CN116120459A - 一种抗人IgE纳米抗体及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种抗人IgE纳米抗体及其制备方法和应用，该抗人IgE纳米抗体是一种可以与人IgE特异性结合的单域抗体，其仅由一个结构域组成，具有耐酸碱、耐高温、特异性高、分子量小、亲和力高和可大规模生产等优点，且没有普通抗体的重链和轻链的非特异性结合或污染，可以用于人IgE检测、纯化及富集，具有较高的检测准确率和灵敏度。

Description

一种抗人IgE纳米抗体及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及一种抗人IgE纳米抗体，还涉及该纳米抗体的制备方法及其在过敏原诊断、人IgE抗体纯化、富集等领域的应用，属于单域抗体制备(又称纳米抗体制备)、基因工程抗体制备、体外诊断技术领域。
背景技术
过敏疾病是世界上的重大卫生问题之一，据统计全世界约有30％～40％的人患有或患过各种各样的过敏疾病，更快速、更准确的诊断过敏性疾病对于治疗过敏疾病是非常必要的。
传统的检测方案通常采用鼠抗人IgE抗体作为主要原材料应用在过敏原体外诊断试剂盒的开发中，但是鼠抗人IgE抗体分子量大，导致标记物与样本中的过敏原特异性IgE易受到空间位阻的影响，导致结合效率偏低。
为了提高检测体系的灵敏度，行业内通常的做法是将过敏原进行生物素标记以提高其包被量，或者在包被天然过敏原的同时一起包被致敏率较高的重组过敏原。上述方案不仅增加了生产成本，而且未能从根本上解决过敏原检测灵敏度不足的问题。且单克隆抗体的研发和生产过程极其繁琐和复杂，且抗体稳定性差、生产成本高，相比之下，纳米抗体(Nbs)是来自于骆驼或鲨鱼免疫球蛋白重链的单域抗体(sdAbs)，分子量约15kDa，它代表了具有完全抗原结合能力的最小抗体单位。与常规抗体相比，天然纳米抗体具有特殊性能，如高亲和力、热稳定性、易于生产、更高的多样性，且由于互补决定区3(CDR3)较长而提高了其检测隐性表位的能力。与此同时纳米抗体没有传统抗体所具有的Fc段，在体外诊断试剂盒的开发中，直接避免了样本中的类风湿因子、异嗜性反应等因素所造成的检测结果的假阳性或者假阴性，提高了检测准确率；纳米抗体分子量小，亲和力高的特点降低了反应过程的空间位阻，提高了反应的灵敏度。因此，纳米抗体在体外诊断领域尤其在过敏原的体外诊断领域应用前景广阔。
发明内容
针对现有鼠抗人IgE单克隆抗体存在的不足，本发明提供了一种抗人IgE纳米抗体，该纳米抗体是一种可以与人IgE特异性结合的单域抗体，其分子量小，没有传统抗体所具有的Fc段，特异性强、亲和力高，用于人IgE检测时可以避免假阳性或者假阴性，准确率高、灵敏度高。
本发明具体技术方案如下：
本发明提供了两株抗人IgE纳米抗体(简称纳米抗体)，所述纳米抗体具有SEQ IDNO.1所示的氨基酸序列或SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。
进一步的，所述抗人IgE纳米抗体的氨基酸序列分为四个框架区(Frameworkregion,FR)和三个互补决定区(complementarity determining region,CDR)。
进一步的，本发明所提供的氨基酸序列可以作为前体，通过随机或定点突变技术进行改造，获得性质(水溶性、稳定性、亲和力及特异性等)更好的突变体，该突变体能够与人IgE特异性结合。
本发明还提供了编码上述抗人IgE纳米抗体的核酸分子，其中编码SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，编码SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
本发明提供的核苷酸序列可以通过合适的表达系统进行表达以得到抗人IgE纳米抗体。这些表达系统包括细菌、真菌、动物细胞、植物细胞、昆虫细胞或无细胞表达系统。
