CN114634576B - 抗pivka-ii单克隆抗体及其应用 - Google Patents
抗pivka-ii单克隆抗体及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及生物技术领域，具体涉及抗PIVKA‑II单克隆抗体及其应用。公开了一组可以配合使用的PIVKA‑II单克隆抗体，本发明PIVKA‑II单克隆抗体与PIVKA‑II结合具有高特异性和稳定性，应用到试剂盒中可以实现实现对PIVKA‑II的高灵敏度、高精密度、宽线性范围的检测。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及抗PIVKA-II单克隆抗体及其应用。
相关申请
本申请要求2021年5月26日提交的申请号CN202110581767.8的优先权，均通过全文提述并入本文。
背景技术
异常凝血酶原(PIVKA-II)，是一种维生素K缺乏诱导蛋白。正常情况下维生素K充足，凝血酶原Gla结构域的10个谷氨酸残基(Glu)能被γ-谷氨酰羧化酶氧化成γ-羧基谷氨酸(Gla)，使之成为有活性的凝血酶原。当肝脏发生异常时，上述位点的一个或多个Glu残基羧化不全，从而形成PIVKA II，丧失凝血活性。因此，PIVKA-II的检测对于肝脏病变至关重要。
目前已知的蛋白检测方法较多，例如：放射免疫分析法(RIA)、酶免疫分析法(EIA)、化学发光免疫法(CLEIA)等。但RIA容易受到放射性同位素的辐射影响，EIA灵敏度低、准确性不高,已逐渐被市场淘汰，相对而言，CLEIA因为其简单的操作和较高的灵敏度逐渐受到关注，成为医疗诊断行业中更佳的选择。
早期的化学发光检测PIVKA II，多采用特异性识别PIVKA II的抗体与识别凝血酶原的抗体搭配使用，但存在检测灵敏度较低的问题，为了改善灵敏度，目前多采用多克隆抗体与单克隆抗体混合使用，但多克隆抗体本身特异性不如单克隆抗体，且因为制备批次不同，容易出现批间差，导致检测精密度降低。所以，高特异性且能配对使用的单克隆抗体，会是化学发光检测PIVKA II，甚至其他采用双抗夹心检测PIVKA II方法学的更好选择，但目前市面上使用的单克隆抗体可选择性较少，且特异性不够，亟待开发更多可供选择的高特异性单克隆抗体。
发明内容
为了解决目前利用双抗夹心检测PIVKA II中存在的灵敏度和精密度不高的问题，本发明公布了高特异性的单克隆抗体，具体如下：
1.抗PIVKA II单克隆抗体，其特征在于，所述抗PIVKA II单克隆抗体选自抗体A、抗体B、抗体C或抗体D；
所述抗体D包括：
如SEQ ID NO:1所列的重链可变区CDR1；
如SEQ ID NO:2所列的重链可变区CDR2；
如SEQ ID NO:3所列的重链可变区CDR3；
如SEQ ID NO:4所列的轻链可变区CDR1；
如SEQ ID NO:5所列的轻链可变区CDR2和
如SEQ ID NO:6所列的轻链可变区CDR3；
所述抗体A包括：
如SEQ ID NO:7所列的重链可变区CDR1；
如SEQ ID NO:8所列的重链可变区CDR2；
如SEQ ID NO:9所列的重链可变区CDR3；
如SEQ ID NO:10所列的轻链可变区CDR1；
如SEQ ID NO:11所列的轻链可变区CDR2和
如SEQ ID NO:12所列的轻链可变区CDR3；
所述抗体B包括：
如SEQ ID NO:13所列的重链可变区CDR1；
如SEQ ID NO:14所列的重链可变区CDR2；
如SEQ ID NO:15所列的重链可变区CDR3；
如SEQ ID NO:16所列的轻链可变区CDR1；
如SEQ ID NO:17所列的轻链可变区CDR2和
如SEQ ID NO:18所列的轻链可变区CDR3；
所述抗体C包括：
如SEQ ID NO:19所列的重链可变区CDR1；
如SEQ ID NO:20所列的重链可变区CDR2；
如SEQ ID NO:21所列的重链可变区CDR3；
如SEQ ID NO:22所列的轻链可变区CDR1；
如SEQ ID NO:23所列的轻链可变区CDR2和
如SEQ ID NO:24所列的轻链可变区CDR3。
所述抗体D重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:25所示，轻链可变区的氨基酸序列SEQ ID NO:26所示。
所述抗体D重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO:27所示，轻链可变区的核苷酸序列SEQ ID NO:28所示。
所述抗体A重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:29所示，轻链可变区的氨基酸序列SEQ ID NO:30所示。
所述抗体A重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO:31所示，轻链可变区的核苷酸序列SEQ ID NO:32所示。
所述抗体B重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:33所示，轻链可变区的氨基酸序列SEQ ID NO:34所示。
所述抗体B重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO:35所示，轻链可变区的核苷酸序列SEQ ID NO:36所示。
所述抗体C重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:37所示，轻链可变区的氨基酸序列SEQ ID NO:38所示。
所述抗体C重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO:39所示，轻链可变区的核苷酸序列SEQ ID NO:40所示。
