KR20180055823A

KR20180055823A - Pivka-ii의 측정 방법, 및 pivka-ii 면역측정 시약 또는 키트의 제조 방법

Info

Publication number: KR20180055823A
Application number: KR1020187007870A
Authority: KR
Inventors: 요시유키 키타무라; 카츠미 아오야기
Original assignee: 후지레비오 가부시키가이샤; 세키스이 메디칼 가부시키가이샤
Priority date: 2015-10-07
Filing date: 2016-10-06
Publication date: 2018-05-25
Also published as: CN108139392A; EP3361252A4; CN108139392B; US20180284119A1; EP3361252A1; WO2017061546A1; KR102549704B1; US10830771B2; JP6713478B2; JPWO2017061546A1

Abstract

인간 프로트롬빈에 대한 모노클로날 항체를 사용한, 보다 정밀도가 높은 PIVKA-II의 면역학적 측정계의 구축을 가능하게 하는 수단이 개시되어 있다. 본 발명에 의한 PIVKA-II의 측정 방법은, 친수성의 PIVKA-II 분자를 인식하는 제1의 항프로트롬빈 항체 또는 그 항원 결합성 단편과, 소수성의 PIVKA-II 분자를 인식하는 제2의 항프로트롬빈 항체 또는 그 항원 결합성 단편의 혼합물, 및 PIVKA-II에 특이적으로 결합하는 항PIVKA-II 항체 또는 그 항원 결합성 단편을 사용한 면역측정에 의해 검체 중의 PIVKA-II를 측정하는 것을 포함한다.

Description

PIVKA-II의 측정 방법, 및 PIVKA-II 면역측정 시약 또는 키트의 제조 방법

본 발명은 검체 중에 포함되는 PIVKA-II 분자군을 빠짐 없이 검출 가능한 PIVKA-II 측정 방법, 및 PIVKA-II 측정 시약 또는 키트의 제조 방법에 관한 것이다.

PIVKA-II(Protein induced by vitamin K absence-II)는 혈액응고에 관련되는 프로트롬빈과 유사한 구조를 갖는 당 단백질이다. 프로트롬빈은 579 잔기의 단백질이며, N 말단의 근방에 있는 10개의 글루탐산(Glu) 잔기가 γ-카르복실화를 받아서 γ-카르복시글루탐산(Gla) 잔기로 되어 있다. 이 N 말단의 영역을 Glu-Gla 영역이라고 한다. 프로트롬빈이 생체 내에서 산생될 때에 비타민 K의 결핍, 간기능 부전, 비타민 K 길항제의 투여, 간세포 장해 등에 기인하여 γ-카르복실화가 불완전하게 되고, 10개의 잔기 중 전부 또는 일부가 Glu 잔기로 되어 있는 당 단백질이 혈액 중에 발견되는 것이 알려져 있다. 이 단백질이 이상 프로트롬빈이라고도 불리는 PIVKA-II이다. 최근, 간세포암 환자에 있어서 혈장 중에 PIVKA-II가 고농도로 검출되는 것이 보고되어, 간세포암의 마커로서 진단의 모니터에 이용되게 되었다. 또한, Glu-Gla 영역 이외에는 프로트롬빈과 PIVKA-II에서 구조에 차이는 없고, 어느쪽의 단백질이나 중앙 영역에 2개의 크링글 도메인(프로트롬빈 프래그먼트 1(F1) 영역, 프로트롬빈 프래그먼트 2(F2) 영역)을 갖고, C 말에 트롬빈 영역을 갖는다.

검체 중의 PIVKA-II를 특이적으로 검출하는 방법으로서, PIVKA-II를 특이적으로 인식하는 모노클로날 항체와 프로트롬빈에 대한 폴리클로날 항체의 양자를 사용하고, 그 한쪽을 고정화항체로 하고, 다른쪽을 표식항체로 해서 측정하는 면역측정법이 보고되어 있다(특허문헌 1). 그러나, 폴리클로날 항체는 로트 차에 의해서 프로트롬빈에 대한 특이성이나 친화성에 편차가 생겨 버린다. 이것을 회피하기 위해서, 복수의 로트의 특이성과 친화성을 평가할 필요가 있지만, 보다 높은 특이성을 담보하기 위해서는 폴리클로날 항체보다 모노클로날 항체 쪽이 바람직하다.

또한, ELISA법에 의한 PIVKA-II의 측정에 있어서 PIVKA-II를 특이적으로 인식하는 모노클로날 항체를 고상 항체로 하고, 프로트롬빈에 대한 폴리클로날 항체를 2차 항체로 해서 사용했을 경우에, 트롬빈과 반응성을 나타내는 항체가 2차 항체에 포함됨으로써 혈청 검체의 측정계에 악영향을 주어 안정된 측정값이 얻어지지 않는 것이 알려져 있다(특허문헌 2). 특허문헌 2에서는, 이것을 해결하기 위해서 인간 트롬빈과는 반응하지 않고, 인간 프로트롬빈과 특이적으로 반응하는 항체를 2차 항체로서 사용함으로써 혈청 검체를 안정시켜서 PIVKA-II를 측정할 수 있는 것이 보고되어 있다. 그러나, 이 방법도 폴리클로날 항체를 사용하기 때문에, 특허문헌 1과 같은 문제점이 있다. 또한, 특허문헌 2의 방법에서는 인간 프로트롬빈에 대한 폴리클로날 항체로부터 트롬빈에 대한 항체를 제거하기 위해서, 인간 프로트롬빈 어피니티 칼럼을 이용하여 프로트롬빈과 반응하는 항체를 취득한 후에 투석하고, 또한 인간 트롬빈 어피니티 칼럼을 이용하여 트롬빈과 반응하지 않는 항체를 취득해 투석할 필요가 있어, 항체의 정제 공정이 매우 번잡하다.

ELISA법에 의한 PIVKA-II의 측정 기술의 다른 예로서, 고상 항체에 항PIVKA-II 모노클로날 항체를, 표식항체로서 PIVKA-II의 항F1 모노클로날 항체와 항F2 모노클로날 항체의 혼합물을 이용하여 PIVKA-II를 측정하는 기술이 보고되어 있다(특허문헌 3). 이 기술에 의하면, 동일 환자로부터 거의 동시에 채취된 혈청과 혈장의 페어 검체에 있어서의 혈청 혈장 상관을 개선할 수 있다. 그러나, PIVKA-II의 검출 정밀도 자체의 향상에 대해서는 특허문헌 3에서는 문제로 하고 있지 않다.

또한, 혈중 PIVKA-II의 Glu-Gla 영역에 대해서는, 지금까지 탈카르복실화 부위를 중심으로 해서 상세한 해석이 이루어져 있고, 분자 다양성이 풍부한 것이 나타내어져 있다. 그러나, 해당 Glu-Gla 영역을 제외한 크링글 도메인보다 C 말측의 PIVKA-II의 분자 다양성에 대해서는 지금까지 검토되고 있지 않고, 상기 특허문헌 1∼3에 있어서도 일체 기재가 없다.

일본 특허공개 소 60-60557공보 일본 특허공개 평 5-249108공보 일본 특허공개 2014-35278공보

본 발명은 인간 프로트롬빈에 대한 모노클로날 항체를 사용한, 보다 정밀도가 높은 PIVKA-II의 면역학적 측정계의 구축을 가능하게 하는 수단을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본원 발명자들은 항인간 프로트롬빈 모노클로날 항체를 사용한 PIVKA-II의 면역측정계에 대해서 예의 검토한 결과, 검체와 항인간 프로트롬빈 모노클로날 항체의 조합에 의해서는 측정 결과에 정합성이 얻어지지 않는 케이스가 있는 것을 찾아내고, 종래의 기술에서는 정확하게 PIVKA-II를 측정할 수 없는 검체(환자)가 존재할 가능성이 생각되었다.

더욱 예의 연구한 결과, PIVKA-II 분자에는 Glu-Gla 영역의 분자 다양성에 더해, 소수성의 정도가 다른 복수의 분자종이 존재하는 것을 찾아냈다. 소수성의 정도가 다른 복수 종류의 PIVKA-II 분자의 함유 비율은, 검체의 종류(혈장인지 혈청인지)에 의하지 않고 검체마다 다르고, 예를 들면 혈청 검체간이여도 소수성이 다른 PIVKA-II 분자종의 함유 비율이 달랐다. 또한, 공지의 항인간 프로트롬빈 모노클로날 항체는 복수 존재하지만, 이들 모노클로날 항체는 소수성의 정도가 다른 PIVKA-II 분자종에 대한 친화성이 다르고, 소수성이 높은 분자종으로의 친화성이 높은 항체나, 소수성이 낮은 분자종으로의 친화성이 높은 항체가 존재하는 것이 판명되었다. 예를 들면, 소수성이 높은 분자종을 인식하는 항체를 PIVKA-II의 면역학적 측정 방법에 사용했을 경우, 친수성이 높은 분자종이 많이 포함되는 검체에서는 검체 중에 포함되는 PIVKA-II의 대부분이 검출되어 있지 않아, 혈중 PIVKA-II를 정확하게 측정할 수 없었던 것이 판명되었다.

그래서, 본원 발명자들은 프로트롬빈 영역을 인식하는 모노클로날 항체를 사용한 PIVKA-II 측정계의 구축에 있어서, 소수성이 높은 PIVKA-II 분자종에 대하여 친화성을 갖는 항체와 소수성이 낮은 PIVKA-II 분자종에 대하여 친화성을 갖는 항체의 혼합물을 이용하여 PIVKA-II를 측정함으로써, 매우 정밀도 좋게 PIVKA-II를 측정하는 것이 가능하게 되는 것을 찾아내고 본원 발명을 완성하였다.

