JPH10197532A - モノクローナル抗体、該抗体を用いた免疫測定方法及び測定試薬 - Google Patents
モノクローナル抗体、該抗体を用いた免疫測定方法及び測定試薬Info
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- JPH10197532A JPH10197532A JP35674096A JP35674096A JPH10197532A JP H10197532 A JPH10197532 A JP H10197532A JP 35674096 A JP35674096 A JP 35674096A JP 35674096 A JP35674096 A JP 35674096A JP H10197532 A JPH10197532 A JP H10197532A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 ポリペプチドを免疫原として得られた抗体
（第二抗体）と抗原との結合を増強する性質を有するモ
ノクローナル抗体（第三抗体）、並びに該第三抗体を添
加した検体中に含まれる低濃度のヒトＰＩＶＫＡ−Ｉ
Ｉ、糖化ヘモグロビンＡ１ｃ等の抗原の免疫測定方法及
びその免疫測定試薬の提供。 【解決手段】 抗原と反応する抗体（第一抗体）に標識
物が結合した標識抗体と、抗原を構成するポリペプチド
を免疫原として得られた抗体（第二抗体）が結合した固
相試薬と、第二抗体と抗原との結合を増強する性質を有
する少なくとも１種類のモノクローナル抗体（第三抗
体）と、検体とを混合し、免疫複合体を形成させて検体
中の抗原を免疫測定する。又、抗原に標識物が結合した
標識抗原と、抗原を構成するポリペプチドを免疫原とし
て得られた抗体（第二抗体）が結合した固相試薬と、第
二抗体と抗原との結合を増強する性質を有する少なくと
も１種類のモノクローナル抗体（第三抗体）と、検体と
を混合し、免疫複合体を形成させて検体中の抗原を免疫
測定法する。
（第二抗体）と抗原との結合を増強する性質を有するモ
ノクローナル抗体（第三抗体）、並びに該第三抗体を添
加した検体中に含まれる低濃度のヒトＰＩＶＫＡ−Ｉ
Ｉ、糖化ヘモグロビンＡ１ｃ等の抗原の免疫測定方法及
びその免疫測定試薬の提供。 【解決手段】 抗原と反応する抗体（第一抗体）に標識
物が結合した標識抗体と、抗原を構成するポリペプチド
を免疫原として得られた抗体（第二抗体）が結合した固
相試薬と、第二抗体と抗原との結合を増強する性質を有
する少なくとも１種類のモノクローナル抗体（第三抗
体）と、検体とを混合し、免疫複合体を形成させて検体
中の抗原を免疫測定する。又、抗原に標識物が結合した
標識抗原と、抗原を構成するポリペプチドを免疫原とし
て得られた抗体（第二抗体）が結合した固相試薬と、第
二抗体と抗原との結合を増強する性質を有する少なくと
も１種類のモノクローナル抗体（第三抗体）と、検体と
を混合し、免疫複合体を形成させて検体中の抗原を免疫
測定法する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ポリペプチドを免
疫原として得られた抗体（第二抗体）と抗原との結合を
増強する性質を有するモノクローナル抗体（第三抗
体）、該抗体を用いる免疫測定方法及びその測定試薬に
関する。。
疫原として得られた抗体（第二抗体）と抗原との結合を
増強する性質を有するモノクローナル抗体（第三抗
体）、該抗体を用いる免疫測定方法及びその測定試薬に
関する。。
【０００２】
【従来の技術】生体内に存在するホルモン、酵素、血清
蛋白質、腫瘍抗原、ＤＡＮ結合性蛋白質、サイトカイ
ン、細菌、ウイルス、原虫等に関連する蛋白質等の抗原
性物質を測定する方法として、モノクローナル抗体、ポ
リクローナル抗体等を用いる免疫測定法が広く行われて
いる。従来、これらの抗体は生体成分より分離精製した
抗原性物質（以下天然型抗原という）を得、この天然型
抗原を動物に免疫原として投与しポリクローナル抗体又
はモノクローナル抗体を取得していた。
蛋白質、腫瘍抗原、ＤＡＮ結合性蛋白質、サイトカイ
ン、細菌、ウイルス、原虫等に関連する蛋白質等の抗原
性物質を測定する方法として、モノクローナル抗体、ポ
リクローナル抗体等を用いる免疫測定法が広く行われて
いる。従来、これらの抗体は生体成分より分離精製した
抗原性物質（以下天然型抗原という）を得、この天然型
抗原を動物に免疫原として投与しポリクローナル抗体又
はモノクローナル抗体を取得していた。
【０００３】近年、抗体の産生は、天然型抗原の代わり
に合成ペプチドや遺伝子組換え蛋白質を免疫原として行
われている。しかしながら、これらの合成ペプチドや遺
伝子組換え蛋白質を免疫原として得られる抗体は、必ず
しも天然型抗原に対して強い親和性を持つとは限らず、
多くは反応性が低い抗体である。特に、合成ペプチドを
免疫原として抗体を作成した場合、固相に結合した天然
型抗原に反応するするものが少ないのに加えて、フリー
（溶液中）の天然型抗原に対して極めて弱い親和性しか
示さないものが多く得られるのが現状である。
に合成ペプチドや遺伝子組換え蛋白質を免疫原として行
われている。しかしながら、これらの合成ペプチドや遺
伝子組換え蛋白質を免疫原として得られる抗体は、必ず
しも天然型抗原に対して強い親和性を持つとは限らず、
多くは反応性が低い抗体である。特に、合成ペプチドを
免疫原として抗体を作成した場合、固相に結合した天然
型抗原に反応するするものが少ないのに加えて、フリー
（溶液中）の天然型抗原に対して極めて弱い親和性しか
示さないものが多く得られるのが現状である。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】前記合成ペプチドや組
換え型抗原を免疫して得られる抗体が、必ずしも検体中
の抗原性物質に強い親和性を持たないことから、この抗
体を用いて製造した免疫測定試薬では十分な測定感度を
有しているとは言えなかった。その原因は、組換え型抗
原や合成ペプチドではその立体構造が天然型抗原とは異
なるためと考えられる。殊に合成ペプチドを抗原とした
場合にはその感度の低下は顕著であった。そこで、この
ような感度が不足する抗体結合試薬であっても、簡単な
操作で感度上昇させることができれば利用範囲が広がる
ことから、改良が望まれていた。
換え型抗原を免疫して得られる抗体が、必ずしも検体中
の抗原性物質に強い親和性を持たないことから、この抗