本发明还提供了一种重组表达载体，所述重组表达载体中包含上述核酸分子。该重组表达载体由表达载体和本发明核酸分子按照现有技术常用的基因重组技术重组而得。所用的表达载体可以为pET系列、pGEX系列、pPICZα-A、pPIC9、pPIC9K、pPIC3.5K、pMECS等。
本发明还提供了一种重组宿主细胞，该重组宿主细胞中包含上述重组表达载体。该重组宿主细胞通过宿主细胞转化或转染重组表达载体而得，转化或转染的方式可以采用本领域常用的方式进行,转化或转染的方式可以为化学转化法、电化学转化法。所述宿主细胞可以选择：BL21(DE3)、Rosetta-gami(DE3)、OrigamiB(DE3)、Rosetta(DE3)、毕赤酵母(P.pastoris)、WK6等。
本发明还提供了一种上述抗人IgE的纳米抗体的制备方法，该方法是：培养上述重组宿主细胞，通过重组宿主细胞的表达得到抗人IgE纳米抗体。该制备方法操作简单、便于工业化大规模生产，且成本较低。
在本发明某一具体实施方式中，提供了一种具体的抗人IgE纳米抗体的制备方法，其包括以下步骤：将重组表达载体转化至宿主细胞BL21等中，得到重组宿主细胞。将该重组宿主细胞在含有氨苄青霉素的培养基中进行扩大培养，温度设置为37℃左右；当菌体OD在0.6左右时加入诱导剂IPTG诱导纳米抗体的表达，28℃左右培养48小时；高速离心收集菌体，将菌体破碎，使其中的纳米抗体析出，纳米抗体进行纯化，从而得到抗人IgE的纳米抗体。其中，菌体破碎可以采用现有技术常用的方法，例如超声破碎法、加渗透压破菌法等。
本发明还提供了一种经化学标记或生物标记的抗人IgE纳米抗体，即将上述抗人IgE纳米抗体进行化学标记或生物标记而形成。所述化学标记可以为同位素标记、免疫毒素标记、化学药物标记等，所述生物标记可以为生物素标记、亲和素标记、酶标记等。同位素可以为2H(氘)、15N、13C或15N和13C等，免疫毒素可以为细菌性毒素、植物性毒素、人源性蛋白毒素、双弹头或杂合弹头毒素等，化学药物可以为吖啶酯(AE)、鲁米诺、异硫氰酸荧光素(FITC)等。化学标记或生物标记的方式可以根据现有技术中报道的方式进行，这对本领域技术人员来说不具有难度。
在本发明的某一具体实施方式中，提供了一种采用吖啶酯(AE)标记的抗人IgE纳米抗体，该吖啶酯(AE)标记的抗人IgE纳米抗体可以采用以下步骤制得：
1、将抗人IgE纳米抗体(简称纳米抗体)使用pH7.5的0.02M PB缓冲液稀释至终浓度为1.0mg/ml，然后加入纳米抗体10倍摩尔量的吖啶酯(AE)，充分混匀，室温避光、静置反应30min；
2、反应后，向步骤1的反应液中加入反应体系十分之一体积的0.1M的Tris缓冲液，充分混匀，室温避光、静置反应30min，得到标记产物——吖啶酯(AE)标记的抗人IgE纳米抗体。
3、反应后，将标记产物全部吸至透析袋中，于2-8℃中使用pH7.0的0.02M PB缓冲液透析48小时，并将标记后的抗体使用复溶液(20mM tris、1％酪蛋白、0.1％TritonX-100、0.1％ProClin-300，pH7.0)稀释至0.1ug/ml，即得吖啶酯标记的抗人IgE纳米抗体溶液，2-8℃保存备用。
本发明还提供了上述抗人IgE纳米抗体与固体介质或半固体介质偶联制得的偶联物，或者经化学标记或生物标记的抗人IgE纳米抗体与固体介质或半固体介质偶联制得的偶联物。所述固体介质可以为纳米磁珠、荧光微球、胶体金等，所述半固体介质可以为琼脂糖凝胶微球等。具体的偶联方式可以根据现有技术的报道进行操作。
在本发明某一具体实施方式中，提供了一种纳米磁珠偶联的抗人IgE纳米抗体，该纳米磁珠为载体，优选为甲苯磺酰基(-Tosyl)基团修饰的纳米磁珠。该纳米磁珠偶联的抗人IgE纳米抗体可以采用以下步骤制得：
1、将纳米磁珠超声分散，并使用pH9.5、100mM的BB标记缓冲液清洗三次，且纳米磁珠定标至终浓度20mg/ml；
