CN104039962B - 乳腺癌诊断和预示的标志物 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了SEQ ID No.48所示的CST1基因剪切子和SEQ ID No.52所示CST1基因编码蛋白Cystatin SN作为乳腺癌诊断和预示标志物的应用，通过测定所述标志物的表达量，可以进行乳腺癌或乳腺癌组织转移的鉴别诊断和/或易感性分析，乳腺癌或乳腺癌组织转移治疗药物、治疗方法、治疗疗效及预后的评估，相关人群乳腺癌或乳腺癌组织转移患病风险的评估等，灵敏度高，特异性好，结果准确可靠；本发明还公开了所述CST1基因剪切子的捕获剂和Cystatin SN的捕获剂在制备乳腺癌诊断和预示试剂、试剂盒及芯片中的应用，并公开了包含上述捕获剂的乳腺癌诊断和预示试剂盒、芯片。

Description

乳腺癌诊断和预示的标志物
技术领域
本发明属于生物医学技术领域，涉及一种可用于肿瘤诊断和预示的分子标志物，以及用于检测该分子标志物的试剂、试剂盒和芯片。
背景技术
据世界卫生组织(WHO)统计，全世界每年约有120万妇女罹患乳腺癌，约有54万乳腺癌患者死亡，且乳腺癌的发病率及致死率还在逐年上升。因此，乳腺癌的防治是目前亟待解决的问题，包括如何更早发现、及时干预，如何实现疗效评估和监测，以及如何对术后患者进行实时准确的复发监控等。其中，灵敏度高、特异性强的乳腺癌诊断试剂的研制是提高乳腺癌早期检出率、改善患者预后的关键之一。
近年来，随着对肿瘤发病机理研究的不断深入，发现Cystatin家族作为组织蛋白酶主要是半胱氨酸蛋白酶的内源性抑制剂，在肿瘤的发生、发展、浸润和转移过程中起着非常重要的作用。研究结果显示，Cystatin家族的几个成员在不同肿瘤中的表达水平有所上升，例如CystatinC在卵巢癌和头颈部癌症中的表达有不同水平的上升，stefinA在非小细胞肺癌中的表达水平有所增加，CystatinF在多种肿瘤中的表达水平都有显著增加，很可能是由于在肿瘤发生、发展过程中需要组织蛋白酶的参与，先诱导其表达量增加，再激活机体本身的应激机制，导致Cystatin的表达量上升以抑制过盛的组织蛋白酶活性。但Cystatin的表达量并不与肿瘤的发展成正相关关系，例如在胶质瘤中，CystatinC的低表达意味着疾病的晚期，患者的生存期较短，且易于复发，这可能是到了肿瘤的后期阶段，又会有一些其他的机制对Cystatin的水平进行调控，以促进肿瘤的进一步恶化。
CystatinSN是人类Cystatin家族成员，由CST1基因编码，含141个氨基酸，分子中有两个二硫键，分子量为16.4Kda，为典型的分泌蛋白，分布于多种体液和分泌物中，如眼泪、唾液、血清、血浆等。文献报道，CST1在胃癌组织中的表达量高于正常胃粘膜组织，在胃癌细胞系中的表达部位与胃癌组织较一致，且表达率随细胞系的分化程度降低而降低；临床资料分析表明，CST1的表达与浸润深度、远处转移以及TNM分期相关；生存分析表明，CST1表达阳性组的5年生存率显著高于无表达组；Cox回归分析表明，CST1是一个独立预后因子；从而提示CST1可能在胃癌的发生、发展过程中发挥类似肿瘤抑制因子的作用。但迄今为止，CST1与乳腺癌的关系尚未见文献报道。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于研究CST1在乳腺癌中的表达情况，并分析其与乳腺癌临床病理参数和生物学行为的关系，进而发现CST1在乳腺癌发生、发展、转移过程中所起的作用。
首先，从mRNA水平，本发明比较了CST1在人体不同组织中的表达，发现CST1在除唾液腺外的人体正常组织中均低表达，这对于CST1用于病理条件下检测极为有利。接着，本发明比较了CST124、CST1、CST2、CST4在乳腺癌与癌旁组织手术标本中的表达差异，发现CST1在乳腺癌与癌旁组织中的表达差异最大。由于CST1mRNA(SEQIDNo.44)选择性剪切形成2种剪切子，第一种剪切子(SEQIDNo.48)包含CST1外显子1(SEQIDNo.45)、外显子2(SEQIDNo.46)和外显子3(SEQIDNo.47)，第二种剪切子(SEQIDNo.49)仅包含CST1外显子1(SEQIDNo.45)和外显子2(SEQIDNo.46)，本发明接着比较了CST1两种剪切子在乳腺癌与癌旁组织手术标本中的表达差异，发现第一种剪切子在癌与癌旁组织中的表达差异程度优于第二种剪切子。接着，本发明分别比较了CST1第一种剪切子在乳腺癌、癌旁及正常组织手术标本，乳腺癌、乳腺炎与正常组织穿刺标本，乳腺癌转移阳性淋巴结与阴性淋巴结，乳腺癌、乳腺炎患者与正常人血浆循环(cell-free)RNA中的表达差异，发现CST1第一种剪切子在乳腺癌及乳腺癌转移组织中异常高表达，通过测定其表达量，可以将乳腺癌、癌旁与正常组织，乳腺癌转移阳性组织与阴性组织区分开来，灵敏度高，特异性好。
再次，从蛋白水平，本发明比较了CST1编码蛋白CystatinSN(氨基酸序列如SEQIDNo.52所示，编码基因序列如SEQIDNo.53所示)在乳腺癌细胞株培养上清与正常人血清、乳腺癌患者血清与正常人血清中的表达差异，发现CystatinSN在乳腺癌细胞株培养上清与乳腺癌患者血清中异常高表达，通过测定其表达量，可以将乳腺癌细胞株培养上清与正常人血清、乳腺癌患者血清与正常人血清区分开来，灵敏度高，特异性好。
综合上述研究结果，CST1第一种剪切子和CystatinSN可以作为乳腺癌诊断和预示的分子标志物应用。根据本领域的公知常识，CystatinSN的表位肽也同样可以作为乳腺癌诊断和预示的分子标志物应用，CystatinSN表位肽的氨基酸序列可以如SEQIDNo.54所示(即去除CystatinSN前端的分泌信号肽序列)。
通过测定上述分子标志物的表达量，可以进行乳腺癌的诊断和预示，包括乳腺癌或乳腺癌组织转移的鉴别诊断和/或易感性分析，乳腺癌或乳腺癌组织转移治疗药物、治疗方法、治疗疗效及预后的评估，相关人群乳腺癌或乳腺癌组织转移患病风险的评估等。例如，方法之一：测定待测样品中CST1第一种剪切子或CystatinSN的含量或表达水平，将检测结果与阈值进行比较，如果超过阈值则判断为阳性；所述阈值可通过对比正常人与乳腺癌患者体液或组织中CST1第一种剪切子或CystatinSN的含量或表达水平统计得到。
