CN104039962A - 乳腺癌诊断和预示的标志物 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了SEQ ID No.48所示的CST1基因剪切子和SEQ ID No.52所示CST1基因编码蛋白Cystatin SN作为乳腺癌诊断和预示标志物的应用，通过测定所述标志物的表达量，可以进行乳腺癌或乳腺癌组织转移的鉴别诊断和/或易感性分析，乳腺癌或乳腺癌组织转移治疗药物、治疗方法、治疗疗效及预后的评估，相关人群乳腺癌或乳腺癌组织转移患病风险的评估等，灵敏度高，特异性好，结果准确可靠；本发明还公开了所述CST1基因剪切子的捕获剂和Cystatin SN的捕获剂在制备乳腺癌诊断和预示试剂、试剂盒及芯片中的应用，并公开了包含上述捕获剂的乳腺癌诊断和预示试剂盒、芯片。

Description

乳腺癌诊断和预示的标志物 技术领域 本发明属于生物医学技术领域， 涉及一种可用于肿瘤诊断和预示的分子标志物， 以及用 于检测该分子标志物的试剂、 试剂盒和芯片。 背景技术
据世界卫生组织 （WHO) 统计， 全世界每年约有 120万妇女罹患乳腺癌， 约有 54万乳 腺癌患者死亡， 且乳腺癌的发病率及致死率还在逐年上升。 因此， 乳腺癌的防治是目前亟待 解决的问题， 包括如何更早发现、 及时干预， 如何实现疗效评估和监测， 以及如何对术后患 者进行实时准确的复发监控等。 其中， 灵敏度高、 特异性强的乳腺癌诊断试剂的研制是提高 乳腺癌早期检出率、 改善患者预后的关键之一。
近年来， 随着对肿瘤发病机理研究的不断深入， 发现 Cystatin家族作为组织蛋白酶主要 是半胱氨酸蛋白酶的内源性抑制剂， 在肿瘤的发生、 发展、 浸润和转移过程中起着非常重要 的作用。 研究结果显示， Cystatin家族的几个成员在不同肿瘤中的表达水平有所上升， 例如 Cystatin C在卵巢癌和头颈部癌症中的表达有不同水平的上升， stefm A在非小细胞肺癌中的 表达水平有所增加， Cystatin F 在多种肿瘤中的表达水平都有显著增加， 很可能是由于在肿 瘤发生、 发展过程中需要组织蛋白酶的参与， 先诱导其表达量增加， 再激活机体本身的应激 机制， 导致 Cystatin的表达量上升以抑制过盛的组织蛋白酶活性。 但 Cystatin的表达量并不 与肿瘤的发展成正相关关系， 例如在胶质瘤中， Cystatin C 的低表达意味着疾病的晚期， 患 者的生存期较短， 且易于复发， 这可能是到了肿瘤的后期阶段， 又会有一些其他的机制对 Cystatin的水平进行调控， 以促进肿瘤的进一步恶化。
Cystatin SN是人类 Cystatin家族成员， 由 CST1基因编码， 含 141个氨基酸， 分子中有 两个二硫键， 分子量为 16.4Kda， 为典型的分泌蛋白， 分布于多种体液和分泌物中， 如眼 泪、 唾液、 血清、 血浆等。 文献报道， CST1 在胃癌组织中的表达量高于正常胃粘膜组织， 在胃癌细胞系中的表达部位与胃癌组织较一致， 且表达率随细胞系的分化程度降低而降低； 临床资料分析表明， CST1 的表达与浸润深度、 远处转移以及 TNM 分期相关； 生存分析表 明， CST1表达阳性组的 5年生存率显著高于无表达组； Cox回归分析表明， CST1是一个独 立预后因子； 从而提示 CST1 可能在胃癌的发生、 发展过程中发挥类似肿瘤抑制因子的作 用。 但迄今为止， CST1与乳腺癌的关系尚未见文献报道。 发明内容 有鉴于此， 本发明的目的在于研究 CST1在乳腺癌中的表达情况， 并分析其与乳腺癌临 床病理参数和生物学行为的关系， 进而发现 CST1在乳腺癌发生、 发展、 转移过程中所起的 作用。
首先， 从 mRNA水平， 本发明比较了 CST1在人体不同组织中的表达， 发现 CST1在除 唾液腺外的人体正常组织中均低表达， 这对于 CST1用于病理条件下检测极为有利。 接着， 本发明比较了 CST124、 CST1、 CST2、 CST4在乳腺癌与癌旁组织手术标本中的表达差异， 发现 CST1在乳腺癌与癌旁组织中的表达差异最大。 由于 CSTl mRNA ( SEQ ID No.44) 选 择性剪切形成 2种剪切子， 第一种剪切子 （SEQ ID No.48 ) 包含 CSTl外显子 1 ( SEQ ID No.45 ) 外显子 2 ( SEQ ID No.46) 和外显子 3 ( SEQ ID No.47), 第二种剪切子 ( SEQ ID No.49) 仅包含 CSTl 外显子 1 ( SEQ ID No.45 ) 和外显子 2 ( SEQ ID No.46), 本发明接着 比较了 CSTl 两种剪切子在乳腺癌与癌旁组织手术标本中的表达差异， 发现第一种剪切子在 癌与癌旁组织中的表达差异程度优于第二种剪切子。 接着， 本发明分别比较了 CST1第一种 剪切子在乳腺癌、 癌旁及正常组织手术标本， 乳腺癌、 乳腺炎与正常组织穿刺标本， 乳腺癌 转移阳性淋巴结与阴性淋巴结， 乳腺癌、 乳腺炎患者与正常人血浆循环 （cell-free) RNA 中 的表达差异， 发现 CST1第一种剪切子在乳腺癌及乳腺癌转移组织中异常高表达， 通过测定 其表达量， 可以将乳腺癌、 癌旁与正常组织， 乳腺癌转移阳性组织与阴性组织区分开来， 灵 敏度高， 特异性好。
再次， 从蛋白水平， 本发明比较了 CST1编码蛋白 Cystatin SN (氨基酸序列如 SEQ ID No.52所示， 编码基因序列如 SEQ ID No.53所示） 在乳腺癌细胞株培养上清与正常人血清、 乳腺癌患者血清与正常人血清中的表达差异， 发现 Cystatin SN在乳腺癌细胞株培养上清与 乳腺癌患者血清中异常高表达， 通过测定其表达量， 可以将乳腺癌细胞株培养上清与正常人 血清、 乳腺癌患者血清与正常人血清区分开来， 灵敏度高， 特异性好。
