CN101685098A - 一种通过检测样品中egfl7来诊断肝细胞癌的试剂盒及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种诊断肝细胞癌的试剂盒及其应用。本发明还涉及该试剂盒的其他用途。本发明的技术方案是：在所述的试剂盒中包括能与EGFL7蛋白或其片段产生特异性结合的抗体或其片段。本发明提供的试剂盒较现有的诊断肝细胞癌的方法具备更高的灵敏性和准确性，并且可用于监测肝细胞癌的复发转移和判断其术后预后。

Description

一种通过检测样品中EGFL7来诊断肝细胞癌的试剂盒及其应用

技术领域

本发明涉及一种诊断肝细胞癌的试剂盒。

本发明还涉及该试剂盒的其他用途。

背景技术

在全世界范围内，肝细胞癌(Hepatocellular Carcinoma，HCC)居常见恶性肿瘤的第五位，同时是第三大恶性肿瘤相关性死因^[1]。外科手术切除是目前治疗肝细胞癌最有效的手段。尽管近年来随着肝脏外科技术的不断进步，肝细胞癌手术切除率已有明显提高，但以5年生存率衡量，我国肝细胞癌的整体治疗水平仍无显著改善。究其原因，主要是由于无法对肝细胞癌作到有效地早期诊断和及时治疗，很大一部分患者在就诊时就已经出现肝内或远处转移，从而错过了进行有效外科治疗的最佳时期。因此，有效地进行早期诊断和复发转移的监测对于肝细胞癌患者来说意义十分重大。

目前临床实践中，主要采用肿瘤标志物与超声影像学的联合检测来筛查肝细胞癌^[2]。如果肝硬化和慢性肝炎患者的血清AFP持续性增高则强烈预示肝细胞癌的发生，这时可以通过影像学检查予以验证；同样对于那些临床症状不明显或是影像学检查无法鉴别良恶性肿块的患者也采用这种方法加以鉴别^[3]。但是AFP对早期肝细胞癌和一部分小肝细胞癌诊断的敏感性和特异性欠佳，而且并不能评估肝细胞癌病人的预后，AFP的这些局限性直接导致了目前肝细胞癌的早期发现、早期诊断十分困难，严重影响了肝细胞癌患者治疗效果和生存时间。虽然，病理组织学诊断是肝细胞癌诊断的金标准。通过在超声、CT等影像学方法引导下活检进行病理组织学诊断虽然在技术上可行，且可以明确肿瘤的分化程度等情况。但该类检查方法属有创性，穿刺活检操作本身易导致肿瘤沿针道播散、出血等严重并发症^[4，5]，因而并不适用于肝细胞癌的筛查、早期诊断及术后复发转移监测。基于此，如何建立更为简便、实用、准确、可靠而且无创的检测方法以进一步提高肝细胞癌早期诊断及术后复发转移监测的效能则显得尤为重要。长期的临床实践证明，曾经广泛应用于肿瘤筛查的肿瘤标志物正符合上述条件。在肝细胞癌诊断中，肿瘤标志物发挥了重要的作用。它们可以与超声、CT、MRI等影像学检查相互印证，甚至某些标志物的单独或者联合检测就可以筛查出肝细胞癌患者。可见，肝细胞癌早期诊断水平的提高很大程度上取决于能否找到合适、高效的肝细胞癌肿瘤标志物。半个多世纪以来，伴随着分子生物学技术的高速发展，人类基因组图谱的绘制完毕，研究人员已经发现了许多有助于肝细胞癌诊断的靶点，其大体可以分为肿瘤组织标志物和血清标志物。组织标志物需要获取组织标本，因此难以在术前进行检测，临床价值有限。而血清标志物检测十分方便，属于无创性检查病人易接受，无需获取组织标本，完全适用于肝细胞癌高危人群的筛查，早期诊断，术前评估及术后肝细胞癌复发转移的动态监测，因此其临床价值更为显著。

近半个世纪的研究，发现了以AFP为代表的数十种肝细胞癌肿瘤组织标志物和血清标志物，大体上可以划分为肿瘤胚胎抗原和糖蛋白抗原、酶和同工酶、基因与细胞因子四大类，研究表明这些标志物有助于提高肝细胞癌早期诊断与术后复发转移监测的效果。但现有的资料表明，这些标志物由于其在特异性及灵敏性方面的缺陷，大多数尚未被临床广泛接受，仅AFP等少数标志物得到广泛认同并应用于临床的肝细胞癌诊断与治疗中。即便如此，这些目前得到大家高度认同的标志物也有其明显的局限性。以AFP为例，其在胚胎时期由胚肝合成，出生后血清中含量显著下降，一年内达到正常成人水平(＜20ng/ml)，而在肝细胞癌发生时会急剧上升，是目前公认应用最广泛的肝细胞癌临床诊断指标。然而，AFP在某些非肝细胞癌的特殊情况(如妊娠、生殖系肿瘤、肝炎等)下也会轻度上升，而在某些小肝细胞癌或早期肝细胞癌中升高并不显著或根本不升高。有统计表明其对于早期肝细胞癌诊断的灵敏度仅为20-40％^[6]。在另一方面，患者血清中AFP含量的高低并不能反应患者病情的严重程度，也不能评估肝细胞癌患者的预后情况。而其他诸如DCP等最近发现的肝细胞癌血清标志物，虽然有研究表明他们可能在肝细胞癌的早期诊断与预后判断上优于AFP，但缺乏进一步的大样本多中心研究的支持，其在临床上的应用价值也未得到公认。因此，如果能找到一个单独诊断肝细胞癌敏感性、特异性、准确性俱佳的诊断指标，或与AFP联合能提高早期肝细胞癌诊断效能，同时又能较好地预测患者预后情况并且可以广泛应用于临床诊断的血清学标志物，将具有十分深远的意义。

