000032
表20 5888-153人源化后抗体的轻重链可变区序列搭配
Figure PCTCN2021073009-appb-000033
表21 5888-357人源化后抗体的轻重链可变区序列搭配
Figure PCTCN2021073009-appb-000034
Figure PCTCN2021073009-appb-000035
表22 5888-379人源化后抗体的轻重链可变区序列搭配
Figure PCTCN2021073009-appb-000036
(2)人源化抗体抑制IL33结合human ST2活性筛选
按照上文第2.2节中“(3)鼠抗抑制IL33结合human ST2活性筛选”中描述的实验过程进行检测。结果见图9和表23，图9中阴性对照为空白培养基与稀释的human IL33-his 1:1混合，阳性对照为空白培养基。
表23 人源化抗体抑制IL33结合human ST2的活性以及相较于CNTO7160的相对活性
Figure PCTCN2021073009-appb-000037
Figure PCTCN2021073009-appb-000038
(3)人源化抗体抑制IL33促KU812-IL5生成活性筛选
将human IL33-his用培养基稀释到80ng/mL，人源化抗体用培养基稀释到640μg/mL，4倍稀释，共11个浓度，将二者1:1混合后50μL/孔加到96孔板中。接下来的实验过程与上文第2.2节中“(6)鼠抗体外药理研究”中的相同。结果见表24和图10，图10中阴性对照为空白培养基与稀释的human IL33-his 1:1混合，阳性对照为空白培养基。
表24 人源化抗体抑制IL33促KU812-IL5生成活性结果以及相较于CNTO7160的相对活性
Figure PCTCN2021073009-appb-000039
Figure PCTCN2021073009-appb-000040
(4)人源化抗体抑制IL33激活KU812 NF-κB报告基因活性研究
按照上文第2.2节中“(4)鼠抗抑制IL33激活KU812 NF-κB报告基因活性筛选”中所述的实验过程进行检测。结果见表25。
表25 人源化抗体抑制IL33激活KU812 NF-κB报告基因活性以及相较于CNTO7160的相对活性
抗体 IC 50(ng/mL) 相对活性 最大抑制率
5886-156-H1L0 477.9 41.91％ 92.49％
5887-41-H1L0 55.35 361.88％ 89.24％
5888-116-H0L1 13.03 1537.22％ 95.74％
5888-153-H0L1 43.78 457.51％ 88.24％
5888-153-H1L1 12.36 1620.55％ 91.36％
5888-153-H1L2 44.07 454.50％ 84.98％
5888-153-H3L1 39.42 508.12％ 86.11％
5888-153-H3L2 55.28 362.34％ 88.11％
CNTO7160 200.3   88.24％
(5)人源化抗体抑制氧化型IL33促KU812-IL5生成活性研究
将氧化型human IL33-his用培养基稀释到200ng/mL，人源化抗体用培养基稀释到640μg/mL，4倍稀释，共11个浓度，将二者1:1混合后50μL/孔加到96孔板中。接下来的实验过程与上文第2.2节中“(6)鼠抗体外药理研究”中的相同。结果见图11和表26，图11中阴性对照为空白培养基与稀释的human IL33-his 1:1混合，阳性对照为空白培养基。
表26 人源化抗体抑制氧化型IL33促KU812-IL5生成活性结果
抗体 IC 50(μg/mL) 相对活性 最大抑制率
5886-156-H1L0 0.0285 77.49％ 101.11％
5887-41-H1L0 0.0337 65.40％ 101.12％
5888-116-H0L1 0.0036 614.14％ 101.56％
5888-153-H0L1 0.0147 150.07％ 101.47％
5888-153-H3L1 0.0136 161.97％ 101.38％
5888-153-H3L2 0.0173 127.44％ 101.37％
5888-379-H1L0 0.0161 137.27％ 101.34％
5888-379-H2L1 0.0228 96.84％ 101.14％
CNTO7160 0.0221 100.00％ 98.90％