즉, 본 발명은 친수성의 PIVKA-II 분자를 인식하는 적어도 1종의 제1의 항프로트롬빈 항체 또는 그 항원 결합성 단편과, 소수성의 PIVKA-II 분자를 인식하는 적어도 1종의 제2의 항프로트롬빈 항체 또는 그 항원 결합성 단편의 혼합물, 및 PIVKA-II에 특이적으로 결합하는 항PIVKA-II 항체 또는 그 항원 결합성 단편을 사용한 면역측정에 의해, 검체 중의 PIVKA-II를 측정하는 것을 포함하는 PIVKA-II의 측정 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 PIVKA-II 및 프로트롬빈의 양자에 결합하지만 트롬빈에는 반응성을 나타내지 않는 항체 또는 그 항원 결합성 단편에 대해서, PIVKA-II의 친수성 획분 및 소수성 획분으로의 반응성을 조사하는 공정과; 친수성 획분에 반응하는 적어도 1종의 항체 또는 그 항원 결합성 단편과, 소수성 획분에 반응하는 적어도 1종의 항체 또는 그 항원 결합성 단편을 혼합하는 공정을 포함하는 PIVKA-II의 면역측정 시약 또는 키트의 제조 방법을 제공한다.

(발명의 효과)

본 발명에 의하면, 혈액 검체 중에 포함되는 PIVKA-II 분자군을 높은 정밀도로 측정할 수 있다. 혈중 PIVKA-II 분자가 소수성의 정도가 다른 분자의 집단이며, 검체마다 소수성이 높은 PIVKA-II 분자와 소수성이 낮은 PIVKA-II 분자의 존재 비율이 다르다고 하는 것은 본원 발명자들이 처음으로 찾아낸 것이다. 혈중 PIVKA-II 분자의 소수성/친수성 레벨에 관해서 정밀히 조사되어 있지 않았던 종래의 항프로트롬빈 모노클로날 항체를 사용한 면역측정 방법에서는, 사용하는 항체의 성질에 따라서는 혈중 PIVKA-II 분자군을 정밀도 좋게 검출하는 것이 가능하지 않았다. 본 발명의 방법에 의하면, 종래법에서는 간과하고 있을 우려가 있었던 복수의 PIVKA-II 분자종을 높은 정밀도로 검출할 수 있으므로 PIVKA-II의 측정 정밀도가 비약적으로 향상된다.

도 1은 간세포암 환자 유래의 혈청 검체 6예를 각각 소수성 상호작용 크로마토그래피에 의해 분획한 각 프랙션(fraction)을 측정용 시료로 하고, 효소표식항체로서 ALP 표식 항프로트롬빈 폴리클로날 항체를 이용하여 시료중 PIVKA-II 분자를 측정한 결과이다.
도 2a는 간세포암 환자 유래의 혈청 검체(No.4)를 소수성 상호작용 크로마토그래피에 의해 분획한 각 프랙션을 측정용 시료로 하고, 표식항체 A∼D를 이용하여 시료중 PIVKA-II 분자를 측정한 결과이다.
도 2b는 간세포암 환자 유래의 혈청 검체(No.269)를 소수성 상호작용 크로마토그래피에 의해 분획한 각 프랙션을 측정용 시료로 하고, 표식항체 A∼D를 이용하여 시료중 PIVKA-II 분자를 측정한 결과이다.
도 2c는 간세포암 환자 유래의 혈청 검체(No.275)를 소수성 상호작용 크로마토그래피에 의해 분획한 각 프랙션을 측정용 시료로 하고, 표식항체 A∼D를 이용하여 시료중 PIVKA-II 분자를 측정한 결과이다.
도 3a는 간세포암 환자 유래의 혈청 검체(No.4)를 소수성 상호작용 크로마토그래피에 의해 분획한 각 프랙션을 측정용 시료로 하고, 표식항체로서 항체 혼합물(항체 C/A, 항체 C/B, 항체 C/D)을 이용하여 시료중 PIVKA-II를 측정한 결과이다.
도 3b는 간세포암 환자 유래의 혈청 검체(No.269)를 소수성 상호작용 크로마토그래피에 의해 분획한 각 프랙션을 측정용 시료로 하고, 표식항체로서 항체 혼합물(항체 C/A, 항체 C/B, 항체 C/D)을 이용하여 시료중 PIVKA-II를 측정한 결과이다.
도 3c는 간세포암 환자 유래의 혈청 검체(No.275)를 소수성 상호작용 크로마토그래피에 의해 분획한 각 프랙션을 측정용 시료로 하고, 표식항체로서 항체 혼합물(항체 C/A, 항체 C/B, 항체 C/D)을 이용하여 시료중 PIVKA-II를 측정한 결과이다.
도 4a는 간세포암 환자 유래의 혈청 검체(No.275)를 소수성 상호작용 크로마토그래피에 의해 분획한 각 프랙션을 측정용 시료로 하고, 표식항체로서 항체 C/A를 각종 중량비율(A:C=1:1∼30:1)로 혼합한 항체 혼합물을 이용하여 시료중 PIVKA-II를 측정한 결과이다.
도 4b는 간세포암 환자 유래의 혈청 검체(No.275)를 소수성 상호작용 크로마토그래피에 의해 분획한 각 프랙션을 측정용 시료로 하고, 표식항체로서 항체 C/A를 각종 중량비율(A:C=3:1∼0.03:1)로 혼합한 항체 혼합물을 이용하여 시료중 PIVKA-II를 측정한 결과이다.

본 발명의 PIVKA-II 측정 방법은 PIVKA-II에 결합하는 항체 또는 그 항원 결합성 단편을 이용하여 PIVKA-II를 면역학적 방법에 의해 측정하는 방법이며, 항체 또는 그 항원 결합성 단편의 하나로서 친수성의(소수성이 낮은) PIVKA-II 분자를 인식하는 적어도 1종의 항프로트롬빈 항체 또는 그 항원 결합성 단편과, 소수성의(소수성이 높은) PIVKA-II 분자를 인식하는 적어도 1종의 항프로트롬빈 항체 또는 그 항원 결합성 단편의 혼합물을 사용한다. 본 발명에서는 편의상, 전자의 친수성 PIVKA-II 분자를 인식하는 항체를 제1의 항체, 후자의 소수성 PIVKA-II 분자를 인식하는 항체를 제2의 항체라고 한다.

검체중에 소수성의 정도가 다른 PIVKA-II 분자가 혼재하고 있다고 하는 것은 본원 발명자들이 처음으로 찾아낸 것이다. PIVKA-II 분자의 소수성의 차이는, Glu-Gla 영역에 있어서의 γ-카르복실화의 정도에 의해 초래되고 있는 것이 아니라, 분자 중앙의 크링글 도메인 및 그 이후의 C 말측의 구조에 다양성이 있고, 그 다양성에 의해 초래되고 있는 것이라고 추측된다.

항프로트롬빈 항체란 PIVKA-II 및 프로트롬빈의 양자를 인식해서 결합하지만, 트롬빈과는 반응성을 나타내지 않는 항체이다. 여기에서 말하는 「반응성을 나타내지 않는다」란, 트롬빈과는 검출 가능한 레벨에서 결합하지 않거나(즉, 트롬빈과의 결합이 백그라운드 이하이거나), 또는 검출할 수 있는 레벨에서 결합해도 그 결합의 정도가 PIVKA-II 및 프로트롬빈과의 결합보다 명확하게 적고, 당업자라면 트롬빈과는 결합하고 있지 않다고 판단하는 정도로 밖에 결합하지 않는 것을 의미한다. 항프로트롬빈 항체 자체는 공지이며, 시판품도 존재한다. 본 발명에서 사용하는 제1의 항프로트롬빈 항체 및 제2의 프로트롬빈 항체는 공지의 항프로트롬빈 항체 중에서 선택해도 좋고, 새롭게 항프로트롬빈 항체를 만들어내어 그 중에서 선택해도 좋다. 제1 및 제2의 항프로트롬빈 항체의 선택 방법의 상세한 것은 후술한다.

또한, 또 하나의 항체 또는 그 항원 결합성 단편으로서, PIVKA-II를 프로트롬빈과 구별해서 특이적으로 결합하는 항PIVKA-II 항체 또는 그 항원 결합성 단편을 사용한다. 항PIVKA-II 항체의 특이성은 「PIVKA-II와만 결합하고, 프로트롬빈과는 반응성을 나타내지 않는다」라고 표현할 수 있다. 「반응성을 나타내지 않는다」의 의미는 상기와 같다. 이 항PIVKA-II 항체는 프로트롬빈에는 없는 PIVKA-II에 특징적인 영역, 즉 Glu-Gla 영역을 인식하는 항체이며, 소수성인가 친수성인가를 막론하고 PIVKA-II 분자에 결합한다.

그러한 항PIVKA-II 항체도 공지이며(예를 들면, 특허문헌 1), 시판품도 존재한다. 또한, 새롭게 제작한 항PIVKA-II 항체를 사용해도 좋다.

제1 및 제2의 항프로트롬빈 항체, 및 항PIVKA-II 항체는, 폴리클로날 항체여도 모노클로날 항체여도 좋지만, 면역측정의 재현성 등의 관점으로부터는 모노클로날 항체가 바람직하다.

