CN117250356B - 一种定量检测可溶性st2蛋白的胶乳增强免疫比浊试剂盒及其制备方法 - Google Patents

一种定量检测可溶性st2蛋白的胶乳增强免疫比浊试剂盒及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种定量检测可溶性ST2蛋白的胶乳增强免疫比浊试剂盒，包括试剂R1、试剂R2和校准品；试剂R1包括稳定剂、促凝剂、防腐剂和缓冲液；试剂R2包括稳定剂、防腐剂、表面活性剂、缓冲液、包被抗人可溶性ST2蛋白抗体的胶乳颗粒；校准品包括防腐剂、稳定剂、ST2抗原和缓冲液；所述试剂R2中，采用两种人源化改造的纳米单克隆抗体作为抗人可溶性ST2蛋白抗体，且两种抗体分别与胶乳颗粒之间通过“链酶亲和素‑生物素系统”连接。本发明还提供了上述试剂盒的制备方法。本发明的优点在于：灵敏度更高、特异性更好，且可实现可溶性ST2蛋白的定量检测。

Description

一种定量检测可溶性ST2蛋白的胶乳增强免疫比浊试剂盒及 其制备方法
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，尤其涉及一种定量检测可溶性ST2蛋白的胶乳增强免疫比浊试剂盒及其制备方法。
背景技术
ST2蛋白是一种跨膜蛋白，也称为IL-1R4。可溶性ST2蛋白是ST2的可溶性形式，它是由细胞膜表面剪切产生的，在细胞外部游离存在。可溶性ST2蛋白主要由心脏和免疫系统的细胞产生，包括心肌细胞、成纤维细胞、巨噬细胞、树突状细胞和T细胞等。
人的ST2基因长约40kb，位于人类染色体2q12。该基因编码两种不同形式的蛋白，一种是可溶性ST2蛋白(sST2)，另一种是跨膜形式ST2蛋白(ST2L)。
可溶性ST2蛋白还被认为是一种自然的抗炎分子，因为它可以结合并中和一种被称为IL-33的促炎症细胞因子，从而抑制其在体内的作用。ST2作为IL-33受体，在其与IL-33结合时，会引发一系列免疫反应和炎症反应，从而参与许多疾病的发生和发展。可溶性ST2蛋白通过与IL-33竞争结合其受体，可以减轻免疫反应和炎症反应，从而发挥抗炎作用。
除了抗炎作用之外，可溶性ST2蛋白还具有许多其他生物学功能。研究表明，sST2蛋白在心脏、肾脏、肝脏等器官中表达，并参与多种生理和病理过程。sST2是一种机械应力诱导产生的心肌蛋白，在生物机械拉伸的刺激下分泌增多。随着心力衰竭程度的加重，心脏的负荷增加，sST2升高更为显著。同时，sST2作为血清可溶性诱骗受体，可以阻断IL-33与ST2L结合，从而阻止IL-33的心脏保护作用。因此，sST2可能是心肌肥大和心肌纤维化的潜在病理生理介质之一。所以sST2可以作为一种心脏肌肉损伤的生物标志物，在急性心肌梗死、心力衰竭等心血管疾病的诊断和治疗中发挥重要作用。
根据2013年美国心脏学会和美国心脏病学会指南，对于急性或动态心衰患者，建议进行sST2测量，并给出IIb级的建议。sST2不仅可以预测心衰患者的住院和死亡风险，而且在门诊随访的慢性心衰患者中，使用sST2进行风险分类也被推荐为IIb级和B级建议。2017年ACC/AHA/HFSA心衰指南再次推荐sST2作为危险分层和评估预后的生物标志物之一。sST2可与临床上常用的生物标志物如BNP、NT-proBNP结合使用，共同用于心衰的诊断和预测预后，为未来的心衰治疗提供新的思路和方法。
除以上应用外，sST2还与癌症等多种疾病的预后和治疗反应密切相关。可溶性ST2蛋白水平的升高可能与某些肿瘤的发生和恶性程度相关。因此，可溶性ST2蛋白可以作为一种肿瘤风险评估指标，帮助医生更早地发现肿瘤，制定更有效的治疗方案。例如，在乳腺癌研究中，研究人员发现高水平的可溶性ST2蛋白与更高的乳腺癌风险相关。肿瘤治疗的目标是消灭肿瘤细胞，降低肿瘤复发和转移的风险。可溶性ST2蛋白可以用作评估肿瘤治疗效果的指标。例如，在非小细胞肺癌的研究中，研究人员发现化疗后可溶性ST2蛋白水平的变化可以预测患者的预后和生存期。
总体来说，可溶性ST2蛋白在心血管疾病诊断、自身免疫疾病及肿瘤的早筛及预后上具有很大的临床应用潜力。然而，现有的可溶性ST2蛋白检测试剂盒大多为免疫层析法，不仅无法实现定量检测，而且灵敏度和特异性也有待提高。