(6)人源化抗体抑制还原型IL33促KU812-IL5生成活性研究
将还原型human IL33-his用培养基稀释到6ng/mL，人源化抗体用培养基稀释到640μg/mL，4倍稀释11个点，将二者1:1混合后50μL/孔加到96孔板中。接下来的实验过程与上文第2.2节中“(6)鼠抗体外药理研究”中的相同。结果见图12和表27，图12中阴性对照为空白培养基与稀释的human IL33-his 1:1混合，阳性对照为空白培养基。
表27 人源化抗体抑制还原型IL33促KU812-IL5生成活性结果
抗体 IC 50(μg/mL) 相对活性 最大抑制率
5886-156-H1L0 0.7524 194.71％ 93.38％
5887-41-H1L0 0.7056 207.62％ 78.62％
5888-116-H0L1 0.1245 1176.71％ 75.06％
5888-153-H0L1 0.3891 376.51％ 83.56％
5888-153-H3L1 0.2646 553.67％ 86.93％
5888-153-H3L2 0.5218 280.76％ 87.24％
5888-379-H1L0 2.8650 51.13％ 96.68％
5888-379-H2L1 2.8650 51.13％ 96.68％
CNTO7160 1.4650 100.00％ 97.30％
(7)人源化抗体抑制IL33促HUVEC-IL6生成活性研究
HUVEC细胞按照10000个/孔，100μL体系，37℃、5％CO 2条件下孵育18-24h。将human IL33-his用培养基稀释到10ng/mL，人源化抗体用培养基稀释到400μg/mL，4倍稀释，共11个浓度，将二者1:1混合后100μL/孔 加到上述96孔板中，37℃、5％CO 2条件下孵育18-24h。
按照Human IL-6 DuoSet ELISA试剂盒说明书提前一天包被捕捉抗体(为将240μg/mL储液120倍稀释(PBS)到2μg/mL的工作液)，4℃包被过夜，50μL/孔。封闭液封闭1h，洗涤三次。将180ng/mL的标准液300倍稀释到600pg/mL，然后2倍稀释，共7个浓度。吸取各50μL的细胞培养上清和稀释好的标准液，加入到ELISA孔板中，孵育2h。洗涤三次，加入检测抗体(3μg/mL储液)60倍稀释到50ng/mL的工作液，50μL/孔，孵育2h。洗涤三次，加入SA-HRP 40倍稀释到125ng/mL的工作液，50μL/孔，孵育20-30min。加入50μL/孔显色液，闭光显色5-10min，加入100μL/孔2M硫酸终止，采用酶标仪读取OD450和OD650值，结果见图13和表28，图13中阴性对照为空白培养基与稀释的human IL33-his 1:1混合，阳性对照为空白培养基。
表28 人源化抗体抑制IL33促HUVEC-IL6生成活性结果
抗体 IC50(μg/mL) 相对活性 最大抑制率
5886-156-H1L0 4.051 67.29％ 87.89％
5887-41-H1L0 1.308 208.41％ 93.20％
5888-116-H0L1 0.8321 327.60％ 92.61％
5888-153-H0L1 0.8435 323.18％ 92.99％
5888-153-H3L1 1.636 166.63％ 93.05％
5888-153-H3L2 3.688 73.92％ 91.85％
5888-379-H1L0 16.1 16.93％ 83.05％
5888-379-H2L1 26.14 10.43％ 71.60％
CNTO7160 2.726 100.00％ 66.59％
(8)人源化抗体抑制IL33促HMC-1IL8生成活性研究
human IL33-his终浓度1000ng/mL，人源化抗体按照起始640μg/mL，4倍稀释，共11个浓度，将二者1:1混合后按照50μL/孔加入到96孔板中。取对数生长期的HMC-1细胞按照50000个/孔，50μL/孔加入到上述96孔板中，37℃、5％CO 2条件下孵育18-24h。