测定上述分子标志物的表达量需要使用检测试剂、试剂盒或检测芯片等。因此，本发明进一步研究了上述分子标志物的检测试剂、试剂盒和检测芯片，以用于乳腺癌诊断和预示。
检测mRNA表达的方法有很多种，包括但不限于多聚酶链式反应(polymerasechainreaction，PCR)、实时定量PCR(quantitativereal-timePCR)、基于核酸序列扩增法(NucleicAcidbasedAmplificatin，NASBA)、转录介导的扩增(Transcription-medianamplification，TMA)、连接酶链反应(Ligasechainreaction，LCR)、适温链置换反应(thermophilicstranddisplacementamplification，tSDA)等。根据上述检测方法，只要特异性识别CST1第一种剪切子或其cDNA的引物或探针(统称为CST1第一种剪切子的捕获剂)都可以制成乳腺癌诊断和预示试剂应用。本发明优选特异性识别CST1外显子1的引物或探针或特异性识别CST1外显子2和3的引物或探针，更优选特异性识别CST1外显子1的引物或探针。例如，所述引物优选为核苷酸序列如SEQIDNo.1～2、4～21、34和39～42所示的至少一种，更优选如SEQIDNo.1和SEQIDNo.2所示；所述探针优选为核苷酸序列如SEQIDNo.3、35～38和43所示的至少一种，更优选如SEQIDNo.3所示。
检测蛋白表达的方法有很多种，包括但不限于酶联免疫吸附测定(ELISA)例如竞争性ELISA和双抗夹心ELISA、免疫印迹、ELISA和免疫印迹的组合等。根据上述检测方法，抗CystatinSN的抗体(统称为CystatinSN的捕获剂)都可以制成乳腺癌诊断和预示试剂应用。所述抗体可以是多克隆抗体或单克隆抗体，可以被各种类型的酶如碱性磷酸酶、荧光素酶、过氧化物酶、β-半乳糖苷酶以及各种荧光化合物如荧光素等标记，也可以被生物素标记，再利用亲合素-酶复合物放大反应信号。当标记为酶时，可通过添加酶作用底物使光吸收发生变化而进行定量。当标记为荧光化合物时，可通过用紫外光激发使其发射荧光而进行定量。
为了检测更方便、快速，上述检测试剂可以多种组合或与其它辅助检测试剂组合制成乳腺癌诊断和预示试剂盒。商业化的或文献报道的含有上述检测试剂的试剂盒也可以直接制成乳腺癌诊断和预示试剂盒应用。
作为一种优选的技术方案，基于TaqMan水解探针法实时PCR的CST1第一种剪切子检测试剂盒至少包含特异性识别CST1基因第一种剪切子的cDNA的1对引物和1条探针，所述引物的核苷酸序列如SEQIDNo.1和SEQIDNo.2所示，所述探针的核苷酸序列如SEQIDNo.3所示，探针的5’端用荧光基团标记，3’端用淬灭基团标记。
作为一种优选的技术方案，基于染料法实时PCR的CST1第一种剪切子检测试剂盒至少包含特异性识别CST1基因第一种剪切子的cDNA的1对引物，所述CST1基因剪切子的捕获剂为特异性识别CST1基因剪切子的cDNA的引物，所述引物的核苷酸序列如SEQIDNo.1～2所示，或者如SEQIDNo.4～5所示，或者如SEQIDNo.6～7所示，或者如SEQIDNo.8～9所示，或者如SEQIDNo.10～11所示，或者如SEQIDNo.12～13所示，或者如SEQIDNo.14～15所示，或者如SEQIDNo.16～17所示，或者如SEQIDNo.18～19所示，或者如SEQIDNo.20～21所示。
作为一种优选的技术方案，基于NASBA或TMA的CST1第一种剪切子检测试剂盒至少包含特异性识别CST1基因第一种剪切子的cDNA的1对引物和1条探针，所述引物的核苷酸序列如SEQIDNo.34和SEQIDNo.2所示，所述探针的核苷酸序列如SEQIDNo.3所示，探针的5’端用荧光基团标记，3’端用淬灭基团标记。
作为一种优选的技术方案，基于LCR的CST1第一种剪切子检测试剂盒至少包含特异性识别CST1基因第一种剪切子的4条探针，所述探针的核苷酸序列如SEQIDNo.35～40所示，每条探针的5’端用半抗原标记。
作为一种优选的技术方案，基于tSDA的CST1第一种剪切子检测试剂盒至少包含特异性识别CST1基因第一种剪切子的cDNA的2对引物和1条探针，所述引物的核苷酸序列如SEQIDNo.39～44所示，所述探针的核苷酸序列如SEQIDNo.43所示，探针的5’端用放射性同位素标记。
在上述CST1第一种剪切子检测试剂盒中，还可以视情况加入一种或多种辅助检测试剂，所述辅助试剂包括但不限于：①使所述引物对应的扩增子可视化的反应试剂，例如通过琼脂糖凝胶电泳法、酶联凝胶法、化学发光法、原位杂交法、荧光检测法等使扩增子可视化的试剂；②RNA提取试剂；③逆转录试剂；④cDNA扩增试剂，例如PCR、实时定量PCR、NASBA、TMA、LCR、tSDA的相关试剂；⑤制备标准曲线所用的标准品，例如包含CST1第一种剪切子扩增子的重组质粒；⑥阳性对照品，例如人乳腺癌细胞株HCC1937、SK-BR-3、MCF-7；⑦阴性对照品，例如人正常乳腺细胞Hs578Bst。
作为一种优选的技术方案，基于竞争性ELISA的CystatinSN检测试剂盒至少包含CystatinSN抗原、抗CystatinSN单克隆抗体、酶标二抗和酶作用底物。用CystatinSN抗原包被ELISA平板，待测样品与抗CystatinSN单克隆抗体依次加于平板进行孵育，通过报告组分(酶标二抗和酶作用底物)检测结合在平板上的抗CystatinSN单克隆抗体的量，据此确定样品中CystatinSN的量。
作为一种优选的技术方案，基于双抗夹心ELISA的CystatinSN检测试剂盒至少包含抗CystatinSN单克隆抗体、生物素标记的抗CystatinSN多克隆抗体、亲合素-酶复合物和酶作用底物。用CystatinSN单克隆抗体包被平板，待测样品和生物素标记的抗CystatinSN多克隆抗体依次加于平板进行孵育，通过报告组分(亲合素-酶复合物和酶作用底物)检测结合在平板上的抗CystatinSN单克隆抗体的量，据此确定样品中CystatinSN的量。
