CN104949971B - 肝癌早期诊断试剂盒及其应用 - Google Patents

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本发明属于生物检测领域，具体涉及一种肝癌早期诊断试剂盒及其应用。所述的诊断试剂盒组成如下:DCP标准品溶液，辣根过氧化物酶(HRP)标记的DCP单克隆抗体溶液，对照缓冲液，清洗缓冲液，底物液，显色液，终止液和DCP多克隆抗体包被酶标板。

Description

肝癌早期诊断试剂盒及其应用
技术领域
本发明属于生物检测领域，具体涉及一种肝癌早期诊断试剂盒及其应用。
背景技术
国际卫生组织统计结果显示，2013年全球有101万肝癌新发病例，76万肝癌死亡病例，男、女新发病例分别位于当年恶性肿瘤发病率的第五位及第七位，而男、女死亡病例分别位于当年恶性肿瘤死亡率的第二位及第六位。在所有肝癌患者中，肝细胞癌为最常见的一种组织学类型，占所有肝癌患者的70％-85％。
肝癌恶性程度高，病情发展迅速，若治疗不及时或治疗不当，则可使病情迅速恶化而致死亡。近年来，随着人们生活方式的改变及其他各种因素的影响，我国肝癌发病率仍有逐年上升趋势，我国每年死于肝癌的患者约有12万人，约占世界肝癌死亡人数的46％，目前肝癌已经成为我国仅次于胃癌、食管癌第三位的恶性肿瘤死亡原因。
PIVKA-II(ProteinInducedbyVitaminKAbsenceorAntagonist-II)也被称作脱-羧基凝血酶原(Des-carboxy-prothrombin,DCP),是一种异常的凝血酶原,最早于1984年由Liebman从肝细胞癌(hepatoeellularcarcinoma,HCC)患者的血清中发现,其形成的确切机制不明。与正常的凝血酶原相比,以往文献表明PIVKA-II和AFP没有相关性,两者联合检测能提高阳性率。PIVKA-II,尤其是和AFP联合,可以作为肝癌早期检测的一个理想标志物。
检测血清DCP受多种非特异物理吸附或者非特异结合的影响，比如凝血素、凝血酶和纤维素及其类似物等的干扰比较大，因此多克隆DCP抗体在免疫分析上受到很大影响，制约其应用。随着分子生物学和基因工程的发展，DCP抗体应用到免疫分析检测上，纯化的DCP单克隆抗体的出现更是解决了交叉性大的问题。作为血清学标志物，DCP抗体出现后，人们试图建立各种免疫分析方法用于DCP的检测.目前文献中报道的方法有:电化学发光免疫分析技术、液相亲和免疫方法、免疫沉淀法、westernblot、ELISA等。
发明内容
本发明的目的是提供一种灵敏度、特异度更高的肝癌早期诊断试剂盒。本发明的技术方案如下：一种肝癌早期诊断试剂盒，所述的诊断试剂盒组成如下:DCP标准品溶液，辣根过氧化物酶(HRP)标记的DCP单克隆抗体溶液，对照缓冲液，清洗缓冲液，底物液，显色液，终止液和DCP多克隆抗体包被酶标板。
DCP标准品溶液为取相应量DCP标准品溶解于含有3g/LOVA的20mmol/L的PBS缓冲液，DCP标准品浓度依次为10mAU/L，80mAU/L，200mAU/L，800mAU/L和2000mAU/L.
所述包被酶标板的制备过程为：将包被用DCP多克隆抗体用0.05M碳酸盐缓冲液(pH值为9.5)稀释后加入酶标板各孔，每孔100μl，吸附过夜，用0.05M磷酸盐缓冲液(pH值为9.5)洗板，再用封闭液封闭过夜，甩干后晾干，即获得单克隆抗体包被酶标板。所述封闭液为含5g/L的明胶、0.5g/L的蔗糖和1.5g/L的蛋清白蛋白(OVA)的20mmol/LPBS缓冲液，pH值为9.5。
辣根过氧化酶标记的DCP单克隆抗体溶液的制备方法为:先将2mgDCP单克隆抗体和20mgHRP，加入1ml的100mmol/LPBS缓冲液(pH值7.4)中，在4℃旋转混合，缓慢加入4ml的1％戊二醛溶液，25℃放置2小时，加入0.1ml200mmol/L的赖氨酸溶液，4℃放置2h，装入透析袋，透析过夜，向透析产物加入等体积的60％甘油，混匀，加入终浓度为5g/L的OVA。
对照缓冲液为20mmol/L的PBS(pH7.4)缓冲液；
底物液为磷酸-柠檬酸缓冲液(pH7.4)配制的3％过氧化氢溶液，并且溶液中0.1mg/L的焦磷酸二氢钠；
显色液为四甲基联苯胺(TMB)的甲醇溶液，浓度为0.1mg/ml；
终止液为3mol/L硫酸；
清洗缓冲液为15mmol/L的PBS(pH7.4)配制的0.05％吐温20溶液。
本发明所述肝癌早期诊断试剂盒对DCP的最低检测限可以达到2.0mAU/mL，并且稳定性极佳，在室温条件下可保存1年，在4℃下可保存3年。
具体实施方式
下面将进一步的详细说明本发明。需要指出的是，以下说明仅仅是对本发明要求保护的技术方案的举例说明，并非对这些技术方案的任何限制。本发明的保护范围以所附权利要求书记载的内容为准。
