JP2000146981A - ヒトチミジル酸シンタ―ゼの測定方法及び測定用キット - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【解決手段】 抗ヒトチミジル酸シンターゼ抗体を用い
てヒトチミジル酸シンターゼを免疫学的に測定する方法
において、当該抗体として、少なくとも不溶性担体に固
定化した抗ヒトチミジル酸シンターゼポリクローナル抗
体を用いるヒトチミジル酸シンターゼの測定方法、当該
測定方法による測定結果から当該癌細胞のフルオロピリ
ミジン系抗ガン剤に対する感受性を評価する方法、及び
少なくとも１種類の抗ヒトチミジル酸シンターゼポリク
ローナル抗体が固定化された不溶性担体を含んでなるヒ
トチミジル酸シンターゼ測定用キット。 【効果】 簡便な免疫学的測定法によって検体中ヒトTS
を高感度に測定できる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、ヒトチミジル酸シ
ンターゼの免疫学的測定方法とその測定用キットに関す
る。

【０００２】

【従来の技術】チミジル酸シンターゼ（thymidylate sy
nthase；EC2.1.1.45、以下「TS」と称する）は、デオキ
シウリジル酸からチミジル酸を生成する反応を触媒する
酵素で、DNAに特異的な塩基であるチミンを供給する役
割をもち、かつDNA前駆体供給経路の主要な律速酵素の
一つである。従って、細胞増殖の盛んな胸腺や腫瘍組織
中でその活性が高くなることが知られている。

【０００３】一方、5-フルオロウラシル、5-フルオロデ
オキシウリジン等のフルオロピリミジン系の抗ガン剤
は、このTSを標的酵素とするものであり、例えば5-フル
オロデオキシウリジンは生体内でフルオロデオキシウリ
ジル酸に変化してTSを阻害する。特に、フルオロピリミ
ジン系抗ガン剤は、腫瘍細胞中のTS量が少ない患者に対
してはその投与効果が大きく、顕著な延命効果が見られ
るのに対し、TS量が多い患者に対しては投与効果が小さ
いことが知られている（癌と化学療法，24(6)：705-71
2，1997）。従って、例えば腫瘍患者の治療を行うに際
し、予め摘出腫瘍中のTS量を測定することは、治療方法
の決定や投与する抗ガン剤の選定の指標となるなど、そ
の重要度は高い。

【０００４】従来のTS測定法としては、生化学的にその
酵素活性を測定する手法が中心に行われ、例えば反応産
物のジヒドロ葉酸の生成を特定波長の吸光度で測定する
方法、TSに対して結合する放射能ラベル化したフルオロ
デオキシウリジル酸（FdUMP）（例えば[3H]FdUMP）の量
を測定する方法が挙げられる。

【０００５】一方、抗TS抗体を用いた免疫学的測定法も
報告されている。例えば、抗TSモノクロナール抗体M-TS
-4及びM-TS-9を用いてTSを測定する方法（Malgorzata
M.Jastreboff et al., Biochemistry, 1985(24), 587-5
92）、抗TSモノクロナール抗体TA 102、TS 105、TS 10
6、TS 109、TS 110、TS 11A及びTS 11Bを用いてTSを検
出する方法（特表平6-507314号公報）が知られている。
また、ホモジナイズした各種腫瘍細胞を電気泳動にか
け、転写後一次抗体に抗TS-IgG抗体、二次抗体に標識化
した抗IgGを用いるブロッティング法（癌と化学療法，2
4(6)：705-712，1997）、標準TS抗原をウェルにコート
してTSを含む被検試料と抗TS抗体を添加し競合させる競
合法、TSを含む被検試料をウェルにコートして抗TS抗体
を添加結合させ、次いで標識化抗マウスIgGを反応させ
る方法等が知られている。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、前記の
生化学的にTSの酵素活性を測定する方法は、低レベルの
酵素活性を測定するためには感度が不十分である点、新
鮮な試料の使用が必要であったり、あるいは酵素分解を
防ぐため被検試料の取扱いに注意が必要である点、被検
試料が大量に必要である点、放射性物質を扱う場合には
特殊な技術と施設が必要である点など、多くの問題点を
有している。

【０００７】また、従来の免疫学的測定法についても、
操作の煩雑さや測定精度の面で十分とは言い難い。すな
わち、例えば電気泳動後ブロッティングによって検出す
る方法は、非常に手技が煩雑な割には定量性に乏しく、
抗原コートウェル上で検体と抗体を競合的に反応させる
方法は、測定感度が悪く、また検体の希釈物をそのまま
ウェルにコートする方法でも、TSの全量がコートされる
とは限らず信頼性に乏しいという問題がある。従って、
より簡便かつ高精度のTSの測定方法が求められているの
が現状である。