在上述CystatinSN检测试剂盒中，还可以加入一种或多种辅助检测试剂，所述辅助试剂包括但不限于：①封闭液；②抗体稀释液；③洗涤缓冲液；④显色终止液；⑤制备标准曲线所用的CystatinSN标准品。
为了检测更方便、快速，特异性识别CST1第一种剪切子或其cDNA的探针还可以固定在固相载体表面制成乳腺癌诊断和预示芯片。商业化的或文献报道的固定有上述探针的芯片也可以直接制成乳腺癌诊断和预示芯片应用。
本发明的检测试剂、试剂盒或芯片可用于判断乳腺癌是否易感或形成，进行乳腺癌pTNM分期，评估乳腺癌进展或治疗效果，判断是否转移、复发。受检样品可包括手术组织、穿刺组织、淋巴结组织、骨髓、血清样品、血浆样品、全血样品、血液级分样品、尿样等。受试者可以是因乳房不适就医者、有家族性乳腺癌病史的人群或乳腺癌患者等。
本发明的有益效果在于：本发明公开了SEQIDNo.48所示的CST1基因剪切子和SEQIDNo.52所示的CST1基因编码蛋白CystatinSN作为乳腺癌诊断和预示的分子标志物的应用，通过测定所述分子标志物的表达量，可以进行乳腺癌或乳腺癌组织转移的鉴别诊断和/或易感性分析，乳腺癌或乳腺癌组织转移治疗药物、治疗方法、治疗疗效及预后的评估，相关人群乳腺癌或乳腺癌组织转移患病风险的评估等，灵敏度高，特异性好，结果准确可靠；本发明还公开了所述CST1基因剪切子的捕获剂和CystatinSN的捕获剂在制备乳腺癌诊断和预示试剂、试剂盒及芯片中的应用，并公开了包含上述捕获剂的乳腺癌诊断和预示试剂盒、芯片。
附图说明
图1为包含CST1第一种剪切子扩增子的重组质粒(pMD18-T-CST1)图谱。
图2为CST1基因在人体正常组织(扁桃体、垂体后叶、甲状腺、唾液腺、骨骼肌、骨髓、除去红细胞和血小板的外周血、肺、胃、肝脏、心脏、肾、肾上腺、肠、结肠、胰脏、脾脏、膀胱、前列腺、乳腺、卵巢、子宫、胎盘和睾丸)、人乳腺癌细胞株(HCC1937、SK-BR-3、和MCF-7)及人正常乳腺细胞株Hs578Bst中的表达情况。
图3为染料法实时定量PCR检测CST124、CST1、CST2、CST4在乳腺癌及癌旁组织手术样本中的表达差异。
图4为染料法实时定量PCR检测ACTB在乳腺癌及癌旁组织手术样本中的表达，N1～N20和T1～T20分别表示20对乳腺癌、癌旁组织配对样本。
图5为染料法实时定量PCR检测CST1第一种剪切子(splicel)、第二种剪切子(splice2)在乳腺癌及癌旁组织手术样本中的表达差异。
图6为实时PCR绝对定量法检测CST1第一种剪切子在乳腺癌、癌旁及正常组织手术样本中的表达差异。
图7为实时PCR绝对定量法检测CST1第一种剪切子在乳腺癌及乳腺炎穿刺样本中的表达差异。
图8为实时PCR绝对定量法检测CST1第一种剪切子在乳腺癌转移阳性淋巴结和阴性淋巴结中的表达差异。
图9为实时PCR绝对定量法检测CST1第一种剪切子在乳腺癌患者、乳腺炎患者和正常人血浆循环(cell-free)RNA中的表达差异。
图10为实时PCR绝对定量法检测的受试者工作特征曲线(receiveroperatorcharacteristiccurve，ROC曲线)。
图11为连接酶链反应(Ligasechainreaction，LCR)检测CST1第一种剪切子在乳腺癌患者、乳腺炎患者和正常人血浆循环RNA中的表达差异。
图12为适温链置换反应(thermophilicstranddisplacementamplification，tSDA)检测CST1第一种剪切子在乳腺癌患者、乳腺炎患者和正常人血浆循环RNA中的表达差异。
图13为核酸序列扩增法(NucleicAcidbasedAmplificatin，NASBA)检测CST1第一种剪切子在乳腺癌患者、乳腺炎患者和正常人尿液循环RNA中的表达差异。
图14为乳腺癌患者外周血CST1第一种剪切子表达水平检测与细胞学检测对比。
图15为乳腺癌患者骨髓CST1第一种剪切子表达水平检测与细胞学检测对比。
图16为转录介导的扩增(Transcription-mediatedamplification，TMA)检测CST1第一种剪切子在乳腺癌不同pTNM分期血浆循环RNA中的表达差异。
图17为CystatinSN在乳腺癌细胞株培养上清和正常人血清中的表达差异。
图18为CystatinSN在正常人血清和乳腺癌患者血清中的表达差异。
图19为竞争ELISA法测定正常人和乳腺癌患者血清中CystatinSN的表达差异。
图20为双抗夹心ELISA法测定正常人和乳腺癌患者血清中CystatinSN的表达差异。
图21为ELISA测定乳腺癌患者血清CystatinSN和癌胚抗原(CEA)的灵敏度和特异性比较。
图22为乳腺癌患者经治疗后高于CystatinSN蛋白表达中位数组及低于该中位数组的无病生存曲线。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明的优选实施例进行详细的描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第三版，J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译，科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另有说明，优选实施例中所述百分比均为质量百分比。
(一)mRNA水平
优选实施例中所用标本均是在与病人签署知情同意书后按医院规定途径获得。穿刺活检获取的病理部位标本与非病理部位样本作为对比。手术中获取的淋巴结等样本立即提取RNA或置于液氮或RNAlater(Ambion公司)中保存；外周血、骨髓或尿液样本先在4℃、4000rpm条件下离心20分钟，取上清，再在4℃、13000rpm条件下离心10分钟，分离上清和沉淀，立即提取RNA或置-20～-80℃保存。
实施例1.人体不同组织中的CST1表达差异
本实施例中使用的人体组织标本除正常乳腺组织标本为发明人从合作医院采集外，其它各组织标本均从正规商业渠道获得。采用Affymetrix的核苷酸芯片HG-U95Av检测人体不同组织标本中CST1mRNA的相对表达量，具体操作参照核苷酸芯片说明书，相对表达量的值为通过管家基因β-actin荧光值进行归一化处理后的标准化信号值。检测结果如图2所示，CST1除在唾液腺中的表达量较高外，在其它组织中均不表达，说明CST1表达在正常组织中的背景值很低，这对CST1用于病理条件下检测极为有利。此外，CST1在人乳腺癌细胞株HCC1937、SK-BR-3和MCF-7中过表达，在人正常乳腺细胞Hs578Bst中不表达，说明CST1极有可能作为乳腺癌分子诊断的标志物。