按照Human IL-8 DuoSet ELISA试剂盒说明书提前一天包被捕捉抗体(为120倍稀释(PBS)的工作液)，4℃包被过夜，50μL/孔。封闭液封闭1h，洗涤三次。将标准液40倍稀释到2000pg/mL，然后2倍稀释，共7个 浓度。吸取各50μL的细胞培养上清和稀释好的标准液，加入到ELISA孔板中，孵育2h。洗涤三次，加入检测抗体60倍稀释的工作液，50μL/孔，孵育2h。洗涤三次，加入SA-HRP 40倍稀释到125ng/mL的工作液，50μL/孔，孵育20-30min。加入50μL/孔显色液，闭光显色5-10min，加入100μL/孔2M硫酸终止，采用酶标仪读取OD450和OD650值，结果见图14和表29，图4中阴性对照为空白培养基与human IL33-his 1:1混合，阳性对照为空白培养基。
表29 人源化抗体抑制IL33促HMC-1IL8生成活性结果
抗体 IC50(μg/mL) 相对活性 最大抑制率
5886-156-H1L0 0.1771 56.86％ 81.01％
5887-41-H1L0 0.1234 81.60％ 77.81％
5888-116-H0L1 0.005512 1826.92％ 90.57％
5888-153-H0L1 0.03592 280.35％ 87.17％
5888-153-H3L1 0.04719 213.39％ 86.75％
5888-153-H3L2 0.09443 106.64％ 83.30％
5888-379-H1L0 0.334 30.15％ 85.60％
5888-379-H2L1 0.2298 43.82％ 90.15％
CNTO7160 0.1007   82.34％
(9)人源化抗体亲和力测定
抗human ST2抗体与human ST2-his相互作用实验使用Biacore X100进行。
(9-1)human ST2与人源化抗体在pH7.4条件下解离动力学亲和力实验：实验均在25℃下在HBS-EP(1×)缓冲液(pH7.4)中操作。
抗human ST2抗体稀释至2μg/mL，捕获于Protein A芯片表面，捕获时间60s。抗体捕获之后，注射溶液形式的human ST2-his(起始浓度20nM，2倍梯度稀释6个浓度)。监测缔合180s，监测解离700s，通过注射pH2.0的甘氨酸溶液获得传感器表面的再生。动力学数据使用1:1结合模型分析。
(9-2)human ST2与人源化抗体在pH5.5条件下解离动力学亲和力实验：
参照(9-1)中描述的实验过程进行，区别在于使解离在pH5.5的HBS-EP(1×)缓冲液条件下进行，监测解离600s。
结果见表30。
表30 人源化抗体pH7.4和pH5.5条件下的亲和力
Figure PCTCN2021073009-appb-000041
*CN104334582B中的抗体Ab2
实施例3抗体小鼠PK
适应期后，将20只小鼠随机分成4组，每组5只，给药信息见表31。
表31 各组小鼠给药信息
  抗体 给药方式 给药体积
A 5888-116-H0L1 5mg/kg i.p. 0.1mL/10g
B 5888-153-H0L1 5mg/kg i.p. 0.1mL/10g
C CNTO7160 5mg/kg i.p. 0.1mL/10g
D 5886-156-H1L0 5mg/kg i.p. 0.1mL/10g
根据组别分别进行给药，并记录给药时间。每组小鼠在给药前(0hr)及给药后4hr、8hr、24hr(1d)、72hr(3d)、120hr(5d)、168hr(7d)、240hr(10d)、288hr(12d)、336hr(14d)分别进行采血，并收集血清，-60～-80℃保存。
小鼠PK血药浓度检测方法如下：
(1)包被：将human ST2-his使用PBS(7.2-7.4)稀释至1μg/mL，加入96孔ELSIA板内，50μL/孔，封膜。2-8℃放置15-20小时。使用PBST(pH7.2-7.4，Tween-20 0.05％v/v)洗涤3次。
(2)封闭与干燥：使用N502封闭，200μL/孔，室温封闭1-2hr。吸去封闭液。在25℃恒温箱内干燥>1hr。立即使用或封膜放置于2-8℃。
(3)标曲和质控品制备：将抗体样品使用小鼠血浆(EDTA-K)稀释至1000ng/mL，随后2倍梯度稀释至15ng/mL(含1000ng/mL共7个点)。此外将标曲的抗体样品定量稀释到定量范围作为质控品(QC)，稀释浓度分别为1000ng/mL、100ng/mL、20ng/mL。
(4)待测样品处理：获得各个采血点样品，使用纯小鼠血浆稀释至标曲范围内。
(5)标曲、QC及待测样品稀释：采用0.1％酪蛋白(pH6.2，使用PBS6.2稀释酪蛋白母液)稀释10倍(例如10μL+90μL)，加入干燥后的板内，50μL/孔，每个样品2个复孔。封膜，室温孵育2hr。使用PBST(pH7.2-7.4，Tween-200.05％v/v)洗涤3次。