Folkman^[7]于1971年首次提出抑制肿瘤血管生成可以作为治疗实体瘤的新途径的理论，开创了抑制肿瘤血管生成的肿瘤综合治疗的新时代。此后在抗肿瘤血管生成的基础和临床研究中取得了极大的进展，并且发现了诸如VEGF、EGF等生长因子类蛋白在肝细胞癌的发生、发展中发挥了重要作用。有研究表明，这些功能多样性的蛋白还具有其他尚未阐明的生物学作用。EGFL7是一种最新发现的EGF相关性蛋白^[8]。目前的研究认为EGFL7同时是一种分泌性蛋白，主要表达于血管内皮细胞^[8，9]。在体内外研究中发现，在炎症、创伤及肿瘤等情况下血管内皮中的EGFL7表达水平明显上调^[10]，进而促进血管中平滑肌细胞迁徙、诱导成管^[11]，表现为周围微血管密度增加。目前此类研究主要集中在分子机制等基础性研究方面^{[10，12，13，14，15]}，仅有少数研究者开展了其在血管相关性病变方面的临床研究^[16]。

发明内容

本发明的目的就是提供一种灵敏度、准确度更高的诊断肝细胞癌的试剂盒；

本发明的另一目的是提供一种监测肝细胞癌复发转移的试剂盒；

本发明的另一目的是提供一种预测肝细胞癌手术预后的试剂盒。

本发明的技术方案是：在所述的试剂盒中包括能与EGFL7蛋白特异性结合的抗体或其片段。

EGFL7是一种EGF相关性蛋白，广泛分布于全身多种组织中，已有研究表明其可能具有促进血管生成、损伤修复等生物学功能。本申请人分别采用RT-PCR、Western-blot法检测了EGFL7在肝细胞癌组织及相应癌旁肝组织中的表达情况，结果发现EGFL7在肝细胞癌组织中呈显著性高表达(见图1)。通过肝细胞癌组织石蜡切片的免疫组化检测发现，EGFL7蛋白主要定位于肝细胞癌细胞的胞浆内并且其表达强度明显高于周围血管内皮中的表达强度(见图2)。在进一步的细胞学实验中，我们还发现EGFL7在高侵袭转移潜能的肝细胞癌细胞系中的表达亦显著升高(见图3)。进一步的临床随访发现EGFL7高表达的肝细胞癌病人的术后生存率明显低于EGFL7低表达的肝细胞癌病人(见图4)。由此推断，EGFL7作为一个新的肿瘤组织标志物对于肝细胞癌诊断有着重要意义。

根据本发明的实施例，采用本发明提供的试剂盒能灵敏地诊断肝细胞癌，其单独诊断肝细胞癌时，具有很高的诊断灵敏度和准确度。采用本发明提供的试剂盒与目前临床最常用的AFP比较，其在特异度相当的基础上，EGFL7的诊断灵敏度和准确度均明显高于AFP。采用EGFL7与AFP平行诊断肝细胞癌的灵敏度、准确度较单独的AFP检测均有较大的提高。

另一方面，本发明还包括对EGFL7 DNA或是其片段编码的多肽具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。这里，特异性的抗体是指那些能与EGFL7基因产物或片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。关于抗体的制备，已经是一项十分成熟的技术。本发明的抗体可以通过本领域技术人员已知的各种技术进行制备。根据已知的抗原(例如，Abnova公司制备的全长EGFL7重组蛋白)可以通过现有的单克隆抗体的制备方法，获得所需单克隆抗体。目前，已经有用于实验的抗EGFL7的鼠抗人单克隆抗体，例如Abnova公司制备的EGFL7鼠单克隆抗体(M01)；Santa Cruz生物技术公司制备的EGFL7兔抗人多克隆抗体(H-90)等。

本发明不仅包括完善的单克隆抗体和多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab’或(Fab)₂片段；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的单链Fv分子；或嵌合抗体。

抗EGFL7的抗体可用于免疫组织化学技术中，检测活检或切除标本中的EGFL7蛋白。抗体可以通过ELISA、Western印迹分析，或者与检测基团偶联，通过化学发光等方法来检测。体液中的EGFL7的直接测定可以作为肝细胞癌的诊断和预后的观测指标，也可作为肿瘤早期诊断的依据。

本发明也包括试剂盒，以及这里进行描述的任何方法。其中所述试剂盒将以适当的容器形式包含这些试剂中的一种或多种。所述试剂盒也可包含用于RNA分离、扩增细胞中RNA的纯化的试剂、标记等。