实施例2.乳腺癌及癌旁组织手术样本中CST124、CST1、CST2、CST4的表达差异
采用染料法实时定量PCR分别检测20对乳腺癌、癌旁组织手术样本中CST124、CST1、CST2、CST4mRNA的相对表达量。样本总RNA的提取采用Trizol试剂。RNA逆转录为cDNA采用商业化的逆转录试剂盒并按照试剂盒说明书进行操作。目的基因的PCR扩增引物序列见表1。荧光染料为SYBRGreen，EveGreen，LCGreen等。检测结果如图3所示，可见CST1在乳腺癌及癌旁组织中的表达量差异最大。
表1CST124、CST1、CST2、CST4的PCR扩增引物序列
实施例3.乳腺癌及癌旁组织手术样本中CST1第一种剪切子、第二种剪切子的表达差异
首先，采用染料法实时定量PCR检测20对乳腺癌、癌旁组织手术样本中管家基因ACTB的表达量。检测结果如图4所示，各样本中ACTB的CP(crosspoint)值基本一致。然后，采用染料法实时定量PCR检测CST1第一种剪切子、第二种剪切子在20对乳腺癌、癌旁组织手术样本中癌旁与对应癌组织的CP值之差的中位数，具体方法和引物序列参照实施例2。检测结果如图5所示，CST1第一种剪切子在乳腺癌及癌旁组织中的表达量差异明显优于第二种剪切子，提示CST1第一种剪切子在判别是否为癌时更具有优越性。
实施例4.乳腺癌、癌旁及正常组织手术样本中CST1第一种剪切子的表达差异
采用实时PCR绝对定量法检测CST1第一种剪切子在100例乳腺癌、癌旁及正常组织手术样本中的表达差异，引物序列如SEQIDNo.1和SEQIDNo.2所示，扩增子序列如SEQIDNo.50所示。检测结果如图6所示，CST1第一种剪切子在乳腺恶性病理条件下特异性高表达，而在癌旁及正常组织低表达，癌标本拷贝的中位数是正常组织标本拷贝中位数的15.6倍；从223.20拷贝处划线，可将癌组织与正常组织区分开来，因此，223.20拷贝可作为手术取样组织样本乳腺癌诊断的一个参考值。
实施例5.乳腺癌及乳腺炎穿刺样本中CST1第一种剪切子的表达差异
穿刺取样与手术取样的样本具有较大差别，主要表现在穿刺取样的样本中乳腺癌细胞的比例变动较大，有时可能仅占到整块样本的很小一部分，有时甚至没有。因此，本实施例采用实时PCR绝对定量法检测了CST1第一种剪切子在40例乳腺癌、乳腺炎患者穿刺样本中的表达差异，引物序列如SEQIDNo.1和SEQIDNo.2所示。检测结果如图7所示，CST1第一种剪切子在乳腺癌标本中特异性高表达，而在乳腺炎标本中低表达，癌标本拷贝的中位数是炎标本拷贝中位数的11.0倍；从120.66拷贝处划线，可将癌与炎区分开来，因此，120.66拷贝可作为穿刺取样样本乳腺癌诊断的一个参考值。
实施例6.乳腺癌转移阳性淋巴结和阴性淋巴结中CST1第一种剪切子的表达差异
手术获得经病理证明为乳腺癌转移阳性的淋巴结30枚，且转移灶大小不等。病理阴性淋巴结30枚主要取自早期乳腺癌患者，尽可能减少病理诊断阴性但实际有微转移存在的淋巴结，以避免实验误差。采用实时PCR绝对定量法检测CST1第一种剪切子在乳腺癌转移阳性淋巴结和阴性淋巴结中的表达差异，引物序列如SEQIDNo.1和SEQIDNo.2所示，扩增子序列如SEQIDNo.50所示。检测结果如图8所示，CST1第一种剪切子在转移阳性淋巴结中高表达，而在阴性淋巴结中低表达，转移阳性淋巴结标本拷贝的中位数是阴性淋巴结标本拷贝中位数的6.3倍；从82.45拷贝处划线，阴性淋巴结中有2例检出CST1第一种剪切子弱阳性，经连续切片细致观察发现，这2例阴性淋巴结有微转移的存在，因此，82.45拷贝不仅100％区分了细胞学检测结果，而且能检测出细胞学不能检出的有微转移存在的淋巴结，CST1第一种剪切子拷贝数检测相比细胞学检测具有更高的灵敏度。
实施例7.PCR检测乳腺癌、炎患者及正常人血浆循环RNA中CST1第一种剪切子的表达差异
采用商品化试剂盒抽提血浆中的循环(Cell-free)RNA，实时PCR绝对定量法检测50例乳腺癌患者、30例乳腺炎患者与30例正常人血浆循环RNA中CST1第一种剪切子的表达差异，引物序列如SEQIDNo.1和SEQIDNo.2所示，扩增子序列如SEQIDNo.50所示。结果如图9所示，CST1第一种剪切子在癌中拷贝的中位数分别是炎的8.8倍和正常的32倍；从65.23拷贝处划线，可将癌、炎和正常区分开来。图10的ROC曲线显示基于CST1第一种剪切子表达水平诊断乳腺癌的方法具有较高的灵敏度和特异性，曲线下面积为0.987，因此，CST1第一剪切子可作为非侵入性血浆样本乳腺癌诊断的特异性标志物。
实施例8.LCR检测乳腺癌、炎患者及正常人血浆循环RNA中CST1第一种剪切子的表达差异
采用商品化试剂盒抽提血浆中的循环RNA，LCR检测50例乳腺癌患者、30例乳腺炎患者与30例正常人血浆循环RNA中CST1第一种剪切子的表达差异，引物序列如SEQIDNo.1和SEQIDNo.2所示，扩增子序列如SEQIDNo.50所示。结果如图11所示，CST1第一种剪切子在癌中相对荧光强度(relativelightunits，RLU)的中位数分别是炎的12.38倍和正常的40.12倍；从18.51RLU处划线，可将癌、炎和正常区分开来。
实施例9.tSDA检测乳腺癌、炎患者及正常人血浆循环RNA中CST1第一种剪切子的表达差异
采用商品化试剂盒抽提血浆中的循环RNA，tSDA检测50例乳腺癌患者、30例乳腺炎患者与30例正常人血浆循环RNA中CST1第一种剪切子的表达差异，引物序列如SEQIDNo.1和SEQIDNo.2所示，扩增子序列如SEQIDNo.50所示。结果如图12所示，CST1第一种剪切子在癌中RLU的中位数是炎的41.3倍和正常的42.86倍；从24.81RLU处划线，可将癌、炎和正常区分开来。
实施例10.NASBA检测乳腺癌、炎患者及正常人尿液循环RNA中CST1第一种剪切子的表达差异