【０００８】

【課題を解決するための手段】かかる実情において本発
明者らは、種々検討を重ねた結果、非常に多くの成分
（夾雑物）を含む検体中から微量のヒトTSを特異的に効
率よく捕まえるためには、不溶性担体に固定化した抗ヒ
トTSポリクローナル抗体を用いることが非常に有効であ
ることを見出し、本発明を完成させた。

【０００９】すなわち本発明は、抗ヒトTS抗体を用いて
ヒトチミジル酸シンターゼを免疫学的に測定する方法に
おいて、当該抗体として、少なくとも不溶性担体に固定
化した抗ヒトTSポリクローナル抗体を用いることを特徴
とするヒトTSの測定方法を提供するものである。

【００１０】また本発明は、採取された癌細胞に含まれ
るヒトTSの量を、上記の方法により測定し、その測定結
果から当該癌細胞のフルオロピリミジン系抗ガン剤に対
する感受性を評価する方法を提供するものである。

【００１１】更に本発明は、少なくとも１種類の抗ヒト
TSポリクローナル抗体が固定化された不溶性担体を含ん
でなるヒトTS測定用キットを提供するものである。

【００１２】

【発明の実施の形態】本発明に用いる抗ヒトTSポリクロ
ーナル抗体を取得するには、免疫原としてヒトTSを用い
る。ヒトTSとしては、生体中から抽出、精製することに
より得られたネイティブヒトTS（以下「nhTS」と称す
る）を用いることもでき、また、より容易にかつ大量に
ヒトTSを得るためには、リコンビナントヒトTS（以下
「rhTS」と称する）を用いることもできる。rhTSは入手
が容易であり、またこれを用いた場合には得られる抗体
の反応性を均質化することができ、測定キットにおいて
も測定性能が常に一定化された系を構築しやすいという
メリットがあり、好ましい。

【００１３】nhTSは、例えば以下のようにして得ること
ができる。すなわち、TSを発現するヒト組織あるいはヒ
ト腫瘍由来の腫瘍株の培養細胞又はヌードマウスやヌー
ドラットの皮下移植腫瘍のホモジネートを、10-ホルミ
ル-5,8-ジデアザ葉酸エチルをリガンドにしたカラムに
かけた後、dUMPを含む緩衝液で溶出させることにより高
純度のnhTSを得ることができる。

【００１４】またrhTSは、例えば以下のようにして得る
ことができる。すなわち、まずヒトTSのDNA配列を確認
し、グルタチオンS-トランスフェラーゼ（GST）-TS融合
蛋白を発現するようにデザインされたプラスミドに翻訳
領域を組み込み、イソプロピル-1-チオ-β-D-ガラクト
シド（IPTG）によりGSTーTS融合蛋白が誘導されるプラス
ミドを作製する。このプラスミドをトランスフォームし
た大腸菌をIPTG存在下で大量培養し、グルタチオン−ア
ガロースカラムにかけて吸着したGSTーTS融合蛋白を適当
な緩衝液で溶出させ、トロンビンと塩化カルシウム存在
下で加温し、ヒトTSとGSTを切断する。これを更にGST-
アガロースカラムにかけることにより高純度のrhTSを得
ることができる。

【００１５】本発明に用いる抗ヒトTSポリクローナル抗
体は、このようなヒトTS（例えばrhTS）をマウス、ラッ
ト、ウサギ、ヒツジ等の適当な哺乳動物に投与し、公知
の方法に従って得ることができる。

【００１６】本発明においては、上記抗ヒトTSポリクロ
ーナル抗体を不溶性担体に固定化して用いることによ
り、従来の免疫学的測定法の問題点であった、操作の煩
雑さや測定精度の低さが改善され、極めて高い感度を実
現することができる。

【００１７】本発明のヒトTSの測定方法は、不溶性担体
に固定化した抗ヒトTSポリクローナル抗体、又は更に必
要に応じて当該抗体と異なる種類の抗ヒトTS抗体を組み
合わせて用いるものである限り、いずれの測定方式に適
用することもできる。すなわち、本発明の測定方法は、
例えば、ラテックス凝集法、イムノクロマトグラフ法
や、サンドイッチ法、競合法によるラジオイムノアッセ
イ、エンザイムイムノアッセイ等、特にサンドイッチ法
及びラテックス凝集法に好適に適用することができる。