根据现有的研究，EGFL7是一种分泌性蛋白，可在体液中检测到，而在肝细胞癌中是高表达的。因此，这为试剂盒临床检测提供了简便检测的可能。本发明研究表明，该试剂盒可用于诊断肝细胞癌，所检测的样品可以为体液。

本发明还发现，对病人术后EGFL7水平的动态测定，可监测肝细胞癌患者术后复发情况。

本发明还发现，进一步的临床随访发现EGFL7高表达的肝细胞癌病人的术后生存率明显低于EGFL7低表达的肝细胞癌病人。

因此，根据上述研究，本发明提供的检测试剂盒还可以用于通过检测样品中EGFL7来监测肝细胞癌复发转移的试剂盒，也可以用于通过检测样品中EGFL7来预测肝细胞癌手术预后的试剂盒。

本发明提供了一种高灵敏性、高特异性和高准确性诊断肝细胞癌的试剂盒。该试剂盒尚可以用于监测肝细胞癌的术后复发转移和判断预后。

用本发明提供的试剂盒单独诊断时，

1.EGFL7诊断肝细胞癌的灵敏度比AFP提高了9.6％；(72.8％ vs 63.2％)

2.特异度与AFP相当；(88.6％ vs 93.9％)

3.准确度比AFP提高2.2％；(80.6％ vs 78.4％)

4.EGFL7诊断曲线下面积比AFP提高4.0％；(0.902 vs 0.868)

5.AFP诊断肝细胞癌患者为阴性结果时，EGFL7对其诊断为阳性的概率达到了68.0％。(34/50)

如果用本发明提供的试剂盒与AFP平行诊断，则

1.两者平行诊断灵敏度比单用AFP提高了25.0％；(88.2％ vs 63.2％)

2.EGFL7与AFP平行诊断时，其诊断准确度提高了10.0％；(88.4％ vs 78.4％)

3.EGFL7与AFP平行诊断时，曲线下面积达到了0.967，比AFP单独诊断提高了11.4％。(0.967 vs 0.868)。

本发明提供的试剂盒对预后生存判断时，

1.EGFL7表达水平在肝细胞癌患者术后第10天就降至其截断值以下，复发转移时再次升高至截断值以上，具有术后复发监测的能力，且监测周期比较短；

2.EGFL7表达水平与肝细胞癌直径大小、Edmondson-Steiner分级、脉管浸润显著相关；

3.EGFL7高表达组患者术后总生存时间及无瘤生存时间显著短于EGFL7低表达组。

附图说明

图1.正常肝组织及肝细胞癌组织中EGFL7 mRNA及蛋白的表达水平A EGFL7mRNA在肝细胞癌，癌旁肝组织及正常肝组织中的表达水平；B EGFL7蛋白在肝细胞癌，癌旁肝组织及正常肝组织中的表达水平；C独立样本t检验显示，EGFL7在肝细胞癌组织中呈显著高表达。T：肝细胞癌组织；P：癌旁肝组织；NL：正常肝组织；M：Marker。

图2.免疫组化检测EGFL7在肝细胞癌及相应癌旁肝组织中的表达情况(SP法，×400)。A：肝细胞癌组织中的EGFL7阳性染色主要位于肝细胞癌细胞的胞浆内；B：癌旁肝组织中几无EGFL7的阳性表达；C：少数EGFL7阳性染色位于肝细胞癌组织的血管内皮细胞；D：肝海绵状血管瘤组织的血管内皮细胞则未见EGFL7表达。

图3.EGFL7 mRNA及蛋白在正常肝细胞系及肝细胞癌细胞系中的表达水平。A：EGFL7 mRNA在正常肝细胞系及肝细胞癌细胞系中的表达水平。B：EGFL7蛋白在正常肝细胞系及肝细胞癌细胞系中的表达水平。C：独立样本t检验显示肝细胞癌细胞系中EGFL7的表达水平明显高于正常肝细胞系，且EGFL7在高侵袭转移潜能的肝细胞癌细胞系中的表达水平更高。CCL13：正常肝细胞系；HepG2，MHCC97-L及HCCLM3：三种侵袭转移潜能依次升高的肝细胞癌细胞系；M：Marker。

图4.EGFL7高表达组及EGFL7低表达组肝细胞癌患者生存率的比较。A：EGFL7高表达组病人的总体生存时间明显短于低表达组(P＜0.05)；B：EGFL7高表达组病人的无瘤生存时间亦明显短于低表达组(P＜0.05)。

图5.血清EGFL7的标准蛋白拟合曲线。A：1g(血清EGFL7标准蛋白浓度)-吸光度值拟合曲线；B：血清EGFL7标准蛋白浓度-OD值标准曲线。

图6.肝细胞癌患者与正常人、慢性肝病、良性肝肿瘤及其它消化系肿瘤患者血清EGFL7含量的比较。

图7.血清EGFL7和AFP蛋白相关性分析。

图8.血清EGFL7、AFP独立及联合诊断肝细胞癌的受试者工作特征曲线(ROC曲线)。图中曲线的曲线下面积(AUC)越大，表示诊断价值越高。

图9.肝细胞癌患者及对照组患者手术前后血清EGFL7含量动态变化曲线。

图10.血清EGFL7高表达组与低表达组术后生存时间的比较。A：EGFL7高表达组患者术后无瘤生存时间显著短于EGFL7低表达组(P＝0.03)；B：EGFL7高表达组患者术后总生存时间显著短于EGFL7低表达组(P＝0.02)。