항체 및 그 항원 결합성 단편의 제작 방법 자체는 주지의 상법이다. 항프로트롬빈 폴리클로날 항체는, 예를 들면 프로트롬빈 또는 그 부분단편(Glu-Gla 영역 이외의 부분단편)을 적당하게 아쥬반트와 함께 동물(인간을 제외함)에 면역하고, 그 동물로부터 채취한 혈액으로부터 항혈청을 얻고, 그 혈청 중의 폴리클로날 항체를 정제함으로써 얻을 수 있다. 면역은 피면역 동물 중에서의 항체가를 상승시키기 때문에 통상 수주간에 걸쳐서 복수회 행한다. 항혈청 중의 항체의 정제는, 예를 들면 황산암모늄 침전이나 음이온 크로마토그래피에 의한 분획, 어피니티 칼럼 정제 등에 의해 행할 수 있다.

항프로트롬빈 모노클로날 항체는, 예를 들면 주지의 하이브리도마법에 의해 제작할 수 있다. 구체적으로는, 프로트롬빈 또는 그 부분단편(Glu-Gla 영역 이외의 부분단편)을 적당하게 아쥬반트와 함께 동물(인간을 제외한다)에 면역하고, 그 동물로부터 비장세포나 림프구와 같은 항체산생세포를 채취하고, 이것을 골수종세포와 융합시켜서 하이브리도마를 조제하여, 프로트롬빈과 결합하는 항체를 산생하는 하이브리도마를 선택하고, 이것을 증식시켜서 배양 상청으로부터 항프로트롬빈 모노클로날 항체를 얻을 수 있다. 하이브리도마의 선택에 있어서는 PIVKA-II를 항원으로서 사용해도 좋고, 프로트롬빈과 PIVKA-II의 양자에 결합하는 것을 확인해도 좋다.

항PIVKA-II 항체는 카르복실화가 불완전한 Glu-Gla 영역 부분단편을 면역원으로서 사용해서 제작할 수 있지만, 본 발명에 있어서는 PIVKA-II에의 충분한 특이성을 가질 필요가 있기 때문에, 통상은 모노클로날 항체가 사용된다. PIVKA-II 모노클로날 항체는 PIVKA-II 또는 그 부분단편(카르복실화를 받는 Glu-Gla 영역의 10잔기 중 적어도 일부를 포함하는 부분단편)을 면역원으로서 사용하고, 하이브리도마를 조제 후, PIVKA-II에는 결합하지만 프로트롬빈에는 결합하지 않는 항체를 산생하는 하이브리도마를 선택하고, 항체를 회수하면 된다. 항PIVKA-II 항체의 제조 방법의 구체예로서, 일본 특허공개 소60-60557 공보, 일본 특허공개 평9-249699 공보에 기재된 방법을 들 수 있다.

「항원 결합성 단편」은 원래의 항체의 대응 항원에 대한 결합성(항원 항체 반응성)을 유지하고 있는 한 어떠한 항체 단편이라도 된다. 구체예로서는, Fab, F(ab')₂, scFv 등을 들 수 있지만, 이것들에 한정되지 않는다. Fab나 F(ab')₂는 주지와 같이, 모노클로날 항체를 파파인이나 펩신과 같은 단백질 분해효소로 처리함으로써 얻을 수 있다. scFv(single chain fragment of variable region, 단쇄 항체)의 제작 방법도 주지이며, 예를 들면 상기와 같이 제작한 하이브리도마의 mRNA를 추출하고, 단일쇄 cDNA를 조제하고, 면역 글로블린 H쇄 및 L쇄에 특이적인 프라이머를 이용하여 PCR를 행해서 면역 글로블린 H쇄 유전자 및 L쇄 유전자를 증폭하고, 이것들을 링커로 연결하고, 적절한 제한효소 부위를 부여해서 플러스미드 벡터에 도입하고, 그 벡터에서 대장균을 형질전환해서 scFv를 발현시키고, 이것을 대장균으로부터 회수함으로써 scFv를 얻을 수 있다.

면역원으로서 사용하는 폴리펩티드 또는 그 부분단편은 화학 합성, 유전자 공학적 방법 등의 상법에 의해 제작할 수 있다. 또는, 신선 인간 혈장 등으로부터 프로트롬빈이나 PIVKA-II를 추출·정제해서 얻을 수도 있다(Thromb. Diath. Haemorph. 1966; 16:469-90 등 참조).

서열표의 서열번호 1에 나타내는 아미노산 서열은, 프로트롬빈 및 PIVKA-II의 서열에 시그널 서열이 부가된 아미노산 서열이며, 이 중 44번∼622번 아미노산의 영역이 프로트롬빈 및 PIVKA-II의 아미노산 서열에 해당한다. 44번∼84번 아미노산의 영역이 Glu-Gla 영역이며, 프로트롬빈에서는 이 영역 중의 10개의 「Xaa」의 모두가 γ-카르복시글루탐산(Gla) 잔기로 되어 있다. 이 프로트롬빈 서열은, GenBank에 액션번호 NP_000497로 등록되어 있다. 서열번호 2에 나타내는 염기서열은 서열번호 1의 아미노산 서열을 코드하는 서열이며, GenBank에 액션번호 NM_000506으로 등록되어 있다. 서열번호 2 중의 44번∼1912번 염기의 영역이 코드 영역이다.

화학 합성법의 구체예로서는, 예를 들면 Fmoc법(플루오렌일메틸옥시카르보닐법), tBoc법(t-부틸옥시카르보닐법) 등을 들 수 있다. 또한, 각종 시판의 펩티드 합성기를 이용해서 상법에 의해 합성할 수도 있다. 화학 합성의 경우에는 아미노산 서열만에 의거하여 소망의 폴리펩티드를 합성할 수 있다.

유전자 공학적 방법에 의한 폴리펩티드의 제작 방법도 주지이다. 항프로트롬빈 항체를 제작할 때에 면역원으로서 사용하는 폴리펩티드를 유전자 공학적 방법에 의해 제작할 경우에는, 예를 들면 다음과 같이 행하면 좋다. 우선, 인간 유래 배양세포 등으로부터 RNA를 추출하고, 역전사 반응에 의해 mRNA로부터 cDNA를 합성한다. 이 cDNA를 주형으로 하고, 인간 프로트롬빈의 mRNA 서열 정보에 의거하여 설계한 프라이머를 이용하여 PCR을 행하고, 프로트롬빈의 전장 또는 소망의 일부를 코드하는 폴리뉴클레오티드를 조제한다. PCR에 사용하는 프라이머는 서열번호 2에 나타낸 염기서열이나 GenBank 등의 데이터베이스에 등록되어 있는 인간 프로트롬빈 서열 정보 등에 의거하여 적당하게 설계할 수 있다. 또는, 소망의 폴리펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드는 시판의 핵산 합성기를 사용한 상법에 의해 조제할 수도 있다. 각 아미노산을 코드하는 코돈(codon)이 공지이기 때문에 아미노산 서열마저 특정할 수 있으면, 그 아미노산 서열을 코드하는 폴리뉴클레오티드의 염기서열도 결정할 수 있다. 이어서, 조제한 폴리뉴클레오티드를 적당한 벡터에 짜 넣고, 적당한 발현계에서 폴리펩티드를 발현시키고, 이 폴리펩티드를 회수함으로써 소망의 폴리펩티드를 얻을 수 있다. 사용하는 벡터나 각종의 발현계(세균 발현계, 효모세포 발현계, 포유동물세포 발현계, 곤충세포 발현계, 무세포 발현계 등)도 주지이며, 여러 가지 벡터나 숙주세포, 시약류, 키트가 시판되고 있기 때문에 당업자라면 적당하게 선택해서 사용할 수 있다. 인간 유래 배양세포도 시판·분양되고 있어, 입수는 용이하다.

본 발명에 있어서 PIVKA-II의 면역측정은, 전형적으로는 샌드위치법에 의해 행하여진다. 샌드위치 면역측정 자체는 주지의 상법이다. 구체예를 들면, 화학발광 효소 면역측정법(chemiluminescent enzyme immunoassay; CLEIA), 효소결합 면역흡착법(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay; ELISA), 방사면역측정법, 전기화학발광 면역측정법 등의 각종의 방법이 있고, 본 발명에 있어서는 어느 방법을 사용해도 된다.

샌드위치 측정계에 있어서는, 통상 2종류의 항체 또는 그 항원 결합성 단편 중 한쪽을 고상으로 고정화한 고상 항체로 하고, 다른쪽을 표식물질로 표식한 표식항체로서 사용한다. 본 발명에 있어서는 제1 및 제2의 항프로트롬빈 항체 또는 그 항원 결합성 단편의 혼합물을 1종류의 항체로 하고, 항PIVKA-II 항체 또는 그 항원 결합성 단편을 또 1종류의 항체로서 사용하지만, 어느 것을 고상 항체로서 사용해도 된다. 하기 실시예에서는 항PIVKA-II 항체를 고상 항체로 하고, 항체 혼합물을 표식항체로서 사용하고 있지만, 이것에 한정되지 않는다.

제1 및 제2의 항프로트롬빈 항체의 혼합물을 표식항체로서 사용할 경우를 예로, 본 발명의 PIVKA-II 측정 방법을 구체적으로 설명한다. 무엇보다, 상기 혼합물을 고상 항체로 하고, 항PIVKA-II 항체를 표식항체로서 사용할 수도 있으므로, 본 발명의 범위는 하기의 구체예에는 한정되지 않는다. 또한, 항체 대신에 각 항체의 항원 결합성 단편을 사용해도 된다.