(6)二抗孵育：将Goat anti-Human IgG Fc-HRP使用10％山羊血清稀释50000倍，加入板内，50μL/孔，封膜，室温孵育1hr。使用PBST(pH7.2-7.4，Tween-20 0.05％v/v)洗涤3次。
(7)显色：将已温育至室温的TMB加入板内，50μL/孔，避光反应20min。
(8)终止与读数：2M硫酸，100μL/孔，轻敲板，混匀。于450nm参比650nm读数，计算待测样品浓度。
实验结果显示三个抗体的半衰期均超过100h，具体排序为5886-156-H1L0>5888-153-H0L1>5888-116-H0L1，其中5886-156H1L0的半衰期与CNTO7160相当，达到10d。结果见图15和表32。
表32 抗体的小鼠PK参数
参数 5888-116-H0L1 5888-153-H0L1 CNTO7160 5886-156-H1L0
t 1/2(h) 174.78 191.46 241.97 241.18
Cmax(kg*ng/ml/mg) 10972.58 9380.59 15733.80 11319.84
AUC(h*ng/ml) 11509209.16 11404571.90 17097590.16 12860587.84
CL(ml/h/kg) 0.31 0.30 0.18 0.26
MRT(h) 139.03 146.65 146.40 147.33
以上对本发明具体实施方式的描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变或变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求的范围。

Claims (15)

  1. 一种抗体或其片段，所述抗体或其片段包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中所述重链可变区和轻链可变区包含选自以下组合中任一个所示的重链CDR和轻链CDR：
    (I)：依次示于SEQ ID NO.56、63、70的H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3；和，依次示于SEQ ID NO.85、93、97的L-CDR1、L-CDR2、L-CDR3；
    (II-1)：依次示于SEQ ID NO.57、64、71的H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3；和，依次示于SEQ ID NO.86、93、98的L-CDR1、L-CDR2、L-CDR3；
    (II-2)：依次示于SEQ ID NO.57、64、71的H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3；和，依次示于SEQ ID NO.87、93、98的L-CDR1、L-CDR2、L-CDR3；
    (III)：依次示于SEQ ID NO.58、65、72的H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3；和，依次示于SEQ ID NO.88、94、99的L-CDR1、L-CDR2、L-CDR3；
    (IV-1)：依次示于SEQ ID NO.59、66、73的H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3；和，依次示于SEQ ID NO.89、95、100的L-CDR1、L-CDR2、L-CDR3；
    (IV-2)：依次示于SEQ ID NO.59、66、74的H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3；和，依次示于SEQ ID NO.89、95、100的L-CDR1、L-CDR2、L-CDR3；
    (IV-3)：依次示于SEQ ID NO.59、66、75的H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3；和，依次示于SEQ ID NO.89、95、100的L-CDR1、L-CDR2、L-CDR3；