另一方面本发明公开了一种抗原抗体混合物，所述抗原抗体混合物含有所述的抗体A、抗体B、抗体C或抗体D。
优选的，所述抗原抗体混合物含有抗体A和抗体D、B和抗体D或C和抗体D。
上述抗体D和A、B、C的结合位点不同，通过特异性的结合PIVKA II的不同抗原结合位点配合使用，达到检测PIVKA II的目的，所述配合使用即形成抗体A-PIVKA II-抗体D、抗体B-PIVKA II-抗体D、抗体C-PIVKA II-抗体B，实现对PIVKA II的双抗夹心检测。
另一方面，本发明公开了含有上述抗体A、抗体B、抗体C或抗体D的试剂盒。
另一方面，本发明公开了一种结合物，包含与化学标记或生物标记共价链接的所述抗PIVKA II单克隆抗体。
另一方面，本发明公开了一种偶联物，由所述抗PIVKA II单克隆抗体、和/或所述的结合物与固体介质或半固体介质偶联形成。
另一方面，本发明公开了所述的抗PIVKA II单克隆抗体和/或所述的结合物和/或所述的偶联物在制备检测PIVKA II表达产品中的应用。
技术效果：
(1)本发明的单克隆抗体应用到化学发光试剂盒中，检测线性范围较广，在5-35000mAu/ml范围内可有良好区分。
(2)特异性较高，制备工艺简单，成本较低。
附图说明
图1：重组蛋白纯度凝胶实验；
图2：试剂盒标准曲线；
图3：相关性实验。
具体实施例
实施例1：重组蛋白PIVKA II的表达纯化
将人PIVKA II前1-155aa基因序列克隆至原核表达载体构建原核表达质粒，该表达质粒转化大肠杆菌BL21后用含有抗生素的LB平板培养。挑取单克隆接种至LB培养基。培养至菌液OD值达到0.6后，加入IPTG诱导蛋白的表达。诱导16小时之后离心收集菌液。菌体经破碎以后离心收集上清，并采用亲和层析以及分子筛纯化得到抗原蛋白。纯化结果如图1所示，蛋白分子量约20kDa，纯度90％以上。
实施例2：鼠免疫及抗体检测
挑选5只6-8周龄SPF级雌性BALB/c小鼠，将弗氏完全佐剂与浓度为2mg/ml的PIVKAII蛋白按等体积混合并乳化。乳化好的抗原免疫6-8周龄SPF级雌性BALB/c小鼠，采用脚底注射或背部皮下注射每只小鼠注射40μg抗原蛋白。初次免疫完成两周后，将抗原蛋白与弗氏不完全佐剂混合乳化，再次采用脚底注射或背部皮下注射每只小鼠注射40μg抗原蛋白。两周以后通过尾静脉采血，离心收集上清并用ELISA检测血清效价。每两周免疫一次并检测血清效价。2次免疫后，百万倍稀释后血清效价已高达2.0以上。筛选血清效价106以上的小鼠，取淋巴分离淋巴细胞用于细胞融合。
实施例3：细胞融合及阳性杂交瘤细胞筛选和亚克隆
分离免疫小鼠的淋巴细胞与培养的SP2/0细胞进行PEG1500介导的融合或者进行电融合。融合细胞培养在包含20％ FBS血清的HAT-1640培养基中筛选培养。一周之后更换培养基，再培养4天之后取培养上清用于阳性克隆筛选。采用PIVKA II进行阳性孔筛选。选取ELISA阳性值与细胞数比值较高的孔进行多次亚克隆。用PIVKA II蛋白包被ELISA板。取亚克隆的培养上清筛选在抗原包被条件下能表现亲和力的单克隆，从中选出亲和力最高的单克隆杂交瘤细胞，最终得到两株能够分泌PIVKA II单克隆抗体的杂交瘤细胞株，命名为细胞A、细胞B、细胞C、细胞D。
实施例4：单克隆抗体的生产纯化
选择两组6-8周BALB/c小鼠，腹腔注射500μL石蜡油以抑制小鼠免疫反应。于注射一周之后向四组小鼠腹腔内分别注入0.5ml的细胞A、细胞B、细胞C、细胞D，细胞数量约1×106。两周之后开始腹水收集。收集的腹水经硫酸铵沉淀和蛋白A的亲和纯化得到目的抗体A、抗体B、抗体C和抗体D。
实施例5：单克隆抗体的亚型鉴定及基因序列克隆
采用SouthernBiothech公司的SBA Clonotyping System-HRP试剂盒，按照说明书的操作来鉴定单克隆抗体重链和轻链的亚型。具体操作为：
1、用包被液(0.05M pH 9.5的碳酸盐和碳酸氢盐缓冲液)将捕获抗体稀释至1μg/mL，按照100μL/孔加入酶标板，于4℃包被过夜。用含有0.05％Tween-20的PBS缓冲液(洗板液)洗板3次。
2、用稀释液(1％BSA,0.1％PBST)按照1:1稀释待检杂交瘤细胞的培养上清，按照100μL/孔加入酶标板，于37℃孵育30分钟。用稀释液将对应的酶标抗体(Ig-HRP,IgG1-HRP,IgG2a-HRP,IgG2b-HRP,IgG3-HRP,IgM-HRP,kappa-HRP,lamda-HRP)1:3000稀释。
3、用洗板液3次洗板后每孔加入100μL稀释的酶标抗体，于37℃孵育30分钟。再次洗板3次以后加入显色液，约5分钟(视反应强弱而定)之后加入2M硫酸终止反应，读取OD450吸光值。经过鉴定，抗体A和抗体B的重链亚型均为IgG1，轻链为Kappa。根据抗体亚型结果，采用基于RACE技术路线的方法克隆抗体基因序列。收集生长状态良好的杂交瘤细胞，使用总RNA提取试剂盒获得杂交瘤细胞总RNA，按照Takara公司的SMARTer RACE说明书的操作方法将mRNA逆转录为cDNA，并扩增目的抗体全长序列。
实施例6单克隆抗体稳定性鉴定
将抗体A、抗体B抗体C和抗体D放置于-20℃/4℃/37℃环境下，浓度为1mg/ml，每隔5天取一次样，用ELISA间接法测定抗体的活性变化。结果如表1-4所示，显示在-20℃和37℃保存25天的抗体活性几乎无变化。说明抗体A、抗体B抗体C和抗体D具有良好的稳定性，可在-20℃和4℃条件下保存。
表1抗体A稳定性
| 时间(天) | 4℃ | -20℃ | 37℃ |
| 1 | 1.21 | 1.25 | 1.27 |
| 5 | 1.28 | 1.21 | 1.25 |
| 10 | 1.2 | 1.19 | 1.24 |
| 15 | 1.18 | 1.2 | 1.23 |
| 20 | 1.17 | 1.22 | 1.22 |
| 25 | 1.18 | 1.2 | 1.23 |