2、按照每毫克纳米磁珠用30ug抗体的比例加入抗人IgE纳米抗体，反应10min；
3、加入偶联增强剂(NH4)2SO4至其终浓度为1.0M，过夜反应；
4、清洗纳米磁珠三次，加入封闭剂BSA至终浓度为1wt％，过夜反应；
5、清洗纳米磁珠三次，使用磁珠稀释液(50mM tris、0.9wt％NaCl、1wt％牛血清白蛋白、0.1wt％TritonX-100、0.1wt％ProClin-300pH8.0)重悬纳米磁珠，至终浓度为0.4mg/mL，即得纳米磁珠偶联的抗人IgE纳米抗体溶液，2-8℃保存备用。
本发明还提供了上述抗人IgE纳米抗体、上述偶联物在制备检测人IgE抗体、纯化人IgE抗体、富集人IgE抗体的产品中的应用。
本发明还提供了一种人IgE抗体检测试剂盒，该试剂盒包括上述抗人IgE纳米抗体或上述偶联物。
本发明取得的优点和积极效果为：
1、本发明纳米抗体是一种可以与人IgE特异性结合的单域抗体，可以用于人IgE检测、富集及纯化，例如用于制备检测和纯化人IgE的试剂和工具等。
2、本发明提供了该纳米抗体的基因序列，通过基因重组技术可以使该纳米抗体在真核细胞、原核细胞宿主细胞内高效表达，该纳米抗体制备过程简单，成本低，产量高，具有工业化生产前景。
3、本发明纳米抗体仅由一个结构域组成，具有耐酸碱、耐高温、特异性高、分子量小、亲和力高和可大规模生产等优点，且没有普通抗体的重链和轻链的非特异性结合或污染。
4、本发明纳米抗体可应用在过敏原诊断试剂盒的开发中，没有传统抗体所具有的Fc段，直接避免了样本中的类风湿因子、异嗜性反应等因素所造成的检测结果的假阳性或者假阴性，提高了检测准确率；本发明纳米抗体分子量小，亲和力高的特点降低了反应过程的空间位阻，提高了反应的灵敏度，无需在试剂盒的开发中使用链霉素-生物素的放大系统，节约了成本，降低了污染。
附图说明
图1为实施例1中VHH的基因电泳图；其中，泳道1是DNA分子标准，泳道2是PCR扩增得到的VHH片段；
图2为用噬菌体的酶联免疫方法(ELISA)筛选特异性单个阳性克隆的模式图；其中，1是经人IgE包被的ELISA板，2是抗人IgE纳米抗体，3是鼠抗HA抗体，4是山羊抗小鼠碱性磷酸酶标记的抗体，5是碱性磷酸酶显色液；
图3为实施例7中采用抗人IgE纳米抗体检测总IgE过敏原的流程图。
图4为实施例8中采用抗人IgE纳米抗体检测特异性IgE过敏原的流程图。
具体实施方式
下面通过实施例详细叙述本发明的技术方案，需要说明的是，本实施例是叙述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。
本发明中所使用的原料，如无特殊说明，均为常规的市售产品；本发明中所使用的方法，如无特殊说明，均为本领域的常规方法。
本发明首先将人IgE免疫一只新疆双峰驼，经过4次免疫之后提取该双峰驼外周血淋巴细胞并构建了针对于人IgE的纳米抗体文库。将人IgE抗体偶联在酶标板上，展示蛋白质的正确空间结构，使得人IgE抗体的抗原表位得以暴露出来，利用噬菌体展示技术筛选人IgE抗体免疫性的纳米抗体基因库(骆驼重链抗体噬菌体展示基因库)，从而最终获得能在宿主细胞中高效表达的纳米抗体株。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。
实施例1：针对于人IgE的纳米抗体文库(VHH)的构建：
(1)人IgE(购自holmes)浓度为500微克每毫升，每次免疫将1毫克人IgE与弗氏佐剂(购自sigma公司)等体积混合，免疫一只健康新疆双峰驼，每周一次，共免疫4次，除第一次使用完全的弗氏佐剂，剩余几次全部使用弗式不全佐剂，免疫过程中刺激B细胞表达抗原特异性的纳米抗体。
(2)4次免疫结束后，提取骆驼外周血淋巴细胞100ml并提取总RNA，参照QIAGEN公司提供的RNA提取试剂盒。按照Super-Script III FIRST STRANDSUPERMIX试剂盒说明书，将提取的RNA反转录成cDNA。