    (V-1)：依次示于SEQ ID NO.60、67、76的H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3；和，依次示于SEQ ID NO.90、95、101的L-CDR1、L-CDR2、L-CDR3；
    (V-2)：依次示于SEQ ID NO.60、67、76的H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3；和，依次示于SEQ ID NO.90、95、102的L-CDR1、L-CDR2、L-CDR3；
    (V-3)：依次示于SEQ ID NO.60、67、77的H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3；和，依次示于SEQ ID NO.90、95、101的L-CDR1、L-CDR2、L-CDR3；
    (V-4)：依次示于SEQ ID NO.60、67、77的H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3；和，依次示于SEQ ID NO.90、95、102的L-CDR1、L-CDR2、L-CDR3；
    (V-5)：依次示于SEQ ID NO.60、67、78的H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3；和，依次示于SEQ ID NO.90、95、101的L-CDR1、L-CDR2、L-CDR3；
    (V-6)：依次示于SEQ ID NO.60、67、78的H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3；和，依次示于SEQ ID NO.90、95、102的L-CDR1、L-CDR2、L-CDR3；
    (VI-1)：依次示于SEQ ID NO.61、68、79的H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3；和，依次示于SEQ ID NO.91、95、100的L-CDR1、L-CDR2、L-CDR3；
    (VI-2)：依次示于SEQ ID NO.61、68、80的H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3；和，依次示于SEQ ID NO.91、95、100的L-CDR1、L-CDR2、L-CDR3；
    (VI-3)：依次示于SEQ ID NO.61、68、81的H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3；和，依次示于SEQ ID NO.91、95、100的L-CDR1、L-CDR2、L-CDR3；
    (VII-1)：依次示于SEQ ID NO.62、69、82的H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3；和，依次示于SEQ ID NO.92、96、103的L-CDR1、L-CDR2、L-CDR3；
    (VII-2)：依次示于SEQ ID NO.62、69、83的H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3；和，依次示于SEQ ID NO.92、96、103的L-CDR1、L-CDR2、L-CDR3；
    (VII-3)：依次示于SEQ ID NO.62、69、84的H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3；和，依次示于SEQ ID NO.92、96、103的L-CDR1、L-CDR2、L-CDR3。
  2. 根据权利要求1所述的抗体或其片段，其特征在于，所述重链可变区包含SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.28中任一个所示的氨基酸序列或者与所述氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；和/或，
    所述轻链可变区包含SEQ ID NO.29至SEQ ID NO.53中任一个所示的氨基酸序列或者与所述氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列。