具体实施方式

本发明中提供具体实施内容，不能理解为对本发明的限制。根据本发明公开的发明内容，本领域技术人员可以做适当的变化，但其没有脱离本发明的内容。

实验材料

病人组织及临床病理资料的采集

肝细胞癌新鲜组织取自中南大学湘雅医院2005年11月～2006年9月间手术切除的31例肝细胞癌癌组织(注意避开坏死组织)和相对应的癌旁1cm外的非癌肝组织(癌旁肝组织)；正常肝组织取自5例肝血管瘤患者瘤旁肝脏组织，且均无乙型肝炎病毒感染及肝硬化。标本离体后取一部分立即液氮保存并随后转至-80℃深低温冰箱保存备用。另一部分以10％福尔马林固定，石蜡包埋、切片，进行HE或免疫组化染色。全部病例术前均未接受包括肝动脉化疗栓塞等在内的治疗。31例肝细胞癌中男27例，女4例；年龄25-62岁，中位年龄46岁。其中细胞分化程度为I～II级13例，III～IV级18例；肿瘤直径大于5cm的24例，直径小于或等于5cm的7例；有肉眼或镜下静脉浸润者19例，无静脉浸润者12例。另外，收集湘雅医院2000年10月至2004年7月之间行手术切除的肝细胞癌石蜡标本102例。全组病例术前均未接受包括肝动脉栓塞化疗在内的任何其它治疗，全部切片均经病理组织学检查证实诊断。

细胞系

本研究室采用的HCCLM3细胞系和MHCC97-L细胞系购自复旦大学肝细胞癌研究所；CCL13细胞系购自ATCC(美国标准生物品收藏中心)；HepG2细胞系由中南大学湘雅医院细胞实验中心惠赠。实验用DMEM、D-Hanks液、胰蛋白酶的配制参照《分子克隆》(第二版)。以上细胞系均采用低糖DMEM培基和特级胎牛血清，置于37℃和5％CO₂浓度培养。然后进行细胞的冻存、复苏及传代培养。

血清标本

血液样本来自通过湘雅伦理委员会批准并签订同意书的136例肝细胞癌患者(通过联合AFP、影像学和组织病理学等确诊)、34例慢性肝病患者、16例肝良性肿瘤组、62例胃肠癌组、以及132例健康血液捐献者。已诊断为非恶性肝病的病人血清，只有在收集后6个月无恶性疾病指征的情况下，才纳入本研究。

主要试剂和实验材料

96 well ELISA Microplates，PS，F-bottom MICROLON，med.Binding(Cat.655001，greinerbio-one，Germany)

EGFL7 Recombinant Protein(P01)(Cat.H00051162-P01，Abnova，Taiwan，China)

EGFL7 monoclonal antibody(M01)，clone 2H6(Cat.H00051162-M01，Abnova，Taiwan，China)

EGFL7 polyclonal antibody(H-90)(Cat.SC-66874，Santa Cruz，USA)

Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)Antibody，F(ab′)2 fragment，Human Serum Adsorbed andPeroxidase labeled(Cat.214-1516，KPL，USA)

可溶型单组分TMB底物溶液(Cat.PA107-01，天根生物有限公司，北京，中国)

1M H₂SO₄终止液(Cat.SC250815，生物晶美，中国)

含0.05％PBST的洗涤液

含4％BSA的封闭液

主要实验仪器

4℃、-20℃及-80℃冰箱

SPX生化培养箱

WD9405B水平摇床

ELX-808全自动酶标仪

实验方法

RT-PCR

组织及细胞总RNA提取，其主要步骤简述如下：剪取50-100mg新鲜组织，放入匀浆器中并加入1ml Trizol Reagent RNA提取试剂(美国Invitrogen公司)后在冰上匀浆至未见明显组织碎块。于冰上静置5分钟后匀浆液倒入EP管中，加入0.2ml氯仿，剧烈摇匀30秒，12000rpm离心10分钟。收集上层水相300ul于新的EP管，注意切勿吸取中间层的物质。加入0.3ml的异丙醇，振荡摇匀，冰上孵育5分钟。在12000rpm离心5分钟，弃上清，向EP管内加入0.7ml的75％的乙醇并振荡，12000rpm离心5分钟沉淀RNA，弃上清。重复用75％的乙醇沉淀RNA。将EP管倒立于滤纸上，空气干燥10分钟。加入30ul的DEPC处理水(上海生物工程公司)融解RNA。将所提取的RNA溶液行琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯下见到明显的5S，18S，28S的条带则认为合格。将合格的RNA溶液用DU640紫外分光光度计(Berkman公司)比色，计算浓度，剩余保存。