据此，目前急需开发设计出一种灵敏度更高、特异性更好，且可实现定量检测的可溶性ST2蛋白检测试剂盒。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种灵敏度更高、特异性更好，且可实现定量检测的可溶性ST2蛋白胶乳增强免疫比浊检剂盒及其制备方法。
本发明采用以下技术方案解决上述技术问题：
一种定量检测可溶性ST2蛋白的胶乳增强免疫比浊试剂盒，包括试剂R1、试剂R2和校准品；
所述试剂R1包括稳定剂、促凝剂、防腐剂和缓冲液；
所述试剂R2包括稳定剂、防腐剂、表面活性剂、缓冲液、包被抗人可溶性ST2蛋白抗体的胶乳颗粒；
所述校准品包括防腐剂、稳定剂、ST2抗原和缓冲液；
所述试剂R2的“包被抗人可溶性ST2蛋白抗体的胶乳颗粒”中，具体采用两种人源化改造的纳米单克隆抗体作为抗人可溶性ST2蛋白抗体，且两种抗体分别与胶乳颗粒之间通过“链酶亲和素-生物素系统”连接；其中，两种纳米单克隆抗体的原始氨基酸序列分别为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示，人源化改造指对所述纳米单克隆抗体的C端融合人源Fc序列并加入Avi-Tag标签。
作为本发明的优选方式之一，所述试剂R1中：
所述稳定剂包括5mg/mL牛血清白蛋白和0.1mg/mL明胶；
所述促凝剂为终浓度0.5％的PEG6000；
所述防腐剂为0.05％ ProClin300；
所述缓冲液包括50mM Tris-HCl缓冲液和150mM NaCl，缓冲液pH 7.5。
作为本发明的优选方式之一，所述试剂R2中：
所述稳定剂包括5mg/mL牛血清白蛋白和25mg/mL海藻糖；
防腐剂为0.05％ ProClin300；
所述表面活性剂为0.01％ Tween 20；
所述缓冲液包括20mM、pH 7.5的Hepes缓冲液以及30mM、pH 8.0的硼酸缓冲液；
所述包被抗人可溶性ST2蛋白抗体的胶乳颗粒，终浓度0.1％。
作为本发明的优选方式之一，所述试剂R2的包被抗人可溶性ST2蛋白抗体的胶乳颗粒中，两种人源化改造的纳米单克隆抗体之间的质量比为1:1。
作为本发明的优选方式之一，所述校准品中：
所述防腐剂为0.1％叠氮钠；
所述稳定剂包括10mg/mL牛血清白蛋白和50mg/mL海藻糖；
所述ST2抗原为浓度0～500ng/mL的ST2蛋白抗原；
所述缓冲液为浓度20mM、pH7.2的磷酸盐缓冲液。
作为本发明的优选方式之一，所述校准品的ST2蛋白抗原为体外真核系统表达并纯化的重组ST2蛋白，纯度≥95％。
作为本发明的优选方式之一，所述“包被抗人可溶性ST2蛋白抗体的胶乳颗粒”通过如下方法获得：
(1)胶乳颗粒的洗涤及活化
①将胶乳颗粒加入MES洗涤液离心，弃上清，重复洗涤若干次；
②将沉淀重悬于MES偶联缓冲液中，并加入EDC活化；
③活化后的胶乳颗粒用MES偶联缓冲液洗涤后重悬；
(2)链酶亲和素偶联
①取活化洗涤后的胶乳溶液，加入链酶亲和素；混匀后摇床偶联；
②用Hepes缓冲液洗涤微球颗粒，重复若干次；
③加入封闭剂封闭；
(3)抗人可溶性ST2蛋白抗体的生物素化
表达、纯化目标所需的两种人源化改造的纳米单克隆抗体，并利用现有生物素连接酶试剂盒(安徽千诚生物技术有限公司，货号：SCSA003)分别将两种人源化改造的纳米单克隆抗体与生物素混合反应(1mg抗体使用1ug生物素连接酶)；反应液分别离心去除沉淀后，上清放入透析袋中，在硼酸缓冲液中透析过夜；最终获得两种“生物素化抗人可溶性ST2蛋白抗体”；
(4)“生物素化可溶性ST2蛋白抗体”与链酶亲和素包被颗粒的连接
将步骤(2)制得的胶乳颗粒溶液与步骤(3)获得的两种“生物素化可溶性ST2蛋白抗体”分别混合，并分别置于摇床中孵育，形成两种“胶乳颗粒-链酶亲和素-生物素-抗人可溶性ST2蛋白抗体的复合物”；其中，采用1L的0.5％的胶乳颗粒溶液分别加入抗体量为100mg的抗体进行混合孵育；
(5)混合