  3. 根据权利要求1或2所述的抗体或其片段，其特征在于，所述抗体或其片段包含选自以下组合中任一个所述重链可变区和轻链可变区：
    (I-1)：SEQ ID NO.1所示的重链可变区和SEQ ID NO.29所示的轻链可变区；
    (I-2)：SEQ ID NO.2所示的重链可变区和SEQ ID NO.30所示的轻链可变区；
    (I-3)：SEQ ID NO.2所示的重链可变区和SEQ ID NO.31所示的轻链可变区；
    (I-4)：SEQ ID NO.3所示的重链可变区和SEQ ID NO.30所示的轻链可变区；
    (I-5)：SEQ ID NO.3所示的重链可变区和SEQ ID NO.31所示的轻链可变区；
    (II-1)：SEQ ID NO.4所示的重链可变区和SEQ ID NO.32所示的轻链可变区；
    (II-2)：SEQ ID NO.5所示的重链可变区和SEQ ID NO.33所示的轻链可变区；
    (II-3)：SEQ ID NO.5所示的重链可变区和SEQ ID NO.34所示的轻链可变区；
    (II-4)：SEQ ID NO.5所示的重链可变区和SEQ ID NO.35所示的轻链可变区；
    (II-5)：SEQ ID NO.6所示的重链可变区和SEQ ID NO.33所示的轻链可变区；
    (II-6)：SEQ ID NO.6所示的重链可变区和SEQ ID NO.34所示的轻链可变区；
    (II-7)：SEQ ID NO.6所示的重链可变区和SEQ ID NO.35所示的轻链可变区；
    (III-1)：SEQ ID NO.7所示的重链可变区和SEQ ID NO.36所示的轻链可变区；
    (III-2)：SEQ ID NO.8所示的重链可变区和SEQ ID NO.37所示的轻链可变区；
    (III-3)：SEQ ID NO.8所示的重链可变区和SEQ ID NO.38所示的轻链可变区；
    (III-4)：SEQ ID NO.9所示的重链可变区和SEQ ID NO.37所示的轻链可变区；
    (III-5)：SEQ ID NO.9所示的重链可变区和SEQ ID NO.38所示的轻链可变区；
    (IV-1)：SEQ ID NO.10所示的重链可变区和SEQ ID NO.39所示的轻链可变区；
    (IV-2)：SEQ ID NO.11所示的重链可变区和SEQ ID NO.40所示的轻链可变区；
    (IV-3)：SEQ ID NO.11所示的重链可变区和SEQ ID NO.41所示的轻链可变区；
    (IV-4)：SEQ ID NO.12所示的重链可变区和SEQ ID NO.40所示的轻链可变区；
    (IV-5)：SEQ ID NO.12所示的重链可变区和SEQ ID NO.41所示的轻链 可变区；
    (IV-6)：SEQ ID NO.13所示的重链可变区和SEQ ID NO.40所示的轻链可变区；
    (IV-7)：SEQ ID NO.13所示的重链可变区和SEQ ID NO.41所示的轻链可变区；
    (IV-8)：SEQ ID NO.14所示的重链可变区和SEQ ID NO.40所示的轻链可变区；
    (IV-9)：SEQ ID NO.14所示的重链可变区和SEQ ID NO.41所示的轻链可变区；
    (V-1)：SEQ ID NO.15所示的重链可变区和SEQ ID NO.42所示的轻链可变区；
    (V-2)：SEQ ID NO.16所示的重链可变区和SEQ ID NO.43所示的轻链可变区；
    (V-3)：SEQ ID NO.16所示的重链可变区和SEQ ID NO.44所示的轻链可变区；
    (V-4)：SEQ ID NO.16所示的重链可变区和SEQ ID NO.45所示的轻链可变区；
    (V-5)：SEQ ID NO.17所示的重链可变区和SEQ ID NO.43所示的轻链可变区；
    (V-6)：SEQ ID NO.17所示的重链可变区和SEQ ID NO.44所示的轻链可变区；
    (V-7)：SEQ ID NO.17所示的重链可变区和SEQ ID NO.45所示的轻链可变区；
    (V-8)：SEQ ID NO.18所示的重链可变区和SEQ ID NO.43所示的轻链可变区；