向培养细胞至融合度为80％的50ml培养瓶中加入1ml Trizol，吹打使混匀，冰上静置5-10min，裂解细胞。将裂解液倒于离心管中，加氯仿0.2ml，震荡15sec使混匀，室温2-3min后，12000rpm，4℃离心15min。吸取上层水相于另一1.5ml离心管中，加异丙醇0.5ml，混匀，室温静10min后，12000rpm，4℃离心10min；弃上清，75％乙醇洗涤RNA沉淀，7500rpm，4℃离心5min；弃除乙醇，空气干燥RNA，加入40ul DEPC处理水，用吸头反复吹打，并置55℃水浴使充分溶解。

cDNA合成。

cDNA合成步骤简述如下。在EP管中将总RNA2ug与Oliga(dT)(上海生物工程公司)0.5ug混合，加Depc处理水至总体积11ul，混匀后点动离心，于70℃孵育5分钟，置于冰上冷却。再向EP管中依次加入M-MLV 5×反应缓冲液5ul，10mMol/L的DNTP溶液(Gibco公司)1.5ul，RNA酶抑制物(Rnase inhibitor，Rnasin)(Gibco公司)2.5ul。反应液混匀后点动离心，于37℃孵育5分钟，置于冰上冷却。最后加入M-MLV逆转录酶(美国Promega公司)1ul。将此20微升的反应体系在42℃孵育60分钟后于70℃孵育10分钟。然后进行PCR扩增。PCR循环条件为：94℃变性5分钟，后继94℃变性50秒，48℃退火1分钟，72℃延伸1分钟，进行30个循环。PCR产物在2％(质量/体积)的琼脂糖凝胶中电泳，在紫外光下观察结果，当同时出现GAPDH(500bp)条带和EGFL7条带(282bp)则判断为阳性。用Eagle eye^TM II凝胶成象系统照相，并用Eagle eye^TM II图像分析系统对扩增产物条带的光密度进行分析，每例EGFL7 mRNA表达值以EGFL7光密度值/GAPDH光密度值表示。

Western blot

取500mg新鲜组织加入1.5ml细胞裂解液〔20mmol/L TrisH2Cl(PH7.4)，150mmol/LNaCl，1mmol/L EDTA(PH8.0)，1mmol/L MgCl2，1％NP-40，0.1％SDS，0.01％PMSF〕，匀浆器研磨组织提取总蛋白，按照BCA蛋白浓度测定试剂盒说明(Pierce公司，美国)进行蛋白样品定量，取100ug总蛋白100℃变性10min，以8％聚丙烯酰胺(Sigma公司，美国)凝胶通过垂直电泳槽仪(Bio-Rad公司，美国)电泳分离蛋白后经电转移槽湿转法至NC膜〔48mmol/L TrisH2Cl(PH8.4)，192mmol/L Glycini，20％Methanol〕。PBST配制的5％脱脂奶粉封闭1h，NC膜置入1∶200稀释的一抗山羊抗人EGFL7多克隆抗(Santa Cruz，美国)稀释液中37℃孵育30min，PBST洗膜30min，再置入1∶5000稀释的二抗(兔抗山羊IgG，KPL公司产品，美国)室温孵育2h，PBST洗涤NC膜30min后以化学发光试剂(Pierce公司)显影曝光摄片。同样采用Eagleeye II型图像分析仪(Stratagene公司，美国)对照片中的条带进行半定量分析，42kDa大小β-actin作为内参照(Sigma公司，美国)。

免疫组化

免疫组织化学分析采用链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结法(SP法)。山羊抗人EGFL7多克隆抗体(Santa Cruz公司，美国)工作浓度为1∶50。兔抗山羊二抗试剂盒(中杉金桥生物技术有限公司，中国北京)操作步骤参照其说明书。选用EDTA缓冲液(0.01M，pH＝8.0)经微波炉加热15min行抗原热修复。同时用兔血清封闭液代替一抗作为阴性对照。光学显微镜(Olympus公司，日本)下阅片及评分。染色判定标准参照Shimizu方法^[37]进行评定和积分。具体为：1、染色强度评分标准：细胞浆无显色，0分；胞浆呈云雾状淡黄色，1分；胞浆呈黄色颗粒状，2分；胞浆呈均匀深黄色，3分。2、阳性细胞所占比例评分标准：阳性细胞数≤10者，0分；10％～40％者，1分；40％～70％者，2分；≥70％者，3分。3、着色强度评分+阳性细胞所占比例评分＝总积分；4、总积分0～1分为阴性，大于2分为阳性；再将全组病例划为低表达组(总积分0～3分)及高表达组(总积分4～6分)比较预后情况。

改良双抗体夹心ELISA法

1.血清标本制备

抽取每位实验对象晨起空腹5ml外周静脉全血于医用无菌促凝管内，轻微振荡3次待血液凝固后置于4℃冰箱中静置8小时，然后于常温离心机离心20min(3000rpm)，选取无溶血及脂血标本，分装上层血清于无菌管内，并置于-80℃备用。