综合上述研究结果， CST1第一种剪切子和 Cystatin SN可以作为乳腺癌诊断和预示的分 子标志物应用。 根据本领域的公知常识， Cystatin SN的表位肽也同样可以作为乳腺癌诊断和 预示的分子标志物应用， Cystatin SN表位肽的氨基酸序列可以如 SEQ ID No.54所示 （即去 除 Cystatin SN前端的分泌信号肽序列）。
通过测定上述分子标志物的表达量， 可以进行乳腺癌的诊断和预示， 包括乳腺癌或乳腺 癌组织转移的鉴别诊断和 /或易感性分析， 乳腺癌或乳腺癌组织转移治疗药物、 治疗方法、 治疗疗效及预后的评估， 相关人群乳腺癌或乳腺癌组织转移患病风险的评估等。 例如， 方法 之一： 测定待测样品中 CST1 第一种剪切子或 Cystatin SN的含量或表达水平， 将检测结果 与阈值进行比较， 如果超过阈值则判断为阳性； 所述阈值可通过对比正常人与乳腺癌患者体 液或组织中 CST1第一种剪切子或 Cystatin SN的含量或表达水平统计得到。
测定上述分子标志物的表达量需要使用检测试剂、 试剂盒或检测芯片等。 因此， 本发明 进一步研究了上述分子标志物的检测试剂、 试剂盒和检测芯片， 以用于乳腺癌诊断和预示。
检测 mR A表达的方法有很多种， 包括但不限于多聚酶链式反应 （polymerase chain reaction, PCR)、 实时定量 PCR (quantitative real-time PCR) 基于核酸序列扩增法 （Nucleic Acid based Amplificatin, NASBA )、 转录介导的扩增 ( Transcription-median amplification, TMA)、 连接酶链反应 (Ligase chain reaction, LCR)、 适温链置换反应 (thermophilic strand displacement amplification, tSDA) 等。 根据上述检测方法， 只要特异性识别 CST1第一种剪 切子或其 cDNA的引物或探针 （统称为 CST1第一种剪切子的捕获剂） 都可以制成乳腺癌诊 断和预示试剂应用。 本发明优选特异性识别 CST1 外显子 1 的引物或探针或特异性识别 CST1 外显子 2和 3 的引物或探针， 更优选特异性识别 CST1 外显子 1 的引物或探针。 例 如， 所述引物优选为核苷酸序列如 SEQ ID No.l〜2、 4〜21、 34和 39〜42所示的至少一种， 更 优选如 SEQ ID No.l和 SEQ ID No.2所示； 所述探针优选为核苷酸序列如 SEQ ID No.3、 35-38和 43所示的至少一种， 更优选如 SEQ ID No.3所示。
检测蛋白表达的方法有很多种， 包括但不限于酶联免疫吸附测定 （ELISA) 例如竞争性 ELISA和双抗夹心 ELISA、 免疫印迹、 ELISA和免疫印迹的组合等。 根据上述检测方法， 抗 Cystatin SN的抗体 （统称为 Cystatin SN的捕获剂） 都可以制成乳腺癌诊断和预示试剂应 用。 所述抗体可以是多克隆抗体或单克隆抗体， 可以被各种类型的酶如碱性磷酸酶、 荧光素 酶、 过氧化物酶、 β-半乳糖苷酶以及各种荧光化合物如荧光素等标记， 也可以被生物素标 记， 再利用亲合素 -酶复合物放大反应信号。 当标记为酶时， 可通过添加酶作用底物使光吸 收发生变化而进行定量。 当标记为荧光化合物时， 可通过用紫外光激发使其发射荧光而进行 定量。
为了检测更方便、 快速， 上述检测试剂可以多种组合或与其它辅助检测试剂组合制成乳 腺癌诊断和预示试剂盒。 商业化的或文献报道的含有上述检测试剂的试剂盒也可以直接制成 乳腺癌诊断和预示试剂盒应用。
作为一种优选的技术方案， 基于 TaqMan水解探针法实时 PCR的 CST1第一种剪切子检 测试剂盒至少包含特异性识别 CST1基因第一种剪切子的 cDNA的 1对引物和 1条探针， 所 述引物的核苷酸序列如 SEQ ID No.l和 SEQ ID No.2所示， 所述探针的核苷酸序列如 SEQ ID No.3所示， 探针的 5'端用荧光基团标记， 3'端用淬灭基团标记。
作为一种优选的技术方案， 基于染料法实时 PCR 的 CST1 第一种剪切子检测试剂盒至 少包含特异性识别 CST1基因第一种剪切子的 cDNA的 1对引物， 所述 CST1基因剪切子的 捕获剂为特异性识别 CST1基因剪切子的 cDNA的引物， 所述引物的核苷酸序列如 SEQ ID No.l〜2所示， 或者如 SEQ ID No.4〜5所示， 或者如 SEQ ID No.6〜7所示， 或者如 SEQ ID No.8〜9所示， 或者如 SEQ ID Νο.10〜11所示， 或者如 SEQ ID Νο.12〜13所示， 或者如 SEQ ID Νο.14〜15所示， 或者如 SEQ ID Νο.16〜17所示， 或者如 SEQ ID Νο.18〜19所示， 或者如 SEQ ID No.20~21所示。
作为一种优选的技术方案， 基于 NASBA或 TMA的 CST1第一种剪切子检测试剂盒至 少包含特异性识别 CST1基因第一种剪切子的 cDNA的 1对引物和 1条探针， 所述引物的核 苷酸序列如 SEQ ID No.34和 SEQ ID No.2所示， 所述探针的核苷酸序列如 SEQ ID No.3所 示， 探针的 5'端用荧光基团标记， 3'端用淬灭基团标记。
作为一种优选的技术方案， 基于 LCR 的 CST1 第一种剪切子检测试剂盒至少包含特异 性识别 CST1基因第一种剪切子的 4条探针， 所述探针的核苷酸序列如 SEQ ID No.35〜40所 示， 每条探针的 5'端用半抗原标记。