    (V-9)：SEQ ID NO.18所示的重链可变区和SEQ ID NO.44所示的轻链可变区；
    (V-10)：SEQ ID NO.18所示的重链可变区和SEQ ID NO.45所示的轻链可变区；
    (V-11)：SEQ ID NO.19所示的重链可变区和SEQ ID NO.43所示的轻链可变区；
    (V-12)：SEQ ID NO.19所示的重链可变区和SEQ ID NO.44所示的轻链可变区；
    (V-13)：SEQ ID NO.19所示的重链可变区和SEQ ID NO.45所示的轻链可变区；
    (VI-1)：SEQ ID NO.20所示的重链可变区和SEQ ID NO.46所示的轻链可变区；
    (VI-2)：SEQ ID NO.21所示的重链可变区和SEQ ID NO.47所示的轻链可变区；
    (VI-3)：SEQ ID NO.21所示的重链可变区和SEQ ID NO.48所示的轻链可变区；
    (VI-4)：SEQ ID NO.22所示的重链可变区和SEQ ID NO.47所示的轻链可变区；
    (VI-5)：SEQ ID NO.22所示的重链可变区和SEQ ID NO.48所示的轻链可变区；
    (VI-6)：SEQ ID NO.23所示的重链可变区和SEQ ID NO.47所示的轻链可变区；
    (VI-7)：SEQ ID NO.23所示的重链可变区和SEQ ID NO.48所示的轻链可变区；
    (VI-8)：SEQ ID NO.24所示的重链可变区和SEQ ID NO.47所示的轻链可变区；
    (VI-9)：SEQ ID NO.24所示的重链可变区和SEQ ID NO.48所示的轻链可变区；
    (VII-1)：SEQ ID NO.25所示的重链可变区和SEQ ID NO.49所示的轻链可变区；
    (VII-2)：SEQ ID NO.26所示的重链可变区和SEQ ID NO.52所示的轻链可变区；
    (VII-3)：SEQ ID NO.26所示的重链可变区和SEQ ID NO.53所示的轻链可变区；
    (VII-4)：SEQ ID NO.26所示的重链可变区和SEQ ID NO.50所示的轻链可变区；
    (VII-5)：SEQ ID NO.26所示的重链可变区和SEQ ID NO.51所示的轻 链可变区；
    (VII-6)：SEQ ID NO.27所示的重链可变区和SEQ ID NO.52所示的轻链可变区；
    (VII-7)：SEQ ID NO.27所示的重链可变区和SEQ ID NO.53所示的轻链可变区；
    (VII-8)：SEQ ID NO.27所示的重链可变区和SEQ ID NO.50所示的轻链可变区；
    (VII-9)：SEQ ID NO.27所示的重链可变区和SEQ ID NO.51所示的轻链可变区；
    (VII-10)：SEQ ID NO.28所示的重链可变区和SEQ ID NO.52所示的轻链可变区；
    (VII-11)：SEQ ID NO.28所示的重链可变区和SEQ ID NO.53所示的轻链可变区；
    (VII-12)：SEQ ID NO.28所示的重链可变区和SEQ ID NO.50所示的轻链可变区；
    (VII-13)：SEQ ID NO.28所示的重链可变区和SEQ ID NO.51所示的轻链可变区。
  4. 根据权利要求1至3中任一项所述的抗体或其片段，其特征在于，所述抗体或其片段结合ST2，优选哺乳动物ST2，更优选灵长类动物ST2，进一步优选人或食蟹猴ST2，特别是人ST2。
  5. 根据权利要求1至4中任一项所述的抗体或其片段，其特征在于，所述抗体为单克隆抗体、单链抗体、双功能抗体、单域抗体、纳米抗体、完全或部分人源化的抗体或者嵌合抗体等任意形式；优选地，所述抗体为IgA、IgD、IgE、IgG或IgM，更优选为IgG1、IgG2或IgG4；
    优选地，所述片段为所述抗体能够特异性结合ST2或其任何部分的功能活性片段；更优选地，所述片段为所述抗体的scFv、BsFv、dsFv、(dsFv) 2、Fab、Fab'、F(ab') 2或Fv片段；