将两种“胶乳颗粒-链酶亲和素-生物素-抗人可溶性ST2蛋白抗体的复合物”按质量比1:1混合构成完整的“包被抗人可溶性ST2蛋白抗体的胶乳颗粒”。
一种上述定量检测可溶性ST2蛋白的胶乳增强免疫比浊试剂盒的制备方法，包括如下步骤：
(1)配制试剂R1：
将试剂R1的各组分于同一容器中混合，混合均匀后，制得试剂R1；
(2)配制试剂R2的稀释缓冲液：
将试剂R2的稳定剂、防腐剂、表面活性剂、缓冲液进行混合，获得试剂R2的稀释缓冲液；
(3)配制试剂R2：
①胶乳颗粒的洗涤及活化
将胶乳颗粒加入MES洗涤液离心，弃上清，重复洗涤3次；
将沉淀重悬于MES偶联缓冲液中，并加入EDC活化30min；
活化后的胶乳颗粒用MES偶联缓冲液洗涤3次后重悬，使胶乳颗粒质量体积比终浓度为1％；
②链酶亲和素偶联
取1mL活化洗涤后的胶乳溶液，加入0.5mg/mL链酶亲和素；混匀后25℃摇床220rpm偶联3h；
用Hepes缓冲液洗涤微球颗粒，重复3次；
加入封闭剂封闭2h；封闭剂为Hepes缓冲液，并含有5％BSA；
③抗人可溶性ST2蛋白抗体的生物素化
表达、纯化目标所需的两种人源化改造的纳米单克隆抗体，并利用生物素连接酶试剂盒分别将两种人源化改造的纳米单克隆抗体与生物素混合，30℃反应1h；反应液分别离心去除沉淀后，上清放入透析袋中，在硼酸缓冲液中4℃透析过夜；最终获得两种“生物素化抗人可溶性ST2蛋白抗体”；
④“生物素化可溶性ST2蛋白抗体”与链酶亲和素包被颗粒的连接
将步骤②制得的胶乳颗粒溶液与步骤③获得的两种“生物素化可溶性ST2蛋白抗体”分别混合，并分别置于37℃摇床孵育2h，形成两种“胶乳颗粒-链酶亲和素-生物素-抗人可溶性ST2蛋白抗体的复合物”；
⑤混合
将两种“胶乳颗粒-链酶亲和素-生物素-抗人可溶性ST2蛋白抗体的复合物”按质量比1:1混合构成完整的“包被抗人可溶性ST2蛋白抗体的胶乳颗粒”，并用步骤(2)制得的稀释缓冲液进行稀释，稀释至最终质量体积比为0.1％；
(4)配制校准品：
将校准品的防腐剂、稳定剂、ST2抗原和缓冲液进行混合，获得校准品。
本发明制得的所述人可溶性ST2蛋白增强免疫比浊试剂盒可在半自动、全自动生化分析仪上用于定量检测人体血液中可溶性ST2蛋白的含量，其中所述血液包括全血、血清及血浆。
本发明相比现有技术的优点在于：
(1)本发明试剂盒具有操作简单、可自动化的特点；
(2)本发明试剂R2中的胶乳颗粒与抗人可溶性ST2蛋白抗体为间接连接系统，所述间接连接系统为“链霉亲和素-生物素连接系统”；所述“链霉亲和素-生物素连接系统”在不增加非特异干扰的前提下，可极大提高检测方法的灵敏度；
(3)本发明对试剂R2中抗体进行了设计与改造；一方面是对序列进行了筛选设计，获得了两个目标序列，基于该氨基酸序列的抗体亲和力更高，针对st2抗原具有更好的特异性；一方面是在所用抗体的c端加入了avi标签，进而便于后续通过生物素连接酶将Avi标签生物素化，使“链霉亲和素-生物素连接系统”更精准地发挥作用，提高最终检测的灵敏度；
(4)本发明试剂盒与现有试剂盒对同一样本的可溶性ST2蛋白检测结果经统计分析，结果相关性好，结果准确可靠，并无显著差异，在临床上可替代现有的产品使用，并能显著降低检测成本。
附图说明
图1是实施例2中可溶性ST2蛋白结合抗体亲和力ELISA检测结果图；
图2是实验例1中检测试剂盒的线性范围相关性图；
图3是实验例1中本发明试剂盒与免疫荧光层析试剂盒检测临床样本的相关性比较图。
具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
以下实施例中的所使用的试剂产品及实验方法，未经特别说明的，均为本领域常规试剂或方法，不再赘述。
实施例1
本实施例的一种定量检测可溶性ST2蛋白的胶乳增强免疫比浊试剂盒，包括试剂R1、试剂R2和校准品。
所述试剂R1包括：5mg/mL牛血清白蛋白，0.1mg/mL明胶，0.5％ PEG6000，0.05％ProClin300，50mM Tris-HCl缓冲液(内含150mM NaCl，缓冲液pH7.5)。