作为一种优选的技术方案， 基于 tSDA的 CST1第一种剪切子检测试剂盒至少包含特异 性识别 CST1基因第一种剪切子的 cDNA的 2对引物和 1条探针， 所述引物的核苷酸序列如 SEQ ID No.39〜44所示， 所述探针的核苷酸序列如 SEQ ID No.43所示， 探针的 5'端用放射 性同位素标记。
在上述 CST1 第一种剪切子检测试剂盒中， 还可以视情况加入一种或多种辅助检测试 剂， 所述辅助试剂包括但不限于： ①使所述引物对应的扩增子可视化的反应试剂， 例如通过 琼脂糖凝胶电泳法、 酶联凝胶法、 化学发光法、 原位杂交法、 荧光检测法等使扩增子可视化 的试剂； ② R A 提取试剂； ③逆转录试剂； ④ cDNA 扩增试剂， 例如 PCR、 实时定量 PCR、 NASBA、 TMA、 LCR、 tSDA的相关试剂； ⑤制备标准曲线所用的标准品， 例如包含 CST1 第一种剪切子扩增子的重组质粒； ⑥阳性对照品， 例如人乳腺癌细胞株 HCC1937、 SK-BR-3、 MCF-7; ⑦阴性对照品， 例如人正常乳腺细胞 Hs578Bst。
作为一种优选的技术方案， 基于竞争性 ELISA 的 Cystatin SN 检测试剂盒至少包含 Cystatin SN抗原、 抗 Cystatin SN单克隆抗体、 酶标二抗和酶作用底物。 用 Cystatin SN抗原 包被 ELISA平板， 待测样品与抗 Cystatin SN单克隆抗体依次加于平板进行孵育， 通过报告 组分 （酶标二抗和酶作用底物） 检测结合在平板上的抗 Cystatin SN 单克隆抗体的量， 据此 确定样品中 Cystatin SN的量。
作为一种优选的技术方案， 基于双抗夹心 ELISA的 Cystatin SN检测试剂盒至少包含抗 Cystatin SN单克隆抗体、 生物素标记的抗 Cystatin SN多克隆抗体、 亲合素-酶复合物和酶作 用底物。 用 Cystatin SN单克隆抗体包被平板， 待测样品和生物素标记的抗 Cystatin SN多克 隆抗体依次加于平板进行孵育， 通过报告组分 （亲合素 -酶复合物和酶作用底物） 检测结合 在平板上的抗 Cystatin SN单克隆抗体的量， 据此确定样品中 Cystatin SN的量。
在上述 Cystatin SN检测试剂盒中， 还可以加入一种或多种辅助检测试剂， 所述辅助试 剂包括但不限于： ①封闭液； ②抗体稀释液； ③洗涤缓冲液； ④显色终止液； ⑤制备标准曲 线所用的 Cystatin SN标准品。
为了检测更方便、 快速， 特异性识别 CST1第一种剪切子或其 cDNA的探针还可以固定 在固相载体表面制成乳腺癌诊断和预示芯片。 商业化的或文献报道的固定有上述探针的芯片 也可以直接制成乳腺癌诊断和预示芯片应用。
本发明的检测试剂、 试剂盒或芯片可用于判断乳腺癌是否易感或形成， 进行乳腺癌 pTNM 分期， 评估乳腺癌进展或治疗效果， 判断是否转移、 复发。 受检样品可包括手术组 织、 穿刺组织、 淋巴结组织、 骨髓、 血清样品、 血浆样品、 全血样品、 血液级分样品、 尿样 等。 受试者可以是因乳房不适就医者、 有家族性乳腺癌病史的人群或乳腺癌患者等。
本发明的有益效果在于： 本发明公开了 SEQ ID No.48所示的 CST1基因剪切子和 SEQ ID No.52所示的 CST1基因编码蛋白 Cystatin SN作为乳腺癌诊断和预示的分子标志物的应 用， 通过测定所述分子标志物的表达量， 可以进行乳腺癌或乳腺癌组织转移的鉴别诊断和 / 或易感性分析， 乳腺癌或乳腺癌组织转移治疗药物、 治疗方法、 治疗疗效及预后的评估， 相 关人群乳腺癌或乳腺癌组织转移患病风险的评估等， 灵敏度高， 特异性好， 结果准确可靠； 本发明还公开了所述 CST1 基因剪切子的捕获剂和 Cystatin SN的捕获剂在制备乳腺癌诊断 和预示试剂、 试剂盒及芯片中的应用， 并公开了包含上述捕获剂的乳腺癌诊断和预示试剂 盒、 芯片 附图说明
图 1为包含 CST1第一种剪切子扩增子的重组质粒 （pMD18-T-CSTl ) 图谱。
图 2为 CST1基因在人体正常组织 （扁桃体、 垂体后叶、 甲状腺、 唾液腺、 骨骼肌、 骨 髓、 除去红细胞和血小板的外周血、 肺、 胃、 肝脏、 心脏、 肾、 肾上腺、 肠、 结肠、 胰脏、 脾脏、 膀胱、 前列腺、 乳腺、 卵巢、 子宫、 胎盘和睾丸）、 人乳腺癌细胞株 （HCC1937、 SK-BR-3、 和 MCF-7) 及人正常乳腺细胞株 Hs578Bst中的表达情况。 图 3为染料法实时定量 PCR检测 CST124、 CST1、 CST2、 CST4在乳腺癌及癌旁组织 手术样本中的表达差异。
图 4 为染料法实时定量 PCR检测 ACTB 在乳腺癌及癌旁组织手术样本中的表达， N1-N20和 T1〜T20分别表示 20对乳腺癌、 癌旁组织配对样本。
图 5 为染料法实时定量 PCR 检测 CST1 第一种剪切子 （splicel )、 第二种剪切子 (splice2) 在乳腺癌及癌旁组织手术样本中的表达差异。
图 6为实时 PCR绝对定量法检测 CST1第一种剪切子在乳腺癌、 癌旁及正常组织手术 样本中的表达差异。
图 7为实时 PCR绝对定量法检测 CST1第一种剪切子在乳腺癌及乳腺炎穿刺样本中的 图 8为实时 PCR绝对定量法检测 CST1第一种剪切子在乳腺癌转移阳性淋巴结和阴性 淋巴结中的表达差异。
图 9为实时 PCR绝对定量法检测 CST1第一种剪切子在乳腺癌患者、 乳腺炎患者和正 常人血浆循环 （cell-free) R A中的表达差异。
图 10 为实时 PCR 绝对定量法检测的受试者工作特征曲线 （receiver operator characteristic curve, ROC曲线)。
图 11为连接酶链反应 （Ligase chain reaction, LCR) 检测 CST1第一种剪切子在乳腺癌 患者、 乳腺炎患者和正常人血浆循环 R A中的表达差异。