    更优选地，所述抗体还包含重链恒定区，所述重链恒定区为IgG1、IgG2或IgG4亚型；或者，所述抗体还包含轻链恒定区，所述轻链恒定区为κ型；进一步优选地，所述重链恒定区包含SEQ ID NO.54所示的氨基酸序列或者与所述氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；所述轻链恒定区包含 SEQ ID NO.55所示氨基酸序列或者与所述氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；
    优选地，所述至少75％同一性为例如至少80％、优选至少85％、更优选至少90％、进一步优选至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或甚至99％同一性等≥75％的任何百分比的同一性。
  6. 一种缀合物或融合蛋白，所述缀合物或融合蛋白包含权利要求1至5中任一项所述的抗体或其片段。
  7. 一种核酸分子，其编码权利要求1至6中任一项所述的抗体或其片段中的重链CDR、轻链CDR、重链可变区、轻链可变区、重链或轻链。
  8. 一种载体，其包含权利要求7所述的核酸分子。
  9. 一种宿主细胞，所述宿主细胞包含权利要求7所述的核酸分子和/或权利要求8所述的载体，或者所述宿主细胞被权利要求7所述的核酸分子和/或权利要求8所述的载体转化或转染。
  10. 一种组合物，所述组合物包含权利要求1至5中任一项所述的抗体或其片段、权利要求6所述的缀合物或融合蛋白、权利要求7所述的核酸分子、权利要求8所述的载体和/或权利要求9所述的宿主细胞；
    优选地，所述组合物为药物组合物，其任选地还包含药学上可接受的辅料。
  11. 权利要求1至5中任一项所述的抗体或其片段、权利要求6所述的缀合物或融合蛋白、权利要求7所述的核酸分子、权利要求8所述的载体、权利要求9所述的宿主细胞和/或权利要求10所述的组合物在制备用于预防、治疗或改善疾病的药物中的用途；
    优选地，所述疾病与ST2表达或IL-33/ST2途径失调相关；
    优选地，所述疾病为炎性疾病或自身免疫性疾病；更优选地，所述疾病为心力衰竭、过敏性鼻炎、鼻息肉、特应性皮炎、慢性阻塞性肺病、哮喘、肺纤维化、败血症、炎性肠病、系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、全身性硬化症、韦格纳氏肉芽肿或化疗相关性腹泻。
  12. 一种用于预防、治疗或改善疾病的方法，所述方法包括给有此需要的受试者施用权利要求1至5中任一项所述的抗体或其片段、权利要求6所述的缀合物或融合蛋白、权利要求7所述的核酸分子、权利要求8所述的载体、权利要求9所述的宿主细胞和/或权利要求10所述的组合物，以及任选 的其他药物或手段；
    优选地，所述疾病与ST2表达或IL-33/ST2途径失调相关；
    优选地，所述疾病为炎性疾病或自身免疫性疾病；更优选地，所述疾病为心力衰竭、过敏性鼻炎、鼻息肉、特应性皮炎、慢性阻塞性肺病、哮喘、肺纤维化、败血症、炎性肠病、系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、全身性硬化症、韦格纳氏肉芽肿或化疗相关性腹泻。
  13. 一种药物组合，其包含权利要求1至5中任一项所述的抗体或其片段、权利要求6所述的缀合物或融合蛋白、权利要求7所述的核酸分子、权利要求8所述的载体、权利要求9所述的宿主细胞和/或权利要求10所述的组合物，和任选的其他药物。
  14. 一种检测或诊断疾病的方法，所述方法包括使权利要求1至5中任一项所述的抗体或其片段、权利要求6所述的缀合物或融合蛋白、权利要求7所述的核酸分子、权利要求8所述的载体、权利要求9所述的宿主细胞和/或权利要求10所述的组合物与来自受试者的样品相接触；
    优选地，所述疾病与ST2表达或IL-33/ST2途径失调相关；
    优选地，所述疾病为炎性疾病或自身免疫性疾病；更优选地，所述疾病为心力衰竭、过敏性鼻炎、鼻息肉、特应性皮炎、慢性阻塞性肺病、哮喘、肺纤维化、败血症、炎性肠病、系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、全身性硬化症、韦格纳氏肉芽肿或化疗相关性腹泻。
  15. 一种试剂盒，所述试剂盒包括权利要求1至5中任一项所述的抗体或其片段、权利要求6所述的缀合物或融合蛋白、权利要求7所述的核酸分子、权利要求8所述的载体、权利要求9所述的宿主细胞和/或权利要求10所述的组合物。
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