우선, PIVKA-II 항체(고상 항체)를 담체에 고상화한다. 고상화된 PIVKA-II 항체와 검체 중에 포함되는 PIVKA-II를 접촉시킴으로써, 고상 항체와 PIVKA-II를 특이적으로 결합시킨다. 이어서, 결합되지 않은 검체 중의 성분을, 예를 들면 담체를 적당한 완충액으로 세정함으로써 제거한 후, 표식물질로 표식된 제1 및 제2의 항프로트롬빈 항체의 혼합물(즉, 표식한 적어도 1종의 제1의 항프로트롬빈 항체와, 표식한 적어도 1종의 제2의 항프로트롬빈 항체의 혼합물)을, 고상 항체에 결합한 PIVKA-II에 결합시킨다. 반응 종료 후, 미반응의 성분을 제거하기 위해서, 예를 들면 담체를 적당한 완충액으로 세정한 후, 표식물질로부터의 시그널을 적당한 방법으로 검출함으로써 검체 중에 포함되는 PIVKA-II를 측정하는 것이 가능해진다.

고상은 특별하게 한정되지 않고, 공지의 샌드위치 면역측정계에서 사용되고 있는 고상과 같아도 좋다. 고상의 재질의 구체예로서는, 폴리스티렌, 폴리에틸렌, 세파로오스 등을 들 수 있지만, 이것들에 한정되지 않는다. 고상의 물리적 형상은 본질적으로 중요하지는 않다. 사용하는 고상은, 그 표면에의 항체의 고정화가 용이하고, 측정 중에 형성되는 면역복합체와 미반응의 성분을 용이하게 분리할 수 있는 것이 바람직하다. 특히, 통상의 면역측정법에 사용되는 플라스틱 플레이트나 자성 입자가 바람직하다. 취급, 보존, 및 분리의 용이성 등의 관점으로부터, 상술한 바와 같은 재질의 자성 입자를 사용하는 것이 가장 바람직하다. 이들 고상으로의 항체의 결합은 당업자에게 주지인 상법에 의해 행할 수 있다. 고상으로의 항체의 결합은 물리적 흡착에 의해 행해도 되고, 공유결합을 사용해도 된다. 예를 들면, 글루타르알데히드법, 과요오드산법, 말레이미드법, 및 피리딜·디술피드법 등을 사용할 수 있다. 또는, 완충액에 자성 입자를 첨가해서 분산된 입자 현탁액에, 항체를 적당량 첨가해, 20∼37℃에서 1시간 정도 교반하고, 그 후에 자성 입자를 자력으로 모으고, 입자를 적당한 완충액에 의해 세정해서 항체 결합 입자를 얻을 수 있다. 사용하는 완충액의 조성은 항체의 고정화에 사용되는 일반적인 것이면 되고, pH는 항체가 안정되게 존재하고, 고상으로의 고정화를 저해하지 않는 범위이면 된다.

표식물질도 특별하게 한정되지 않고, 공지의 면역측정계에서 사용되고 있는 표식물질과 같은 것을 사용할 수 있다. 구체예로서는, 효소, 형광물질, 화학발광물질, 염색물질, 방사성물질 등를 들 수 있다. 효소로서는 알칼리포스파타아제(ALP), 퍼옥시다아제, β갈락토시다아제 등, 공지의 것을 사용할 수 있지만, 이것에 한정되는 것은 아니다. 높은 검출 감도의 측정계를 제공하기 위해서는 ALP를 사용하는 것이 바람직하다. 이들 표식물질로의 항체의 결합은 당업자에게 주지인 상법에 의해 행할 수 있다. 표식물질로의 항체의 결합은 공유결합이 바람직하고, 글루타르알데히드법, 과요오드산법, 말레이미드법, 및 피리딜·디술피드법 등을 사용할 수 있다. 예를 들면, 항체를 펩신 처리 및 환원 처리해서 얻어진 항체 단편과 말레이미드화한 ALP를 혼합하여 표식물질로 표식된 항체를 조제할 수 있다.

표식물질로서 효소를 사용할 경우, 상기 효소에 대응한 발색기질, 형광기질또는 발광기질 등의 기질을 상기 효소와 반응시키고, 그 결과 발생하는 시그널을 측정함으로써 효소 활성을 구해 측정 대상물을 측정할 수 있다. 예를 들면, 표식물질로서 ALP를 사용할 경우, 3-(4-메톡시스피로(1,2-디옥세탄-3,2'-트리시클로[3.3.1.13,7]데칸)-4-일)페닐포스페이트2나트륨(예를 들면 상품명 AMPPD) 등의 발광기질을 사용할 수 있다.

표식물질로서 비오틴 또는 합텐이 사용될 경우에는, 효소, 형광물질, 화학발광물질, 염색물질 또는 방사성물질 등을 결합한 스트렙트아비딘 또는 합텐 항체 등을 이용하여 측정할 수 있다.

시그널의 검출은 표식물질의 종류에 따라 적당하게 선택된다. 예를 들면, 시그널이 발색이면 비색계나 흡광광도계를, 형광이면 형광광도계를, 발광이면 포톤카운터를, 방사선이면 방사선 측정장치를 각각 사용하면 좋다. PIVKA-II를 여러 가지 농도로 포함하는 농도 기지의 표준시료에 대해서, 본 발명의 방법에 의해 PIVKA-II를 측정하고, 표식으로부터의 시그널의 값과 표준시료 중의 PIVKA-II 농도의 상관 관계를 플롯해서 검량선을 작성해 두고, PIVKA-II 농도가 미지의 검체에 대해서 같은 측정 조작을 행해서 표식으로부터의 시그널값을 측정하고, 측정된 시그널값을 이 검량선에 적용함으로써 검체 중의 PIVKA-II를 정량할 수 있다.

본 발명의 측정 방법이 적용되는 검체는 피검자로부터 분리된 검체이며, 혈액 검체가 바람직하고, 특히 혈장 또는 혈청이 바람직하다. 검체는 필요에 따라 적당하게 희석해서 사용해서 좋다.

피검자는 포유동물이면 특별하게 한정되지 않지만, 일반적으로는 인간이며, 예를 들면 간세포암 환자 또는 간세포암의 혐의가 있는 환자일 수 있다.

본 발명에 의한 PIVKA-II의 면역측정에 사용하는 제1 및 제2의 항프로트롬빈 항체는, 각각 상술한 바와 같이 친수성 PIVKA-II 분자를 인식하는 적어도 1종의 항프로트롬빈 항체 및 소수성 PIVKA-II 분자를 인식하는 적어도 1종의 항프로트롬빈 항체이다. 공지의 항프로트롬빈 항체 또는 새롭게 조제한 항프로트롬빈 항체가, 친수성 PIVKA-II 분자와 소수성 PIVKA-II 분자의 어느쪽에 친화성을 갖는지를 조사하기 위해서는, PIVKA-II를 함유하는 시료를 소수성 상호작용 크로마토그래피로 분획한 각 획분의 셋트를 측정용 시료로 하고, 항프로트롬빈 항체 및 항PIVKA-II 항체를 사용한 샌드위치 면역측정을 행하여 어느 획분과의 반응성이 높은지를 조사하면 된다.

측정용 시료의 조제에 사용하는 PIVKA-II를 함유하는 시료로서는, 예를 들면 간세포암 환자 유래의 혈청 등을 사용할 수 있다. 소수성 상호작용 크로마토그래피에서는 페닐기를 관능기로 하는 소수성 크로마토그래피 컬럼을 사용하고, 황산암모늄 직선 농도 구배(예를 들면 1.0M→0M)를 이용하여 용출을 행하면 된다. 용출 획분을 20∼30개 정도로 분취하고, 얻어진 1세트의 용출 획분을 측정용 시료로 하면 된다. PIVKA-II를 함유하는 시료로서 환자 유래 혈청을 복수 사용할 경우에는, 각각을 크로마토그래피에 붙여서 복수 셋트의 측정용 시료를 조제해도 좋고, 또는 복수의 혈청 검체를 혼합한 것을 크로마토그래피에 붙여서 측정용 시료를 조제해도 좋다.

소수성 및 친수성 PIVKA-II 분자와의 친화성을 조사해야 할 항프로트롬빈 항체와 항PIVKA-II 항체를 사용한 샌드위치 면역측정에 의해, 상기와 같이 조제한 측정용 시료의 개개의 획분에 대해서 측정 조작을 행한다. 이 때의 샌드위치 면역측정계는 최종적으로 PIVKA-II 면역측정계로서 구축할 때와 마찬가지로 구축할 수 있다. 즉, 제1 및 제2의 항프로트롬빈 항체의 혼합물을 표식항체로 하고, 항PIVKA-II 항체를 고상 항체로 한 PIVKA-II 면역측정계를 구축하는 것이라면, 소수성 및 친수성 PIVKA-II 분자와의 친화성을 조사해야 할 항프로트롬빈 항체는 표식항체로 하고, 항PIVKA-II 항체는 고상 항체로 해서 상기 측정용 시료의 측정을 행하면 좋다.