下列实施例中未注明具体实验条件的实验方法，通常按照常规条件，分子克隆实验指南(SambrookJ,etal.2008.MolecularCloning:ALaboratoryManual,3rdEd.)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1
一种肝癌早期诊断试剂盒，所述的诊断试剂盒组成如下:
DCP标准品溶液，辣根过氧化物酶(HRP)标记的DCP单克隆抗体溶液，对照缓冲液，清洗缓冲液，底物液，显色液，终止液和DCP多克隆抗体包被酶标板.
DCP标准品取相应量DCP标准品溶解于含有3g/LOVA的20mmol/L的PBS缓冲液，DCP标准品浓度依次为10mAU/L，80mAU/L，200mAU/L，800mAU/L和2000mAU/L.
所述包被酶标板的制备过程为：将包被用DCP多克隆抗体用0.05M碳酸盐缓冲液(pH值为9.5)稀释后加入酶标板各孔，每孔100μl，吸附过夜，用0.05M磷酸盐缓冲液(pH值为9.5)洗板，再用封闭液封闭过夜，甩干后晾干，即获得单克隆抗体包被酶标板。所述封闭液为含5g/L的明胶、0.5g/L的蔗糖和1.5g/L的蛋清白蛋白(OVA)的20mmol/LPBS缓冲液，pH值为9.5。
辣根过氧化酶标记的DCP单克隆抗体溶液的制备方法为:先将2mgDCP单克隆抗体和20mgHRP，加入1ml的100mmol/LPBS缓冲液(pH值7.4)中，在4℃旋转混合，缓慢加入4ml的1％戊二醛溶液，25℃放置2小时，加入0.1ml200mmol/L的赖氨酸溶液，4℃放置2h，装入透析袋，透析过夜，向透析产物加入等体积的60％甘油，混匀，加入终浓度为5g/L的OVA。
本实施例中DCP单克隆抗体和DCP多克隆抗体购自美国rapidbio(RB)公司。
对照缓冲液为20mmol/L的PBS(pH7.4)缓冲液；
底物液为磷酸-柠檬酸缓冲液(pH7.4)配制的3％过氧化氢溶液，并且溶液中0.1mg/L的焦磷酸二氢钠；
显色液为四甲基联苯胺(TMB)的甲醇溶液，浓度为0.1mg/ml；
终止液为3mol/L硫酸；
清洗缓冲液为15mmol/L的PBS(pH7.4)配制的0.05％吐温20溶液。
实施例2
分别配制DCP标准品不同浓度的PBS缓冲液，采用实施例1制备的试剂盒进行检测，以对照缓冲液作为空白对照，具体检测方法如下：
a)抗原-抗体反应：在包被酶标板的微孔中分别加入50μlDCP标准品溶液和对照缓冲液(空白对照)，37℃水浴保温50分钟。清洗缓冲液洗板操作5次。
b)将HRP标记的DCP单克隆抗体溶液加入各孔，每孔100μl，37℃水浴保温50分钟。重复洗板操作5次。
c)显色反应：每孔依次加入底物溶液，显色液各50μl，37℃水浴保温20分钟，每孔再加入50μl反应终止液结束反应。
d)比色：用酶标仪在450nm测定OD值并记录。
e)制作标准曲线：以标准品浓度为横坐标，标准品测定的OD值为纵坐标，作出标准曲线；计算标准曲线回归系数R2，当R2＞0.99时本次测定有效；
根据DCP标准品与空白对照的OD值，当比值大于2时，说明试剂盒可以测定该浓度的DCP标准品，最低浓度即为试剂盒的灵敏度，平行试验五次取平均值，结果表明实施例1制备的试剂盒灵敏度可达2.0mAU/mL。
实施例3
将实施例1制备的试剂盒在20℃分别放置6个月和12个月后，按照实施例2的方法测定试剂盒的灵敏度，并根据实施例1中不同浓度标准品进行测定，对数据进行回归分析，计算R2值。
本实施例中对比例设定如下：
对比例1：试剂盒的制备方法同实施例1，区别仅在于DCP标准品溶液中OVA的浓度为1g/L；
对比例2：试剂盒的制备方法同实施例1，区别仅在于DCP标准品溶液中OVA的浓度为5g/L；
对比例3：试剂盒的制备方法同实施例1，区别仅在于包被酶标板制备中使用的封闭液为含1g/L的明胶、0.5g/L的蔗糖和5g/L的蛋清白蛋白(OVA)的20mmol/LPBS缓冲液，pH值为9.5。
对比例4：试剂盒的制备方法同实施例1，区别仅在于包被酶标板制备中使用的封闭液为含10g/L的明胶、0.1g/L的蔗糖和0.5g/L的蛋清白蛋白(OVA)的20mmol/LPBS缓冲液，pH值为9.5。
对比例5：试剂盒的制备方法同实施例1，区别仅在于辣根过氧化酶标记的DCP单克隆抗体溶液中最后添加终浓度为5g/L的BSA。
具体结果如下：
另外，在4℃下保存36个月后，试剂盒灵敏度及线性良好，与刚制备的试剂盒无明显差别。
实施例4
实施例1制备试剂盒精密度：配制10mAU/L，800mAU/L和2000mAU/L的DCP标准品溶液；每个浓度样本重复分析三次，计算变异系数(CV)，经检测表明实施例1试剂盒的CV％为1.7％。
本发明内容仅仅举例说明了要求保护的一些具体实施方案，其中一个或更多个技术方案中所记载的技术特征可以与任意的一个或多个技术方案相组合，这些经组合而得到的技术方案也在本申请保护范围内，就像这些经组合而得到的技术方案已经在本发明公开内容中具体记载一样。