体を用いて製造した免疫測定試薬では十分な測定感度を
有しているとは言えなかった。その原因は、組換え型抗
原や合成ペプチドではその立体構造が天然型抗原とは異
なるためと考えられる。殊に合成ペプチドを抗原とした
場合にはその感度の低下は顕著であった。そこで、この
ような感度が不足する抗体結合試薬であっても、簡単な
操作で感度上昇させることができれば利用範囲が広がる
ことから、改良が望まれていた。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明者らは鋭意研究し
た結果、抗原を免疫測定する際に、ポリペプチドを免疫
原として得られた抗体（第二抗体）と抗原との結合を増
強する性質を有する少なくとも１種のモノクローナル抗
体（第三抗体）を添加する方法を見出し本発明を完成す
るに至った。
た結果、抗原を免疫測定する際に、ポリペプチドを免疫
原として得られた抗体（第二抗体）と抗原との結合を増
強する性質を有する少なくとも１種のモノクローナル抗
体（第三抗体）を添加する方法を見出し本発明を完成す
るに至った。
【０００６】本発明は、前記モノクローナル抗体（第三
抗体）、及び抗原と反応する抗体（第一抗体）に標識物
が結合した標識抗体と、抗原を構成するポリペプチドを
免疫原として得られた抗体（第二抗体）が結合した固相
試薬と、抗原を含む検体とを混合して免疫複合体を形成
させる免疫測定法において、第二抗体と抗原との結合を
増強する性質を有する少なくとも１種類のモノクローナ
ル抗体（第三抗体）を添加する方法（サンドイッチ
法）、並びに抗原に標識物が結合した標識抗原と、抗原
を構成するポリペプチドを免疫原として得られた抗体
（第二抗体）が結合した固相試薬と、抗原を含む検体と
を混合して免疫複合体を形成させる免疫測定法におい
て、第二抗体と抗原との結合を増強する性質を有する少
なくとも１種類のモノクローナル抗体（第三抗体）を添
加する方法（競合法）である。
抗体）、及び抗原と反応する抗体（第一抗体）に標識物
が結合した標識抗体と、抗原を構成するポリペプチドを
免疫原として得られた抗体（第二抗体）が結合した固相
試薬と、抗原を含む検体とを混合して免疫複合体を形成
させる免疫測定法において、第二抗体と抗原との結合を
増強する性質を有する少なくとも１種類のモノクローナ
ル抗体（第三抗体）を添加する方法（サンドイッチ
法）、並びに抗原に標識物が結合した標識抗原と、抗原
を構成するポリペプチドを免疫原として得られた抗体
（第二抗体）が結合した固相試薬と、抗原を含む検体と
を混合して免疫複合体を形成させる免疫測定法におい
て、第二抗体と抗原との結合を増強する性質を有する少
なくとも１種類のモノクローナル抗体（第三抗体）を添
加する方法（競合法）である。
【０００７】本発明の測定対象物である抗原としては少
なくとも２個の抗原決定基からなる物質であり、体液中
に含まれるホルモン、酵素、血清蛋白質、糖蛋白質、腫
瘍関連抗原、ＤＡＮ結合性蛋白質、サイトカイン、細
菌、ウイルス、原虫等に関連する蛋白質、糖蛋白質等を
挙げることができる。特にこの抗原としては体液中の正
常蛋白質から修飾又は変異した蛋白質である。例えばア
ミノ酸の置換により変異した蛋白質（ＰＩＶＫＡ−ＩＩ
(Protein Induced by Vitamin K absence II) 、ＲＡＳ
等の癌関連蛋白質、凝固第Ｖ因子等）、アミノ酸の修飾
により変異した蛋白質（糖化ヘモグロビンＡ１ｃ（Ｈｂ
Ａ１ｃ）、リン酸化Ｔａｕ等）、イソフォームを持つ蛋
白質（ＡｐｏＥ、エストロゲンレセプター等）、酵素に
より切断された蛋白質（凝固線溶系に係わる活性化され
た酵素：Ｆ1+2 、ＡＰＣ等；ＴＧＦ−β等）を挙げるこ
とができる。
なくとも２個の抗原決定基からなる物質であり、体液中
に含まれるホルモン、酵素、血清蛋白質、糖蛋白質、腫
瘍関連抗原、ＤＡＮ結合性蛋白質、サイトカイン、細
菌、ウイルス、原虫等に関連する蛋白質、糖蛋白質等を
挙げることができる。特にこの抗原としては体液中の正
常蛋白質から修飾又は変異した蛋白質である。例えばア
ミノ酸の置換により変異した蛋白質（ＰＩＶＫＡ−ＩＩ
(Protein Induced by Vitamin K absence II) 、ＲＡＳ
等の癌関連蛋白質、凝固第Ｖ因子等）、アミノ酸の修飾
により変異した蛋白質（糖化ヘモグロビンＡ１ｃ（Ｈｂ
Ａ１ｃ）、リン酸化Ｔａｕ等）、イソフォームを持つ蛋
白質（ＡｐｏＥ、エストロゲンレセプター等）、酵素に
より切断された蛋白質（凝固線溶系に係わる活性化され
た酵素：Ｆ1+2 、ＡＰＣ等；ＴＧＦ−β等）を挙げるこ
とができる。
【０００８】本発明のサンドイッチ法は免疫測定法で広
く行われる方法であり、その測定に用いる標識抗体とし
ては抗原の一つの抗原決定基と反応する抗体（第一抗
体）と標識物質とを結合させて製造することができる。
この抗体としては前記抗原の抗原決定基と反応する抗体
であればポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体で
あってもよい。抗体を製造するには、前記抗原、この抗
原の合成ペプチド、抗原と同じ抗原決定基を有する抗原
類縁体、組換え型抗原等を免疫原として用い、公知のポ
リクローナル抗体又はモノクローナル抗体の製造法に従
い行うことができる。モノクローナル抗体の製造法とし
ては、例えば「モノクローナル抗体とがん」（株）サイ
エンスフォーラム（１９８５年）等に記載された方法に
より行うことができる。合成ペプチドとしては少なくと
も４個のアミノ酸からなるペプチドを用いることができ
る。このペプチドは周知の縮合試薬を用いるペプチド合
成法、ペプチド合成機により容易に製造することができ
る。また、このペプチドを免疫原として用いる場合に
は、例えばアルブミン、キーホールリンペットヘモシア
ニン（ＫＬＨ）等のキャリアー蛋白質との複合体を製造
し用いることもできる。また抗体は抗原のそれぞれの異
なる抗原決定基と反応するものであればよく、同一若し
は異なるクラス又はサブクラスであり、この抗体をペプ
シン等の酵素処理及び／又は還元処理して製造したＦａ
ｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2 等の抗体フラグメントで
あってもよい。
く行われる方法であり、その測定に用いる標識抗体とし
ては抗原の一つの抗原決定基と反応する抗体（第一抗
体）と標識物質とを結合させて製造することができる。