황산암모늄 농도가 높은 용출 획분에는 소수성이 낮은(친수성의) PIVKA-II 분자가 포함되어 있고, 황산암모늄 농도가 낮은 용출 획분에는 소수성이 높은(소수성의) PIVKA-II 분자가 포함되어 있다. 본 발명에 있어서는 전자의 용출 획분을 PIVKA-II의 친수성 획분이라고 하고, 후자의 용출 획분을 PIVKA-II의 소수성 획분이라고 한다. 이들 용출 획분과 항프로트롬빈 항체의 반응성을 조사함으로써 항프로트롬빈 항체가 친수성 PIVKA-II 분자와 소수성 PIVKA-II 분자 중 어디에 친화성을 갖고 있는지(어느 것을 인식하는지)를 조사할 수 있다.

PIVKA-II의 친수성 획분과 소수성 획분을 구별하는 황산암모늄 농도는, 통상 270mM∼370mM의 범위로부터 선택되고, 예를 들면 290mM∼350mM, 300mM∼340mM, 310mM∼330mM, 280mM∼330mM, 또는 290mM∼330mM의 범위로부터 선택될 수 있다. 이들 범위로부터 선택되는 황산암모늄 농도 이상의 용출 획분을 PIVKA-II의 친수성 획분으로 하고, 해당 황산암모늄 농도 미만의 용출 획분을 PIVKA-II의 소수성 획분으로 해서 사용하면 좋다.

또한, 항프로트롬빈 항체의 친화성을 조사할 때에 사용하는 PIVKA-II의 친수성 획분 및 소수성 획분을 조제하기 위해서는, 친수성 PIVKA-II 분자와 소수성 PIVKA-II 분자의 양자를 포함하는 적어도 1개의 검체, 또는 적어도 친수성 PIVKA-II 분자를 포함하는 적어도 1개의 검체와, 적어도 소수성 PIVKA-II 분자를 포함하는 적어도 1개의 검체를 포함하는 적어도 2개의 검체가 필요하다. 임의의 검체가 친수성 PIVKA-II 분자 및 소수성 PIVKA-II 분자의 어느 것을 포함하고 있을지는, 예를 들면 항PIVKA-II 항체 및 항프로트롬빈 폴리클로날 항체를 사용한 샌드위치 면역측정에 의해 조사할 수 있다. 친수성 PIVKA-II 분자와 소수성 PIVKA-II 분자의 양자를 적당하게 포함하는 검체를 입수할 수 없는 경우에는, 상술한 바와 같이 복수의 검체를 이용하여 측정용 시료를 조제하면 좋다.

친수성 획분 및 소수성 획분과의 반응성을 조사했다면, 횡축을 황산암모늄 농도, 종축을 면역측정에 의해 얻어진 시그널값으로 하고, 각 획분과의 반응성(검출된 시그널의 강도)을 플롯한다. 시그널값을 그대로 플롯해도 좋고, 총 활성에 대한 각 용출 획분의 시그널 강도의 비율을 산출해서 플롯해도 좋다. 친수성 획분과의 반응성 쪽이 높을 경우, 그 항프로트롬빈 항체는 친수성 PIVKA-II 분자와의 친화성을 갖는 항체라고 판단한다. 소수성 획분과의 반응성 쪽이 높을 경우, 그 항프로트롬빈 항체는 소수성 PIVKA-II 분자와의 친화성을 갖는 항체라고 판단한다.

제1의 항체와 제2의 항체의 혼합 비율은, 검체 중의 소수성 PIVKA-II 분자와 친수성 PIVKA-II 분자의 양자를 측정할 수 있는 범위 내이면 되고, 특별하게 한정되지 않지만, 상기와 같이 플롯한 PIVKA-II 함유 시료의 각 획분에 대한 시그널값 또는 총 활성에 대한 각 용출 획분의 시그널 강도의 비율의, 피크의 높이 또는 피크 면적이 1:10∼10:1의 범위, 예를 들면 1:5∼5:1의 범위, 1:3∼3:1, 또는 1:2∼2:1의 범위가 되도록 설정하면 좋다. 제1의 항체와 제2의 항체의 혼합 중량비율(각각 복수의 항체를 사용할 경우에는, 제1의 항체의 합계 중량과 제2의 항체의 합계 중량의 비율)은, 각 항체의 PIVKA-II에 대한 친화성에 따라 검체 중의 소수성 PIVKA-II 분자와 친수성 PIVKA-II 분자의 양자를 측정할 수 있는 범위 내로 설정하면 좋다. 제1의 항체와 제2의 항체의 바람직한 혼합 중량비율은 친수성 PIVKA-II 분자에 대한 제1의 항체의 친화성의 높이, 및 소수성 PIVKA-II 분자에 대한 제2의 항체의 친화성의 높이에 따라 변동할 수 있기 때문에 특별하게 한정되지 않지만, 대부분의 경우, 항체의 혼합 중량비율을 0.03:1∼30:1의 범위, 예를 들면 0.05:1∼20:1의 범위, 0.1:1∼10:1의 범위, 또는 0.3:1∼3:1의 범위로 함으로써 상기한 범위의 피크 높이 또는 피크 면적을 달성할 수 있다. 친수성 PIVKA-II 분자에 친화성을 갖고, 그 분자를 인식하는 적어도 1종의 항프로트롬빈 항체(제1의 항체)와, 소수성 PIVKA-II 분자에 친화성을 갖고, 그 분자를 인식하는 적어도 1종의 항프로트롬빈 항체(제2의 항체)를 조합시키고, 양자의 혼합물을 고상 항체 또는 표식항체로서 사용함으로써 검체 중에 존재하는 PIVKA-II의 다양한 분자종을 높은 정밀도로 측정하는 것이 가능하게 된다.

본 발명에 의한 PIVKA-II 측정 방법을 실시하기 위한 PIVKA-II의 면역측정 시약 또는 키트는 이하의 공정으로 제조할 수 있다.

(공정 1) PIVKA-II 및 프로트롬빈의 양자에 결합하지만 트롬빈에는 반응성을 나타내지 않는 항체(항프로트롬빈 항체) 또는 그 항원 결합성 단편에 대해서, PIVKA-II의 친수성 획분 및 소수성 획분으로의 반응성을 조사한다.

(공정 2) 친수성 획분에 반응하는 적어도 1종의 항체 또는 그 항원 결합성 단편과, 소수성 획분에 반응하는 적어도 1종의 항체 또는 그 항원 결합성 단편을 혼합한다.

공정 1에 붙이는 항프로트롬빈 항체 또는 그 항원 결합성 단편은, 공지의 항프로트롬빈 항체 또는 그 항원 결합성 단편이어도 좋고, PIVKA-II 및 프로트롬빈의 양자에 결합하지만 트롬빈에는 반응성을 나타내지 않는 항체로서 새롭게 조제한 항프로트롬빈 항체 또는 그 항원 결합성 단편이어도 좋다. PIVKA-II 의 친수성 획분 및 소수성 획분으로의 반응성을 조사하는 방법은 상술한 바와 같다.

PIVKA-II 의 친수성 획분에 반응하는 항체, 및 PIVKA-II의 소수성 획분에 반응하는 항체는, 각각 본 명세서에 있어서 제1의 항프로트롬빈 항체 및 제2의 항프로트롬빈 항체라고 부르는 항체에 해당한다. 적어도 1종의 제1의 항프로트롬빈 항체 또는 그 항원 결합성 단편과 적어도 1종의 제2의 항프로트롬빈 항체 또는 그 항원 결합성 단편의 혼합물은, 표식물질을 결합시킨 형태로, 또는 플라스틱 플레이트나 자성 입자와 같은 고상 상에 고정화된 형태로, 면역측정 시약 또는 키트로서 제공될 수 있다. 따라서, 해당 면역측정 시약 또는 키트의 제조 방법은 항프로트롬빈 항체 또는 그 항원 결합성 단편을, 공정 1에 붙이기 전에, 또는 공정 1의 뒤에, 또는 공정 2에서 제1 및 제2의 항체 또는 그 항원 결합성 단편을 혼합한 후에, 표식물질로 표식하는 공정, 또는 공정 2의 뒤에 고상 상에 고정화하는 공정을 더 포함할 수 있다. 항프로트롬빈 항체 또는 그 항원 결합성 단편을, 고상으로서 자성 입자 등의 입자에 고정화하는 경우에는, 공정 1에 붙이기 전에, 또는 공정 1의 뒤에, 고상 상에 고정화하는 공정을 실시하고, 공정 2에서 각 항체를 고정화한 입자를 혼합하는 것으로 해도 된다.

상기 방법에 의해 제조되는 면역측정 시약은, 제1 및 제2의 항체 또는 그 항원 결합성 단편의 혼합물만으로 이루어지는 것이여도 좋고, 적당한 완충액 중에 해당 혼합물이 용해된 형태라도 좋고, 항체의 안정화 등에 유용한 성분을 더 포함하고 있어도 된다.

또한, 해당 면역측정 시약은 항PIVKA-II 항체 또는 그 항원 결합성 단편과 조합시켜서 면역측정 시약 또는 키트로서 제공될 수 있다. 예를 들면, 표식된 제1 및 제2의 항프로트롬빈 항체 또는 그 항원 결합성 단편의 혼합물과, 항PIVKA-II 항체 또는 그 항원 결합성 단편이 고정화된 고상(항PIVKA-II 항체 또는 그 항원 결합성 단편과 이것을 고정화하기 위한 고상의 셋트라도 됨)을 조합시키고, PIVKA-II 의 면역측정 키트로서 제공할 수 있다. 표식하는 항체와 고상화하는 항체는 상기 와 반대라도 좋다. 면역측정 키트에는, 또한 표식물질을 위한 기질이나, 검체 희석액, 세정액 등을 포함하여도 좋다.