【００１８】本発明方法をラテックス凝集法に適用する
場合、例えば抗ヒトTSポリクローナル抗体をラテックス
粒子に感作した後、これをヒトTSを含む検体と反応さ
せ、生じた凝集による吸光度変化を測定することによ
り、ヒトTSを定量することができる。

【００１９】本発明方法を競合法に適用する場合は、例
えば抗ヒトTSポリクローナル抗体固相化担体とヒトTSを
含む検体、それに標識したヒトTSを競合的に反応させ、
担体に結合した標識ヒトTSの標識活性を測定することに
より、ヒトTSを定量することができる。

【００２０】また本発明方法をサンドイッチ法に適用す
る場合は、例えば抗ヒトTSポリクロ−ナル抗体固相化担
体とヒトTSを含む検体を反応させて複合体を形成した
後、反応液を除去し、次に標識した抗ヒトTS抗体を反応
させて抗ヒトTSポリクローナル抗体固相化担体-ヒトTS-
標識抗ヒトTS抗体のサンドイッチ状反応物を形成させ、
過剰の標識抗体を洗浄操作で除いてから、担体に固定化
された標識量を測定することにより、ヒトTSを定量する
ことができる。

【００２１】サンドイッチ法に用いられる材料を具体的
に挙げると、担体としてはガラス製のチューブ、プレー
ト、ウェルあるいはビーズ、プラスチック製のチュー
ブ、プレート、ウェルあるいはビーズ、フェライト粒子
等が挙げられる。この担体に周知の物理吸着あるいは化
学的結合によって抗ヒトTSポリクローナル抗体を結合
し、抗体固相化担体として用いる。

【００２２】標識には酵素、放射性同位元素、蛍光物質
等が用いられるが、なかでも酵素が好ましく、この酵素
としてはペルオキシダーゼ、アルカリフォスファター
ゼ、グルコースオキシダーゼ、ガラクトシダーゼ等、安
定性に優れ、酵素活性が測定しやすいものが好適に用い
られる。これらの酵素を抗体と結合する方法としては、
グルタルアルデヒドによるアミノ基同士の結合反応、ス
クシンイミド基、マレイミド基等を有する架橋剤による
結合反応などが挙げられ、ペルオキシダーゼの糖鎖を過
ヨウ素酸で酸化して抗体のアミノ基と結合する方法も収
率が良く簡便であることから好ましい。

【００２３】酵素活性を測定するための基質としては、
その酵素に特異的なものが用いられ、発色、蛍光、発光
等を生じさせてそのシグナルを測定機器で検出すること
により、ヒトTSを定量することができる。例えばペルオ
キシダーゼを酵素とする場合、過酸化水素とオルトフェ
ニレンジアミンを組み合わせて用いると酵素量に応じた
発色反応が起こり、過酸化水素とルミノールを組み合わ
せて用いると発光反応が起こる。発色反応は分光光度計
で、発光反応はルミノメーターで測定を行うことにより
酵素量に応じたシグナルが得られる。

【００２４】また、本発明方法をイムノクロマトグラフ
法に適用する場合、不溶性担体としては、紙、セルロー
ス薄膜等、液体を展開しうる公知の材料が用いられ、ヒ
トTSを含む液体試料が展開され検出する部位に抗ヒトTS
ポリクローナル抗体を固定化する。固定化法としては公
知の方法を用いればよく、特に化学結合によるのが好ま
しい。液体試料を滴下する部位あるいは滴下した液体試
料が展開する経路の途中に、標識化した抗ヒトTS抗体を
塗布する。この際、標識化抗ヒトTS抗体が不溶性担体へ
不可逆的に吸着することは好ましくないため、高分子物
質（ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコール、
デキストラン等の高分子糖類）を用いて標識化抗ヒトTS
抗体を薄膜上に固化しておくのが好ましい。また、標識
化物としては、上記酵素以外にも、金コロイド、プラチ
ナ等の金属コロイド、色素等で色付けされたラテックス
粒子（いわゆるカラーラテックス）、フルオレッセイ
ン、ユーロピウムキレート等の各種蛍光試薬、アクリジ
ニウム誘導体等の発光試薬を用いることができる。好適
には新たな増感反応を必要とせず目視的にも観察可能な
金属コロイドやカラーラテックスが用いられる。

【００２５】不溶性担体上に滴下された試料中のヒトTS
に、まず標識された抗TS抗体が結合して展開されてい
く。そして固定化された抗ヒトTSポリクローナル抗体の
部位で捕捉され集約され、当該部位における標識に由来
する着色等の度合いを目視的、あるいは光学的に検出す
ることで、ヒトTSを測定することができる。