2.血清AFP含量测定

肝细胞癌患者、慢性肝病患者及正常人血清样本中AFP的含量均采用双盲的罗氏电化学发光法测定，正常参考值为0～20ng/ml。

3.血清EGFL7含量测定

所有肝细胞癌患者及对照组血清样本中EGFL7蛋白含量通过双抗体夹心ELISA法来检测，标本采集人员将待测血清按阿拉伯数字编写，检测人员不知道标本来源，在双盲条件下进行测定。

具体实验步骤如下：

1)取100μl EGFL7单克隆抗体稀释于9900μl无菌PBS溶液中，每孔中加入100μl稀释液，4℃过夜；

2)吸尽孔内液体，将酶标板倒扣于干净滤纸上拍干。然后每孔加入含0.05％PBST的洗涤液250μl，置于水平摇床上洗3次，每次3min，再次拍干酶标板；

3)每孔加入含有4％BSA的封闭液300μl，置于37℃生化培养箱中2h，然后重复2)步骤；

4)将血清进行稀释(用PBS以1∶250稀释)，每孔加入100μl血清稀释液，每个样品作复孔。取2μl重组EGFL7蛋白标准品加至400μl的PBS，然后作倍比稀释，共7个标准品。每个标准品作复孔，置于37℃生化培养箱中2h，再次重复2)步骤，洗板4次，每次3min；

5)取EGFL7单克隆抗体50μl稀释在9950μl PBS溶液中，每孔加入100μl该稀释液，置于37℃生化培养箱中2h，然后再次重复2)步骤，洗板5次，每次3min；

6)取HRP标记的山羊抗兔抗体5μl稀释在9995μl PBS溶液中，每孔加入100μl该稀释液，置于37℃生化培养箱中2h，然后再次重复2)步骤，洗板6次，每次3min；

7)每孔加入100μl TMB底物(避光)，置于37℃生化培养箱中显色30min；

8)每孔加入100μl的0.5M H₂SO₄终止液后，立即以酶标仪(主波长450nm，参比波长630nm)双波长读取OD值；

9)根据标准品作标准蛋白浓度-OD值标准曲线(浓度为横坐标，OD值为纵坐标)，根据公式计算出每个血清样品的EGFL7蛋白含量。

4.统计软件及方法

统计软件：SPSS 13.0统计软件

统计方法：

1)组间EGFL7表达水平的比较采用t检验和方差分析或者Wilcoxon秩和检验和Kruskall-Wallis H检验；

2)正态分布检验采用分位数图法(Q-Q法)；

3)ROC曲线及约登指数法确定截断值(cutoff value)；

4)方差齐性检验采用F检验和Levene检验；

5)配对EGFL7表达水平的比较采用重复测量设计资料的方差分析；

6)Spearman等级相关检验分析EGFL7与临床病理类型的关系；

7)Cox多元回归分析影响肝细胞癌预后的独立危险因素；

8)Kaplan-Meier曲线Log-Rank检验分析预后。

实施例1

EGFL7蛋白在肝细胞癌组织中的表达情况

前期研究已分别采用RT-PCR、Western-blot法检测了EGFL7在肝细胞癌组织及相应癌旁肝组织中的表达情况，结果发现EGFL7在肝细胞癌组织中显著性高表达(见图1)。

通过组织石蜡切片的免疫组化检测，发现EGFL7蛋白主要定位于肝细胞癌细胞的胞浆内并且其表达强度明显高于周围血管内皮中的表达强度(见图2)。

我们依据上述免疫组化的检测结果分析了EGFL7蛋白的表达水平与肝细胞癌临床病理特征的相关性。统计分析结果发现EGFL7在蛋白的表达水平与肿瘤结节数目和有无静脉浸润有关(P＜0.05)，而与患者性别、年龄、肿瘤大小、肿瘤分化程度、包膜以及肝硬化程度等无关。此结果与Western blotting结果相一致，亦提示EGFL7在肝细胞癌侵袭转移中发挥了重要作用

实施例2

EGFL7在肝细胞癌细胞系中的表达研究

进一步的细胞实验中，采用RT-PCR、Western-blot法检测了EGFL7在正常肝细胞系和肝细胞癌细胞系中的表达情况，结果发现肝细胞癌细胞系中EGFL7的表达水平明显高于正常肝细胞系，且EGFL7在高转移潜能的HCCLM3细胞系中的表达水平高于低转移潜能的HepG2及MHCC97-L细胞系(见图3)。因此，EGFL7作为一个新的肿瘤组织标志物对于肝细胞癌诊断及预后判断有着重要意义。

实施例3

EGFL7蛋白表达水平与临床预后的关系

根据免疫组化结果将102例肝细胞癌分为EGFL7高表达组和EGFL7低表达组。研究结果显示：EGFL7高表达组55例；EGFL7低表达组47例。EGFL7高表达组的中位生存时间为480天；EGFL7低表达组的中位生存时间为796天。EGFL7高表达组肝细胞癌患者的中位生存时间低于EGFL7低表达组肝细胞癌患者，两组之间术后生存率差异有显著性意义(P＜0.05)。EGFL7高表达组的中位无瘤生存时间为180天，EGFL7低表达组的中位无瘤生存时间为512天，两组之间术后无瘤生存率差异有显著性意义(P＜0.05)。此结果提示，EGFL7的高表达与肝细胞癌患者不良预后有关(见图4)。