所述试剂R2包括：5mg/mL牛血清白蛋白，25mg/mL海藻糖，0.05％ProClin300，0.01％ Tween 20，20mM Hepes缓冲液(pH7.5)，30mM硼酸缓冲液(pH8.0)，终浓度0.1％的包被抗人可溶性ST2蛋白抗体的胶乳颗粒。
所述校准品包括：0.1％叠氮钠，10mg/mL牛血清白蛋白，50mg/mL海藻糖，0～500ng/mL ST2蛋白抗原，20mM磷酸盐缓冲液(pH7.2)。
具体地，本实施例中，所述试剂R2的“包被抗人可溶性ST2蛋白抗体的胶乳颗粒”中，具体采用两种人源化改造的纳米单克隆抗体作为抗人可溶性ST2蛋白抗体(质量比1:1)，且两种抗体分别与胶乳颗粒之间通过“链酶亲和素-生物素系统”连接。其中，两种纳米单克隆抗体的原始氨基酸序列分别为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示，人源化改造指对所述纳米单克隆抗体的C端融合人源Fc序列并加入Avi-Tag标签(改造后序列N端-C端为，抗体自身序列+Fc+Avi)。
具体地，本实施例中，所述校准品的ST2蛋白抗原采用安徽千诚生物技术有限公司生产的“重组人STR抗原”，来源于HEK293细胞，人，纯度≥95％，货号：AG02301(也可采用现有市场的其他体外真核系统表达并纯化的重组ST2蛋白)。
实施例2
实施例1中两种“抗人可溶性ST2蛋白抗体”的获得方法。
(1)CHO-K1-ST2蛋白抗体稳定细胞株的构建
细胞复苏：取一支液氮冻存细胞(约1x10E7细胞)，37℃水浴快速融化，300g，离心5min。用酒精棉擦拭冻存管后置于超净工作台，吸出上清，用20mL预温的CHO完全培养基重悬，置于125mL摇瓶培养，37℃，5％ CO2，转速120～130rpm。
质粒抽提：提前接种“含有抗体1/抗体2稳转载体的DH5a菌株”(生物公司基因合成，抗体1、抗体2氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2，且抗体的C端融合人源Fc序列并加入Avi-Tag标签)，并37℃培养过夜，用商业化质粒抽提试剂盒抽提pXC17.4-ST2抗体1、pXC17.4-ST2抗体2稳转质粒。
细胞转染：细胞活率大于95％，无明显细胞聚团，密度在2到3x 10E6时，取4x 10E7细胞，300g，离心5min。去除上清，用Celetrix商业化电转液400uL重悬细胞。抗体1和抗体2质粒各使用25ug，分别消耗细胞2x10E7。用Celetrix细胞电转仪1250V电压下进行电转。
细胞恢复及加压：转染后的细胞用CHO完全培养基重悬，并在37℃，5％CO2培养箱中静置恢复24h。恢复后的细胞300g，离心5min，去除培养基后加入CHO培养基并添加25uMMSX，细胞密度为1x10E6。37℃，5％ CO2培养箱中静置8到10天至细胞活率大于30％。
单克隆筛选：将细胞活率大于30％的细胞池用康晟商业化单克隆培养基稀释至2.5cell/mL，200uL/孔铺96孔板，共30块板。37℃，5％ CO2培养箱中静置培养至单克隆长满孔。将表达量高的单克隆转移至摇瓶扩大培养，将最终确定的单克隆构建CHO-K1工作细胞库，并冻存于液氮罐中，用于后续抗体的表达。
(2)CHO-K1悬浮表达系统表达“抗人可溶性ST2蛋白抗体”
细胞复苏：从液氮罐中取出步骤(1)构建的CHO-K1工作细胞株，37℃水浴快速解冻后，用CHO细胞培养基重悬细胞，并放入细胞培养摇床中培养复苏48h。
细胞转接及流加培养：细胞恢复后，将细胞转接至发酵培养基中，密度0.5x10E6。培养至Day5，开始流加补料，到Day7降温培养。
上清收取：培养至Day15或细胞活率低于60％，将培养上清离心，去除细胞沉淀，保留上清。
(3)亲和纯化“抗人可溶性ST2蛋白抗体”
亲和柱装填：计算所需商品化的Protein A填料，并将填料进行装柱，将装柱的填料用PBS平衡缓冲液进行清洗。
上样及清洗：将离心收集的ST2蛋白抗体细胞上清低流速上样，上样结束后用平衡缓冲液清洗10个柱体积，用pH5.0的预洗脱液A清洗10个柱体积。
洗脱与中和：将预洗脱液清洗后的填料，用pH3.2的柠檬酸洗脱液进行洗脱，洗脱后的蛋白用2M的Tris缓冲液进行中和，将中和后的抗体溶液测定蛋白浓度后透析换液至PBS中并分装保存。