采用商品化试剂盒抽提尿液中的循环RNA，NASBA检测20例乳腺癌患者、10例乳腺炎患者与10例正常人尿液循环RNA中CST1第一种剪切子的表达差异，引物序列如SEQIDNo.1和SEQIDNo.2所示，扩增子序列如SEQIDNo.50所示。结果如图13所示，CST1第一种剪切子在癌中RLU的中位数是炎的18倍和正常的18.87倍；从22.93RLU处划线，可将癌、炎和正常区分开来，即22.93RLU可作为非侵入性尿液样本乳腺癌诊断的一个参考值。
实施例11.乳腺癌患者外周血CST1第一种剪切子表达水平检测与细胞学检测对比
将乳腺癌患者除去红细胞和血小板的外周血有核细胞提取RNA，采用实时PCR绝对定量法检测CST1第一种剪切子的表达水平，引物序列如SEQIDNo.1和SEQIDNo.2所示，扩增子序列如SEQIDNo.50所示，通过与乳腺炎患者及正常人的表达量比较，判断CST1第一种剪切子是否高表达，从而确认乳腺癌患者的外周血中是否有游离乳腺癌细胞存在，并与细胞学检测结果进行比对。结果如图14所示，CST1第一种剪切子表达水平检测可100％确认细胞学鉴定的阳性结果，同时可检测出细胞学鉴定阴性的病例中存在部分转移的病例，说明CST1第一种剪切子表达水平检测比细胞学检测具有更高的灵敏度，能检测到细胞学无法检测的微转移的存在。
实施例12.乳腺癌患者骨髓CST1第一种剪切子表达水平检测与细胞学检测对比
将穿刺活检取样获得的乳腺癌患者骨髓采用实时PCR绝对定量法检测CST1第一种剪切子的表达水平，引物序列如SEQIDNo.1和SEQIDNo.2所示，扩增子序列如SEQIDNo.50所示，通过与正常骨髓的表达量比较，判断CST1第一种剪切子是否高表达，从而确认骨髓是否存在转移和微转移，并与细胞学检测结果进行比对。结果如图15所示，CST1第一种剪切子表达水平检测可95％确认细胞学鉴定的阳性结果，同时阳性率高于细胞学检测，表明CST1第一种剪切子表达水平检测的灵敏度高于细胞学检测。
实施例13.CST1第一种剪切子表达量用于乳腺癌pTNM分期
采用商品化试剂盒抽提血浆中的循环RNA，TMA法检测80例乳腺癌不同pTNM分期(I+II30例、III+IV50例)血浆循环RNA中CST1第一种剪切子的表达差异，引物序列如SEQIDNo.1和SEQIDNo.2所示，扩增子序列如SEQIDNo.50所示。结果如图16所示，乳腺癌III+IV中CST1第一种剪切子的RLU中位数是I+II的15倍，说明CST1第一种剪切子的表达量可用于乳腺癌pTNM分期。
实施例14.CST1第一种剪切子表达量用于乳腺癌治疗过程中的动态监测
通过实时定量PCR法检测患者血液中CST1第一种剪切子的表达量，引物序列如SEQIDNo.1和SEQIDNo.2所示，扩增子序列如SEQIDNo.50所示，实时监测乳腺癌患者(化疗6人，放疗4人)的治疗效果。结果如表2所示，治疗有效患者血液中CST1第一种剪切子的表达量随着疗程增加而逐渐降低，同时影像学观察发现乳腺癌肿块逐渐减小；而治疗无效患者血液中CST1第一种剪切子的表达量随着疗程的增加而逐渐上升，同时影像学观察发现乳腺癌肿块逐渐变大。因此，CST1第一种剪切子的表达量可作为乳腺癌患者治疗效果的评价指标，用于乳腺癌治疗过程中的动态监测。
表2实时定量PCR检测放化疗过程中乳腺癌患者血液中CST1第一种剪切子的表达量
实施例15.CST1第一种剪切子表达量用于乳腺癌患者的预后判断
通过实时定量PCR法检测患者血液中CST1第一种剪切子的表达量，引物序列如SEQIDNo.1和SEQIDNo.2所示，扩增子序列如SEQIDNo.50所示，分别在术后或放化疗后的1个月、3个月、1年考察5个乳腺癌患者的预后效果。结果如表3所示，一年后复发的2个患者血液中CST1第一种剪切子的表达量随着时间的延长而逐渐增高，当达到约1000拷贝时被影像学发现确诊；而1年内没有复发的3个患者血液中CST1第一种剪切子的表达量随着时间的延长并无明显变化，影像学也无发现异常。因此，CST1第一种剪切子的表达量可作为乳腺癌患者预后判断的指标。
表3实时定量PCR检测术后或放化疗后乳腺癌患者血液中CST1第一种剪切子的表达量
实施例16.基于TaqMan水解探针法实时PCR的CST1第一种剪切子检测试剂盒
至少包括以下组分：①针对CST1第一个剪切子的引物：上游引物：5’-tctcaccctcctctcctg-3’(SEQIDNo.1)；下游引物：5’-ttatcctatcctcctccttgg-3’(SEQIDNo.2)；②针对CST1第一个剪切子的探针：5′-ctccagctttgtgctctgcctct-3′(SEQIDNo.3)，5′端用FAM标记，3′端用TAMRA标记。
还可以包括以下组分中的任一种或多种：RNA提取试剂、逆转录试剂、脱氧核糖核苷酸(dNTP)、缓冲液、MgCl2、DNA聚合酶、包含CST1第一种剪切子扩增子(序列如SEQIDNo.51所示)的重组质粒标准品[其图谱如图1所示；针对CST1第一种剪切子的引物：上游引物：5’-gggctccctgcctcgggctctcac-3’(SEQIDNo.22)；下游引物：5’-acggtctgttgcctggct-cttagt-3’(SEQIDNo.23)]、阳性对照(乳腺癌细胞株HCC1937)、阴性对照(人正常乳腺细胞株Hs578Bst)。
检测时，分别将实验组、阳性对照组、阴性对照组与重组质粒标准品进行实时PCR扩增，根据重组质粒标准品的浓度梯度和扩增后对应的CP值作标准曲线，再依据该标准曲线给出实验组、阳性对照组和阴性对照组的拷贝数。
实施例17.基于染料法实时PCR的CST1第一种剪切子检测试剂盒