この抗体としては前記抗原の抗原決定基と反応する抗体
であればポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体で
あってもよい。抗体を製造するには、前記抗原、この抗
原の合成ペプチド、抗原と同じ抗原決定基を有する抗原
類縁体、組換え型抗原等を免疫原として用い、公知のポ
リクローナル抗体又はモノクローナル抗体の製造法に従
い行うことができる。モノクローナル抗体の製造法とし
ては、例えば「モノクローナル抗体とがん」（株）サイ
エンスフォーラム（１９８５年）等に記載された方法に
より行うことができる。合成ペプチドとしては少なくと
も４個のアミノ酸からなるペプチドを用いることができ
る。このペプチドは周知の縮合試薬を用いるペプチド合
成法、ペプチド合成機により容易に製造することができ
る。また、このペプチドを免疫原として用いる場合に
は、例えばアルブミン、キーホールリンペットヘモシア
ニン（ＫＬＨ）等のキャリアー蛋白質との複合体を製造
し用いることもできる。また抗体は抗原のそれぞれの異
なる抗原決定基と反応するものであればよく、同一若し
は異なるクラス又はサブクラスであり、この抗体をペプ
シン等の酵素処理及び／又は還元処理して製造したＦａ
ｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2 等の抗体フラグメントで
あってもよい。
【０００９】標識物質としては標識免疫測定に用いられ
る例えば酵素、放射性同位元素、蛍光物質、発光物質、
着色粒子、コロイド粒子等を挙げることができる。酵素
としては、例えばペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）、アルカ
リ性ホスファターゼ（Ａｌｐ）、β−ガラクトシダーゼ
等を挙げることができる。放射性同位元素としては、ヨ
ウ素１２５、トリチウム等、蛍光物質としては、ローダ
ミン、ウンベリフェロン等、発光物質としてはルミノー
ル又はイソルミノール誘導体、アクリジニウムエステル
誘導体等を挙げるとができる。
る例えば酵素、放射性同位元素、蛍光物質、発光物質、
着色粒子、コロイド粒子等を挙げることができる。酵素
としては、例えばペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）、アルカ
リ性ホスファターゼ（Ａｌｐ）、β−ガラクトシダーゼ
等を挙げることができる。放射性同位元素としては、ヨ
ウ素１２５、トリチウム等、蛍光物質としては、ローダ
ミン、ウンベリフェロン等、発光物質としてはルミノー
ル又はイソルミノール誘導体、アクリジニウムエステル
誘導体等を挙げるとができる。
【００１０】また、第一抗体と標識物とを結合させるに
は、前記抗体と標識物とを公知の共有結合又は非共有結
合を作る方法を利用して結合することができる。共有結
合による方法としては例えばグルタールアルデヒド法、
過ヨウ素酸法、マレイミド法、ピリジル・ジスルフィド
法、公知の各種架橋剤を用いる方法等を挙げることがで
きる（例えば「蛋白質核酸酵素」別冊３１号、３７〜４
５頁（１９８７）参照）。共有結合による方法では、モ
ノクローナル抗体に存在する官能基を利用することがで
きるほか、抗体に例えばチオール基、アミノ基、カルボ
キシル基、水酸基等の基を導入した後、前記共有結合に
よる方法に従い反応を行うことができる。一方、非共有
結合による方法としては前記抗体と標識物とを混合して
行う物理吸着法を挙げることができる。
は、前記抗体と標識物とを公知の共有結合又は非共有結
合を作る方法を利用して結合することができる。共有結
合による方法としては例えばグルタールアルデヒド法、
過ヨウ素酸法、マレイミド法、ピリジル・ジスルフィド
法、公知の各種架橋剤を用いる方法等を挙げることがで
きる（例えば「蛋白質核酸酵素」別冊３１号、３７〜４
５頁（１９８７）参照）。共有結合による方法では、モ
ノクローナル抗体に存在する官能基を利用することがで
きるほか、抗体に例えばチオール基、アミノ基、カルボ
キシル基、水酸基等の基を導入した後、前記共有結合に
よる方法に従い反応を行うことができる。一方、非共有
結合による方法としては前記抗体と標識物とを混合して
行う物理吸着法を挙げることができる。
【００１１】さらに固相試薬は、抗原を構成するポリペ
プチドを免疫原として作成した前記抗原とは異なる抗原
決定基と結合する抗体（第二抗体）と固相とを結合させ
て製造することができる。この第二抗体は抗原の全部又
はその一部で構成されたポリペプチドを免疫原として前
記方法に従い製造することができる。これらの抗原を免
疫原として得た抗体はポリクローナル抗体又はモノクロ
ーナル抗体であり、前記標識試薬に用いた抗体と同様な
抗体のフラグメントであってもよい。本発明を効率よく
実施するには第二抗体として前記抗原決定基とは異なる
抗原決定基と結合するモノクローナル抗体を用いること
が好ましい。
プチドを免疫原として作成した前記抗原とは異なる抗原
決定基と結合する抗体（第二抗体）と固相とを結合させ
て製造することができる。この第二抗体は抗原の全部又
はその一部で構成されたポリペプチドを免疫原として前
記方法に従い製造することができる。これらの抗原を免
疫原として得た抗体はポリクローナル抗体又はモノクロ
ーナル抗体であり、前記標識試薬に用いた抗体と同様な
抗体のフラグメントであってもよい。本発明を効率よく
実施するには第二抗体として前記抗原決定基とは異なる
抗原決定基と結合するモノクローナル抗体を用いること
が好ましい。
【００１２】また、固相は従来の免疫測定に使用される
各種固相を用いることができる。固相としては例えばプ
ラスチック製の試験管、マイクロプレートウエル、ガラ
スビーズ、プラスチックビーズ、各種メンブレン、磁性
粒子等を挙げるとができる。この固相試薬を製造するに
は、標識試薬を製造する際に使用した共有結合又は非共
有結合による方法に従い前記抗体と前記固相と結合させ
て製造することができる。
各種固相を用いることができる。固相としては例えばプ
ラスチック製の試験管、マイクロプレートウエル、ガラ
スビーズ、プラスチックビーズ、各種メンブレン、磁性
粒子等を挙げるとができる。この固相試薬を製造するに
は、標識試薬を製造する際に使用した共有結合又は非共
有結合による方法に従い前記抗体と前記固相と結合させ
て製造することができる。
【００１３】本発明の第三抗体は、抗原の前記抗原決定
基とは異なる基と結合し、第二抗体と抗原の抗原決定基