实施例4

血清EGFL7检测有助于提高临床诊断肝细胞癌的能力

本实验采用双抗体夹心ELISA法来检测肝细胞癌患者血清EGFL7水平。在结果判读前需进行实验的线性分析，在每块酶标板上加入不同浓度的标准蛋白，然后绘制EGFL7的标准拟合曲线，由曲线可知EGFL7蛋白的浓度在某一范围内时与测得的OD值呈直线关系，计算相关指数R²值(见图5)。在检测的范围内将分析结果线性化，根据标准曲线公式计算出血清标本的浓度。

建立收集病人血清的实验方案，这些病人在中南大学湘雅医院接受治疗，并签署了同意书。通过使用改良夹心ELISA测量136例肝细胞癌患者、34例慢性肝病患者、16例肝良性肿瘤患者、62例胃肠癌患者以及132例正常人血清中EGFL7的水平进行了研究。发现132例正常人血清EGFL7浓度为1.75±1.17μg/ml，34例慢性肝病患者血清EGFL7浓度为2.61±1.32μg/ml，16例肝脏良性肿瘤患者(10例肝血管瘤患者、3例肝脏纤维瘤样增生、2例肝囊腺瘤、1例肝脏局灶性结节性增生)血清EGFL7浓度为2.14±1.26μg/ml，62例胃肠道恶性肿瘤患者血清EGFL7浓度为2.62±1.62μg/ml，136例肝细胞癌患者血清EGFL7浓度为4.19±1.76ug/ml。组间采用LSD检验分析发现对照组与肝细胞癌组比较有显性差异(P＜0.001)。正常人与慢性肝病和胃肠道恶性肿瘤也存在显著差异(P＜0.05)，但正常人与肝脏良性肿瘤之间无统计学差异(P＞0.05)，且慢性肝病、肝脏良性肿瘤和胃肠道恶性肿瘤两两之间也无统计学差异(P＞0.05)(见图6)。

我们采用ELISA法检测了380例肝细胞癌和对照组样本，发现肝细胞癌组EGFL7含量显著高于慢性肝病组、肝良性肿瘤组、胃肠癌组及正常组(P＜0.001)，说明EGFL7具有较好的肝细胞癌组织特异性，可用来诊断肝细胞癌。根据136例肝细胞癌患者和132例正常人EGFL7表达水平，绘制ROC曲线，以约登指数法计算截断值，确定为3100ng/ml。并以此值为界将肝细胞癌患者分为EGFL7阳性表达组和EGFL7阴性表达组；同样根据临床AFP正常值范围确定其截断值为20ng/ml，同样以此值为界将肝细胞癌患者分为AFP阳性表达组和AFP阴性表达组。分别计算肝细胞癌组(136例)和正常组(132例)中EGFL7和AFP表达情况，然后评价其诊断肝细胞癌的效能(见表1)。

表1.EGFL7与AFP诊断HCC效能评价(％)

由上表可知：EGFL7的诊断灵敏度明显高于AFP，即EGFL7诊断的漏诊率低于AFP。EGFL7诊断准确度高于AFP，是指EGFL7诊断试验正确诊断的肝细胞癌病例数与非肝细胞癌病例数之和占所有人数之比率要高于AFP。EGFL7阴性似然比低于AFP，表示EGFL7诊断试验错判阴性的可能性与正确判断阴性的可能性之比要小于AFP。阴性似然比越小，表示诊断试验的诊断价值就越高。预测值又称诊断价值，表示诊断结果的实际临床意义，EGFL7的阴性预测值高于AFP，说明EGFL7诊断试验阴性结果中真正无肝细胞癌的概率要高于AFP。在此基础上，我们分析了两种方法诊断肝细胞癌的相关性，经pearson检验肝细胞癌组患者中血清EGFL7与AFP含量相关性不具有统计学意义(r＝0.004，P＝0.44)，因此可将EGFL7与AFP进行联合诊断(见图7)。由上表可知，平行诊断其灵敏度、准确度及阴性预测值都有了较大的提高，阴性似然比亦明显降低了。

我们进一步分析AFP诊断肝细胞癌患者为阴性结果时，EGFL7对其诊断为阳性的概率却达到了68％，这说明了EGFL7可显著提高AFP阴性肝细胞癌的检出率；而AFP诊断试验是阳性时，EGFL7也是阳性的概率达到了75.6％，提示两者诊断一致率较高。绘制EGFL7单独、AFP单独及联合诊断原发性肝细胞癌的ROC曲线(见图8)，计算曲线下面积，AUC(EGFL7)＝0.902，AUC(AFP)＝0.868，AUC(联合)＝0.967，可见EGFL7独立诊断其曲线下面积大于AFP，联合诊断曲线下面积达到最大。曲线下面积越大，表示其诊断效能越高。

实施例5

血清EGFL7对肝细胞癌术后复发转移患者具有监测的能力

肝细胞癌患者术后EGFL7表达水平明显下调，术后第10天就降至其截断值以下，监测周期比较短；而AFP表达水平术后第10天未降至正常值。肝细胞癌复发转移时EGFL7表达水平再次显著升高，且高于其截断值，上升幅度明显大于AFP，提示EGFL7比AFP具有更好的术后复发监测能力(见图9)。