表2抗体B稳定性
| 时间(天) | 4℃ | -20℃ | 37℃ |
| 1 | 1.31 | 1.28 | 1.27 |
| 5 | 1.3 | 1.27 | 1.27 |
| 10 | 1.29 | 1.25 | 1.24 |
| 15 | 1.31 | 1.3 | 1.23 |
| 20 | 1.28 | 1.28 | 1.25 |
| 25 | 1.3 | 1.31 | 1.22 |
表3抗体C稳定性
| 时间(天) | 4℃ | -20℃ | 37℃ |
| 1 | 1.28 | 1.30 | 1.23 |
| 5 | 1.27 | 1.31 | 1.24 |
| 10 | 1.30 | 1.28 | 1.29 |
| 15 | 1.26 | 1.27 | 1.28 |
| 20 | 1.30 | 1.26 | 1.25 |
| 25 | 1.29 | 1.30 | 1.27 |
表4抗体D稳定性
| 时间(天) | 4℃ | -20℃ | 37℃ |
| 1 | 1.31 | 1.29 | 1.33 |
| 5 | 1.29 | 1.26 | 1.27 |
| 10 | 1.28 | 1.28 | 1.30 |
| 15 | 1.25 | 1.27 | 1.31 |
| 20 | 1.30 | 1.31 | 1.28 |
| 25 | 1.28 | 1.30 | 1.29 |
且本发明还将抗体A、抗体B抗体C和抗体D放置于-20℃/4℃/37℃环境下，浓度为1mg/ml，每隔1年取一次样，共取3年，用ELISA间接法测定抗体的活性变化，结果表明-20℃和4℃活性无变化，1年后37℃活性开始下降，但下降范围＜10％；2年后-20℃活性几乎无变化，4℃活性下降＜5％，37℃活性下降范围>20％，已经不适合使用，3年后-20℃活性几乎无变化，4℃活性下降＜10％，总体来说抗体稳定性在-20℃中可以长期稳定保存，在4℃中至少可以稳定保存3年，37℃只能稳定保存一年，但作为试剂盒使用，已经十分稳定，非常适合商用。
实施例7 PIVKA II单克隆抗体应用到化学发光中
(1)试剂盒的制备
本发明试剂盒含有3种试剂组分，分别是2μg/mL的链霉亲和素-碱性磷酸酶偶联物，1μg/mL的生物素-抗体D偶联物，1mg/mL的磁微粒复合物。
所述链霉亲和素-碱性磷酸酶偶联物是将碱性磷酸酶和链霉亲和素偶联得到的。
所述生物素-抗体D偶联物是通过以下的方法制备：在100mM的碳酸盐溶液中将抗体D脱盐并浓缩至浓度为2mg/mL；生物素用DMSO溶解，按照10:1的比例将生物素加入抗体D中，37℃偶联2小时，用脱盐柱除去未偶联的生物素，得到生物素抗试剂。
所述磁微粒复合物为磁微粒复合物A、磁微粒复合物B或磁微粒复合物C，所述磁微粒复合物A通过以下方法制备：将羧基磁珠用EDC活化后清洗四次，将抗体A以TCEP活化后、超滤管浓缩后更换PBS缓冲液中；将羧基磁珠与抗体A按1：50的质量比混合偶联4小时，偶联结束以后以BSA、PEG20000作为封闭剂，封闭2小时后进行磁分离清洗，即得磁微粒复合物，利用合适的稀释液调节浓度到1mg/mL。
所述磁微粒复合物B和C，按上述所述磁微粒复合物A的方法制备，将上述制备过程中的抗体A换为抗体B或C。
(2)标曲的建立
A)PIVKA II校准品的制备：校准品稀释液溶剂为人血清基质，包括NaCl 1％、Tween-20 5％、BSA 2％、上述的百分比为人血清基质体积用量的百分比。将PIVKA II重组蛋白溶于上述人血清基质，制备不同浓度的校准品(0mAu/ml、20mAu/ml、100mAu/ml、500mAu/ml、1000mAu/ml、5000mAu/ml、30000mAu/ml)
B)分析方法：采用中元汇吉EXI1800发光仪测得的上述7种不同含量的PIVKA II标准品的曲线，每个点代表一个含量的参考标准品，其中X轴表示PIVKA II含量(mAu/ml)；Y轴表示信号值。结果如表5和图2所示，R2＝0.99，线性非常好。
表5化学发光标曲构建
(3)灵敏度和精密度的实验
a)灵敏度实验
用重庆中元汇吉生物技术有限公司的EXI1800进行检测，测空白样本20次，浓度为5mIU/ml的PIVKA II样本5次，计算出抗体A、D试剂盒检出限为3.14mIU/ml，计算出抗体B、D试剂盒检出限为3.27mIU/ml，计算出抗体C、D试剂盒检出限为3.19mIU/ml，证明本发明抗体应用到化学发光试剂盒中，具有很高的灵敏度，适合用于PIVKA II的检测。
b)精密度试验
抗体A和抗体D试剂盒：
检测低值和高值样本，每份检测20次，计算批间精密度，结果表6所示，精密度CV小于5％，证明本发明的抗体A和抗体D应用到化学发光试剂盒中，能够准确的检测PIVKA II的浓度。
表6精密度实验
抗体B和抗体D，抗体C和抗体D：方法同抗体A和抗体B，计算批间精密度。
抗体B和抗体D，低值：3.98％，高值：2.14％；
抗体C和抗体D，低值：4.15％，高值：2.64％。
(4)PIVKA II含量检测试剂盒的临床实验
选取4例健康人血清及37例肝癌病人血清，按照上述条件，用上述抗体A和抗体D制备的PIVKA II含量检测试剂盒分别测定各血清中PIVKA II的含量，并用雅培试剂盒对临床样本进行赋值。结果显示，PIVKA II单克隆抗体在检测PIVKA II血清样本时与雅培具有高灵敏度和良好相关性。检测结果如表7和图3所示，在化学发光平台，本发明公布的两种单克隆抗体组合在检测低区(5-1000mAu/ml)临床样本时，相关性系数R1可达0.980；检测整体(5-30000mAu/ml)临床样本时，相关性系数R2可达0.984。说明基于本发明公布的两种单克隆抗体制备的PIVKA II含量检测试剂盒能够满足临床检测的需求。
表7相关性实验
序列表
<110> 中元汇吉生物技术股份有限公司
<120> 抗PIVKA-II单克隆抗体及其应用
<130> 2022/4/20