との結合を増強する性質を有する少なくとも１種類の抗
体である。この抗体はモノクローナル抗体であり、抗原
の前記標識抗体及び固相抗体の抗原決定基とは異なる基
と結合する抗体であることが好ましい。この抗体は、抗
原と結合する抗体として周知の方法に従い製造された前
記モノクローナル抗体の中からスクリーニングをするこ
とにより得ることができる。
基とは異なる基と結合し、第二抗体と抗原の抗原決定基
との結合を増強する性質を有する少なくとも１種類の抗
体である。この抗体はモノクローナル抗体であり、抗原
の前記標識抗体及び固相抗体の抗原決定基とは異なる基
と結合する抗体であることが好ましい。この抗体は、抗
原と結合する抗体として周知の方法に従い製造された前
記モノクローナル抗体の中からスクリーニングをするこ
とにより得ることができる。
【００１４】このスクリーニング方法は、サンドイッチ
ＥＬＩＳＡの第一反応（固相抗体と天然型抗原との反
応）時に、天然型抗原（場合によっては組換え抗原）免
疫マウスのリンパ球とミエローマ細胞との細胞融合で得
られた培養上清を存在させたＥＬＩＳＡの活性を増強さ
せるモノクローナル抗体を選択する一連の操作よりな
る。例えば、天然型抗原Ａの一部の配列より成る合成ペ
プチドを免疫原として得た抗体をサンドイッチＥＬＩＳ
Ａの固相として使用したい場合、この抗体をＥＬＩＳＡ
プレートに吸着させ、第一反応（固相抗体と抗原との反
応）時に天然型抗原Ａを免疫したマウスのリンパ球とミ
エローマ細胞との細胞融合の培養上清を添加し反応させ
る。次に、天然型抗原Ａを認識する酵素標識抗体を反応
させた後、基質を添加しその発色等の増強の見られるク
ローンを選択することによりスクリーニングを行うこと
ができる。以上の方法で選択されたモノクローナル抗体
は、ＩｇＧ、ＩｇＭ等のクラスの抗体であって、使用時
にはこれらの抗体をペプシン等の酵素処理及び／又は還
元処理して製造したＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2
等の抗体フラグメントであってもよい。
ＥＬＩＳＡの第一反応（固相抗体と天然型抗原との反
応）時に、天然型抗原（場合によっては組換え抗原）免
疫マウスのリンパ球とミエローマ細胞との細胞融合で得
られた培養上清を存在させたＥＬＩＳＡの活性を増強さ
せるモノクローナル抗体を選択する一連の操作よりな
る。例えば、天然型抗原Ａの一部の配列より成る合成ペ
プチドを免疫原として得た抗体をサンドイッチＥＬＩＳ
Ａの固相として使用したい場合、この抗体をＥＬＩＳＡ
プレートに吸着させ、第一反応（固相抗体と抗原との反
応）時に天然型抗原Ａを免疫したマウスのリンパ球とミ
エローマ細胞との細胞融合の培養上清を添加し反応させ
る。次に、天然型抗原Ａを認識する酵素標識抗体を反応
させた後、基質を添加しその発色等の増強の見られるク
ローンを選択することによりスクリーニングを行うこと
ができる。以上の方法で選択されたモノクローナル抗体
は、ＩｇＧ、ＩｇＭ等のクラスの抗体であって、使用時
にはこれらの抗体をペプシン等の酵素処理及び／又は還
元処理して製造したＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2
等の抗体フラグメントであってもよい。
【００１５】本発明の測定を実施するには、前記標識抗
体と、前記固相試薬と、第三抗体とを用いる周知の１−
ステップサンドイッチ法、ディレイ−１−ステップサン
ドイッチ法、２−ステップサンドイッチ法等のサンドイ
ッチ法に従い行うことができる。その測定では、免疫反
応により固相上に形成された免疫複合体の標識物を測定
する方法に従い行うことができる。測定を行うにあたっ
て第三抗体は、１種類又は２種類以上を免疫複合体を形
成する際の反応溶液中に存在させればよく、いずれの時
期に反応液中に添加することもできる。例えば２−ステ
ップサンドイッチ法ではまず固相試薬と、抗原を含む検
体と、前記第三抗体とを緩衝液中でインキュベーッショ
ン（例えば５〜５０℃、５分〜１日）した後、固相を洗
浄する。次に標識抗体を含む緩衝液中に固相を移し、さ
らにインキュベーション（例えば５〜５０℃、５分〜１
日）した後、固相を再び洗浄する。このようにして固相
上に形成された免疫複合体から標識物の測定を行う方法
である。添加する第三抗体の量は、検体中に含有すると
予想される測定対象物の抗原に対応して適宜変えること
ができる。
体と、前記固相試薬と、第三抗体とを用いる周知の１−
ステップサンドイッチ法、ディレイ−１−ステップサン
ドイッチ法、２−ステップサンドイッチ法等のサンドイ
ッチ法に従い行うことができる。その測定では、免疫反
応により固相上に形成された免疫複合体の標識物を測定
する方法に従い行うことができる。測定を行うにあたっ
て第三抗体は、１種類又は２種類以上を免疫複合体を形
成する際の反応溶液中に存在させればよく、いずれの時
期に反応液中に添加することもできる。例えば２−ステ
ップサンドイッチ法ではまず固相試薬と、抗原を含む検
体と、前記第三抗体とを緩衝液中でインキュベーッショ
ン（例えば５〜５０℃、５分〜１日）した後、固相を洗
浄する。次に標識抗体を含む緩衝液中に固相を移し、さ
らにインキュベーション（例えば５〜５０℃、５分〜１
日）した後、固相を再び洗浄する。このようにして固相
上に形成された免疫複合体から標識物の測定を行う方法
である。添加する第三抗体の量は、検体中に含有すると
予想される測定対象物の抗原に対応して適宜変えること
ができる。
【００１６】さらに本発明の競合法において、前記標識
された抗原は、前記抗原と前記標識抗体で用いた同一の
標識物質とを結合させて製造することができる。抗原
は、第一抗体と標識物とを結合させる共有結合又は非共
有結合を作る方法に従い、前記標識物質と反応させるこ
とができる。反応に用いる抗原は、前記抗原に限定され
ず、抗原と同じ抗体反応性の抗原決定基を有する物質で
あればよく、官能基が導入された抗原誘導体、同じ反応
性の抗原決定基を有する抗原の類縁体等も用いることが
できる。
された抗原は、前記抗原と前記標識抗体で用いた同一の
標識物質とを結合させて製造することができる。抗原
は、第一抗体と標識物とを結合させる共有結合又は非共
有結合を作る方法に従い、前記標識物質と反応させるこ
とができる。反応に用いる抗原は、前記抗原に限定され
ず、抗原と同じ抗体反応性の抗原決定基を有する物質で
あればよく、官能基が導入された抗原誘導体、同じ反応