(실시예)

이하, 본 발명을 실시예에 의거하여 보다 구체적으로 설명한다. 무엇보다, 본 발명은 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

1. 소수성 상호작용 크로마토그래피

혈청 검체 25∼50μL를 500μL의 2M 황산암모늄을 포함하는 0.1M 인산 완충액(PB) pH7.0(인산 1칼륨 5.00g/L, 인산 2나트륨(12수염) 22.6g/L, 황산암모늄 264 g/L; 4N 수산화나트륨을 적당량 첨가함으로써 pH7.0으로 조정), 450μL∼475μL의 0.1M PB pH7.0(인산 1칼륨 5.00g/L, 인산 2나트륨(12수염) 22.6g/L; 4N 수산화나트륨을 적당량 첨가함으로써 pH 7.0으로 조정)을 혼합한 토털 1.0mL의 샘플을 크로마토그래피 분리에 제공했다.

소수성 상호작용 크로마토그래피에 사용한 컬럼은 HiTrap Phenyl HP(GE 헬스케어사: 단체 용량 1mL)이며, 장치는 AKTA FPLC UPC900(GE 헬스케어사)을 이용하여 분획을 행하였다.

컬럼을 10컬럼 용량 이상의 1M 황산암모늄을 포함하는 0.1M PB pH7.0으로 평형화한 후, 상기 샘플 1.0mL를 컬럼에 인젝션하고, 유속 0.5 mL에서 분획했다. 0.5ml씩 용출 프랙션을 회수했다. 용출은 1M 황산암모늄을 포함하는 0.1M PB pH7.0(인산 1칼륨 5.00g/L, 인산 2나트륨(12수염) 22.6g/L, 황산암모늄 132g/L; 4N 수산화나트륨을 적당량 첨가함으로써 pH7.0으로 조제)과 0.1M PB pH7.0(인산 1칼륨 5.00g/L, 인산 2나트륨(12수염) 22.6g/L; pH의 조정은 상기와 같음)의 2액을 사용한 염농도 리니어 그라디언트로 행하고, 30mL 용출하는 동안에 황산암모늄 농도를 1.0M으로부터 0M으로까지 변화시켰다.

2. 표식항체의 제작

PIVKA-II 및 프로트롬빈의 양자에 결합하는 모노클로날 항체 4종(항체A, 항체B, 항체C, 항체D)을 이용하여 표식항체를 제작했다.

3mg/mL의 항체A 용액을 6mL 취하고, 0.1M 시트르산 완충액(pH3.5)으로 평형화한 G-25 컬럼(파르마시아사제)에 첨가하고, 항체 용액의 완충액 치환을 행하였다. 이것에 1mg/mL 펩신 용액을 약 100μL 첨가하고, 37℃, 1시간 방치하고, 트리스 완충액에서 pH를 중성 부근으로 하고나서 슈퍼덱스 200 컬럼(파르마시아사제)에 첨가하고, 항체의 겔 여과 정제를 행하였다. 얻어진 획분의 흡광도 280nm에서의 싱글 피크를 풀하고, 항체A의 F(ab')₂ 프래그먼트로 했다. 이 F(ab')₂ 프래그먼트 용액 4mL에 0.2M 2-메르캅토에틸아민(이하, 2-MEA로 기재함) 용액을 200μL 첨가하고, 37℃ 2시간 방치하여 환원 처리를 행하였다. 이것을 G-25 컬럼에 첨가해서 2-MEA를 제거하고, 항체A의 Fab' 프래그먼트로 했다.

10mg/mL의 고비활성 ALP 용액 1.5mL를 0.1M 인산 완충액(pH7.0)으로 평형화한 G-25 컬럼에 첨가하고, ALP 용액의 완충액 치환을 행하였다. 이것에 10mg/mL N-(4-말레이미드부티릴옥시)-숙신이미드(이하, GMBS로 기재함)의 디메틸포름아미드 용액을 70μL 첨가하고, 30℃, 1시간 방치해 반응을 행하였다. 이 용액을 0.1M 인산 완충액(pH6.3)으로 평형화한 G-25 컬럼에 첨가하고, 과잉의 GMBS를 제거하고, 말레이미드화 ALP를 제작했다. 먼저 제작한 항체A의 Fab' 프래그먼트 용액 4mL와 말레이미드화 ALP 용액 3mL와 0.1M 인산 완충액(pH6.3) 13mL를 혼합하고, 실온에서 1시간 방치함으로써 ALP 표식항체를 제작했다. 이것에 2M 2-MEA 용액을 1mL 첨가하고, 실온에서 30분간 방치하고, 여분의 말레이미드기를 블록한 후, 슈퍼덱스 200 컬럼에 첨가하여 정제를 행하였다. 흡광도 280nm의 몇개의 피크 중, Fab'와 ALP가 1:1이 되는 분자량의 피크를 풀하고, 정제 ALP 표식항체A로 했다.

항체B, 항체C 및 항체D에 대해서도 마찬가지로 해서 각 표식항체를 제작했다.

3. PIVKA-II의 측정

PIVKA-II를 포함하는 시료(혈청 검체 등)를 상기 1에 기재한 바와 같이 소수성 상호작용 크로마토그래피에 의해 분획한 각 프랙션을 측정용 시료로 했다. 측정에는 효소 표식항체 이외에는 루미펄스 프레스토(등록상표) PIVKA-II 에이사이(후지레비오사제)에 부속되어진 시약(항체결합 입자, PIVKA-II 캘리브레이터 셋트) 및 루미펄스 프레스토용 시약(기질액, 세정액 등)(후지레비오사제)을 사용했다.

우선, 루미펄스 프레스토 PIVKA-II 에이사이에 부속된 PIVKA-II와 특이적으로 결합하는 항PIVKA-II 모노클로날 항체(마우스)가 결합된 항체결합 입자(항PIVKA-II 모노클로날 항체(마우스)결합 페라이트 입자) 50μL에 측정용 시료 20μL를 첨가해서 교반한 후, 37℃, 8분간 반응시켰다. 자력에 의해, 자성 입자로부터 반응 잔액을 분리 제거하고, 세정액으로 세정했다. 세정 후의 입자에 ALP 표식한 항체A(종농도 0.36㎍/mL), 항체B(종농도 0.5㎍/mL), 항체C(종농도 0.12㎍/mL), 및 항체D(종농도 0.5㎍/mL), 또는 루미펄스 프레스토 PIVKA-II 에이사이에 부속되어진 ALP 표식 항프로트롬빈 폴리클로날 항체를 첨가하고, 교반후, 37℃에서 8분간 반응시켰다. 다시 자력에 의해 자성 입자와 반응 잔액을 분리 제거하고, 세정액으로 세정했다. 이 입자에 알칼리 포스파타제의 화학발광 기질인 3-(2'-스피로아다만탄)-4-메톡시-4-(3"-포스포릴옥시)페닐-1,2-디옥세탄·2나트륨염(AMPPD)을 포함하는 기질액 200μL를 첨가해 37℃에서 4분간 반응시켰다. 반응 후의 화학발광량(파장 463mm)을 루미노미터로 측정했다. 측정에는 전자동 화학발광 면역측정 장치 루미펄스 프레스토 II(후지레비오사제)를 사용했다.

간세포암 환자 유래의 혈청 검체 6예를 각각 소수성 상호작용 크로마토그래피에 의해 분획한 각 프랙션을 측정용 시료로 하고, 효소 표식항체로서 루미펄스 프레스토 PIVKA-II 에이사이에 부속되어진 ALP 표식 항프로트롬빈 폴리클로날 항체를 이용하여 측정한 결과를 도 1에 나타낸다. 각 프랙션의 시그널값으로부터 루미펄스 프레스토 PIVKA-II 에이사이의 첨부 문서에 기재된 방법에 따라서 활성값(mAU/mL)으로서 산출한 값을 그래프화했다. 검체에 의해 2봉우리성의 피크가 되는 검체와 1봉우리성의 피크가 되는 검체가 존재하고, 피크의 패턴은 여러가지이었다. 이것은 혈중의 PIVKA-II는 보다 친수성이 높은 분자, 보다 소수성이 높은 분자라고 하는 것과 같이, 성질이 다른 복수의 분자가 혼재하고 있고, 혈액 검체에 의해 각 분자의 존재 비율은 다른 것을 나타내고 있다. 이들 친수성 획분도 소수성 획분도, 어느 것이나 PIVKA-II 분자이기 때문에, 혈중의 PIVKA-II를 재현성 좋게 정확하게 측정하기 위해서는 쌍방에 반응할 수 있는 모노클로날 항체를 선택할 필요가 있는 것이 나타내어졌다.

간세포암 환자 유래의 혈청 검체 3예(검체 No.4, No.269, No.275)를 각각 소수성 상호작용 크로마토그래피에 의해 분획한 각 프랙션을 측정용 시료로 하고, 표식항체 A∼D를 이용하여 측정을 행한 결과를 도 2a∼도 2c에 나타낸다. 각 프랙션의 시그널값으로부터, 검출된 총 활성(총 시그널값)에 대한 각 프랙션의 시그널 강도의 비율로서 산출한 값을 그래프화했다. 항체A와 항체B는 친수성 획분에 반응하고, 항체C는 소수성 획분에 반응했다. 항체D는 친수성 획분과 주로 반응하고 있고, 소수성 획분에도 반응이 가능했다. 이것들의 결과로부터, 친수성 획분에 반응하는 항체와 소수성 획분에 반응하는 항체를 조합시킴으로써 정확한 혈중 PIVKA-II의 측정이 가능한 것이 시사되었다.