<160> 40
<170> SIPOSequenceListing 1.0
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Ser Tyr Ala Met Ser
1 5
<210> 14
<211> 17
<212> PRT
<213> mouse
<400> 14
Thr Ile Ser Thr Gly Gly Val Lys Thr Tyr Tyr Leu Asp Ser Val Lys
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Gly
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<213> mouse
<400> 15
Leu Asn Tyr Gly Asn Tyr Phe Asp Tyr
1 5
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Arg Ser Gly Gln Ser Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His
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<400> 17
Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser
1 5
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Ser Gln Ser Arg His Val Pro Pro Thr
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Asn Tyr Gly Met Ser
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<213> mouse
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Thr Ile Arg Ser Asp Gly Ser Ser Ala Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Arg
1 5 10 15
Gly
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Leu Asn Tyr Gly Asn Tyr Phe Asp Tyr
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Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His
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Lys Leu Ser Asn Arg Phe Ser
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Ser Gln Ser Arg His Val Pro Pro Thr
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Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Met Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Thr Gly Tyr Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Trp Ile Glu Trp Ile Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Leu Pro Gly Thr Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Glu Thr Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Ala Thr Phe Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Val Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ala Arg Pro Leu Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ala Leu Thr Val
100 105 110
Ser
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<212> PRT
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<400> 26
Asp Ile Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Val Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser
20 25 30
Thr Asn Gln Arg Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Asn Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Val Lys Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Tyr Asp Ser Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 27