性の抗原決定基を有する抗原の類縁体等も用いることが
できる。
【００１７】本発明の競合法は、前記標識された抗原
と、前記固相試薬と、前記第三抗体とを用いて周知の方
法に従い行うことができる。その測定では、サンドイッ
チ法と同様に免疫反応により固相上に形成された免疫複
合体の標識物を測定し行うことができる。測定を行うに
あたって第三抗体は、１種類又は２種類以上を免疫複合
体を形成する際の反応溶液中に添加することができる。
競合法ではまず固相試薬と、抗原性物質を含む検体と、
標識された抗原と、さらに前記第三抗体とを緩衝液中で
混合し、インキュベーッション（例えば５〜５０℃、５
分〜１日）した後、固相を洗浄する。次に固相上に形成
された免疫複合体から標識物の測定を行う方法である。
と、前記固相試薬と、前記第三抗体とを用いて周知の方
法に従い行うことができる。その測定では、サンドイッ
チ法と同様に免疫反応により固相上に形成された免疫複
合体の標識物を測定し行うことができる。測定を行うに
あたって第三抗体は、１種類又は２種類以上を免疫複合
体を形成する際の反応溶液中に添加することができる。
競合法ではまず固相試薬と、抗原性物質を含む検体と、
標識された抗原と、さらに前記第三抗体とを緩衝液中で
混合し、インキュベーッション（例えば５〜５０℃、５
分〜１日）した後、固相を洗浄する。次に固相上に形成
された免疫複合体から標識物の測定を行う方法である。
【００１８】本発明において、標識物の測定には標識物
に対応した装置として放射性同位元素を放射線測定する
他、発光、蛍光、発色等を目視又は比色計、蛍光光度
計、フォトンカウンター、感光フィルム等の測定機器を
用いて測定し行うことができる。標識物質が酵素の場合
には、その酵素活性を発光基質、蛍光基質、発色基質等
を加えて反応を行い、その発光、蛍光、発色等を目視又
は前記測定機器により測定を行うことができる。
に対応した装置として放射性同位元素を放射線測定する
他、発光、蛍光、発色等を目視又は比色計、蛍光光度
計、フォトンカウンター、感光フィルム等の測定機器を
用いて測定し行うことができる。標識物質が酵素の場合
には、その酵素活性を発光基質、蛍光基質、発色基質等
を加えて反応を行い、その発光、蛍光、発色等を目視又
は前記測定機器により測定を行うことができる。
【００１９】また、本発明の免疫測定試薬は、前記第一
抗体と標識物とが結合した標識抗体と、前記第二抗体と
固相とが結合した固相試薬と、第二抗体と抗原の抗原決
定基との結合を増強する性質を有する少なくとも１種の
モノクローナル抗体（第三抗体）とから構成されるサイ
ンドイッチ法の試薬、又は前記第二抗体と固相とが結合
した固相試薬と、標識された抗原と、第二抗体と抗原の
抗原決定基との結合を増強する性質を有する少なくとも
１種のモノクローナル抗体等とから構成される競合法の
試薬である。この測定試薬には、試薬が固体状態である
場合には溶解液、標識物質が酵素である場合にはその酵
素反応を停止させるための反応停止試薬等を任意に組み
合わせることができる。
抗体と標識物とが結合した標識抗体と、前記第二抗体と
固相とが結合した固相試薬と、第二抗体と抗原の抗原決
定基との結合を増強する性質を有する少なくとも１種の
モノクローナル抗体（第三抗体）とから構成されるサイ
ンドイッチ法の試薬、又は前記第二抗体と固相とが結合
した固相試薬と、標識された抗原と、第二抗体と抗原の
抗原決定基との結合を増強する性質を有する少なくとも
１種のモノクローナル抗体等とから構成される競合法の
試薬である。この測定試薬には、試薬が固体状態である
場合には溶解液、標識物質が酵素である場合にはその酵
素反応を停止させるための反応停止試薬等を任意に組み
合わせることができる。
【００２０】本発明の測定に用いられる検体としては、
特に制限はなく、例えば全血、血清、血漿、尿、リンパ
液等の体液を挙げることができる。
特に制限はなく、例えば全血、血清、血漿、尿、リンパ
液等の体液を挙げることができる。
【００２１】
【実施例】以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説
明する。
明する。
【００２２】実施例１ 抗ヒトＰＩＶＫＡ−ＩＩエンハ
ンス抗体（第３抗体）の作成 ＢＡＬＢ／Ｃマウスをフロイント完全アジュバントでエ
マルジョン化したプロトロンビン２５〜１００μｇで初
回免疫を行い、２〜３週間後、フロイント不完全アジュ
バントでエマルジョン化したプロトロンビン２５〜１０
０μｇで追加免疫を行った。抗体価の上昇を確認後、フ
リーのプロトロンビン２５〜１００μｇを静脈内に投与
し、その３〜４日後、マウスから脾臓を取り出し脾細胞
を調製する。前もってＲＰＭＩ−１６４０培地で培養し
ていたマウスミエローマ細胞と脾細胞を１：２〜１：５
の比率で混合し、ポリエチレングリコールを用いて細胞
融合を行う。融合した細胞は、ＨＡＴ培地に浮遊した
後、９６ウエル培養プレートに分注し３７℃炭酸ガスイ
ンキュベーターで培養する。
ンス抗体（第３抗体）の作成 ＢＡＬＢ／Ｃマウスをフロイント完全アジュバントでエ
マルジョン化したプロトロンビン２５〜１００μｇで初
回免疫を行い、２〜３週間後、フロイント不完全アジュ
バントでエマルジョン化したプロトロンビン２５〜１０
０μｇで追加免疫を行った。抗体価の上昇を確認後、フ
リーのプロトロンビン２５〜１００μｇを静脈内に投与
し、その３〜４日後、マウスから脾臓を取り出し脾細胞
を調製する。前もってＲＰＭＩ−１６４０培地で培養し
ていたマウスミエローマ細胞と脾細胞を１：２〜１：５
の比率で混合し、ポリエチレングリコールを用いて細胞
融合を行う。融合した細胞は、ＨＡＴ培地に浮遊した
後、９６ウエル培養プレートに分注し３７℃炭酸ガスイ
ンキュベーターで培養する。
【００２３】エンハンス抗体のスクリーニングは以下の
ようにして実施した。フリーのヒトＰＩＶＫＡ−ＩＩと
の反応の見られないモノクローナル抗体Ｅ７−１３（固
相化したヒトＰＩＶＫＡ−ＩＩには反応する）を９６ウ
エルＥＬＩＳＡプレート（ファルマシア社製）に１０μ
ｇ／ｍｌの濃度で５０μｇ／ウエル分注し、４℃一晩放
置することにより吸着させる。１％スキムミルクでブロ
ッキングした後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢ
Ｓで洗浄し、４０μｌの細胞融合を行ったプレートの培
養上清と１０μｌのヒトＰＩＶＫＡ−ＩＩ抗原（１μｇ