(3)VHH片段由两步PCR扩增获得
第一轮PCR：
以cDNA作模板
上游引物：GTCCTGGCTGCTCTTCTACAAGGC
下游引物：GGTACGTGCTGTTGAACTGTTCC
第一轮PCR扩增为扩增重链抗体引导肽和抗体CH2之间的片段，PCR程序为：54℃退火，25个循环；
第二轮PCR：
以第一轮PCR产物作模板，
上游引物：GATGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGRGGAGG
下游引物：GGACTAGTGCGGCCGCTGGAGACGGTGACCTGGGT
第二轮扩增为VHH片段，PCR程序为：60℃退火，17个循环，回收目的片段，结果如图1显示，从左到右的DNA条带分别是：第一为DNA分子Marker，第二为VHH电泳带约为500bp。
(4)使用限制性的内切酶(购自NEB)PstI及NotI酶切20μg pMECS噬菌体展示载体及10μg上述得到重链抗体可变区基因(VHH片段)，并用T4 DNA连接酶(购自TaKaRa公司)连接两个片段。
(5)将连接产物电转化至电转感受态细胞TG1中，构建针对于人IgE的纳米抗体噬菌体展示文库并通过平板计数法计算库容，库容的大小为1.8*109；与此同时，通过菌落PCR检测所建文库的插入率检测结果，插入率约100％。
实施例2：抗人IgE纳米抗体筛选过程：
(1)将人IgE溶解在pH 8.2、100mM NaHCO3溶液中，至终浓度为1-50ug/ml；取100μL偶联在酶标板上，4℃放置过夜，同时设立空白对照。
(2)第二天，两个孔中分别加入100微升0.1wt％的酪蛋白，室温封闭2小时。
(3)2小时后，加入8*1011tfu噬菌体(来自实施例1的针对于人IgE的纳米抗体噬菌体展示文库)，在室温下作用1小时。
(4)用PBST(PBS中含有0.05wt％吐温20)洗5遍，以洗掉不结合的噬菌体。
(5)用三乙基胺(100mM)将与人IgE特异性结合的噬菌体解离下，并感染处于对数期生长的大肠杆菌TG1，产生并纯化噬菌体用于下一轮的筛选，相同筛选过程重复3-4轮。在不断地筛选的过程中，阳性的克隆将不断地被富集，从而达到了利用噬菌体展示技术筛取抗体库中人IgE特异抗体的目的。
本实施例中为了获得亲和力高，特异性强的抗人IgE纳米抗体，在筛选过程中使用条件梯度筛选法，即第1轮筛选酶标板人IgE包被浓度是50ug/ml，第2轮筛选酶标板人IgE包被浓度是25ug/ml，第3轮筛选酶标板人IgE包被浓度是5ug/ml，第4轮筛选酶标板人IgE包被浓度是1ug/ml。
本实施例中为了消除人IgG、IgM的干扰，在筛选过程中先将待筛选的噬菌体与人IgG、IgM混合作用1h，然后进行步骤(3)的操作。
实施例3：用噬菌体的酶联免疫方法(ELISA)筛选特异性单个阳性克隆：
用噬菌体的酶联免疫方法(ELISA)筛选特异性单个阳性克隆，原理模式图如图2所示。步骤如下：
(1)从上述实施例2筛选后含有噬菌体的细胞培养皿中，挑选96个单个菌落并接种于含有100微克每毫升的氨苄青霉素的TB培养基(1升TB培养基中含有2.3克磷酸二氢钾，12.52克磷酸氢二钾，12克蛋白胨，24克酵母提取物，4毫升甘油)中，生长至对数期后，加终浓度1毫摩尔的IPTG，28℃培养过夜。
(2)利用渗透法获得粗提抗体，并将抗体转移到经人IgE包被的ELISA板中，在室温下放置1小时。
(3)用PBST洗去未结合的抗体，加入mouse anti-HAtag antibody(鼠抗HA抗体，购自Roche)，在室温下放置1小时。
(4)用PBST洗去未结合的抗体，加入anti-mouse alkaline phosphataseconjugate(山羊抗小鼠碱性磷酸酶标记抗体，购自Sigma)，在室温下放置1小时。
(5)用PBST洗去未结合的抗体，加入碱性磷酸酶显色液，于ELISA仪上，在405nm波长，读取吸收值。
(6)当样品孔OD值大于对照孔OD值3倍以上时，判为阳性克隆孔。