图 12 为适温链置换反应 (thermophilic strand displacement amplification, tSDA) 检测
CST1第一种剪切子在乳腺癌患者、 乳腺炎患者和正常人血浆循环 R A中的表达差异。
图 13为核酸序列扩增法 （Nucleic Acid based Amplificatin, NASBA) 检测 CST1第一种 剪切子在乳腺癌患者、 乳腺炎患者和正常人尿液循环 R A中的表达差异。
图 14为乳腺癌患者外周血 CST1第一种剪切子表达水平检测与细胞学检测对比。
图 15为乳腺癌患者骨髓 CST1第一种剪切子表达水平检测与细胞学检测对比。
图 16为转录介导的扩增 （Transcription-mediated amplification, TMA) 检测 CST1第一 种剪切子在乳腺癌不同 pTNM分期血浆循环 R A中的表达差异。
图 17为 Cystatin SN在乳腺癌细胞株培养上清和正常人血清中的表达差异。
图 18为 Cystatin SN在正常人血清和乳腺癌患者血清中的表达差异。
图 19为竞争 ELISA法测定正常人和乳腺癌患者血清中 Cystatin SN的表达差异。
图 20为双抗夹心 ELISA法测定正常人和乳腺癌患者血清中 Cystatin SN的表达差异。 图 21 为 ELISA测定乳腺癌患者血清 Cystatin SN和癌胚抗原 （CEA) 的灵敏度和特异 性比较。
图 22为乳腺癌患者经治疗后高于 Cystatin SN蛋白表达中位数组及低于该中位数组的无 病生存曲线。 具体实施方式 为了使本发明的目的、 技术方案和优点更加清楚， 下面将结合附图对本发明的优选实施 例进行详细的描述。 优选实施例中未注明具体条件的实验方法， 通常按照常规条件， 例如分 子克隆实验指南 （第三版， J.萨姆布鲁克等著， 黄培堂等译， 科学出版社， 2002 年） 中所述 的条件， 或按照制造厂商所建议的条件。 除非另有说明， 优选实施例中所述百分比均为质量 百分比。
(一） mRNA 7j平
优选实施例中所用标本均是在与病人签署知情同意书后按医院规定途径获得。 穿刺活检 获取的病理部位标本与非病理部位样本作为对比。 手术中获取的淋巴结等样本立即提取 R A或置于液氮或 R Alater (Ambion公司） 中保存； 外周血、 骨髓或尿液样本先在 4°C、 4000rpm条件下离心 20分钟， 取上清， 再在 4°C、 13000rpm条件下离心 10分钟， 分离上清 和沉淀， 立即提取 R A或置 -20〜- 80°C保存。
实施例 1.人体不同组织中的 CST1表达差异
本实施例中使用的人体组织标本除正常乳腺组织标本为发明人从合作医院采集外， 其它 各组织标本均从正规商业渠道获得。 采用 Affymetrix的核苷酸芯片 HG-U95Av检测人体不同 组织标本中 CSTl mRNA的相对表达量， 具体操作参照核苷酸芯片说明书， 相对表达量的值 为通过管家基因 β -actin荧光值进行归一化处理后的标准化信号值。 检测结果如图 2所示， CST1 除在唾液腺中的表达量较高外， 在其它组织中均不表达， 说明 CST1 表达在正常组织 中的背景值很低， 这对 CST1 用于病理条件下检测极为有利。 此外， CST1 在人乳腺癌细胞 株 HCC1937、 SK-BR-3禾 B MCF-7 中过表达， 在人正常乳腺细胞 Hs578Bst中不表达， 说明 CST1极有可能作为乳腺癌分子诊断的标志物。
实施例 2.乳腺癌及癌旁组织手术样本中 CST124、 CST1、 CST2、 CST4的表达差异 采用染料法实时定量 PCR 分别检测 20 对乳腺癌、 癌旁组织手术样本中 CST124、 CST1、 CST2、 CST4 mRNA的相对表达量。 样本总 R A的提取采用 Trizol试剂。 R A逆 转录为 cDNA采用商业化的逆转录试剂盒并按照试剂盒说明书进行操作。 目的基因的 PCR 扩增引物序列见表 1。 荧光染料为 SYBR Green, Eve Green, LC Green等。 检测结果如图 3 CST124、 CST1、 CST2、 CST4的 PCR扩增引物序列
实施例 3.乳腺癌及癌旁组织手术样本中 CST1第一种剪切子、 第二种剪切子的表达差 异
首先， 采用染料法实时定量 PCR检测 20 对乳腺癌、 癌旁组织手术样本中管家基因 ACTB的表达量。 检测结果如图 4所示， 各样本中 ACTB的 CP ( cross point) 值基本一致。 然后， 采用染料法实时定量 PCR检测 CST1第一种剪切子、 第二种剪切子在 20对乳腺癌、 癌旁组织手术样本中癌旁与对应癌组织的 CP值之差的中位数， 具体方法和引物序列参照实 施例 2。 检测结果如图 5 所示， CST1 第一种剪切子在乳腺癌及癌旁组织中的表达量差异明 显优于第二种剪切子， 提示 CST1第一种剪切子在判别是否为癌时更具有优越性。
实施例 4.乳腺癌、 癌旁及正常组织手术样本中 CST1第一种剪切子的表达差异 采用实时 PCR绝对定量法检测 CST1 第一种剪切子在 100例乳腺癌、 癌旁及正常组织 手术样本中的表达差异， 引物序列如 SEQ ID No.l和 SEQ ID No.2所示， 扩增子序列如 SEQ ID No.50所示。 检测结果如图 6所示， CST1第一种剪切子在乳腺恶性病理条件下特异性高 表达， 而在癌旁及正常组织低表达， 癌标本拷贝的中位数是正常组织标本拷贝中位数的 15.6 倍； 从 223.20 拷贝处划线， 可将癌组织与正常组织区分开来， 因此， 223.20 拷贝可作为手 术取样组织样本乳腺癌诊断的一个参考值。
实施例 5.乳腺癌及乳腺炎穿刺样本中 CST1第一种剪切子的表达差异