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<212> DNA
<213> mouse
<400> 27
caggttcagc tgcagcagtc tggacctgag ctgatgaagc ctggggcctc agtgaagata 60
tcctgcaagg ctactggcta cacattcagt aactactgga tagagtggat aaagcagagg 120
cctggacatg gccttgagtg gattggagag attttacctg gaactggtaa tactaattac 180
aatgagacat tcaagggcag ggccacattc actgcagata catcttccaa cacagcctac 240
atgcaactca gcagcctgac atctgtggac tctgccgtct attactgtgc aagacccctc 300
tttgactact ggggccaagg caccgctctc acagtctcct 340
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<212> DNA
<213> mouse
<400> 28
gacattgtga tgtcacagtc tccatcctcc ctagctgtgt cagttggaga gaaggtaact 60
atgagctgca agtccagtca gagtctatta tatagtacca atcaaaggaa ctacttggcc 120
tggtaccagc agaaaccagg gcagtctcct aaattgttga tttactgggc atccaatagg 180
gaatctgggg tccctgatcg cttcacaggc agtggatctg ggacagattt cactctcacc 240
atcagcagtg tgaaggctga agacctggca gtttattact gtcagcaata tgatagttat 300
ccgtacacgt tcggaggggg gaccaaactg gaaataaaa 339
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<212> PRT
<213> mouse
<400> 29
Glu Val Met Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gly Tyr
20 25 30
Gly Met Ser Trp Phe Arg Arg Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ser Leu Asn Tyr Gly Asn Tyr Phe Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Leu Thr Val Ser Ser
115
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Asp Val Val Met Thr Gln Pro Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Leu Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
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65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Thr
85 90 95
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100 105 110
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<400> 31
gaagtgatgc tggtggagtc tgggggaggc ttagtgaagc ctggagggtc cctgaaactc 60
tcctgtgcag cctctggatt cactttcagt ggctatggca tgtcttggtt tcgccggact 120
ccggagaaga ggctggagtg ggtcgcaacc attagtagtg ggggtggttc cacctactat 180
ccagacagtg tgaaggggcg atttaccgtc tccagagaca atgccaagaa caccctgtac 240
ctgcaaatga gcagtctgag gtctgaggac acggccattt attactgtgc aagtctcaac 300
tatggtaact actttgactt ctggggccaa ggcaccactc tcacagtctc ctca 354
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<211> 336
<212> DNA
<213> mouse
<400> 32
gatgttgtga tgacccaacc tccactctcc ctgcctgtca gtgttggaga tccagcctcc 60
atctcttgca gatctagtca gagtcttgtc cacagtaatg gaaacaccta tttacattgg 120
taccagcaga agccgggcca gtctccaaag ctcctgatct acaaactttc caaccgattt 180