(4)“抗人可溶性ST2蛋白抗体”ELISA亲和力检测
铺板：重组人可溶性ST2蛋白用碳酸盐缓冲液稀释至浓度0.5ug/mL，以100uL/孔加入至Elisa板中，4℃静置过夜。
封闭：用PBS+0.1％吐温20清洗液清洗ELISA板3遍后，加入PBST+2.5％脱脂奶粉封闭液，加入量为200uL/孔，37℃封闭1h。
一抗结合：用PBS+0.1％吐温20清洗液清洗ELISA板3遍，用PBST+2.5％脱脂奶粉稀释抗体，首孔浓度1ug/mL，3倍梯度稀释，共8个梯度。将稀释好的抗体加入到Elisa板中，加入量为100uL/孔，37℃孵育2h。
二抗结合：用PBS+0.1％吐温20清洗液清洗ELISA板3遍，用PBST+2.5％脱脂奶粉稀释羊抗人Fc-HRP二抗。将稀释好的抗体加入到Elisa板中，加入量为100uL/孔，37℃孵育1h。
显色：用PBS+0.1％吐温20清洗液清洗ELISA板3遍，加入OPD显色液，加入量为100uL/孔。显色5～15min后，每孔加入100uL 2M H2SO4进行终止，并用酶标仪在波长OD450下进行检测。将检测结果用Graphpad进行处理，处理结果见图1。由图1可知：抗体1、抗体2分别与可溶性ST2蛋白有很好的结合活性，两株抗体的Ec50范围在5～20ng/ml。
实施例3
本实施例的一种上述实施例1中定量检测可溶性ST2蛋白的胶乳增强免疫比浊试剂盒的制备方法，基于实施例1配方，包括如下步骤：
(1)配制试剂R1：
在50mM的Tris-HCl缓冲液(内含150mM NaCl，缓冲液pH7.5)中加入5mg/mL牛血清白蛋白、0.1mg/mL明胶、0.5％ PEG6000、0.05％ ProClin300，搅拌均匀，即为R1试剂。
(2)配制试剂R2的稀释缓冲液：
将30mM硼酸缓冲液(pH8.0)、20mM Hepes缓冲液(pH7.5)、5mg/mL牛血清白蛋白、25mg/mL海藻糖、0.05％ ProClin300、0.01％ Tween 20进行混合，获得试剂R2的稀释缓冲液。
(3)配制试剂R2：
①胶乳颗粒的洗涤及活化
将胶乳颗粒加入MES洗涤液离心，弃上清，重复洗涤3次；
将沉淀重悬于MES偶联缓冲液中，并加入EDC活化30min；
活化后的胶乳颗粒用MES偶联缓冲液洗涤3次后重悬，使胶乳颗粒质量体积比终浓度为1％。
②链酶亲和素偶联
取1mL活化洗涤后的胶乳溶液，加入0.5mg/mL链酶亲和素；混匀后25℃摇床220rpm偶联3h；
用Hepes缓冲液洗涤微球颗粒，重复3次；
加入封闭剂封闭2h；封闭剂为Hepes缓冲液，并含有5％BSA。
③抗人可溶性ST2蛋白抗体的生物素化
取实施例2制得的两种抗人可溶性ST2蛋白抗体，并利用生物素连接酶试剂盒(安徽千诚生物技术有限公司，货号：SCSA003)分别将两种人源化改造的纳米单克隆抗体与生物素混合，30℃反应1h(操作方法参照试剂盒的说明书，1mg抗体使用1ug生物素连接酶)；反应液分别离心去除沉淀后，上清放入透析袋中，在硼酸缓冲液中4℃透析过夜；最终获得两种“生物素化抗人可溶性ST2蛋白抗体”。
④“生物素化可溶性ST2蛋白抗体”与链酶亲和素包被颗粒的连接
将步骤②制得的胶乳颗粒溶液与步骤③获得的两种“生物素化可溶性ST2蛋白抗体”分别混合，并分别置于37℃摇床孵育2h，形成两种“胶乳颗粒-链酶亲和素-生物素-抗人可溶性ST2蛋白抗体的复合物”。
⑤混合
将两种“胶乳颗粒-链酶亲和素-生物素-抗人可溶性ST2蛋白抗体的复合物”按质量比1:1混合构成完整的“包被抗人可溶性ST2蛋白抗体的胶乳颗粒”，并用步骤(2)制得的稀释缓冲液进行稀释，稀释至最终质量体积比为0.1％。
(4)配制校准品：
在pH7.2并含有0.1％叠氮钠、10mg/mL牛血清白蛋白、50mg/mL海藻糖的20mM磷酸盐缓冲液中，加入浓度分别为0、25ng/mL、100ng/mL、250ng/mL、500ng/mL的ST2蛋白抗原，搅拌均匀，作为ST2蛋白校准品。
对比例1