穿刺取样与手术取样的样本具有较大差别， 主要表现在穿刺取样的样本中乳腺癌细胞的 比例变动较大， 有时可能仅占到整块样本的很小一部分， 有时甚至没有。 因此， 本实施例采 用实时 PCR绝对定量法检测了 CST1第一种剪切子在 40例乳腺癌、 乳腺炎患者穿刺样本中 的表达差异， 引物序列如 SEQ ID No.l和 SEQ ID No.2所示。 检测结果如图 Ί所示， CST1 第一种剪切子在乳腺癌标本中特异性高表达， 而在乳腺炎标本中低表达， 癌标本拷贝的中位 数是炎标本拷贝中位数的 11.0 倍； 从 120.66 拷贝处划线， 可将癌与炎区分开来， 因此， 120.66拷贝可作为穿刺取样样本乳腺癌诊断的一个参考值。
实施例 6.乳腺癌转移阳性淋巴结和阴性淋巴结中 CST1第一种剪切子的表达差异 手术获得经病理证明为乳腺癌转移阳性的淋巴结 30 枚， 且转移灶大小不等。 病理阴性 淋巴结 30 枚主要取自早期乳腺癌患者， 尽可能减少病理诊断阴性但实际有微转移存在的淋 巴结， 以避免实验误差。 采用实时 PCR绝对定量法检测 CST1 第一种剪切子在乳腺癌转移 阳性淋巴结和阴性淋巴结中的表达差异， 引物序列如 SEQ ID No.l和 SEQ ID No.2所示， 扩 增子序列如 SEQ ID No.50所示。 检测结果如图 8所示， CST1第一种剪切子在转移阳性淋巴 结中高表达， 而在阴性淋巴结中低表达， 转移阳性淋巴结标本拷贝的中位数是阴性淋巴结标 本拷贝中位数的 6.3倍； 从 82.45拷贝处划线， 阴性淋巴结中有 2例检出 CST1第一种剪切 子弱阳性， 经连续切片细致观察发现， 这 2例阴性淋巴结有微转移的存在， 因此， 82.45 拷 贝不仅 100%区分了细胞学检测结果， 而且能检测出细胞学不能检出的有微转移存在的淋巴 结， CST1第一种剪切子拷贝数检测相比细胞学检测具有更高的灵敏度。
实施例 7. PCR检测乳腺癌、 炎患者及正常人血浆循环 RNA中 CST1第一种剪切子的 表达差异
采用商品化试剂盒抽提血浆中的循环 （Cell-free) RNA, 实时 PCR绝对定量法检测 50 例乳腺癌患者、 30例乳腺炎患者与 30例正常人血浆循环 R A中 CST1第一种剪切子的表 达差异， 引物序列如 SEQ ID No.l和 SEQ ID No.2所示， 扩增子序列如 SEQ ID No.50所 示。 结果如图 9所示， CST1第一种剪切子在癌中拷贝的中位数分别是炎的 8.8倍和正常的 32 倍； 从 65.23 拷贝处划线， 可将癌、 炎和正常区分开来。 图 10 的 ROC 曲线显示基于 CST1 第一种剪切子表达水平诊断乳腺癌的方法具有较高的灵敏度和特异性， 曲线下面积为 0.987， 因此， CST1第一剪切子可作为非侵入性血浆样本乳腺癌诊断的特异性标志物。
实施例 8. LCR检测乳腺癌、 炎患者及正常人血浆循环 RNA中 CST1第一种剪切子的 表达差异
采用商品化试剂盒抽提血浆中的循环 R A， LCR检测 50例乳腺癌患者、 30例乳腺炎患 者与 30例正常人血浆循环 R A 中 CST1 第一种剪切子的表达差异， 引物序列如 SEQ ID No.l和 SEQ ID No.2所示， 扩增子序列如 SEQ ID No.50所示。 结果如图 11所示， CST1第 一种剪切子在癌中相对荧光强度 （relative light units, RLU) 的中位数分别是炎的 12.38倍和 正常的 40.12倍； 从 18.51RLU处划线， 可将癌、 炎和正常区分开来。 实施例 9. tSDA检测乳腺癌、 炎患者及正常人血浆循环 RNA中 CST1第一种剪切子的 表达差异
采用商品化试剂盒抽提血浆中的循环 R A， tSDA检测 50例乳腺癌患者、 30例乳腺炎 患者与 30例正常人血浆循环 R A中 CST1第一种剪切子的表达差异， 引物序列如 SEQ ID No.l和 SEQ ID No.2所示， 扩增子序列如 SEQ ID No.50所示。 结果如图 12所示， CST1第 一种剪切子在癌中 RLU的中位数是炎的 41.3倍和正常的 42.86倍； 从 24.81RLU处划线， 可将癌、 炎和正常区分开来。
实施例 10. NASBA检测乳腺癌、 炎患者及正常人尿液循环 RNA中 CST1第一种剪切子 的表达差异
采用商品化试剂盒抽提尿液中的循环 R A， NASBA检测 20例乳腺癌患者、 10例乳腺 炎患者与 10例正常人尿液循环 R A中 CST1第一种剪切子的表达差异， 引物序列如 SEQ ID No.l和 SEQ ID No.2所示， 扩增子序列如 SEQ ID No.50所示。 结果如图 13所示， CST1 第一种剪切子在癌中 RLU的中位数是炎的 18倍和正常的 18.87倍； 从 22.93RLU处划线， 可将癌、 炎和正常区分开来， 即 22.93RLU可作为非侵入性尿液样本乳腺癌诊断的一个参考 值。
实施例 11.乳腺癌患者外周血 CST1第一种剪切子表达水平检测与细胞学检测对比 将乳腺癌患者除去红细胞和血小板的外周血有核细胞提取 R A， 采用实时 PCR绝对定 量法检测 CST1第一种剪切子的表达水平， 引物序列如 SEQ ID No.l和 SEQ ID No.2所示， 扩增子序列如 SEQ ID No.50所示， 通过与乳腺炎患者及正常人的表达量比较， 判断 CST1 第一种剪切子是否高表达， 从而确认乳腺癌患者的外周血中是否有游离乳腺癌细胞存在， 并 与细胞学检测结果进行比对。 结果如图 14所示， CST1第一种剪切子表达水平检测可 100% 确认细胞学鉴定的阳性结果， 同时可检测出细胞学鉴定阴性的病例中存在部分转移的病例， 说明 CST1第一种剪切子表达水平检测比细胞学检测具有更高的灵敏度， 能检测到细胞学无 法检测的微转移的存在。