／ｍｌ）を各ウエルに加え３７℃１時間反応させる。洗
浄後ＰＯＤ標識抗プロトロンビン抗体（ＤＡＣＯ社製）
を加え、３７℃１時間反応させる。洗浄後基質ＡＢＴＳ
を加え発色の見られるウエルを選択する。このようにし
て得られたＥ７−１３のフリーのヒトＰＩＶＫＡ−ＩＩ
に対する反応をエンハンスする活性を有するモノクロー
ナル抗体（第３抗体）を産生するセルラインを確立し、
モノクローナル抗体をＰＴＵＰ９と命名した。ＰＴＵＰ
９はＩｇＭタイプの抗体でありプロトロンビン、ヒトＰ
ＩＶＫＡ−ＩＩの両者に反応する。
ようにして実施した。フリーのヒトＰＩＶＫＡ−ＩＩと
の反応の見られないモノクローナル抗体Ｅ７−１３（固
相化したヒトＰＩＶＫＡ−ＩＩには反応する）を９６ウ
エルＥＬＩＳＡプレート（ファルマシア社製）に１０μ
ｇ／ｍｌの濃度で５０μｇ／ウエル分注し、４℃一晩放
置することにより吸着させる。１％スキムミルクでブロ
ッキングした後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢ
Ｓで洗浄し、４０μｌの細胞融合を行ったプレートの培
養上清と１０μｌのヒトＰＩＶＫＡ−ＩＩ抗原（１μｇ
／ｍｌ）を各ウエルに加え３７℃１時間反応させる。洗
浄後ＰＯＤ標識抗プロトロンビン抗体（ＤＡＣＯ社製）
を加え、３７℃１時間反応させる。洗浄後基質ＡＢＴＳ
を加え発色の見られるウエルを選択する。このようにし
て得られたＥ７−１３のフリーのヒトＰＩＶＫＡ−ＩＩ
に対する反応をエンハンスする活性を有するモノクロー
ナル抗体（第３抗体）を産生するセルラインを確立し、
モノクローナル抗体をＰＴＵＰ９と命名した。ＰＴＵＰ
９はＩｇＭタイプの抗体でありプロトロンビン、ヒトＰ
ＩＶＫＡ−ＩＩの両者に反応する。
【００２４】実施例２ 糖化ヘモグロビンＡ１ｃ（Ｈｂ
Ａ１ｃ）エンハンス抗体（第３抗体）の作成 ＢＡＬＢ／Ｃマウスをフロイント完全アジュバントでエ
マルジョン化したヘモグロビン２５〜１００μｇで初回
免疫を行い、２〜３週間後、フロイント不完全アジュバ
ントでエマルジョン化したヘモグロビン２５〜１００μ
ｇで追加免疫を行った。抗体価の上昇を確認後、フリー
のヘモグロビンを２５〜１００μｇを静脈内に投与し、
その３〜４日後、マウスから脾臓を取り出し脾細胞を調
整する。前もってＲＰＭＩ−１６４０培地で培養してい
たマウスミエローマ細胞と脾細胞を１：２〜１：５の比
率で混合し、ポリエチレングリコール等の融合剤を用い
細胞融合を行う。融合した細胞はＨＡＴ培地に浮遊した
後、９６ウエル培養プレートに分注し３７℃炭酸ガスイ
ンキュベーターで培養する。
Ａ１ｃ）エンハンス抗体（第３抗体）の作成 ＢＡＬＢ／Ｃマウスをフロイント完全アジュバントでエ
マルジョン化したヘモグロビン２５〜１００μｇで初回
免疫を行い、２〜３週間後、フロイント不完全アジュバ
ントでエマルジョン化したヘモグロビン２５〜１００μ
ｇで追加免疫を行った。抗体価の上昇を確認後、フリー
のヘモグロビンを２５〜１００μｇを静脈内に投与し、
その３〜４日後、マウスから脾臓を取り出し脾細胞を調
整する。前もってＲＰＭＩ−１６４０培地で培養してい
たマウスミエローマ細胞と脾細胞を１：２〜１：５の比
率で混合し、ポリエチレングリコール等の融合剤を用い
細胞融合を行う。融合した細胞はＨＡＴ培地に浮遊した
後、９６ウエル培養プレートに分注し３７℃炭酸ガスイ
ンキュベーターで培養する。
【００２５】エンハンス抗体のスクリーニングは以下の
ようにして実施した。フリーのＨｂＡ１ｃとの反応の見
られないモノクローナル抗体Ａ１ｃ１４２（固相化した
ＨｂＡ１ｃには反応する）を９６ウエルＥＬＩＳＡプレ
ート（ファルマシア社製）に１０μｇ／ｍｌの濃度で５
０μｇ／ウエル分注し、４℃一晩放置することにより吸
着させる。１％スキムミルクでブロッキングした後、
０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで洗浄し、４０
μｌの細胞融合を行ったプレートの培養上清と１０μｌ
のＨｂＡ１ｃ抗原（１μｇ／ｍｌ）を各ウエルに加え３
７℃１時間反応させる。洗浄後アルカリ性ホスファター
ゼ（Ａｌｐ）標識抗ヘモグロビン抗体（ウサギを免疫し
て作成）を加え、３７℃１時間反応させる。洗浄後基質
としてｐ−ニトロフェニルホスフェート（ＰＮＰＰ）を
加え発色の見られるウエルを選択する。このようにして
得られたＡ１ｃ１４２のフリーのＨｂＡ１ｃに対する反
応をエンハンスする活性を有するモノクローナル抗体
（第３抗体）を産生するセルラインを確立し、モノクロ
ーナル抗体をＨＢＵＰ３と命名した。ＨＢＵＰ３はＩｇ
Ｇタイプの抗体でありヘモグロビン、ＨｂＡ１ｃの両者
に反応する。
ようにして実施した。フリーのＨｂＡ１ｃとの反応の見
られないモノクローナル抗体Ａ１ｃ１４２（固相化した
ＨｂＡ１ｃには反応する）を９６ウエルＥＬＩＳＡプレ
ート（ファルマシア社製）に１０μｇ／ｍｌの濃度で５
０μｇ／ウエル分注し、４℃一晩放置することにより吸
着させる。１％スキムミルクでブロッキングした後、
０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで洗浄し、４０
μｌの細胞融合を行ったプレートの培養上清と１０μｌ
のＨｂＡ１ｃ抗原（１μｇ／ｍｌ）を各ウエルに加え３
７℃１時間反応させる。洗浄後アルカリ性ホスファター
ゼ（Ａｌｐ）標識抗ヘモグロビン抗体（ウサギを免疫し
て作成）を加え、３７℃１時間反応させる。洗浄後基質
としてｐ−ニトロフェニルホスフェート（ＰＮＰＰ）を
加え発色の見られるウエルを選択する。このようにして
得られたＡ１ｃ１４２のフリーのＨｂＡ１ｃに対する反
応をエンハンスする活性を有するモノクローナル抗体
（第３抗体）を産生するセルラインを確立し、モノクロ
ーナル抗体をＨＢＵＰ３と命名した。ＨＢＵＰ３はＩｇ
Ｇタイプの抗体でありヘモグロビン、ＨｂＡ１ｃの両者
に反応する。
【００２６】実施例３ ヒトＰＩＶＫＡ−ＩＩの測定 ＥＬＩＳＡプレート（ＭＡＸＩＳＯＲＢ；ＮＵＮＣ社
製）にＥ７−１３を１０μｇ／ｍｌの濃度で７５μｌ／
ｗｅｌｌ、４℃一夜放置しコートした。１％スキムミル
クでブロッキングした後、２０μｇ／ｍｌのＰＴＵＰ９
をが含有した緩衝液（１５％ＣＳ Ｔｒｉｓ７．４）と
含有していない反応緩衝液で検体を測定した。すなわ
ち、４０μｌの血清と４０μｌの反応緩衝液をＥ７−１
３をコートしたウエルに入れ、３７℃で１時間反応させ
る。洗浄後ＰＯＤ標識抗プロトロンビン抗体（ＤＡＣＯ