(7)将阳性克隆孔的菌转摇在含有100微克每毫升的LB液体中以便提取质粒并进行测序。
根据序列比对软件Vector NTI分析各个克隆株的基因序列，把CDR1，CDR2，CDR3序列相同的株视为同一克隆株，而其序列不同的株视为不同克隆株，最终得到2株纳米抗体，即本发明抗人IgE纳米抗体。其中一株抗人IgE纳米抗体记为抗人IgE纳米抗体1，其氨基酸序列如SEQ ID No.1，核酸序列如SEQ ID No.3所示；另一株抗人IgE纳米抗体记为抗人IgE纳米抗体2，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，核酸序列如SEQ ID No.4所示。
实施例4：纳米抗体在宿主菌大肠杆菌中表达、纯化：
(1)将前面实施例3测序分析所获得的2株抗人IgE纳米抗体克隆至表达性的载体PET-32a中，并将测序鉴定正确的重组质粒转化到表达型宿主菌BL21中。将BL21接种在100毫升含有100微克每毫升氨苄青霉素的LB培养液中，37℃摇床培养过夜；培养到OD值达到0.6-1时，加入IPTG，28℃摇床培养48h；测定过夜培养后的菌液OD应该在20-30。
(4)离心收集菌体，设置为Beckman JA-10 8000rpm 4℃15min。
(5)高压渗透法对纳米抗体进行初步纯化，步骤为：
5.1)配制高渗溶液TS(200g蔗糖、400ml1M Tris-HCl pH8.0、10ml100mM EDTA定容至1L)；
5.2)每100ml的菌液收集的菌体中加入1ml TS，吹打均匀，4℃，混匀2h；
5.3)2h后，使用1/4TS(一个体积的TS加3个体积的水)对菌体进行渗透冲击：每100ml的菌液收集的菌体中加入2ml 1/4TS，4℃，混匀2-3h；
5.4)2-3h后，加入100ul 2M MgCl2；
5.5)高速离心获取上清，设置为Beckman JA-25.50 8000rpm 4℃30min。
此处注意，蛋白已经在上清中而非在沉淀中。
本步骤中使用高压渗透法对纳米抗体进行初步纯化后获得的纳米抗体蛋白纯度在70％以上；与传统的细胞破碎的方法相比，避免了大肠杆菌固有蛋白的大量释放，有效的降低杂质蛋白在后续亲和纯化中的干扰。
(6)经镍柱离子亲和层析进一步纯化抗体蛋白，为获得高纯度的抗体，采用咪唑梯度洗脱法，低浓度咪唑洗脱液(50毫摩尔，100毫摩尔)用于洗去杂带，高浓度咪唑洗脱液(250毫摩尔，500毫摩尔)用于洗脱蛋白，最终可制备纯度达90％以上的抗体蛋白，即抗人IgE纳米抗体。
实施例5：纳米磁珠偶联的抗人IgE纳米抗体的制备
采用甲苯磺酰基(-Tosyl)修饰的纳米磁珠为载体，偶联采用上述实施例4的方法制得的抗人IgE纳米抗体1或抗人IgE纳米抗体2，得到纳米磁珠偶联的抗人IgE纳米抗体，具体制备方法如下：
将甲苯磺酰基(-Tosyl)修饰的纳米磁珠超声分散，并使用标记缓冲液(100mM BB，pH9.5)清洗三次，且纳米磁珠定标至终浓度20mg/ml；
按照每毫克纳米磁珠用30ug纳米抗体的比例加入抗人IgE纳米抗体1或抗人IgE纳米抗体2，反应10min；
加入偶联增强剂(NH4)2SO4至其终浓度在1.0M，过夜反应；
清洗偶联后的磁珠三次，加入封闭剂BSA至终浓度1wt％，过夜反应；
清洗偶联后的磁珠三次，得到纳米磁珠偶联的抗人IgE纳米抗体，使用磁珠稀释液(50mM tris、0.9wt％NaCl、1wt％牛血清白蛋白、0.1wt％TritonX-100、0.1wt％ProClin-300，pH8.0)将该纳米磁珠偶联的抗人IgE纳米抗体重悬，至终浓度为0.4mg/mL；2-8℃保存备用。
实施例6：吖啶酯(AE)标记的抗人IgE纳米抗体的制备
将抗人IgE纳米抗体(即采用上述实施例4的方法制得的抗人IgE纳米抗体1或抗人IgE纳米抗体2)透析至0.02M PB缓冲液中，至终浓度1.0mg/ml；