实施例 12.乳腺癌患者骨髓 CST1第一种剪切子表达水平检测与细胞学检测对比 将穿刺活检取样获得的乳腺癌患者骨髓采用实时 PCR绝对定量法检测 CST1 第一种剪 切子的表达水平， 引物序列如 SEQ ID No.l禾 B SEQ ID No.2所示， 扩增子序列如 SEQ ID No.50所示， 通过与正常骨髓的表达量比较， 判断 CST1 第一种剪切子是否高表达， 从而确 认骨髓是否存在转移和微转移， 并与细胞学检测结果进行比对。 结果如图 15所示， CST1第 一种剪切子表达水平检测可 95%确认细胞学鉴定的阳性结果， 同时阳性率高于细胞学检测， 表明 CST1第一种剪切子表达水平检测的灵敏度高于细胞学检测。
实施例 13. CST1第一种剪切子表达量用于乳腺癌 pTNM分期
采用商品化试剂盒抽提血浆中的循环 R A， TMA法检测 80例乳腺癌不同 pTNM分期 (I+II 30例、 III+IV 50例） 血浆循环 R A中 CST1第一种剪切子的表达差异， 引物序列如 SEQ ID No.l和 SEQ ID No.2所示， 扩增子序列如 SEQ ID No.50所示。 结果如图 16所示， 乳腺癌 ΠΙ+IV中 CST1第一种剪切子的 RLU中位数是 Ι+Π的 15倍， 说明 CST1第一种剪切 子的表达量可用于乳腺癌 pTNM分期。
实施例 14. CST1第一种剪切子表达量用于乳腺癌治疗过程中的动态监测
通过实时定量 PCR法检测患者血液中 CST1第一种剪切子的表达量， 引物序列如 SEQ ID No.l和 SEQ ID No.2所示， 扩增子序列如 SEQ ID No.50所示， 实时监测乳腺癌患者 （化 疗 6人， 放疗 4人） 的治疗效果。 结果如表 2所示， 治疗有效患者血液中 CST1第一种剪切 子的表达量随着疗程增加而逐渐降低， 同时影像学观察发现乳腺癌肿块逐渐减小； 而治疗无 效患者血液中 CST1第一种剪切子的表达量随着疗程的增加而逐渐上升， 同时影像学观察发 现乳腺癌肿块逐渐变大。 因此， CST1 第一种剪切子的表达量可作为乳腺癌患者治疗效果的 评价指标， 用于乳腺癌治疗过程中的动态监测。
表 2 实时定量 PCR检测放化疗过程中乳腺癌患者血液中 CST1第一种剪切子的表达量
实施例 15. CST1第一种剪切子表达量用于乳腺癌患者的预后判断
通过实时定量 PCR法检测患者血液中 CST1第一种剪切子的表达量， 引物序列如 SEQ ID No.l和 SEQ ID No.2所示， 扩增子序列如 SEQ ID No.50所示， 分别在术后或放化疗后的 1个月、 3个月、 1年考察 5个乳腺癌患者的预后效果。 结果如表 3所示， 一年后复发的 2 个患者血液中 CST1 第一种剪切子的表达量随着时间的延长而逐渐增高， 当达到约 1000拷 贝时被影像学发现确诊； 而 1年内没有复发的 3个患者血液中 CST1第一种剪切子的表达量 随着时间的延长并无明显变化， 影像学也无发现异常。 因此， CST1 第一种剪切子的表达量 可作为乳腺癌患者预后判断的指标。
表 3 实时定量 PCR检测术后或放化疗后乳腺癌患者血液中 CST1第一种剪切子的表达量
实施例 16.基于 TaqMan水解探针法实时 PCR的 CST1第一种剪切子检测试剂盒 至少包括以下组分： ①针对 CST1第一个剪切子的引物： 上游引物： 5'- tctcaccctcctctcctg -3' ( SEQ ID No.l ); 下游引物： 5'-ttatcctatcctcctccttgg-3， ( SEQ ID No.2); ②针对 CST1第一 个剪切子的探针： 5*-ctccagctttgtgctctgcctct-3* ( SEQ ID No.3 ) , 5'端用 FAM 标记， 3'端用 TAMRA标记。
还可以包括以下组分中的任一种或多种： RNA提取试剂、 逆转录试剂、 脱氧核糖核苷 酸 （dNTP)、 缓冲液、 MgCl2、 DNA聚合酶、 包含 CST1第一种剪切子扩增子 （序列如 SEQ ID No.51所示） 的重组质粒标准品 [其图谱如图 1所示； 针对 CST1第一种剪切子的引物： 上游引物： 5 '-gggctccctgcctcgggctctcac-3 ' ( SEQ ID No.22); 下游引物： 5'-acggtctgttgcctggct- cttagt-3' ( SEQ ID No.23 )] 阳性对照 （乳腺癌细胞株 HCC1937)、 阴性对照 （人正常乳腺细 胞株 Hs578Bst)。
检测时， 分别将实验组、 阳性对照组、 阴性对照组与重组质粒标准品进行实时 PCR扩 增， 根据重组质粒标准品的浓度梯度和扩增后对应的 CP值作标准曲线， 再依据该标准曲线 给出实验组、 阳性对照组和阴性对照组的拷贝数。
实施例 17.基于染料法实时 PCR的 CST1第一种剪切子检测试剂盒
至少包括以下任一对引物： 针对 CST1 第一个剪切子的引物： ①上游引物： 5'-tctcaccct- cctctcctg-3' ( SEQ ID No.l ); 下游引物： 5 ' -ttatcctatcctcctccttgg-3 ' ( SEQ ID No.2); ②上游引 物： 5'-ccctgggagaacagaaggtcc-3， (SEQ ID No.4); 下游引物： 5'-ggtggtggctggtgcgaat-3， (SEQ ID No.5); ③上游引物： 5'-cattcgcaccagccaccac-3， (SEQ ID No.6); 下游引物： 5'-agaagcaa- gaaggaaggagggag-3' (SEQ ID No.7); ④上游弓 I物： 5 ' -cagcgtgcccttcacttcg-3 ' (SEQ ID No. 8)； 下游引物： 5 ' -cggtctgttgcctggctctta-3 ' (SEQ ID No.9); ⑤上游引物： 5'-cattcgcaccagcca- ccac-3' (SEQ ID No.10); 下游引物： 5 ' -cagggctatagaagcaagaaggaa-3 ' (SEQ ID No.ll)； ⑥上 游引物： 5 '-ggtacagcgtgcccttcacttc-3 ' (SEQ ID No.12); 下游引物： 5 '-cggtctgttgcctggctctta-3 '