그래서, 실제로 PIVKA-II 친수성 획분에 반응하는 항체(항체A, 항체B, 항체D)와 소수성 획분에 반응하는 항체(항체C)를 혼합한 것을 표식항체로서 사용하고, 상기의 혈청 검체 3예로부터 조제한 측정용 시료에 대해서 측정을 행했다. 각 프랙션의 시그널값으로부터, 검출된 총 활성에 대한 각 프랙션의 시그널 강도의 비율로서 산출한 값을 그래프화했다. ALP 표식한 항체A(종농도 0.36㎍/mL), 항체B(종농도 0.5㎍/mL), 항체D(종농도 0.5㎍/mL) 각각에, ALP 표식한 항체C(종농도 0.12㎍/mL)를 혼합하고, 표식항체를 조제했다. 측정 결과를 도 3a∼도 3c에 나타낸다. 친수성 획분에 반응하는 항체와 소수성 획분에 반응하는 항체의 2종류의 항체를 사용함으로써, 항프로트롬빈 폴리클로날 항체와 마찬가지로 친수성 획분과 소수성 획분의 쌍방에 반응 가능한 것이 확인되었다.

4. 항체의 혼합비율의 검토

이어서, PIVKA-II 친수성 획분에 반응하는 항체(항체A)와 소수성 획분에 반응하는 항체(항체 C)의 혼합비에 대해서 검토했다. ALP 표식한 항체A 및 ALP 표식한 항체C를 하기 표 1 및 표 2의 비율로 혼합한 점 이외에는, 「3. PIVKA-II의 측정」에 기재된 방법과 마찬가지로 해서 PIVKA-II를 측정했다. 검체는 간세포암 환자 유래의 혈청 검체(No.275)를 사용했다. 검체 No.275는 항프로트롬빈 폴리클로날 항체와의 반응성(도 1)으로부터 친수성 PIVKA-II 분자와 소수성 PIVKA-II 분자의 양자를 포함하는 것이 확인되어 있는 검체이다.

측정 결과를 도 4a 및 도 4b에 나타낸다. 종축은 실제로 측정된 카운트값을 나타낸다. 그 결과, 검토한 혼합 중량비율(0.03:1∼30:1)의 모두에 있어서 친수성 획분 및 소수성 획분의 쌍방을 검출 가능한 것이 확인되었다.

또한, 친수성 획분과 소수성 획분의 피크 면적의 비율을 평가했다. 본 실시예에서는 친수성 획분과 소수성 획분의 경계를 황산암모늄 농도 288mM과 305mM의 사이에 설정하고, 각 피크에 포함되는 획분의 카운트값을 적산하여 친수성 획분과 소수성 획분의 피크 면적을 각각 구했다. 피크 면적은 피크의 상승 전의 525mM∼와, ∼68mM까지의 값을 사용하고, 친수성 획분·소수성 획분 모두 14프랙션분을 적산했다. 카운트값으로서는 백그라운드를 제외할 목적으로 피크 외의 프랙션의 카운트값을 각 카운트값으로부터 뺀 값을 사용했다.

각 혼합비율에 대하여 산출된 피크 면적 비율을 표 1 및 표 2 중에 나타낸다. 친수성 획분과 소수성 획분의 피크 면적 비율은 항체 혼합비율(중량비)이 0.03:1∼30:1의 범위에서는 1:2.1∼2.8:1, 항체 혼합비율이 0.05:1∼20:1의 범위에서는 1:2.1∼2.5:1, 항체 혼합비율이 0.1:1∼10:1의 범위에서는 1:1.9∼1.8:1, 항체 혼합비율이 0.3:1∼3:1의 범위에서는 1:1.7∼1.2:1로 되었다. 이상에 의해, 항체A와 항체C를 혼합해서 사용함으로써 친수성 획분 및 소수성 획분의 쌍방을 정밀도 좋게 검출할 수 있는 것이 확인되었다.

SEQUENCE LISTING <110> FUJIREBIO Inc. EIDIA Co., Ltd. <120> Method for measurement of PIVKA-II, and method for production of reagent or kit for immunoassay of PIVKA-II <130> PF577-PCT <160> 2 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 622 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MOD_RES <222> (49)..(49) <223> Gla or Glu <220> <221> MOD_RES <222> (50)..(50) <223> Gla or Glu <220> <221> MOD_RES <222> (57)..(57) <223> Gla or Glu <220> <221> MOD_RES <222> (59)..(59) <223> Gla or Glu <220> <221> MOD_RES <222> (62)..(62) <223> Gla or Glu <220> <221> MOD_RES <222> (63)..(63) <223> Gla or Glu <220> <221> MOD_RES <222> (68)..(68) <223> Gla or Glu <220> <221> MOD_RES <222> (69)..(69) <223> Gla or Glu <220> <221> MOD_RES <222> (72)..(72) <223> Gla or Glu <220> <221> MOD_RES <222> (75)..(75) <223> Gla or Glu <400> 1 Met Ala His Val Arg Gly Leu Gln Leu Pro Gly Cys Leu Ala Leu Ala 1 5 10 15 Ala Leu Cys Ser Leu Val His Ser Gln His Val Phe Leu Ala Pro Gln 20 25 30 Gln Ala Arg Ser Leu Leu Gln Arg Val Arg Arg Ala Asn Thr Phe Leu 35 40 45 Xaa Xaa Val Arg Lys Gly Asn Leu Xaa Arg Xaa Cys Val Xaa Xaa Thr 50 55 60 Cys Ser Tyr Xaa Xaa Ala Phe Xaa Ala Leu Xaa Ser Ser Thr Ala Thr 65 70 75 80 Asp Val Phe Trp Ala Lys Tyr Thr Ala Cys Glu Thr Ala Arg Thr Pro 85 90 95 Arg Asp Lys Leu Ala Ala Cys Leu Glu Gly Asn Cys Ala Glu Gly Leu 100 105 110 Gly Thr Asn Tyr Arg Gly His Val Asn Ile Thr Arg Ser Gly Ile Glu 115 120 125 Cys Gln Leu Trp Arg Ser Arg Tyr Pro His Lys Pro Glu Ile Asn Ser 130 135 140 Thr Thr His Pro Gly Ala Asp Leu Gln Glu Asn Phe Cys Arg Asn Pro 145 150 155 160 Asp Ser Ser Thr Thr Gly Pro Trp Cys Tyr Thr Thr Asp Pro Thr Val 165 170 175 Arg Arg Gln Glu Cys Ser Ile Pro Val Cys Gly Gln Asp Gln Val Thr 180 185 190 Val Ala Met Thr Pro Arg Ser Glu Gly Ser Ser Val Asn Leu Ser Pro 195 200 205 Pro Leu Glu Gln Cys Val Pro Asp Arg Gly Gln Gln Tyr Gln Gly Arg 210 215 220 Leu Ala Val Thr Thr His Gly Leu Pro Cys Leu Ala Trp Ala Ser Ala 225 230 235 240 Gln Ala Lys Ala Leu Ser Lys His Gln Asp Phe Asn Ser Ala Val Gln 245 250 255 Leu Val Glu Asn Phe Cys Arg Asn Pro Asp Gly Asp Glu Glu Gly Val 260 265 270 Trp Cys Tyr Val Ala Gly Lys Pro Gly Asp Phe Gly Tyr Cys Asp Leu 275 280 285 Asn Tyr Cys Glu Glu Ala Val Glu Glu Glu Thr Gly Asp Gly Leu Asp 290 295 300 Glu Asp Ser Asp Arg Ala Ile Glu Gly Arg Thr Ala Thr Ser Glu Tyr 305 310 315 320 Gln Thr Phe Phe Asn Pro Arg Thr Phe Gly Ser Gly Glu Ala Asp Cys 325 330 335 Gly Leu Arg Pro Leu Phe Glu Lys Lys Ser Leu Glu Asp Lys Thr Glu 340 345 350 Arg Glu Leu Leu Glu Ser Tyr Ile Asp Gly Arg Ile Val Glu Gly Ser 355 360 365 Asp Ala Glu Ile Gly Met Ser Pro Trp Gln Val Met Leu Phe Arg Lys 370 375 380 Ser Pro Gln Glu Leu Leu Cys Gly Ala Ser Leu Ile Ser Asp Arg Trp 385 390 395 400 Val Leu Thr Ala Ala His Cys Leu Leu Tyr Pro Pro Trp Asp Lys Asn 405 410 415 Phe Thr Glu Asn Asp Leu Leu Val Arg Ile Gly Lys His Ser Arg Thr 420 425 430 Arg Tyr Glu Arg Asn Ile Glu Lys Ile Ser Met Leu Glu Lys Ile Tyr 435 440 445 Ile His Pro Arg Tyr Asn Trp Arg Glu Asn Leu Asp Arg Asp Ile Ala 450 455 460 Leu Met Lys Leu Lys Lys Pro Val Ala Phe Ser Asp Tyr Ile His Pro 465 470 475 480 Val Cys Leu Pro Asp Arg Glu Thr Ala Ala Ser Leu Leu Gln Ala Gly 485 490 495 Tyr Lys Gly Arg Val Thr Gly Trp Gly Asn Leu Lys Glu Thr Trp Thr 500 505 510 Ala Asn Val Gly Lys Gly Gln Pro Ser Val Leu Gln Val Val Asn Leu 515 520 525 Pro Ile Val Glu Arg Pro Val Cys Lys Asp Ser Thr Arg Ile Arg Ile 530 535 540 Thr Asp Asn Met Phe Cys Ala Gly Tyr Lys Pro Asp Glu Gly Lys Arg 545 550 555 560 Gly Asp Ala Cys Glu Gly Asp Ser Gly Gly Pro Phe Val Met Lys Ser 565 570 575 Pro Phe Asn Asn Arg Trp Tyr Gln Met Gly Ile Val Ser Trp Gly Glu 580 585 590 Gly Cys Asp Arg Asp Gly Lys Tyr Gly Phe Tyr Thr His Val Phe Arg 595 600 605 Leu Lys Lys Trp Ile Gln Lys Val Ile Asp Gln Phe Gly Glu 610 615 620 <210> 2 <211> 2018 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 gtcaggacag acaattcctc agtgacccag gagctgacac actatggcgc acgtccgagg 60 cttgcagctg cctggctgcc tggccctggc tgccctgtgt agccttgtgc acagccagca 120 tgtgttcctg gctcctcagc aagcacggtc gctgctccag cgggtccggc gagccaacac 180 cttcttggag gaggtgcgca agggcaacct ggagcgagag tgcgtggagg agacgtgcag 240 ctacgaggag gccttcgagg ctctggagtc ctccacggct acggatgtgt tctgggccaa 300 gtacacagct tgtgagacag cgaggacgcc tcgagataag cttgctgcat gtctggaagg 360 taactgtgct gagggtctgg gtacgaacta ccgagggcat gtgaacatca cccggtcagg 420 cattgagtgc cagctatgga ggagtcgcta cccacataag cctgaaatca actccactac 480 ccatcctggg gccgacctac aggagaattt ctgccgcaac cccgacagca gcaccacggg 540 accctggtgc tacactacag accccaccgt gaggaggcag gaatgcagca tccctgtctg 600 tggccaggat caagtcactg tagcgatgac tccacgctcc gaaggctcca gtgtgaatct 660 gtcacctcca ttggagcagt gtgtccctga tcgggggcag cagtaccagg ggcgcctggc 720 ggtgaccaca catgggctcc cctgcctggc ctgggccagc gcacaggcca aggccctgag 780 caagcaccag gacttcaact cagctgtgca gctggtggag aacttctgcc gcaacccaga 840 cggggatgag gagggcgtgt ggtgctatgt ggccgggaag cctggcgact ttgggtactg 900 cgacctcaac tattgtgagg aggccgtgga ggaggagaca ggagatgggc tggatgagga 960 ctcagacagg gccatcgaag ggcgtaccgc caccagtgag taccagactt tcttcaatcc 1020 gaggaccttt ggctcgggag aggcagactg tgggctgcga cctctgttcg agaagaagtc 1080 gctggaggac aaaaccgaaa gagagctcct ggaatcctac atcgacgggc gcattgtgga 1140 gggctcggat gcagagatcg gcatgtcacc ttggcaggtg atgcttttcc ggaagagtcc 1200 ccaggagctg ctgtgtgggg ccagcctcat cagtgaccgc tgggtcctca ccgccgccca 1260 ctgcctcctg tacccgccct gggacaagaa cttcaccgag aatgaccttc tggtgcgcat 1320 tggcaagcac tcccgcacca ggtacgagcg aaacattgaa aagatatcca tgttggaaaa 1380 gatctacatc caccccaggt acaactggcg ggagaacctg gaccgggaca ttgccctgat 1440 gaagctgaag aagcctgttg ccttcagtga ctacattcac cctgtgtgtc tgcccgacag 1500 ggagacggca gccagcttgc tccaggctgg atacaagggg cgggtgacag gctggggcaa 1560 cctgaaggag acgtggacag ccaacgttgg taaggggcag cccagtgtcc tgcaggtggt 1620 gaacctgccc attgtggagc ggccggtctg caaggactcc acccggatcc gcatcactga 1680 caacatgttc tgtgctggtt acaagcctga tgaagggaaa cgaggggatg cctgtgaagg 1740 tgacagtggg ggaccctttg tcatgaagag cccctttaac aaccgctggt atcaaatggg 1800 catcgtctca tggggtgaag gctgtgaccg ggatgggaaa tatggcttct acacacatgt 1860 gttccgcctg aagaagtgga tacagaaggt cattgatcag tttggagagt agggggccac 1920 tcatattctg ggctcctgga accaatcccg tgaaagaatt atttttgtgt ttctaaaact 1980 atggttccca ataaaagtga ctctcagcga aaaaaaaa 2018