向上述缓冲液中加入抗人IgE纳米抗体10倍摩尔量的吖啶酯(AE)，充分混匀，室温避光、静置反应30min；
30min后，加入上述溶液十分之一体积的0.1M的Tris缓冲液，充分混匀，室温避光、静置反应30min；
30min后，将得到的吖啶酯(AE)标记的抗人IgE纳米抗体全部吸至透析袋中，使用0.02MPB缓冲液于2-8℃透析。透析液体积约为1-5L，每4小时换液1次，共计换液3次。并将吖啶酯(AE)标记的抗人IgE纳米抗体使用复溶液(20mM tris、1wt％酪蛋白、0.1wt％TritonX-100、0.1wt％ProClin-300，pH7.0)稀释至0.1ug/ml，2-8℃保存备用。
实施例7：基于抗人IgE纳米抗体制备的总IgE过敏原检测试剂盒
上述实施例5得到的纳米磁珠偶联的抗人IgE纳米抗体和实施例6得到的吖啶酯(AE)标记的人IgE纳米抗体可用于制备总IgE过敏原检测试剂盒，该试剂盒中含有纳米磁珠偶联的抗人IgE纳米抗体1和吖啶酯(AE)标记的人IgE纳米抗体2，或者含有纳米磁珠偶联的抗人IgE纳米抗体2和吖啶酯(AE)标记的人IgE纳米抗体1。
以实施例5中制备的纳米磁珠偶联的抗人IgE纳米抗体1及实施例6中制备的吖啶酯(AE)标记的人IgE纳米抗体2为例，在化学发光仪(深圳迎凯生物科技有限公司Shinei2910全自动化学发光免疫分析仪)上检测待测样本的总IgE抗体浓度，检测流程如图3所示。基于抗人IgE纳米抗体检测总IgE(磁微粒化学发光法)的反应原理为：待测样本、纳米磁珠偶联的抗人IgE纳米抗体和吖啶酯(AE)标记的抗人IgE纳米抗体试剂进行反应，反应结束后进行磁分离和清洗，从而将未结合的部分除去；然后加入发光底物液，诱导快速化学发光反应，通过利用检测仪器检测化学发光强度，待测样本中的总IgE抗体含量与化学发光强度成正比。本检测方法采用双抗体夹心法，具体步骤如下：
S1、校准品的配制
取人IgE，通过质控品稀释液(KH2PO4 2mM、Na2HPO4 8mM、NaCl 136mM、KCL 2.6mM)配制成浓度分别为2IU/mL、20IU/mL、100IU/mL、500IU/mL、1000IU/mL、5000IU/mL的校准品；
S2、待测样本：血浆或者血清。
S3、取反应管，每支反应管中分别加入10μL校准品、10μL质控品、10μL待测样本，然后向每支反应管中均加入40μL纳米磁珠偶联的抗人IgE纳米抗体1(实施例5)以及20μL吖啶酯(AE)标记的抗人IgE纳米抗体2(实施例6)，搅拌混匀后于37℃反应15分钟；
S4、反应结束后，进行磁分离，舍弃上清液，加入500μL清洗液，搅拌混匀后，进行磁分离，再次舍弃上清液；
S5、重复S4的清洗步骤，共计三次；
S6、然后向反应管中分别加入100μL激发液A和激发液B，搅拌混匀后将反应管置于光电盘中进行读数，测定发光值；
S7、利用校准品通过四参数模式拟合标准曲线，全自动化学发光免疫分析仪的操作软件将发光值带入四参数公式，即可计算得出待测样本中的总IgE抗体的浓度值。
病人血清/血浆中的内源性异惰性抗体、类风湿因子可结合其他种属的免疫球蛋白，包括作为免疫分析试剂的异源抗体，这些抗体会干扰免疫检验体系，造成与实际分析物浓度无关的虚高检测值，可能导致误诊。干扰可能由所用检测抗体的Fc片段介导。为了验证本发明抗人IgE纳米抗体的抗干扰能力，使用两种干扰样本，分别测试传统检测体系和本发明抗人IgE纳米抗体检测体系的抗干扰能力，步骤如下：
1、干扰样本制备：取羊抗鼠IgG(购自深圳菲鹏)，通过质控品稀释液(KH2PO4 2mM、Na2HPO4 8mM、NaCl 136mM、KCL 2.6mM)配制成浓度分别为100μg/mL、500μg/mL、1000μg/mL、5000μg/mL的干扰样本1，备用；取类风湿因子(RF)(购自深圳菲鹏)，通过质控品稀释液(KH2PO4 2mM、Na2HPO4 8mM、NaCl 136mM、KCL 2.6mM)配制成浓度分别为100IU/mL、200IU/mL、500IU/mL、1000IU/mL的干扰样本2，备用；