(SEQ ID No.13); ⑦上游引物： 5 ' -gagaacagaaggtccctggtgaa-3 ' (SEQ ID No.14); 下游引 物： 5'-ggtggtggctggtgcgaat-3， ( SEQ ID No.15 )； ⑧上游引物： 5'-tgggtacagcgtgcccttca-3，
(SEQ ID No.16); 下游引物： 5 '-cggtctgttgcctggctctta-3 ' (SEQ ID No.17); ⑨上游引物： 5'- ccctgggagaacagaaggtcc-3 ' (SEQ ID No.18); 下游引物： 5 '-tggtggctggtgcgaatgg-3 ' (SEQ ID No. 19)； ⑩上游引物： 5'-ttccctgggag- aacagaaggtcc-3' (SEQ ID No.20); 下游引物： 5 ' -tggtggctggtgcgaatgg-3 ' (SEQ ID No.21)o
还可以包括以下组分中的任一种或多种： 针对内参基因 β-actin 的引物： 上游引物： 5'- aagatcattgctcctcctg-3' (SEQ ID No.32); 下游引物： 5'-cgtcatactcctgcttgc-3' (SEQ ID No.33); RNA提取试剂、 逆转录试剂、 荧光染料 （如 SYBR Green ) dNTP、 缓冲液、 MgCl2、 DNA 聚合酶。
实施例 18.基于 NASBA的 CST1第一种剪切子检测试剂盒
至少包括以下组分： ①针对 CST1第一个剪切子的引物： 上游引物： 5'-aattctaatacgactca- ctatagggtctcaccctcctctcctg-3 ' (SEQ ID No.34); 下游引物： 5 '-ttatcctatcctcctccttgg-3 ' (SEQ ID No.2); ②针对 CST1第一个剪切子的探针： 5'-ctccagctttgtgctctgcctct-3' (SEQ ID No.3)， 5'端 用 FAM标记， 3'端用 DABSYL标记。
还可以包括以下组分中的任一种或多种： R A提取试剂、 逆转录试剂、 R A荧光染料 (如 Ribo-Green fluorescent dye)、 T7 RNA聚合酶、 RNase H、 禽骨髓白血病病毒 （AMV) 逆转录酶、 核糖核苷酸 （NTP)、 dNTP。
实施例 19.基于 TMA的 CST1第一种剪切子定量检测试剂盒
至少包括以下组分： ①针对 CST1 第一个剪切子的引物： 上游引物： 5'-aattctaatacgactc- actatagggtctcaccctcctctcctg-3 ' (SEQ ID No.34); 下游引物： 5 ' -ttatcctatcctcctccttgg-3 ' ( SEQ ID No.2); ②针对 CST1第一个剪切子的探针： 5'-ctccagctttgtgctctgcctct-3' (SEQ ID No.3)， 5'端 用 FAM标记， 3'端用 DABSYL标记。
还可以包括以下组分中的任一种或多种： R A提取试剂、 逆转录试剂、 R A荧光染料 (如 Ribo-Green fluorescent dye)、 T7 R A聚合酶、 RNase H、 禽骨髓白血病病毒 （AMV) 逆转录酶、 NTP、 dNTP。
实施例 20.基于 LCR的 CST1第一种剪切子定量检测试剂盒
至少包括以下 4条探针： 5'-agtatctgagtaccctgctgctcctgc-3， ( SEQ ID No.35 ); 5'-accctagct- gtggccctggcctggag-3 ' ( SEQ ID No.36 )； 5 '-catagactcatgggacgacg-3 ' ( SEQ ID No.37 )； 5'- acaccgggaccggacctc-3' ( SEQ ID No.38 ); 每条探针的 5'端用半抗原标记。
还可以包括以下组分中的任一种或多种： R A提取试剂、 逆转录试剂、 T4 DNA连接 酶、 dNTP。
实施例 21.基于 tSDA的 CST1第一种剪切子检测试剂盒
至少包括以下组分： ①针对 CST1第一个剪切子的引物： CST1 B1弓 I物： 5'-tgggtacagc- gtgcccttcactt-3' ( SEQ ID No.39); CST1 SI弓 |物： 5 '-ccgctcgagtacagcgtgcccttcacttcgc-3 ' ( SEQ ID No.40); CST1 B2弓 I物: 5 '-caacggtctgttgcctggctctta-3 ' ( SEQ ID No.41 ); CST1 S2引物: 5 '-gacctcgaggttgcctggctcttagtacccg-3 ' ( SEQ ID No.42); ②针对 CST1第一个剪切子的探针： 5 ' -gtgctcgagtcagcgagtataacaaggccaccaaagatgactac-3 ' ( SEQ ID No.43 ), 5 '端用 32P标记。
还可以包括以下组分中的任一种或多种： R A 提取试剂、 逆转录试剂、 dCTPctS、 dATP、 dGTP、 dTTP、 Bsobl酶、 exo-Bca酶。
(二） 蛋白水平