【００２６】固定化抗ヒトTSポリクローナル抗体に加
え、これとは異なる種類の標識した抗体を組み合わせて
用いる場合、このような抗体としては、抗ヒトTSポリク
ローナル抗体、モノクローナル抗体が挙げられる。

【００２７】抗ヒトTSモノクローナル抗体を用いる場合
には、抗ヒトTSモノクローナル抗体は、そのモノクロー
ナル抗体を産生することのできるハイブリドーマ（例え
ば、マウス・ハイブリドーマ）を、例えば、適当な培地
又は哺乳動物（例えば、マウス）の腹腔内で培養するこ
とにより製造することができる。

【００２８】このハイブリドーマは、一般的には、例え
ば、rhTSあるいはnhTSで免疫した哺乳動物又は鳥類（例
えば、マウス）の脾臓細胞と哺乳動物（例えば、マウ
ス）のミエローマ細胞（骨髄腫細胞）とを、Kohler及び
Milsteinの基本方法〔Nature，第256巻，495項(1975年)
参照〕に従って細胞融合することにより製造すること
ができる。ハイブリドーマの培養に使用できる培地とし
ては、好適にはダルベッコ氏変法イーグル氏最小必須培
地（Dulbeccos modified Eeagle's minimum essential
medium）に、ウシ胎児血清、L-グルタミン、L-ピルビン
酸、及び抗生物質（ペニシリンＧとストレプトマイシ
ン）を含む培地が挙げられる。ハイブリドーマの培養
は、培地中で行う場合には、例えば５％CO₂濃度、37℃
で約３日間、またマウスの腹腔内で行う場合には、例え
ば14日間程度行う。このようにして得られた培養液又は
哺乳動物の腹水から、蛋白質の単離・精製に一般的に用
いられている方法により、抗ヒトTSモノクローナル抗体
を分離・精製することができる。そのような方法として
は、例えば、硫安塩析、イオン交換セルロースを用いる
イオン交換カラムクロマトグラフィー、分子篩ゲルを用
いる分子篩カラムクロマトグラフィー、プロテインＡ結
合多糖類を用いる親和性カラムクロマトグラフィー、透
析、凍結乾燥等を挙げることができる。

【００２９】このようにして得られる抗ヒトTSモノクロ
ーナル抗体としては、例えば以下の実施例で示す、マウ
ス・ハイブリドーマRTSMA1（FERM BP-6404）、RTSMA2
（FERMBP-6402）、NTSMA1（FERM BP-6401）、NTSMA2（F
ERM BP-6403）等により産生されるものが挙げられる。
本発明において、不溶性担体に固定化した抗ヒトTSポリ
クローナル抗体に、これらモノクローナル抗体又はポリ
クローナル抗体を併用すると、ヒトTSを精度良く測定す
ることができる。

【００３０】以上のように、抗ヒトTSポリクローナル抗
体固定化担体と、各アッセイ系に応じて標識抗体、基
質、及び測定用機器を選択することにより、ヒトTSの検
出が可能となる。また本発明測定方法に用いられるヒト
TS測定キットは、少なくとも１種類の抗ヒトTSポリクロ
ーナル抗体を固定化した不溶性担体と、各アッセイ系に
応じたその他の要素を、適宜選択して構成することがで
きる。

【００３１】

【実施例】以下、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説
明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