实施例6

血清EGFL7对肝细胞癌患者具有预后判断的能力

我们分析了110例肝细胞癌患者血清EGFL7表达水平与临床病理特征的关系时，结果显示肿瘤直径＞5cm的肝细胞癌患者血清中EGFL7表达水平明显高于肿瘤直径≤5cm的肝细胞癌患者(P＝0.041)；Edmondson-Steiner分级III-IV级的肝细胞癌患者血清中EGFL7表达水平明显高于Edmon dson-Steiner分级I-II级的肝细胞癌患者(P＝0.021)，存在静脉浸润的肝细胞癌患者血清中EGFL7表达水平明显高于无静脉浸润的肝细胞癌患者(P＝0.004)。而与性别、年龄、乙肝病史、肝硬化程度、有无包膜形成、结节数等临床病理特征无关(P＞0.05)(见表2)。同时在分析EGFL7表达水平与临床病理特征的相关性分析时，提示EGFL7的表达水平与肿瘤直径、Edmondson-Steiner分级、脉管浸润呈正相关。在肝细胞癌患者预后Cox回归单、多因素分析时，结果都提示了EGFL7表达水平和脉管浸润均为影响肝细胞癌患者无瘤生存时间和总生存时间的危险因素(P＜0.05)，而AFP表达水平不影响肝细胞癌患者无瘤生存时间和总生存时间(P＞0.05)。根据EGFL7截断值，将96例肝细胞癌患者分为EGFL7高表达组(n＝53)和低表达组(n＝43)，进一步行log-rank检验，发现EGFL7高表达组患者术后总生存时间显著短于EGFL7低表达组(中位生存时间470天vs 680天；P＝0.02)；EGFL7高表达组患者术后无瘤生存时间显著短于EGFL7低表达组(中位生存时间354天vs 600天；P＝0.03)(见图10)。

表2.110例患者血清EGFL7水平与肝癌临床病理特征的关系(mean±S)

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Claims (18)

1.一种通过检测样品中EGFL7来诊断肝细胞癌的试剂盒，其特征在于包括能与EGFL7蛋白或其片段产生特异性结合的抗体或其片段。

2.根据权利要求1所述的诊断肝细胞癌的试剂盒，其特征在于还包括检测AFP的特异性抗体或其它用于检测AFP的试剂或材料。

3.根据权利要求1至2之一所述的诊断肝细胞癌的试剂盒，其特征在于该试剂盒所检测的样品为体液。

4.根据权利要求3所述的诊断肝细胞癌的试剂盒，其特征在于所述的体液是选自血清、血浆或全血，优选血清或血浆。

5.根据权利要求3或4所述的诊断肝细胞癌的试剂盒，其特征在于还包括确定检测结果为阳性的EGFL7截断值，所述的截断值为3100ng/ml。

6.根据权利要求3所述的诊断肝细胞癌的试剂盒，其特征在于所述的抗体或片段为单克隆抗体。

7.根据权利要求2所述的诊断肝细胞癌的试剂盒，其特征在于还包括诊断标准，该诊断为阳性的标准是任意抗体检测为阳性时，即诊断为肝细胞癌。

8.一种通过检测样品中EGFL7来诊断肝细胞癌复发转移的试剂盒，其特征在于包括能与EGFL7蛋白或其片段产生特异性结合的抗体或其片段。

9.根据权利要求8所述的诊断肝细胞癌复发转移的试剂盒，其特征在于该试剂盒所检测的样品为体液。

10.根据权利要求9所述的诊断肝细胞癌复发的试剂盒，其特征在于所述的体液是血清、血浆或全血，优选血清或血浆。

11.根据权利要求9或10所述的诊断肝细胞癌复发转移的试剂盒，其特征在于还包括确定检测结果为阳性的EGFL7截断值，所述的截断值为3100ng/ml。

12.根据权利要求7所述的诊断肝细胞癌复发转移的试剂盒，其特征在于所述的抗体或片段为单克隆抗体。

13.一种通过检测样品中EGFL7来预测肝细胞癌手术预后的试剂盒，其特征在于包括能与EGFL7蛋白或其片段产生特异性结合的抗体或其片段。

14.根据权利要求13所述的诊断肝细胞癌手术预后的试剂盒，其特征在于该试剂盒所检测的样品为体液。

15.根据权利要求14所述的诊断肝细胞癌手术预后的试剂盒，其特征在于所述的体液是血清、血浆或全血，优选血清或血浆。

16.根据权利要求14或15所述的诊断肝细胞癌手术预后的试剂盒，其特征在于还包括确定检测结果为阳性的EGFL7截断值，所述的截断值为3100ng/ml。

17.根据权利要求11所述的诊断肝细胞癌手术预后的试剂盒，其特征在于所述的抗体或片段为单克隆抗体。

18.抗EGFL7或其片段的特异性抗体或其片段在制备诊断肝细胞癌、诊断肝细胞癌复发转移和判断肝细胞癌手术预后的试剂盒中的应用。

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