本对比例的一种定量检测可溶性ST2蛋白的胶乳增强免疫比浊试剂盒，其制备方法与实施例3基本相同，主要不同之处在于：“包被抗人可溶性ST2蛋白抗体的胶乳颗粒”中采用普通ST2蛋白抗体ST2D1、ST2D3(安徽千诚生物技术有限公司，产品货号：MC02301、MC02303，分别作为抗体1、抗体2)，并在其C端融合人源Fc序列，加入Avi-Tag标签。
即，相对实施例3而言，本对比例抗体仅氨基酸序列不同。
对比例2
本对比例的一种定量检测可溶性ST2蛋白的胶乳增强免疫比浊试剂盒，其制备方法与实施例3基本相同，主要不同之处在于：“包被抗人可溶性ST2蛋白抗体的胶乳颗粒”采用未经任何改造的本发明纳米单克隆抗体1、抗体2。
即，相对实施例3而言，本对比例抗体氨基酸序列相同，但其C端不融合人源Fc序列，也不加入Avi-Tag标签。
对比例3
本对比例的一种定量检测可溶性ST2蛋白的胶乳增强免疫比浊试剂盒，其制备方法与实施例3基本相同，主要不同之处在于：“包被抗人可溶性ST2蛋白抗体的胶乳颗粒”采用未经Avi-Tag改造的本发明纳米单克隆抗体1、抗体2。
即，相对实施例3而言，本对比例抗体氨基酸序列相同，C端融合人源Fc序列，但其C端不加入Avi-Tag标签。
试验例1
本实验例用以测试本发明可溶性ST2蛋白试剂盒(实施例3方法制备的试剂盒)的性能。
一、生化分析仪检测方法：
以日立7180生化分析仪为例：测定波长570nm，先加入R1试剂150uL，37℃孵育30s；加入校准品10uL，37℃反应60s；加入R2试剂50uL，37℃反应60s；测定各管吸光值A1，反应5min后，读取各管吸光值A2，计算吸光度差值ΔA＝A2-A1；每管至少重复测2次，将校准管2次测得的吸光度差值ΔA的平均值为纵坐标，对应浓度为横坐标，绘制“浓度-吸光度差值”校准曲线。
取待测血清或血浆样本，同法测定样本的吸光度差值，代入校准曲线，即可算出待测样本中的ST2蛋白的浓度。如果样本中的ST2蛋白的浓度超出标准曲线范围，需要对待测样本进行稀释后再检测，从而确保检测结果的准确性。
二、灵敏度检测：
5％牛血清白蛋白溶液为空白样本，按照上述生化分析仪检测方法反复测定20次以上，以空白均值加上两倍标准差作为最低检测限，结果显示本发明试剂盒的最低检测限为2ng/mL。
三、线性范围检测：
用接近ST2蛋白的浓度500ng/mL的高浓度样本，用生理盐水按照1/1，1/2，1/4，1/8，1/16，1/32，1/64，1/128，1/256稀释，共配制成9个梯度稀释浓度的样本溶液，用所述生化分析仪检测方法测定个稀释的样本浓度。每个浓度重复测定3次，分别求出测定结果的平均值。
以稀释浓度为自变量，以测定结果平均值为因变量求出线性回归方程，按照相应公式计算线性回归相关系数r。检测结果见表1，证明线性性能达到500ng/mL，相关方程为y＝1.0473x-1.7394，相关系数R2＝0.9997，见图2。
表1、本发明试剂盒线性范围检测
稀释比例 理论浓度(ng/mL) 检测浓度(ng/mL) 回收率(％)
1/256 2.0 1.9 95.0
1/128 3.9 4.0 102.6
1/64 7.8 7.8 100.0
1/32 15.6 15.3 98.1
1/16 31.3 31.5 100.6
1/8 62.5 63.2 101.1
1/4 125.0 127.0 101.6
1/2 250.0 253.0 101.2
1/1 500.0 526.0 105.2
四、重复性和准确度：
ST2蛋白的浓度为35ng/mL与200ng/mL的校准品作为样本，按所述生化分析仪检测方法进行测定，各浓度分别重复测定10次，分别计算测定均值和标准差，结果见表2。
表2、可溶性ST2蛋白试剂盒的重复性和准确度检测
由表2可知：可溶性ST2蛋白试剂盒的重复性及准确性都能达到市场应用的要求。
五、批间差：
按照本发明实施例3中所述的试剂盒制备方法制备三批试剂盒，用三批试剂盒按所述生化分析仪检测方法对同一份血清样本进行重复测定，每个批次重复测定三次，分别计算每批3次测定的均值，结果见表3。
表3、可溶性ST2蛋白试剂盒的批间差检测
由表3可知：3个批次的可溶性ST2蛋白试剂盒的批间差较小相对偏差小于5％。