2、以鼠抗人IgE单克隆抗体制备的总IgE过敏原检测试剂为传统检测体系，将实施例5中的纳米抗体替换为鼠抗人IgE单克隆抗体1(购自武汉奥科)，将实施例6中的纳米抗体替换为鼠抗人IgE单克隆抗体2(购自武汉奥科)，将这两种鼠抗人IgE单克隆抗体代替本发明实施例7的两种抗人IgE纳米抗体，作为传统检测体系。以本发明上述实施例5得到的纳米磁珠偶联的抗人IgE纳米抗体1和实施例6得到的吖啶酯(AE)标记的人IgE纳米抗体2制备的总IgE过敏原检测体系为本发明抗人IgE纳米抗体检测体系。
3、检测步骤：参照图3中的流程，将不同干扰样本作为待测样本，按照上述S1-S7的步骤，采用本发明实施例5得到的纳米磁珠偶联的抗人IgE纳米抗体1和实施例6得到的吖啶酯(AE)标记的抗人IgE纳米抗体2进行检测。同时，将本发明纳米磁珠偶联的抗人IgE纳米抗体1和吖啶酯(AE)标记的抗人IgE纳米抗体2分别替换为纳米磁珠偶联的鼠抗人IgE单克隆抗体1和吖啶酯(AE)标记的鼠抗人IgE单克隆抗体2，采用相同的步骤对干扰样本进行检测。
传统检测体系和本发明体系的检测结果如下表1所示：
表1
Figure BDA0004067846710000101
Figure BDA0004067846710000111
从上述结果可以看出，在抗干扰样本浓度较低时，采用传统的检测体系得到的检测结果较为准确，没有明显的假阳性，但随着干扰样本浓度的升高，假阳性现象升高，明显影响了检测结果的准确性。而本发明抗人IgE纳米抗体检测体系在高浓度的干扰样本存在下仍旧不干扰检测，无假阳性现象，抗干扰能力强，可以为临床提供更为准确的诊断结果。
实施例8：基于抗人IgE抗体纳米抗体制备的特异性IgE过敏原检测试剂盒
上述实施例5得到的纳米磁珠偶联的抗人IgE纳米抗体和实施例6得到的吖啶酯(AE)标记的人IgE纳米抗体还可用于制备特异性IgE过敏原检测试剂盒，该试剂盒中含有纳米磁珠偶联的过敏原抗原2，还含有吖啶酯(AE)标记的人IgE纳米抗体1或吖啶酯(AE)标记的人IgE纳米抗体2。
以特异性IgE过敏原为户尘螨过敏原为例，采用本发明抗人IgE抗体纳米抗体检测户尘螨特异性IgE的方法为：将实施例5中的纳米抗体替换为户尘螨过敏源(购自greer)，按照与实施例5中同流程制备纳米磁珠偶联的户尘螨过敏原。参照图4中的流程，利用纳米磁珠偶联的户尘螨过敏原和吖啶酯(AE)标记的抗人IgE纳米抗体在化学发光仪(深圳迎凯生物科技有限公司Shine i2910全自动化学发光免疫分析仪)上检测待测样本中户尘螨特异性IgE抗体的含量。基于抗人IgE纳米抗体检测户尘螨特异性IgE抗体(磁微粒化学发光法)的反应原理是：将待测样本、纳米磁珠偶联的户尘螨过敏源和吖啶酯(AE)标记的抗人IgE纳米抗体试剂进行反应，反应结束后进行磁分离和清洗，从而将未结合的部分除去；然后加入发光底物液，诱导快速化学发光反应，通过利用检测仪器检测化学发光强度，待测样本中的过敏原特异性IgE抗体含量与化学发光强度成正比。本检测方法采用间接法，具体检测步骤如下：
S1、校准品的配制
取户尘螨特异性IgE(购自中国食品药品检定研究院)，通过质控品稀释液(KH2PO42mM、Na2HPO4 8mM、NaCl 136mM、KCL 2.6mM)配制成浓度分别为0IU/mL、0.35IU/mL、3.5IU/mL、17.5IU/mL、50IU/mL、100IU/mL的校准品；
S2、取反应管，向每支反应管中分别加入10μL校准品、10μL待测样本，并向每支反应管中加入40μL纳米磁珠偶联的户尘螨过敏原以及20μL吖啶酯(AE)标记抗人IgE纳米抗体1或吖啶酯(AE)标记抗人IgE纳米抗体2(实施例6)，搅拌混匀后于37℃反应15分钟；
S3、反应结束后，进行磁分离，舍弃上清液，加入500μL清洗液，搅拌混匀后，进行磁分离，再次舍弃上清液；
S4、重复S3的清洗步骤，共计三次；