【００３２】参考例１ Ａ．rhTSの製造 ヒトTS cDNAの制限酵素認識部位MunIからHindIIIまでを
組み込み、グルタチオンS-トランスフェラーゼ（GST）
とヒトTSの融合タンパクを発現するように作製されたプ
ラスミドを導入した大腸菌株NM522を、50μg/mlのアン
ピシリン存在下、200mlのLB培地（和光純薬工業社製）
中で37℃にて一晩振盪培養した。その培養液を100mlず
つアンピシリンを含む１リットルのLB培地の入った２本
の三角フラスコに分注し、25℃で３時間振盪培養し、40
mg/mlのイソプロピル-1-チオ-β-D-ガラクトシド（IPT
G）を0.6mlずつ加え、更に25℃で20時間培養した。遠心
による集菌後、100mlの破菌用バッファー（50mM Tris，
pH7.5，25％シュークロース）に菌体を懸濁し、５mlの1
0％Nonidet P-40（界面活性剤，ナカライテスク社製）
と0.5mlの１Ｍ塩化マグネシウムを加え、ソニケーター
により破菌して10,000rpmで15分間遠心した。その上清
を14mlのグルタチオン（GSH）−アガロース（シグマ社
製）を充填したカラムに通し（20ml／時間）、100mlの
洗浄液（20mM Tris，pH7.5，２mM塩化マグネシウム，１
mM DTT）でカラムを洗浄後、50mlの溶出液（50mM Tri
s，pH9.6，５mM GSH）で３mlずつチューブに溶出し、ブ
ラッドフォード法でタンパク分画を確認してピーク分画
９ml（タンパク濃度は７mg/ml）を得た。それを直ちに
１リットルの洗浄液で透析してpH7.5に戻した後、600ユ
ニットのトロンビンを加え、１mM塩化カルシウムの存在
下に37℃で２時間処理して、GST−TS融合タンパクの結
合部位を切断した。GSTとTSの混合物は、再びGSH−アガ
ロースカラムに通し（20ml／時間）、洗浄液でカラムか
ら溶出させて、ブラッドフォード法によりタンパク分画
を確認し、rhTS溶液を９ml得た。0.2、0.4、0.6、0.8及
び1.0mg/mlのBSA溶液100μlを５mlのブラッドフォード
液に加え595nmの吸光度を測定し、標準曲線を作成し
た。蒸留水で５倍に希釈したrhTS溶液100μlを５mlのブ
ラッドフォード液に加え、595nmの吸光度を測定した結
果、rhTS溶液のタンパク濃度は、3.5mg/mlであった。

【００３３】Ｂ．nhTSの製造 nhTSの精製は、Rodeらの方法に基づいて行った（Rode e
t al., Biochemical Pharmacology 1980 29:723）。50
匹の雄性BALB/c-nu/nuマウスの背部皮下に移植したヒト
肺癌株Lu-99を摘出し、50gの腫瘍を得た。この腫瘍に10
0mlの10mMリン酸緩衝液（pH7.5，100mM塩化カリウム，1
0mM 2-メルカプトエタノール）を加えホモジナイズ後、
４℃にて10,000rpmで１時間遠心後の上清から30〜70％
飽和硫安で沈殿を得た。沈殿を10mMのリン酸緩衝液（pH
7.5，0.1％トリトンX-100，10mM 2-メルカプトエタノー
ル，20μM dUMP）に溶解し、10-ホルミル-5,8-ジデアザ
葉酸エチルをリガンドにしたカラムにかけ、200mMのリ
ン酸緩衝液（pH7.5，0.1％トリトンX-100，10mM 2-メル
カプトエタノール，20μM dUMP）でカラムを洗浄後、20
0mMのリン酸緩衝液（pH7.5，0.1％トリトンX-100，10mM
2-メルカプトエタノール，20μM dUMP）で溶出し、nhT
S溶液を４ml得た。0.2、0.4、0.6、0.8及び1.0mg/mlのB
SA溶液100μlを５mlのブラッドフォード液に加え595nm
の吸光度を測定し、標準曲線を作成した。nhTS溶液100
μlを５mlのブラッドフォード液に加え、595nmの吸光度
を測定した結果、nhTS溶液のタンパク濃度は0.3mg/mlで
あった。

【００３４】参考例２ rhTSを免疫原としたポリクロ
ーナル抗体の製造方法 ウサギ（ニュージーランドホワイト，雌，12週齢）に、
参考例１Ａで得られたrhTSを１匹当たり100μg背部皮下
に投与した。このrhTSは、予めフロイントの完全アジュ
バント中で乳化したものを用いた。このウサギに、14日
の間隔をおいて、予めフロイントの不完全アジュバント
中で乳化したrhTSを100μg／匹の量で続けて４度の背部
皮下注射を行った。最終投与から７日後、ウサギから採
血を行い、血清を得た。血清をプロテインＧセファロー
ス4FFカラム（ファルマシア社製）に通し、洗浄液（20m
Mリン酸ナトリウム，pH7.0）でカラムを洗浄後、溶出液
（0.1Ｍグリシン，pH2.7）で抗体を溶出し、直ちに洗浄
液で透析を行いIgGとして精製した。更に、rhTSを結合
させたセファロース4BカラムにIgG画分の試料をかけ、
洗浄液（20mMリン酸ナトリウム，pH7.0）でカラムを洗
浄後、溶出液（0.1Ｍグリシン，pH2.7）で抗体を溶出
し、直ちに洗浄液で透析を行った。