六、本发明试剂盒与免疫荧光层析试剂盒检测临床样本的相关性比较
由于市场上还没有已上市的可溶性ST2蛋白的胶乳增强比浊检测试剂盒产品，所以本试剂盒用临床上已使用的美国重症监护诊断股份有限公司的试剂盒产品作为对照，对80例临床样本进行检测，检测结果见图3。以对照试剂盒检测的样本ST2蛋白浓度为横坐标，以本发明试剂盒检测ST2蛋白浓度为纵坐标作回归分析，相关方程为：y＝0.9531x+2.5495，线性相关系数R2＝0.9981。
上述结果显示：本发明试剂盒对临床样本的检测与对照试剂盒对临床样本的检测值及趋势有很好的临床相关性。
试验例2
本试验例用以验证本发明试剂盒与对比例1～3试剂盒的性能差异。
分别对本发明实施例3及对比例1、2、3试剂盒中的抗体进行ELISA实验，检测其亲和力，结果如表4所示。
同时，分别采用本发明实施例3与对比例1、2、3试剂盒进行同一标准ST2样品检测，结果如表5所示。
表4、本发明及各对比例抗体的ELISA检测亲和力比较
样本 Ec50(ng/mL) 样本 Ec50(ng/mL)
对比例1-抗体1 46.8 对比例1-抗体2 85.1
对比例2-抗体1 5.6 对比例2-抗体2 14.3
对比例3-抗体1 15.7 对比例3-抗体2 28.3
本发明-抗体1 16.8 本发明-抗体2 25.4
表5、本发明及各对比例试剂的检测结果比较
由表4、表5结果可知：
(1)基于特定序列的本发明抗体，亲和力更高，针对st2抗原的特异性更好(结合对比本发明和对比例1数据结果可知)；
(2)在抗体c端加入avi标签，可进一步提高最终检测的灵敏度，特异性差异不大(结合对比本发明和对比例3数据结果可知)；
(3)在抗体c端融合人源Fc序列，可使得纳米抗体的可变区距离胶乳微球表面有一定的空间距离与位阻，能更好保留纳米抗体的可变区与抗原的结合活性，从而使得纳米抗体更适合用于胶乳免疫比浊工艺，增加纳米抗体制成成品胶乳试剂的检测灵敏度(结合对比例2、3数据结果可知)。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种定量检测可溶性ST2蛋白的胶乳增强免疫比浊试剂盒，其特征在于，包括试剂R1、试剂R2和校准品；
所述试剂R1包括稳定剂、促凝剂、防腐剂和缓冲液；
所述试剂R2包括稳定剂、防腐剂、表面活性剂、缓冲液、包被抗人可溶性ST2蛋白抗体的胶乳颗粒；
所述校准品包括防腐剂、稳定剂、ST2抗原和缓冲液；
所述试剂R2的“包被抗人可溶性ST2蛋白抗体的胶乳颗粒”中，具体采用两种人源化改造的纳米单克隆抗体作为抗人可溶性ST2蛋白抗体，且两种抗体分别与胶乳颗粒之间通过“链酶亲和素-生物素系统”连接；其中，两种纳米单克隆抗体的原始氨基酸序列分别为SEQID NO.1、SEQ ID NO.2所示，人源化改造指对所述纳米单克隆抗体的C端融合人源Fc序列并加入Avi-Tag标签。
2.根据权利要求1所述的定量检测可溶性ST2蛋白的胶乳增强免疫比浊试剂盒，其特征在于，所述试剂R1中：
所述稳定剂包括5mg/mL牛血清白蛋白和0.1mg/mL明胶；
所述促凝剂为终浓度0.5％的PEG6000；
所述防腐剂为0.05％ProClin300；
所述缓冲液包括50mM Tris-HCl缓冲液和150mM NaCl，缓冲液pH 7.5。
3.根据权利要求1所述的定量检测可溶性ST2蛋白的胶乳增强免疫比浊试剂盒，其特征在于，所述试剂R2中：
所述稳定剂包括5mg/mL牛血清白蛋白和25mg/mL海藻糖；
防腐剂为0.05％ProClin300；
所述表面活性剂为0.01％Tween 20；
所述缓冲液包括20mM、pH 7.5的Hepes缓冲液以及30mM、pH 8.0的硼酸缓冲液；
所述包被抗人可溶性ST2蛋白抗体的胶乳颗粒，终浓度0.1％。
4.根据权利要求1所述的定量检测可溶性ST2蛋白的胶乳增强免疫比浊试剂盒，其特征在于，所述试剂R2的包被抗人可溶性ST2蛋白抗体的胶乳颗粒中，两种人源化改造的纳米单克隆抗体之间的质量比为1:1。
5.根据权利要求1所述的定量检测可溶性ST2蛋白的胶乳增强免疫比浊试剂盒，其特征在于，所述校准品中：