tctggggtcc cagacaggtt cagtggcagt ggatcaggga cagatttcac actcaagatc 240
agcagagtgg aggctgagga tctgggagtt tatttctgtt ctcaaactag acatgttcct 300
cccacgttcg gtgctgggac caagctggag ctgaaa 336
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<212> PRT
<213> mouse
<400> 33
Glu Val Met Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
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Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ile Phe Ser Ser Tyr
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Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ile Pro Glu Lys Lys Leu Glu Trp Val
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Ala Thr Ile Ser Thr Gly Gly Val Lys Thr Tyr Tyr Leu Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
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Leu Ser Leu Asn Tyr Gly Asn Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Leu Thr Val Ser Ser
115
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<211> 112
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Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Gly Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Val
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser
85 90 95
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100 105 110
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gaagtgatgt tggtggagtc tgggggaggc ttagtgaagc ctggagggtc cctgaaactc 60
tcctgtgcag cctctggatt cattttcagt agctatgcca tgtcttgggt tcgccagatt 120
ccggagaaga agctggagtg ggtcgcaacc attagtactg gtggtgttaa aacctactat 180
ctagacagtg tgaaggggcg attcaccatc tccagagaca atgccaagaa caccctgtac 240
ctgcaaatga gcagtctgag gtctgaggac acggccatgt attactgttt aagtctcaac 300
tatggtaatt attttgacta ctggggccaa ggcaccactc tcacagtctc ctca 354
<210> 36
<211> 336
<212> DNA
<213> mouse
<400> 36
gatgttgtga tgacccaaac tccactctcc ctgcctgtca gtcttggaga tcaagcctcc 60
atctcttgca gatctggtca gagccttgta cacagtaatg gaaacaccta tttacattgg 120
tacctgcaga agccaggcca gtctccaaag ctcctgatct acaaagtttc caaccgattt 180
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Glu Val His Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Gly
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Ser Leu Lys Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Gly Met Ser Trp Phe Arg Gln Thr Pro Asn Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Arg Ser Asp Gly Ser Ser Ala Tyr Tyr Pro Asp Ser Val
50 55 60
Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn Thr Leu Phe
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Ser Ala Ile Tyr Tyr Cys