至少包括以下任一对引物：针对CST1第一个剪切子的引物：①上游引物：5’-tctcaccct-cctctcctg-3’(SEQIDNo.1)；下游引物：5’-ttatcctatcctcctccttgg-3’(SEQIDNo.2)；②上游引物：5’-ccctgggagaacagaaggtcc-3’(SEQIDNo.4)；下游引物：5’-ggtggtggctggtgcgaat-3’(SEQIDNo.5)；③上游引物：5’-cattcgcaccagccaccac-3’(SEQIDNo.6)；下游引物：5’-agaagcaa-gaaggaaggagggag-3’(SEQIDNo.7)；④上游引物：5’-cagcgtgcccttcacttcg-3’(SEQIDNo.8)；下游引物：5’-cggtctgttgcctggctctta-3’(SEQIDNo.9)；⑤上游引物：5’-cattcgcaccagcca-ccac-3’(SEQIDNo.10)；下游引物：5’-cagggctatagaagcaagaaggaa-3’(SEQIDNo.11)；⑥上游引物：5’-ggtacagcgtgcccttcacttc-3’(SEQIDNo.12)；下游引物：5’-cggtctgttgcctggctctta-3’(SEQIDNo.13)；⑦上游引物：5’-gagaacagaaggtccctggtgaa-3’(SEQIDNo.14)；下游引物：5’-ggtggtggctggtgcgaat-3’(SEQIDNo.15)；⑧上游引物：5’-tgggtacagcgtgcccttca-3’(SEQIDNo.16)；下游引物：5’-cggtctgttgcctggctctta-3’(SEQIDNo.17)；⑨上游引物：5’-ccctgggagaacagaaggtcc-3’(SEQIDNo.18)；下游引物：5’-tggtggctggtgcgaatgg-3’(SEQIDNo.19)；⑩上游引物：5’-ttccctgggag-aacagaaggtcc-3’(SEQIDNo.20)；下游引物：5’-tggtgg-ctggtgcgaatgg-3’(SEQIDNo.21)。
还可以包括以下组分中的任一种或多种：针对内参基因β-actin的引物：上游引物：5’-aagatcattgctcctcctg-3’(SEQIDNo.32)；下游引物：5’-cgtcatactcctgcttgc-3’(SEQIDNo.33)；RNA提取试剂、逆转录试剂、荧光染料(如SYBRGreen)、dNTP、缓冲液、MgCl2、DNA聚合酶。
实施例18.基于NASBA的CST1第一种剪切子检测试剂盒
至少包括以下组分：①针对CST1第一个剪切子的引物：上游引物：5’-aattctaatacgactca-ctatagggtctcaccctcctctcctg-3’(SEQIDNo.34)；下游引物：5’-ttatcctatcctcctccttgg-3’(SEQIDNo.2)；②针对CST1第一个剪切子的探针：5′-ctccagctttgtgctctgcctct-3′(SEQIDNo.3)，5′端用FAM标记，3′端用DABSYL标记。
还可以包括以下组分中的任一种或多种：RNA提取试剂、逆转录试剂、RNA荧光染料(如Ribo-Greenfluorescentdye)、T7RNA聚合酶、RNaseH、禽骨髓白血病病毒(AMV)逆转录酶、核糖核苷酸(NTP)、dNTP。
实施例19.基于TMA的CST1第一种剪切子定量检测试剂盒
至少包括以下组分：①针对CST1第一个剪切子的引物：上游引物：5’-aattctaatacgactc-actatagggtctcaccctcctctcctg-3’(SEQIDNo.34)；下游引物：5’-ttatcctatcctcctccttgg-3’(SEQIDNo.2)；②针对CST1第一个剪切子的探针：5′-ctccagctttgtgctctgcctct-3′(SEQIDNo.3)，5′端用FAM标记，3′端用DABSYL标记。
还可以包括以下组分中的任一种或多种：RNA提取试剂、逆转录试剂、RNA荧光染料(如Ribo-Greenfluorescentdye)、T7RNA聚合酶、RNaseH、禽骨髓白血病病毒(AMV)逆转录酶、NTP、dNTP。
实施例20.基于LCR的CST1第一种剪切子定量检测试剂盒
至少包括以下4条探针：5’-agtatctgagtaccctgctgctcctgc-3’(SEQIDNo.35)；5’-accctagct-gtggccctggcctggag-3’(SEQIDNo.36)；5’-catagactcatgggacgacg-3’(SEQIDNo.37)；5’-acaccgggaccggacctc-3’(SEQIDNo.38)；每条探针的5’端用半抗原标记。
还可以包括以下组分中的任一种或多种：RNA提取试剂、逆转录试剂、T4DNA连接酶、dNTP。
实施例21.基于tSDA的CST1第一种剪切子检测试剂盒
至少包括以下组分：①针对CST1第一个剪切子的引物：CST1B1引物：5’-tgggtacagc-gtgcccttcactt-3’(SEQIDNo.39)；CST1S1引物：5’-ccgctcgagtacagcgtgcccttcacttcgc-3’(SEQIDNo.40)；CST1B2引物：5’-caacggtctgttgcctggctctta-3’(SEQIDNo.41)；CST1S2引物：5’-gacctcgaggttgcctggctcttagtacccg-3’(SEQIDNo.42)；②针对CST1第一个剪切子的探针：5’-gtgctcgagtcagcgagtataacaaggccaccaaagatgactac-3’(SEQIDNo.43)，5’端用32P标记。
还可以包括以下组分中的任一种或多种：RNA提取试剂、逆转录试剂、dCTPαS、dATP、dGTP、dTTP、BsobI酶、exo-Bca酶。
(二)蛋白水平
优选实施例中使用的CystatinSN重组蛋白，兔抗CystatinSN多克隆抗体购自NOVUSBiologicals，鼠抗人CystatinSN单克隆抗体(特异性识别序列如SEQIDNo.54所示的CystatinSN表位)购自R&D，TMB过氧化物酶底物(TMBPeroxidaseSubstrate，包含TMBsolutionA和PeroxidaseSolutionB)购自KirkegaardandPerryLaboratoriesInc.。
血清样品的制备是将全血标本于室温放置2小时或4℃过夜后，1000g离心20分钟，取上清即可检测，或置-20℃或-80℃保存，避免反复冻融。血浆样品的制备是用EDTA或肝素作为抗凝剂，标本采集后30分钟内于2～8℃、1000g离心15分钟，取上清即可检测，或置-20℃或-80℃保存，避免反复冻融。血清或血浆样品用pH7.0～7.2、0.1M的PBS稀释10倍后进行测定。