所述防腐剂为0.1％叠氮钠；
所述稳定剂包括10mg/mL牛血清白蛋白和50mg/mL海藻糖；
所述ST2抗原为浓度0～500ng/mL的ST2蛋白抗原；
所述缓冲液为浓度20mM、pH7.2的磷酸盐缓冲液。
6.根据权利要求1所述的定量检测可溶性ST2蛋白的胶乳增强免疫比浊试剂盒，其特征在于，所述校准品的ST2蛋白抗原为体外真核系统表达并纯化的重组ST2蛋白，纯度≥95％。
7.根据权利要求1～6任一所述的定量检测可溶性ST2蛋白的胶乳增强免疫比浊试剂盒，其特征在于，所述“包被抗人可溶性ST2蛋白抗体的胶乳颗粒”通过如下方法获得：
(1)胶乳颗粒的洗涤及活化
①将胶乳颗粒加入MES洗涤液离心，弃上清，重复洗涤若干次；
②将沉淀重悬于MES偶联缓冲液中，并加入EDC活化；
③活化后的胶乳颗粒用MES偶联缓冲液洗涤后重悬；
(2)链酶亲和素偶联
①取活化洗涤后的胶乳溶液，加入链酶亲和素；混匀后摇床偶联；
②用Hepes缓冲液洗涤微球颗粒，重复若干次；
③加入封闭剂封闭；
(3)抗人可溶性ST2蛋白抗体的生物素化
表达、纯化目标所需的两种人源化改造的纳米单克隆抗体，并利用生物素连接酶试剂盒分别将两种人源化改造的纳米单克隆抗体与生物素混合反应；反应液分别离心去除沉淀后，上清放入透析袋中，在硼酸缓冲液中透析过夜；最终获得两种“生物素化抗人可溶性ST2蛋白抗体”；
(4)“生物素化可溶性ST2蛋白抗体”与链酶亲和素包被颗粒的连接
将步骤(2)制得的胶乳颗粒溶液与步骤(3)获得的两种“生物素化可溶性ST2蛋白抗体”分别混合，并分别置于摇床中孵育，形成两种“胶乳颗粒-链酶亲和素-生物素-抗人可溶性ST2蛋白抗体的复合物”；
(5)混合
将两种“胶乳颗粒-链酶亲和素-生物素-抗人可溶性ST2蛋白抗体的复合物”按质量比1:1混合构成完整的“包被抗人可溶性ST2蛋白抗体的胶乳颗粒”。
8.一种如权利要求1～7任一所述的定量检测可溶性ST2蛋白的胶乳增强免疫比浊试剂盒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)配制试剂R1：
将试剂R1的各组分于同一容器中混合，混合均匀后，制得试剂R1；
(2)配制试剂R2的稀释缓冲液：
将试剂R2的稳定剂、防腐剂、表面活性剂、缓冲液进行混合，获得试剂R2的稀释缓冲液；
(3)配制试剂R2：
①胶乳颗粒的洗涤及活化
将胶乳颗粒加入MES洗涤液离心，弃上清，重复洗涤3次；
将沉淀重悬于MES偶联缓冲液中，并加入EDC活化30min；
活化后的胶乳颗粒用MES偶联缓冲液洗涤3次后重悬，使胶乳颗粒质量体积比终浓度为1％；
②链酶亲和素偶联
取1mL活化洗涤后的胶乳溶液，加入0.5mg/mL链酶亲和素；混匀后25℃摇床220rpm偶联3h；
用Hepes缓冲液洗涤微球颗粒，重复3次；
加入封闭剂封闭2h；封闭剂为Hepes缓冲液，并含有5％BSA；
③抗人可溶性ST2蛋白抗体的生物素化
表达、纯化目标所需的两种人源化改造的纳米单克隆抗体，并利用生物素连接酶试剂盒分别将两种人源化改造的纳米单克隆抗体与生物素混合，30℃反应1h；反应液分别离心去除沉淀后，上清放入透析袋中，在硼酸缓冲液中4℃透析过夜；最终获得两种“生物素化抗人可溶性ST2蛋白抗体”；
④“生物素化可溶性ST2蛋白抗体”与链酶亲和素包被颗粒的连接
将步骤②制得的胶乳颗粒溶液与步骤③获得的两种“生物素化可溶性ST2蛋白抗体”分别混合，并分别置于37℃摇床孵育2h，形成两种“胶乳颗粒-链酶亲和素-生物素-抗人可溶性ST2蛋白抗体的复合物”；其中，采用1L的0.5％的胶乳颗粒溶液分别加入抗体量为100mg的抗体进行混合孵育；
⑤混合
将两种“胶乳颗粒-链酶亲和素-生物素-抗人可溶性ST2蛋白抗体的复合物”按质量比1:1混合构成完整的“包被抗人可溶性ST2蛋白抗体的胶乳颗粒”，并用步骤(2)制得的稀释缓冲液进行稀释，稀释至最终质量体积比为0.1％；
(4)配制校准品：
将校准品的防腐剂、稳定剂、ST2抗原和缓冲液进行混合，获得校准品。
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