Claims (3)

1.一种肝癌早期诊断试剂盒，所述的诊断试剂盒组成如下:DCP标准品溶液，辣根过氧化物酶标记的DCP单克隆抗体溶液，对照缓冲液，清洗缓冲液，底物液，显色液，终止液和DCP多克隆抗体包被酶标板；
所述包被酶标板的制备过程为：将包被用DCP多克隆抗体用0.05M碳酸盐缓冲液，pH值为9.5；稀释后加入酶标板各孔，每孔100μl，吸附过夜，用0.05M磷酸盐缓冲液，pH值为9.5；洗板，再用封闭液封闭过夜，甩干后晾干，即获得单克隆抗体包被酶标板；
所述封闭液为含5g/L的明胶、0.5g/L的蔗糖和1.5g/L的蛋清白蛋白的20mmol/LPBS缓冲液，pH值为9.5；
辣根过氧化酶标记的DCP单克隆抗体溶液的制备方法为:先将2mgDCP单克隆抗体和20mgHRP，加入1ml的100mmol/LPBS缓冲液中，pH值为7.4；在4℃旋转混合，缓慢加入4ml的1%戊二醛溶液，25℃放置2小时，加入0.1ml200mmol/L的赖氨酸溶液，4℃放置2h，装入透析袋，透析过夜，向透析产物加入等体积的60%甘油，混匀，加入终浓度为5g/L的OVA；
底物液为pH值7.4的磷酸-柠檬酸缓冲液配制的3％过氧化氢溶液，并且溶液中0.1mg/L的焦磷酸二氢钠；
DCP标准品溶液为取相应量DCP标准品溶解于含有3g/LOVA的20mmol/L的PBS缓冲液，DCP标准品浓度依次为10mAU/L，80mAU/L，200mAU/L，800mAU/L和2000mAU/L。
2.根据权利要求1所述的肝癌早期诊断试剂盒，其特征在于，显色液为四甲基联苯胺的甲醇溶液，浓度为0.1mg/ml。
3.根据权利要求1所述的肝癌早期诊断试剂盒，其特征在于，对照缓冲液为pH值7.4的20mmol/L的PBS缓冲液，；终止液为3mol/L硫酸；清洗缓冲液为pH值7.4的15mmol/L的PBS配制的0.05％吐温20溶液。
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