实施例22.人乳腺癌细胞株培养上清与正常人血清中CystatinSN的表达差异
取CST1mRNA高表达的人乳腺癌细胞株HCC1937(泳道1-2)、MCF-7(泳道3-4)的培养上清以及正常人的血清样本S1(泳道5-6)和S2(泳道7-8)，进行15％的SDS-PAGE。电泳完毕后，将蛋白电转移至硝酸纤维素膜上，用含有5％脱脂奶粉和0.1％Tween-20的PBS于室温下封闭2小时，加入抗CystatinSN多克隆抗体于4℃温育过夜，用含有0.1％Tween-20的PBS洗涤3次，再加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔IgG于37℃温育1小时，用含有0.1％Tween-20的PBS洗涤4次，再用PBS洗涤1次，之后用TMB过氧化物酶底物显色检测，以β-actin为内参蛋白。结果如图17所示，泳道1-4中检测到约16Kda的强条带，而泳道5-8仅检测到约16Kda的弱条带，说明CST1编码的CystatinSN在人乳腺癌细胞中异常高表达。
实施例23.乳腺癌患者与正常人血清中CystatinSN的表达差异
取正常人的血清样本(泳道1-2)和乳腺癌患者的血清样本(泳道3-6)，按照实施例22所述方法进行SDS-PAGE、蛋白电转和免疫印迹。结果如图18所示，泳道1-2仅检测到弱条带，而泳道3-6检测到强条带，说明CystatinSN在乳腺癌患者血清中异常高表达。
实施例24.竞争ELISA测定乳腺癌患者与正常人血清中CystatinSN的表达差异
用5ug/mlCystatinSN包被ELISA平板，再用3％BSA封闭平板，血清样品与抗CystatinSN单克隆抗体(1∶2000)于37℃温育1小时，用TBS(含有154mMNaCl的pH7.5、10mMTris-HCl)洗涤，再加入0.08ug/mlHRP标记的山羊抗兔IgG于37℃温育1小时，用TBS洗涤，再加入0.4mg/ml邻苯二胺(溶于pH5、500mM磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液中)反应，用酶联仪定量。共测定了20例正常人血清和30例乳腺癌患者血清。结果如图19所示，正常人血清中CystatinSN浓度中位数为1.7ng/ml，乳腺癌患者血清中CystatinSN浓度中位数为4.1ng/ml，从3.25ng/ml处划线，基本可以将癌和正常区分开来。
实施例25.双抗夹心ELISA测定乳腺癌患者与正常人血清中CystatinSN的表达差异
用5ug/ml鼠抗人CystatinSN单克隆抗体包被ELISA平板，再用3％BSA封闭平板，加入血清样品于37℃温育1小时，用TBS洗涤，再加入生物素标记的兔抗CystatinSN多克隆抗体(1∶1000)于37℃温育1小时，用TBS洗涤，再加入亲合素-过氧化物酶复合物于37℃温育1小时，用TBS洗涤，再每孔加入TMB过氧化物酶底物，用酶联仪定量。共测定了30例正常人血清和50例乳腺癌患者血清。结果如图20所示，正常人血清中CystatinSN浓度中位数为0.525ng/ml，乳腺癌患者血清中CystatinSN浓度中位数为2.99ng/ml，从1.48ng/ml处划线，基本可以将癌和正常区分开来。
实施例26.ELISA测定乳腺癌患者血清CystatinSN和癌胚抗原(CEA)的灵敏度和特异性比较
按照实施例25所述方法测定CystatinSN血清水平。采用商品化的CEAELISA试剂盒进行CEA检测，按照试剂盒说明书操作。共测定了30例正常人血清和30例乳腺癌患者血清。结果如图21所示，CystatinSN曲线下面积为0.994，CEA曲线下面积为0.833，说明ELISA测定CystatinSN比测定CEA在灵敏度和特异性方面更具有优越性。
实施例27.基于竞争ELISA法的CystatinSN定量检测试剂盒
1、试剂盒的组成
至少包括以下组分：包被抗原(CystatinSN)；一抗(鼠抗人CystatinSN单克隆抗体)；酶标二抗(HRP标记的山羊抗兔IgG)；酶作用底物(邻苯二胺)。
还可以包括以下组分中的任一种或多种：封闭液(3％BSA)、洗涤缓冲液(TBS，即含有154mMNaCl的pH7.5、10mMTris-HCl)。
2、试剂盒的使用方法
用5mg/mlCystatinSN包被ELISA平板，再用3％BSA封闭平板，血清样品与抗CystatinSN单克隆抗体(1∶2000)于37℃温育1小时，用TBS洗涤，再加入0.08ug/mlHRP标记的山羊抗兔IgG于37℃温育1小时，用TBS洗涤，再加入0.4mg/ml邻苯二胺(溶于pH5、500mM磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液中)反应，用酶联仪定量。
实施例28.基于双抗夹心ELISA法的CystatinSN定量检测试剂盒
1、试剂盒的组成
至少包括以下组分：CystatinSN标准品，临用前用含有i％BSA的PBST溶解或稀释制成一系列梯度溶液，如浓度分别为10、5、2.5、1、0.5、0.25ng/ml；包被抗体(鼠抗人CystatinSN单克隆抗体)；生物素标记二抗(生物素标记的兔抗CystatinSN多克隆抗体)；亲合素-过氧化物酶复合物；过氧化物酶作用底物(TMB过氧化物酶底物)。
还可以包括以下组分中的任一种或多种：包被抗体稀释液(pH9、0.05M的NaHCO3)、封闭液(含有3％BSA的PBST)、二抗稀释液(含有1％BSA的PBST)、洗涤缓冲液(PBST，即含有0.05％Tween-20的PBS)、终止液(2NH2SO4)。
2、试剂盒的使用方法