【００３５】参考例３ rhTSを免疫原としたモノクロ
ーナル抗体の製造 雌性BALB/cマウス（８週齢）に、参考例１Ａで得られた
rhTSを１匹当たり20μg腹腔内注入した。これらのTSタ
ンパクは、予めフロイントの完全アジュバント中で乳化
したものを用いた。このマウスに、14日の間隔をおい
て、予めフロイントの不完全アジュバント中で乳化した
rhTSを20μg／匹の量で続けて４度の追加腹腔内注射を
行った。融合の３日前に0.5mlのリン酸緩衝化生理食塩
水に含まれるrhTS100μgを尾静脈から注射した。免疫化
したマウスからの脾臓細胞（１×10 ⁸）と、２×10⁷のP3
X63Ag8変異種653骨髄腫細胞を、融合試薬として50％（V
/V）のポリエチレングリコール4000（メルク社製）を使
用して、Galfre及びMilsteinの融合方法（Galfre et a
l., Nature 1977 266:550）に従って融合させた。

【００３６】融合後の細胞は、１×10⁶cells/mlの細胞
濃度となるように10％ウシ胎児血清を含むHAT培地（１
×10^-4Ｍヒポキサンチン，４×10^-7Ｍアミノプテリン及
び1.6×10^-5Ｍチミジンを含むRPMI1640培地）に懸濁
し、96ウェルのマイクロプレートに１ウェルあたり200
μlずつ分注した。

【００３７】融合細胞はCO₂インキュベーター（５％C
O₂，37℃）中で培養し、10％ウシ胎児血清を含むHAT培
地で培地交換を行い増殖させて、脾臓細胞と骨髄種細胞
からなるハイブリドーマのスクリーニングを行い、次い
で10％ウシ胎児血清を含むHT培地（１×10^-4Ｍヒポキサ
ンチン及び1.6×10^-5Ｍチミジンを含むRPMI1640培地）
中で馴化した。

【００３８】ハイブリドーマ培養上清中の抗体は、rhTS
を感作したマイクロプレートを用いてELISA法により検
出した。陽性となったウェルに対しては、10％ウシ胎児
血清及び５％ブライクローン（大日本製薬社製）を含む
HT培地を用いて限界希釈法によるクローニングを２回繰
り返し、rhTSに対する反応性を有するクローンを２種類
選出し、RTSMA1（FERM BP-6404）及びRTSMA2（FERM BP-
6402）と名付けた。

【００３９】各クローンの産生するモノクローナル抗体
は、0.5mlのプリスタン（大日本製薬社製）をヌードマ
ウスの腹腔内に注入し、更に７日後に0.5ml腹腔内投与
後、１×10⁷個のハイブリドーマを腹腔内移植して増殖
させ、２〜３週間後に腹水を得た。その腹水をプロテイ
ンＧセファロース4FFカラム（ファルマシア社製）に通
し、洗浄液（20mMリン酸ナトリウム，pH7.0）でカラム
を洗浄後、溶出液（0.1Ｍグリシン，pH2.7）で抗体を溶
出し、直ちに洗浄液で透析を行った。

【００４０】参考例４ nhTSを免疫原としたモノクロ
ーナル抗体の製造 免疫原として、rhTSの代わりに参考例１Ｂで得られたnh
TSを用いるほかは参考例３と同様の方法でnhTSに対する
反応性を有するクローンを２種類選出し、NTSMA1（FERM
BP-6401）、NTSMA2（FERM BP-6403）と名付けた。その
後、これらのハイブリドーマから参考例３と同様にして
モノクローナル抗体を得た。

【００４１】参考例５ 測定用抗体の調製 (1) 抗TSウサギ特異抗体のペプシン消化 上記参考例２により得られたウサギ特異抗体IgG分画
を、50mM酢酸緩衝液pH4.5に対し透析を行った。このIgG
量の2.5％のペプシンを加え37℃の孵卵器中16時間消化
反応を行った。その後、トリス溶液でpHを８に上げて消
化反応を止め、セファクリルS-200カラムを用いたゲル
ろ過で分子量10万の抗体F(ab')₂分画をプールした。

【００４２】(2) 抗体固定化担体の調製 上記で調製した抗TSF(ab')₂分画を20mM PBS（pH7.0）で
２μg/mlに調整し、96穴のELISA用プレートに0.1mlずつ
分注し、シールをして37℃の孵卵器で２時間コーティン
グを行い、抗体固定化担体を得た。使用時には0.05％ツ
イーン20を含む生理食塩水（洗浄液）で２回洗浄して反
応に用いた。