S6、然后向反应管中分别加入100μL激发液A和激发液B，搅拌混匀后将反应管置于光电盘中进行读数，测定发光值；
S7、利用校准品通过四参数模式拟合标准曲线，全自动化学发光免疫分析仪的操作软件将发光值带入四参数公式，计算得出待测样本中的户尘螨特异性IgE抗体的浓度值。
以特异性IgE过敏原为户尘螨过敏源为例，评估传统检测体系和本发明抗人IgE纳米抗体检测体系的最低检出限，进而比较两个检测体系的灵敏度，具体方法如下：
1、取户尘螨特异性IgE(购自中国食品药品检定研究院)，使用质控品稀释液(KH2PO42mM、Na2HPO4 8mM、NaCl 136mM、KCL 2.6mM)进行梯度稀释，分别配制成浓度为2IU/ml、1IU/ml、0.5IU/ml、0.25IU/ml、0.125IU/ml、0.063IU/ml、0.031IU/ml、0.016IU/ml、0.008IU/ml、0.004IU/ml的样本溶液；
2、以纳米磁珠偶联的户尘螨过敏原和吖啶酯(AE)标记的抗人IgE纳米抗体2为本发明检测体系。以基于鼠抗人IgE单克隆抗体制备的户尘螨特异性IgE过敏原检测试剂为传统检测体系，将本发明吖啶酯(AE)标记的抗人IgE纳米抗体2替换为吖啶酯(AE)标记的鼠抗人IgE单克隆抗体2(购自武汉奥科)，即为传统检测体系。
3、检测步骤：参照图4中的流程，按照上述S1-S7的步骤，在化学发光仪(深圳迎凯生物科技有限公司Shine i2910全自动化学发光免疫分析仪)上检测不同浓度下的户尘螨特异性IgE的浓度。同时，将本发明吖啶酯(AE)标记的抗人IgE纳米抗体2替换为吖啶酯(AE)标记的鼠抗人IgE单克隆抗体2，采用相同的步骤对户尘螨特异性IgE进行检测。
传统检测体系和本发明检测体系的检测结果如下表2所示：
表2
Figure BDA0004067846710000131
从上表结果可以看出，采用传统检测体系检测户尘螨过敏原的最低检出限(LOD)为0.063IU/mL，而采用本发明检测系统检测户尘螨过敏原的最低检出限(LOD)为0.008IU/mL，由此可以看出本发明抗人IgE纳米抗体比传统的抗体能显著提高检测的灵敏度。
尽管为说明目的公开了本发明的实施例，但是本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明及所附权利要求的精神和范围内，各种替换、变化和修改都是可能的，因此，本发明的范围不局限于实施例所公开的内容。

Claims (10)

1.一种抗人IgE纳米抗体，其特征是：所述抗人IgE纳米抗体具有SEQ ID NO.1或SEQ IDNO.2所示的氨基酸序列。
2.编码权利要求1所述的抗人IgE纳米抗体的核酸分子。
3.根据权利要求2所述的核酸分子，其特征是：编码SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，编码SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
4.一种重组表达载体，其特征是：包含权利要求2或3所述的核酸分子。
5.一种重组宿主细胞，其特征是：包含权利要求4所述的重组表达载体。
6.一种权利要求1所述的抗人IgE纳米抗体的制备方法，其特征是：培养权利要求5所述的重组宿主细胞，通过重组宿主细胞的表达得到抗人IgE纳米抗体。
7.一种经化学标记或生物标记的权利要求1所述的抗人IgE纳米抗体。
8.权利要求1或7所述的针对抗人IgE纳米抗体与固体介质或半固体介质偶联制得的偶联物。
9.权利要求1或7所述的抗人IgE纳米抗体或权利要求8所述的偶联物在制备检测人IgE抗体、纯化人IgE抗体、富集人IgE抗体的产品中的应用。
10.一种人IgE抗体检测试剂盒，其特征是：包括权利要求1或7所述的抗人IgE纳米抗体或权利要求8所述的偶联物。
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