用包被抗体缓冲液将包被抗体稀释至蛋白含量为5μg/ml，加至ELISA平板中，每孔0.1ml，4℃孵育过夜，弃去孔内液体，用洗涤缓冲液洗涤3次，每次3分钟。再每孔加入200ul封闭液，37℃温育1小时或4℃孵育过夜，弃去孔内液体，用洗涤缓冲液洗涤3次，每次3分钟。分别设空白孔、标准品孔、样品孔，空白孔每孔加样品稀释溶剂即pH7.0～7.2、0.1M的PBS100μl，标准品孔每孔加CystatinSN标准品溶液100μl，样品孔每孔加血清或血浆样品100μl，37℃温育2小时，弃去孔内液体，甩干。再每孔加入生物素标记二抗100μl(使用前用二抗稀释液进行1∶200稀释)，37℃温育1小时，弃去孔内液体，用洗涤缓冲液洗涤3次，每次1～2分钟。再每孔加入亲合素-过氧化物酶复合物100μl，37℃温育1小时，弃去孔内液体，用洗涤缓冲液洗涤5次，每次1～2分钟。再每孔加入过氧化物酶作用底物50μl，37℃避光显色(15分钟内，待肉眼可见标准品前4-5孔有明显的梯度兰色、后4-5孔梯度不明显时即可终止)。再每孔加入终止液50μl终止反应(蓝色立转黄色)。用酶联仪于405nm波长处测量各孔光密度(OD值)。根据标准品浓度和对应的OD值绘制散点曲线，计算R2和曲线方程式，如R2≥0.95，则将样品OD值代入曲线方程式中，即可算出血清或血浆样品中的CystatinSN浓度。
实施例29.CystatinSN表达水平用于乳腺癌pTNM分期
采用实施例28所述试剂盒及其使用方法检测经病理确诊的乳腺癌T期患者20人、N期患者30人和M期患者30人血清中的CystatinSN表达水平，结果如表4所示，可见随着病程的进展，CystatinSN表达水平亦随之提高，提示CystatinSN表达水平可用于乳腺癌pTNM分期。
表4不同病理分期的乳腺癌患者CystatinSN表达水平
实施例30.CystatinSN表达水平用于评估乳腺癌是否转移
采用实施例28所述试剂盒及其使用方法检测经病理确诊的乳腺癌未转移患者20人和转移患者30人血清中的CystatinSN表达水平，结果如表5所示，可见乳腺癌转移患者的CystatinSN表达水平高于未转移者，提示CystatinSN表达水平可用于评估乳腺癌是否转移。
表5转移与未转移乳腺癌患者CystatinSN表达水平
实施例31.CystatinSN表达水平用于评估乳腺癌化疗联合内分泌治疗的效果
2885例N0-1期乳腺癌患者，行4个周期的AC(多柔比星+环磷酰胺)或AT(多柔比星+紫杉醇)方案化疗，再根据激素受体(HR)状况选择是否行辅助内分泌治疗，采用实施例28所述试剂盒及其使用方法检测治疗周期结束后患者血清中的CystatinSN表达水平，有效数据776例，CystatinSN表达中位数为4.06ng/ml，之后随访76个月，记录患者的无病生存情况。结果如图22所示，高于上述CystatinSN表达中位数的患者无病生存率为20％，低于上述CystatinSN表达中位数的患者的无病生存率为60％，提示CystatinSN表达水平可用于评估乳腺癌化疗联合内分泌治疗的效果。
虽然通过上述具体实施例对本发明进行了比较详细的描述，但可以理解的是，本发明为了清楚而在各个实施例中描述的技术特征也可按需要重新组合应用，所有技术特征的等同替换、修饰和改变对本领域技术人员来说都是显而易见的，因此，这些等同替换、修饰和改变也包括在本发明范围之内。

Claims (11)

1.检测CST1基因剪切子、CST1基因编码蛋白CystatinSN及其表位肽的试剂在制备乳腺癌诊断和预示的试剂盒中的应用，所述CST1基因剪切子的核苷酸序列如SEQIDNo.48所示，所述CystatinSN的氨基酸序列如SEQIDNo.52所示；所述CystatinSN表位肽的氨基酸序列如SEQIDNo.54所示。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述乳腺癌诊断和预示包括乳腺癌或乳腺癌组织转移的鉴别诊断和/或易感性分析，乳腺癌或乳腺癌组织转移治疗药物、治疗方法、治疗疗效及预后的评估，以及相关人群乳腺癌或乳腺癌组织转移患病风险的评估。
3.CST1基因剪切子的捕获剂和CST1基因编码蛋白CystatinSN的捕获剂在制备乳腺癌诊断和预示试剂、试剂盒及芯片中的应用，所述CST1基因剪切子的捕获剂为特异性识别CST1基因剪切子的引物和/或探针，所述CystatinSN的捕获剂为抗CystatinSN的抗体，所述CST1基因剪切子的核苷酸序列如SEQIDNo.48所示，所述CystatinSN的氨基酸序列如SEQIDNo.52所示。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述引物为核苷酸序列如SEQIDNo.1~2、4~21、34和39~42所示的至少一种，所述探针为核苷酸序列如SEQIDNo.3、35~38和43所示的至少一种。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述引物的核苷酸序列如SEQIDNo.1~2所示，所述探针的核苷酸序列如SEQIDNo.3所示。
6.包含CST1基因剪切子的捕获剂或CST1基因编码蛋白CystatinSN的捕获剂的试剂盒在制备乳腺癌诊断和预示试剂盒中的应用，所述CST1基因剪切子的捕获剂为特异性识别CST1基因剪切子的引物和/或探针，所述CystatinSN的捕获剂为抗CystatinSN的抗体，所述CST1基因剪切子的核苷酸序列如SEQIDNo.48所示，所述CystatinSN的氨基酸序列如SEQIDNo.52所示。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述引物为核苷酸序列如SEQIDNo.1~2、4~21、34和39~42所示的至少一种，所述探针为核苷酸序列如SEQIDNo.3、35~38和43所示的至少一种。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述引物的核苷酸序列如SEQIDNo.1~2所示，所述探针的核苷酸序列如SEQIDNo.3所示。
9.表面固定有CST1基因剪切子的捕获剂的芯片在制备乳腺癌诊断和预示芯片中的应用，所述CST1基因剪切子的捕获剂为特异性识别CST1基因剪切子的探针，所述CST1基因剪切子的核苷酸序列如SEQIDNo.48所示。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述探针为核苷酸序列如SEQIDNo.3、35~38和43所示的至少一种。
11.根据权利要求10所述的应用，其特征在于，所述探针的核苷酸序列如SEQIDNo.3所示。
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