【００４３】(3) ペルオキシダーゼ標識抗体の調製 西洋ワサビペルオキシダーゼ（東洋紡社製）２mgを0.5m
lの蒸留水に溶解し、0.2Ｍのメタ過ヨウ素酸ナトリウム
0.1mlを加えて室温20分間振盪反応を行った。反応液を
セファデックスG-25カラム（1.5cmφ×12cm，１mM酢酸
緩衝液pH4.2平衡化）にかけ、同緩衝液で溶出されてき
た褐色の酵素部分をプールした。ポリクローナル抗体Ig
G分画２mgとモノクローナル抗体IgG分画２mg（50mM炭酸
緩衝液pH9.5，１ml）のそれぞれにプールした酵素の半
量（１mg）を加え、さらに１Ｍ炭酸緩衝液0.1mlを加え
て室温２時間振盪反応を行った。４mg/mlの水素化ホウ
素ナトリウム0.1mlを加え、４℃で１時間静置して反応
を止めた後、生理食塩水に対して透析を行った。透析内
液をセファクリルS-200カラム（2.5cmφ×70cm，生理食
塩水平衡化）にかけ、分画されてきた最初のピークを酵
素標識抗体としてプールした。

【００４４】試験例１ 抗体の組み合わせの比較 参考例３で得たハイブリドーマRTSMA1（FERM BP-6404）
により得られた抗ヒトTSモノクローナル抗体及び参考例
５(1)で調製した抗ヒトTSポリクローナル抗体を組み合
わせて、測定感度の比較を行った。

【００４５】50mM炭酸緩衝液pH9.5で２μg/mlに調整し
たモノクローナル抗体IgG（RTSMA1）とポリクローナル
抗体IgGを、96穴のELISA用プレートに0.1mlずつ分注
し、シールをして37℃の孵卵器で２時間コーティングを
行い、２種類の抗体固定化担体を得た。洗浄液で２回洗
浄後、0.05％ツイーン20を含む20mM PBS（希釈液）で調
整した精製rhTSの希釈列0.1mlを抗体固定化プレートに
分注し、37℃で１時間静置反応した。洗浄液で２回洗浄
後、参考例４で得たハイブリドーマNTSMA1（FERM BP-64
01）により得られたモノクローナル抗体と、ポリクロー
ナル抗体それぞれで調製した酵素標識抗体0.1mlをウェ
ルに分注し、37℃で１時間静置反応した。洗浄液で４回
洗浄後、３mg/mlオルトフェニレンジアミンと0.75mM過
酸化水素を含む0.1Ｍ酢酸緩衝液pH5.5（発色液）0.1ml
を加え室温暗所にて30分間酵素反応を行った。最後に、
１Ｍ硫酸0.1mlを加えて反応を止め、ELISA用プレートリ
ーダーの測定波長を490nmに設定し、測定を行った。こ
の結果を表１に示す。

【００４６】

【表１】

【００４７】表１から明らかなように、固定化モノクロ
ーナル抗体プレートを用いた場合には低濃度rhTSに対し
て応答が悪く、高感度測定法が構築できないのに対し、
固定化ポリクローナル抗体プレートを用いると、標識抗
体の種類にかかわらず高感度化ができ、微量のヒトTSの
測定が可能である。

【００４８】実施例１ ヒトTSの測定 (1) 標準物と検体中ヒトTSの測定 参考例１Ａで得られた精製rhTSの蛋白量を定量し、その
値を標準物の表示値とした。この標準物を0.05％ツイー
ン20を含む20mM PBS（希釈液）で希釈し、測定に用い
た。また検体としては、癌組織ホモジネートの遠心上清
を希釈液で10倍に希釈し、測定に用いた。標準物あるい
は検体0.1mlを抗ヒトTSポリクローナル抗体固定化プレ
ートに分注し、37℃で１時間静置反応した。洗浄液で２
回洗浄後、抗体量１μg/mlに希釈液で調整した酵素標識
抗ヒトTSポリクローナル抗体0.1mlをウェルに分注し、3
7℃で１時間静置反応した。洗浄液で４回洗浄後、３mg/
mlオルトフェニレンジアミンと0.75mM過酸化水素を含む
0.1Ｍ酢酸緩衝液pH5.5（発色液）0.1mlを加え、室温暗
所にて30分間酵素反応を行った。最後に、１Ｍ硫酸0.1m
lを加えて反応を止め、ELISA用プレートリーダーの測定
波長を490nmに設定し、測定を行った。