社製）を入れ、さらに３７℃で１時間反応させる。洗浄
後基質２，２’−アジノジ（３−エチルベンズチアゾリ
ン）−６’−スルホン酸（ＡＢＴＳ）を入れ波長４０５
ｎｍの吸光度を測定した。その結果を図１に示す。図１
に示すようにＰＴＵＰ９を含まない反応緩衝液では、ヒ
トＰＩＶＫＡ−ＩＩ陽性検体でもほとんど発色が見られ
ないが、ＰＴＵＰ９を含む反応緩衝液では明らかに陽性
検体で強い発色が観察された。
製）にＥ７−１３を１０μｇ／ｍｌの濃度で７５μｌ／
ｗｅｌｌ、４℃一夜放置しコートした。１％スキムミル
クでブロッキングした後、２０μｇ／ｍｌのＰＴＵＰ９
をが含有した緩衝液（１５％ＣＳ Ｔｒｉｓ７．４）と
含有していない反応緩衝液で検体を測定した。すなわ
ち、４０μｌの血清と４０μｌの反応緩衝液をＥ７−１
３をコートしたウエルに入れ、３７℃で１時間反応させ
る。洗浄後ＰＯＤ標識抗プロトロンビン抗体（ＤＡＣＯ
社製）を入れ、さらに３７℃で１時間反応させる。洗浄
後基質２，２’−アジノジ（３−エチルベンズチアゾリ
ン）−６’−スルホン酸（ＡＢＴＳ）を入れ波長４０５
ｎｍの吸光度を測定した。その結果を図１に示す。図１
に示すようにＰＴＵＰ９を含まない反応緩衝液では、ヒ
トＰＩＶＫＡ−ＩＩ陽性検体でもほとんど発色が見られ
ないが、ＰＴＵＰ９を含む反応緩衝液では明らかに陽性
検体で強い発色が観察された。
【００２７】実施例４ ヒトＰＩＶＫＡ−ＩＩの測定に
おけるエンハンス効果の測定 実施例３で測定したＰＴＵＰ９の添加効果について希釈
倍率の異なる検体を用いて測定を行った。ヒトＰＩＶＫ
Ａ−ＩＩ高値血清を１％ＢＳＡ含有Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐ
Ｈ７．４）で希釈し、この検体を実施例３の方法に従い
ＰＴＵＰ９を添加して測定を行った。比較としてＰＴＵ
Ｐ９を添加せず前記検体について同様な測定を行った。
その結果を図２に示す。図２に示すようにＰＴＵＰ９を
添加した測定では約１００倍の感度上昇が見られた。
おけるエンハンス効果の測定 実施例３で測定したＰＴＵＰ９の添加効果について希釈
倍率の異なる検体を用いて測定を行った。ヒトＰＩＶＫ
Ａ−ＩＩ高値血清を１％ＢＳＡ含有Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐ
Ｈ７．４）で希釈し、この検体を実施例３の方法に従い
ＰＴＵＰ９を添加して測定を行った。比較としてＰＴＵ
Ｐ９を添加せず前記検体について同様な測定を行った。
その結果を図２に示す。図２に示すようにＰＴＵＰ９を
添加した測定では約１００倍の感度上昇が見られた。
【００２８】実施例５ ＨｂＡ１ｃの測定 ＥＬＩＳＡプレート（ＭＡＸＩＳＯＲＢ；ＮＵＮＣ社
製）にＡ１ｃ１４２を１０μｇ／ｍｌの濃度で７５μｌ
／ｗｅｌｌ、４℃一夜放置しコートし、１％スキムミル
クでブロッキングした。６０μｌのＨＢＵＰ１培養上清
と共に５μｇ／ｍｌのＨｂＡ１ｃ溶液１５μｌを加え３
７℃１時間反応させた。洗浄後Ａｌｐ標識抗ヘモグロビ
ン抗体を入れ、さらに３７℃で１時間反応させる。洗浄
後基質ＰＮＰＰを入れ波長４０５ｎｍの吸光度を測定し
た。コントロールとして、培養上清はＥ７−１３（抗Ｐ
ＩＶＫＡ−ＩＩモノクローナル抗体）、抗原はＢＳＡを
用いた。その結果を図３に示す。図３に示すようにＨＢ
ＵＰ１培養上清中のＨｂＡ１ｃが存在するときにおいて
のみ発色が観察された。
製）にＡ１ｃ１４２を１０μｇ／ｍｌの濃度で７５μｌ
／ｗｅｌｌ、４℃一夜放置しコートし、１％スキムミル
クでブロッキングした。６０μｌのＨＢＵＰ１培養上清
と共に５μｇ／ｍｌのＨｂＡ１ｃ溶液１５μｌを加え３
７℃１時間反応させた。洗浄後Ａｌｐ標識抗ヘモグロビ
ン抗体を入れ、さらに３７℃で１時間反応させる。洗浄
後基質ＰＮＰＰを入れ波長４０５ｎｍの吸光度を測定し
た。コントロールとして、培養上清はＥ７−１３（抗Ｐ
ＩＶＫＡ−ＩＩモノクローナル抗体）、抗原はＢＳＡを
用いた。その結果を図３に示す。図３に示すようにＨＢ
ＵＰ１培養上清中のＨｂＡ１ｃが存在するときにおいて
のみ発色が観察された。
【００２９】実施例６ ＨｂＡ１ｃの測定におけるエン
ハンス効果の測定 実施例５で測定したＨＢＵＰ３の添加効果について希釈
倍率の異なる検体を用いて測定を行った。ＨｂＡ１ｃを
１％ＢＳＡ含有Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．４）で希釈し
（２００μｇ／ｍｌ〜）、この検体を実施例５の方法に
従いＨＢＵＰ３培養上清と無関係のＥ７−１３培養上清
の存在下で測定し比較した。その結果を図４に示す。図
よりＨＢＵＰ１を添加した測定では１０００倍以上の感
度上昇が見られた。
ハンス効果の測定 実施例５で測定したＨＢＵＰ３の添加効果について希釈
倍率の異なる検体を用いて測定を行った。ＨｂＡ１ｃを
１％ＢＳＡ含有Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．４）で希釈し
（２００μｇ／ｍｌ〜）、この検体を実施例５の方法に
従いＨＢＵＰ３培養上清と無関係のＥ７−１３培養上清
の存在下で測定し比較した。その結果を図４に示す。図
よりＨＢＵＰ１を添加した測定では１０００倍以上の感
度上昇が見られた。
【００３０】
【発明の効果】本発明は、固相に結合した第二抗体と抗
原の抗原決定基との結合を増強する性質を有する第三抗
体を添加して免疫測定する方法であり、従来の測定条件
では十分な感度を示さない場合であっても、第三抗体を
添加する操作だけで低濃度の抗原性物質を感度よく測定
することができる。その結果、本発明は検体中に極微量
含まれるヘモグロビン、血清蛋白質、腫瘍関連抗原、ホ
ルモン、ウイルス等の抗原検出を行うことができ、各種
癌疾患、感染症、内分泌疾患等の早期診断、治療のモニ
ター等に利用することができる。
原の抗原決定基との結合を増強する性質を有する第三抗
体を添加して免疫測定する方法であり、従来の測定条件
では十分な感度を示さない場合であっても、第三抗体を
添加する操作だけで低濃度の抗原性物質を感度よく測定
することができる。その結果、本発明は検体中に極微量
含まれるヘモグロビン、血清蛋白質、腫瘍関連抗原、ホ
ルモン、ウイルス等の抗原検出を行うことができ、各種
癌疾患、感染症、内分泌疾患等の早期診断、治療のモニ
ター等に利用することができる。
【図１】ヒトＰＩＶＫＡ−ＩＩ陽性検体及び陰性検体に