Claims

친수성의 PIVKA-II 분자를 인식하는 적어도 1종의 제1의 항프로트롬빈 항체 또는 그 항원 결합성 단편과, 소수성의 PIVKA-II 분자를 인식하는 적어도 1종의 제2의 항프로트롬빈 항체 또는 그 항원 결합성 단편의 혼합물, 및 PIVKA-II에 특이적으로 결합하는 항PIVKA-II 항체 또는 그 항원 결합성 단편을 사용한 면역측정에 의해, 검체 중의 PIVKA-II를 측정하는 것을 포함하는 PIVKA-II의 측정 방법.
제 1 항에 있어서,
친수성의 PIVKA-II 분자는 페닐기를 관능기로 하는 소수성 상호작용 크로마토그래피 컬럼 및 황산암모늄 직선 농도 구배를 사용한 소수성 상호작용 크로마토그래피에 의해 PIVKA-II를 포함하는 시료를 분획해서 얻어지는 용출 획분 중 소정의 황산암모늄 농도 이상의 획분에 포함되는 PIVKA-II 분자이고, 소수성의 PIVKA-II 분자는 상기 용출 획분 중 소정의 황산암모늄 농도 미만의 획분에 포함되는 PIVKA-II 분자이며, 상기 소정의 황산암모늄 농도는 270mM∼370mM의 범위로부터 선택되는 농도인 측정 방법.
제 2 항에 있어서,
상기 소정의 황산암모늄 농도는 290mM∼350mM의 범위로부터 선택되는 농도인 측정 방법.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 제1의 항프로트롬빈 항체, 상기 제2의 항프로트롬빈 항체, 및 상기 항PIVKA-II 항체가 모노클로날 항체인 측정 방법.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 면역측정이 상기 혼합물을 표식항체로 하고, 상기 PIVKA-II 또는 그 항원 결합성 단편을 고상 항체로 해서 사용한 샌드위치법에 의해 행하여지는 측정 방법.
제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 혼합물에 있어서의, 적어도 1종의 제1의 항프로트롬빈 항체 또는 그 항원 결합성 단편과 적어도 1종의 제2의 항프로트롬빈 항체 또는 그 항원 결합성 단편의 혼합비율은, 소수성 상호작용 크로마토그래피에 의해 분획된 PIVKA-II 함유 시료의 각 획분을 측정 시료로 해서 면역측정했을 경우에 얻어지는 측정값의 피크의 높이 또는 피크 면적의 비율이 1:10∼10:1의 범위로 되도록 설정되는 측정 방법.
제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 검체가 혈청 또는 혈장인 측정 방법.
PIVKA-II 및 프로트롬빈의 양자에 결합하지만 트롬빈에는 반응성을 나타내지 않는 항체 또는 그 항원 결합성 단편에 대해서, PIVKA-II의 친수성 획분 및 소수성 획분으로의 반응성을 조사하는 공정과,
친수성 획분에 반응하는 적어도 1종의 항체 또는 그 항원 결합성 단편과, 소수성 획분에 반응하는 적어도 1종의 항체 또는 그 항원 결합성 단편을 혼합하는 공정을 포함하는 PIVKA-II의 면역측정 시약 또는 키트의 제조 방법.
제 8 항에 있어서,
PIVKA-II의 친수성 획분은 페닐기를 관능기로 하는 소수성 상호작용 크로마토그래피 컬럼 및 황산암모늄 직선 농도 구배를 이용하여 PIVKA-II를 포함하는 시료를 분획해서 얻어지는 용출 획분 중 소정의 황산암모늄 농도 이상의 획분이고, PIVKA-II의 소수성 획분은 상기 용출 획분 중 소정의 황산암모늄 농도 미만의 획분이며, 상기 소정의 황산암모늄 농도는 270mM∼370mM의 범위로부터 선택되는 농도인 제조 방법.
제 9 항에 있어서,
상기 소정의 황산암모늄 농도는 290mM∼350mM의 범위로부터 선택되는 농도인 제조 방법.
제 8 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서,
PIVKA-II 및 프로트롬빈의 양자에 결합하는 상기 항체가 모노클로날 항체인 제조 방법.
제 8 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서,
친수성 획분에 반응하는 적어도 1종의 항체 또는 그 항원 결합성 단편과, 소수성 획분에 반응하는 적어도 1종의 항체 또는 그 항원 결합성 단편의 혼합비율은, 소수성 상호작용 크로마토그래피에 의해 분획된 PIVKA-II 함유 시료의 각 획분을 측정 시료로 해서 면역측정했을 경우에 얻어지는 측정값의 피크의 높이 또는 피크 면적의 비율이 1:10∼10:1의 범위로 되도록 설정되는 제조 방법.