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Ala Ser Leu Asn Tyr Gly Asn Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Leu Thr Val Ser Ser
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Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
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Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
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35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Phe Lys Leu Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser
85 90 95
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100 105 110
<210> 39
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<400> 39
gaggtgcacc tggtggagtc tgggggagac ttagtgaagc ctggagggtc cctgaaactc 60
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ccagacagtg tgagggggcg attcaccatc tccagagaca atgccaggaa caccctgttc 240
ctgcaaatga gcagtctgaa gtctgaggat tcagccattt attactgtgc aagtctcaat 300
tatggtaact actttgacta ttggggccaa ggcaccactc tcacagtctc ctca 354
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<213> mouse
<400> 40
gatgttgtga tgacccaaac tccactctcc ctgcctgtca gtcttggaga tcaagcctcc 60
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tacctgcaga agccaggcca gtctccaaaa ctcctgatct tcaaactttc caaccgattt 180
tctggggtcc cagacaggtt cagtggcagt ggatcaggga cagatttcac actcaagatc 240
agcagagtgg aggctgagga tctgggagtt tatttctgct ctcaaagtag acatgttcct 300
ccgacgttcg gtggaggcac caagctggaa atcaaa 336
Claims (6)
1.抗PIVKA II单克隆抗体，其特征在于，所述抗PIVKA II单克隆抗体选自抗体A、抗体B、抗体C或抗体D；
所述抗体D包括：
如SEQ ID NO:1所列的重链可变区CDR1；
如SEQ ID NO:2所列的重链可变区CDR2；
如SEQ ID NO:3所列的重链可变区CDR3；
如SEQ ID NO:4所列的轻链可变区CDR1；
如SEQ ID NO:5所列的轻链可变区CDR2和
如SEQ ID NO:6所列的轻链可变区CDR3；
所述抗体A包括：
如SEQ ID NO:7所列的重链可变区CDR1；
如SEQ ID NO:8所列的重链可变区CDR2；
如SEQ ID NO:9所列的重链可变区CDR3；
如SEQ ID NO:10所列的轻链可变区CDR1；
如SEQ ID NO:11所列的轻链可变区CDR2和
如SEQ ID NO:12所列的轻链可变区CDR3；
所述抗体B包括：
如SEQ ID NO:13所列的重链可变区CDR1；
如SEQ ID NO:14所列的重链可变区CDR2；
如SEQ ID NO:15所列的重链可变区CDR3；
如SEQ ID NO:16所列的轻链可变区CDR1；
如SEQ ID NO:17所列的轻链可变区CDR2和
如SEQ ID NO:18所列的轻链可变区CDR3；
所述抗体C包括：
如SEQ ID NO:19所列的重链可变区CDR1；
如SEQ ID NO:20所列的重链可变区CDR2；
如SEQ ID NO:21所列的重链可变区CDR3；
如SEQ ID NO:22所列的轻链可变区CDR1；
如SEQ ID NO:23所列的轻链可变区CDR2和
如SEQ ID NO:24所列的轻链可变区CDR3。
2.一种抗原抗体混合物，其特征在于，所述抗原抗体混合物含有如权利要求1中所述的抗体A、抗体B、抗体C或抗体D。
3.一种试剂盒，其特征在于，含有如权利要求1中所述的抗体A、抗体B、抗体C或抗体D。
4.一种结合物，其特征在于，包含与化学标记或生物标记共价链接的如权利要求1中所述的抗PIVKA II单克隆抗体。
5.一种偶联物，其特征在于，由权利要求1中所述的抗PIVKA II单克隆抗体或权利要求4中所述的结合物，与固体介质或半固体介质偶联形成。
6.如权利要求1中所述的抗PIVKA II单克隆抗体或如权利要求4中所述的结合物或如权利要求5中所述的偶联物在制备检测PIVKA II表达产品中的应用。
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