ついて、ＰＴＵＰ９抗体を添加した時の測定結果を示す
図である。
ついて、ＰＴＵＰ９抗体を添加した時の測定結果を示す
図である。
【図２】ヒトＰＩＶＫＡ−ＩＩ陽性検体を希釈してＰＴ
ＵＰ９抗体の添加効果を測定した時の図である。
ＵＰ９抗体の添加効果を測定した時の図である。
【図３】ＨｂＡ１ｃの測定において、ＨＢＵＰ１抗体に
よる添加効果を示す図である。
よる添加効果を示す図である。
【図４】各ＨｂＡ１ｃ濃度の検体の測定において、ＨＢ
ＵＰ１抗体の添加効果を示す図である。
ＵＰ１抗体の添加効果を示す図である。
Claims (13)
- 【請求項１】 ポリペプチドを免疫原として得られた抗
体（第二抗体）と抗原との結合を増強する性質を有する
モノクローナル抗体（第三抗体）。 - 【請求項２】 抗原と反応する抗体（第一抗体）に標識
物が結合した標識抗体と、抗原を構成するポリペプチド
を免疫原として得られた抗体（第二抗体）が結合した固
相試薬とを用いる免疫測定に使用するための抗体であっ
て、第二抗体と抗原との結合を増強する性質を有するモ
ノクローナル抗体（第三抗体）。 - 【請求項３】 抗原に標識物が結合した標識抗原と、抗
原を構成するポリペプチドを免疫原として得られた抗体
（第二抗体）が結合した固相試薬とを用いる免疫測定に
使用するための抗体であって、第二抗体と抗原との結合
を増強する性質を有するモノクローナル抗体（第三抗
体）。 - 【請求項４】 抗原と反応する抗体（第一抗体）に標識
物が結合した標識抗体と、抗原を構成するポリペプチド
を免疫原として得られた抗体（第二抗体）が結合した固
相試薬と、抗原を含む検体とを混合して免疫複合体を形
成させる免疫測定法において、第二抗体と抗原との結合
を増強する性質を有する少なくとも１種類のモノクロー
ナル抗体（第三抗体）を添加することを特徴とする方
法。 - 【請求項５】 抗原に標識物が結合した標識抗原と、抗
原を構成するポリペプチドを免疫原として得られた抗体
（第二抗体）が結合した固相試薬と、抗原を含む検体と
を混合して免疫複合体を形成させる免疫測定法におい
て、第二抗体と抗原との結合を増強する性質を有する少
なくとも１種類のモノクローナル抗体（第三抗体）を添
加することを特徴とする方法。 - 【請求項６】 抗原が少なくとも２個の抗原決定基から
なる抗原である請求項４又は５記載の方法。 - 【請求項７】 抗原が体液中の正常蛋白質の修飾蛋白質
又は変異蛋白質である請求項６記載の方法。 - 【請求項８】 第二抗体がモノクローナル抗体である請
求項４又は５記載の方法 - 【請求項９】 抗原と反応する抗体（第一抗体）に標識
物が結合した標識抗体と、抗原を構成するポリペプチド
を免疫原として得られた抗体（第二抗体）が結合した固
相試薬と、第二抗体と抗原との結合を増強する性質を有
する少なくとも１種類のモノクローナル抗体（第三抗
体）とからなる免疫測定試薬。 - 【請求項１０】 抗原に標識物が結合した標識抗原と、
抗原を構成するポリペプチドを免疫原として得られた抗
体（第二抗体）が結合した固相試薬と、第二抗体と抗原
との結合を増強する性質を有する少なくとも１種類のモ
ノクローナル抗体（第三抗体）とからなる免疫測定試
薬。 - 【請求項１１】 抗原が少なくとも２個の抗原決定基か
らなる抗原である請求項９又は１０記載の測定試薬。 - 【請求項１２】 抗原が体液中の正常蛋白質から修飾又
は変異した蛋白質である請求項１１記載の測定試薬。 - 【請求項１３】 第二抗体がモノクローナル抗体である
請求項９又は１０記載の測定試薬。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP35674096A JP3615006B2 (ja) | 1996-12-27 | 1996-12-27 | モノクローナル抗体、該抗体を用いた免疫測定方法及び測定試薬 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP35674096A JP3615006B2 (ja) | 1996-12-27 | 1996-12-27 | モノクローナル抗体、該抗体を用いた免疫測定方法及び測定試薬 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH10197532A true JPH10197532A (ja) | 1998-07-31 |
| JP3615006B2 JP3615006B2 (ja) | 2005-01-26 |
Family
ID=18450541
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP35674096A Expired - Lifetime JP3615006B2 (ja) | 1996-12-27 | 1996-12-27 | モノクローナル抗体、該抗体を用いた免疫測定方法及び測定試薬 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3615006B2 (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2017061546A1 (ja) * | 2015-10-07 | 2017-04-13 | 富士レビオ株式会社 | Ｐｉｖｋａ－ｉｉの測定方法、及びｐｉｖｋａ－ｉｉ免疫測定試薬又はキットの製造方法 |
| CN111007263A (zh) * | 2019-12-25 | 2020-04-14 | 迈克生物股份有限公司 | 一种检测试剂盒及检测方法 |
| CN114634576A (zh) * | 2021-05-26 | 2022-06-17 | 中元汇吉生物技术股份有限公司 | 抗pivka-ii单克隆抗体及其应用 |
-
1996
- 1996-12-27 JP JP35674096A patent/JP3615006B2/ja not_active Expired - Lifetime
Cited By (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2017061546A1 (ja) * | 2015-10-07 | 2017-04-13 | 富士レビオ株式会社 | Ｐｉｖｋａ－ｉｉの測定方法、及びｐｉｖｋａ－ｉｉ免疫測定試薬又はキットの製造方法 |
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