【００４９】(2) 標準曲線の作成 横軸に標準TS濃度、縦軸に上記(1)で得られた吸光度を
とってグラフを作成したところ、図１に示すように標準
物濃度の増加に伴い吸光度が増加する標準曲線が得られ
た。

【００５０】(3) 基質バインディング法との相関 トリチウムラベルされたFdUMPを用いた基質バインディ
ング法は、Spearsらの方法に基づいて行った（Spears e
t al., Cancer Research 1982 42:450）。腫瘍組織に重
量の３倍量のホモジナイズ用緩衝液（200mM Tris，pH7.
4，20mM 2-メルカプトエタノール，15mMシチジン5'-モ
ノリン酸，100mM フッ化ナトリウム）を加え、ホモジナ
イズ後、105,000×ｇで１時間の遠心にかけてホモジネ
ートを調製した。ホモジネート50μlにバッファーＡ（6
00mM炭酸水素アンモニウム，pH8.0，100mM 2-メルカプ
トエタノール，100mMフッ化ナトリウム，15mMシチジン
5'-モノリン酸）を50μl、バッファーＢ（リン酸カリウ
ム，pH7.4，20mM 2-メルカプトエタノール，15mMシチジ
ン5'-モノリン酸，100mM フッ化ナトリウム，２％BSA，
２mMテトラヒドロ葉酸，16mMアスコルビン酸ナトリウ
ム，９mMホルムアルデヒド）を25μl及び２μCi/mlの[³
H]FdUMPを50μl加え、20分30℃でインキュベートし、酸
不溶性画分の放射活性を測定した。TS量はTSと[³H]FdUM
Pが１：１で結合するとして、[³H]FdUMPの比活性から計
算した。

【００５１】上記(3)の基質バインディング法により得
られた検体中のヒトTS量を横軸に、前記(1)のELISA法に
より得られた検体の吸光度から標準曲線を用いて濃度に
換算した値を縦軸に取ると、図２に示すように良い相関
関係が見られた。

【００５２】

【発明の効果】以上のように、本発明によれば、不溶性
担体に固定化した抗ヒトTSポリクローナル抗体を用いる
ことで、簡便な免疫学的測定法によって検体中ヒトTSを
高感度に測定できる。本発明の測定法を用いて被検体
（例えば胃組織抽出液）のヒトTSを定量することで、癌
の有無の判断、治療効果確認等だけでなく、治療方法の
選定、抗ガン剤投与の可否を決定しうる指標とすること
もできる。

【図面の簡単な説明】

【図１】抗ヒトTSポリクローナル抗体固定化プレート−
酵素標識抗ヒトTSポリクローナル抗体系におけるTS濃度
−吸光度の標準曲線を示す図である。

【図２】基質バインディング法（活性法）と本発明の測
定方法との相関を示す図である。

フロントページの続き (72)発明者 松屋 毅 東京都千代田区東神田１丁目11番４号 株 式会社ヤトロン内 (72)発明者 福島 正和 埼玉県飯能市本町３−８−５−202 (72)発明者 岡部 博之 埼玉県入間市久保稲荷５−14−34

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 抗ヒトチミジル酸シンターゼ抗体を用い
   てヒトチミジル酸シンターゼを免疫学的に測定する方法
   において、当該抗体として、少なくとも不溶性担体に固
   定化した抗ヒトチミジル酸シンターゼポリクローナル抗
   体を用いることを特徴とするヒトチミジル酸シンターゼ
   の測定方法。
2. 【請求項２】 抗ヒトチミジル酸シンターゼ抗体とし
   て、不溶性担体に固定化した抗ヒトチミジル酸シンター
   ゼポリクローナル抗体と、標識化した抗ヒトチミジル酸
   シンターゼ抗体とを組み合わせて用いるものである請求
   項１記載のヒトチミジル酸シンターゼの測定方法。
3. 【請求項３】 抗ヒトチミジル酸シンターゼ抗体が、リ
   コンビナントヒトチミジル酸シンターゼを免疫原として
   得られたものである請求項１又は２記載のヒトチミジル
   酸シンターゼの測定方法。
4. 【請求項４】 採取された癌細胞に含まれるヒトチミジ
   ル酸シンターゼの量を、請求項１〜３のいずれかに記載
   の方法により測定し、その測定結果から当該癌細胞のフ
   ルオロピリミジン系抗ガン剤に対する感受性を評価する
   方法。
5. 【請求項５】 少なくとも１種類の抗ヒトチミジル酸シ
   ンターゼポリクローナル抗体が固定化された不溶性担体
   を含んでなるヒトチミジル酸シンターゼ測定用キット。