优选实施例中使用的 Cystatin SN重组蛋白， 兔抗 Cystatin SN多克隆抗体购自 NOVUS Biologicals, 鼠抗人 Cystatin SN 单克隆抗体 （特异性识别序列如 SEQ ID No.54 所示的 Cystatin SN表位） 购自 R&D， TMB过氧化物酶底物 （TMB Peroxidase Substrate, 包含 TMB solution A禾口 Peroxidase Solution B ) 贝勾自 Kirkegaard and Perry Laboratories Inc.。
血清样品的制备是将全血标本于室温放置 2小时或 4°C过夜后， 1000g离心 20分钟， 取 上清即可检测， 或置 -20°C或 -80°C保存， 避免反复冻融。 血浆样品的制备是用 EDTA或肝素 作为抗凝剂， 标本采集后 30分钟内于 2〜8°C、 1000g离心 15分钟， 取上清即可检测， 或置- 20°C或 -80°C保存， 避免反复冻融。 血清或血浆样品用 pH7.0〜7.2、 0.1M 的 PBS稀释 10倍 后进行测定。
实施例 22.人乳腺癌细胞株培养上清与正常人血清中 Cystatin SN的表达差异
取 CST1 mR A高表达的人乳腺癌细胞株 HCC1937 (泳道 1-2)、 MCF-7 (泳道 3-4 ) 的 培养上清以及正常人的血清样本 S1 (泳道 5-6 ) 和 S2 (泳道 7-8 )， 进行 15%的 SDS- PAGE。 电泳完毕后， 将蛋白电转移至硝酸纤维素膜上， 用含有 5%脱脂奶粉和 0.1% Tween- 20的 PBS于室温下封闭 2小时， 加入抗 Cystatin SN多克隆抗体于 4°C温育过夜， 用含有 0.1% Tween-20的 PBS洗涤 3次， 再加入辣根过氧化物酶 （HRP) 标记的山羊抗兔 IgG于 37 °C温育 1小时， 用含有 0.1% Tween-20的 PBS洗涤 4次， 再用 PBS洗涤 1次， 之后用 TMB 过氧化物酶底物显色检测， 以 β-actin为内参蛋白。 结果如图 17所示， 泳道 1-4中检测到约 16Kda的强条带， 而泳道 5-8仅检测到约 16Kda的弱条带， 说明 CST1 编码的 Cystatin SN 在人乳腺癌细胞中异常高表达。
实施例 23.乳腺癌患者与正常人血清中 Cystatin SN的表达差异
取正常人的血清样本 （泳道 1-2) 和乳腺癌患者的血清样本 （泳道 3-6)， 按照实施例 22 所述方法进行 SDS-PAGE、 蛋白电转和免疫印迹。 结果如图 18所示， 泳道 1-2仅检测到弱 条带， 而泳道 3-6检测到强条带， 说明 Cystatin SN在乳腺癌患者血清中异常高表达。
实施例 24.竞争 ELISA测定乳腺癌患者与正常人血清中 Cystatin SN的表达差异 用 5ug/ml Cystatin SN 包被 ELISA 平板， 再用 3% BSA 封闭平板， 血清样品与抗 Cystatin SN 单克隆抗体 （1 :2000 ) 于 37°C温育 1 小时， 用 TBS (含有 154mM NaCl 的 pH7.5、 10mM Tris-HCl) 洗涤， 再加入 0.08ug/ml HRP标记的山羊抗兔 IgG于 37°C温育 1小 时， 用 TBS洗涤， 再加入 0.4mg/ml邻苯二胺 （溶于 pH5、 500mM磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液 中） 反应， 用酶联仪定量。 共测定了 20 例正常人血清和 30 例乳腺癌患者血清。 结果如图 19所示， 正常人血清中 Cystatin SN浓度中位数为 1.7ng/ml， 乳腺癌患者血清中 Cystatin SN 浓度中位数为 4.1ng/ml， 从 3.25ng/ml处划线， 基本可以将癌和正常区分开来。
实施例 25.双抗夹心 ELISA测定乳腺癌患者与正常人血清中 Cystatin SN的表达差异 用 5ug/ml鼠抗人 Cystatin SN单克隆抗体包被 ELISA平板， 再用 3%BSA封闭平板， 加 入血清样品于 37°C温育 1小时， 用 TBS洗涤， 再加入生物素标记的兔抗 Cystatin SN多克隆 抗体 （1 :1000 ) 于 37°C温育 1小时， 用 TBS洗涤， 再加入亲合素-过氧化物酶复合物于 37°C 温育 1 小时， 用 TBS洗涤， 再每孔加入 TMB过氧化物酶底物， 用酶联仪定量。 共测定了 30例正常人血清和 50例乳腺癌患者血清。 结果如图 20所示， 正常人血清中 Cystatin SN浓 度中位数为 0.525ng/ml， 乳腺癌患者血清中 Cystatin SN 浓度中位数为 2.99ng/ml， 从 1.48ng/ml处划线， 基本可以将癌和正常区分开来。
实施例 26. ELISA测定乳腺癌患者血清 Cystatin SN和癌胚抗原 （CEA) 的灵敏度和特 异性比较
按照实施例 25所述方法测定 Cystatin SN血清水平。 采用商品化的 CEA ELISA试剂盒 进行 CEA检测， 按照试剂盒说明书操作。 共测定了 30例正常人血清和 30例乳腺癌患者血 清。 结果如图 21 所示， Cystatin SN 曲线下面积为 0.994， CEA 曲线下面积为 0.833， 说明 ELISA测定 Cystatin SN比测定 CEA在灵敏度和特异性方面更具有优越性。
实施例 27.基于竞争 ELISA法的 Cystatin SN定量检测试剂盒
1、 试剂盒的组成
至少包括以下组分： 包被抗原 （Cystatin SN ) ; 一抗 （鼠抗人 Cystatin SN 单克隆抗 体）； 酶标二抗 （HRP标记的山羊抗兔 IgG); 酶作用底物 （邻苯二胺）。
还可以包括以下组分中的任一种或多种： 封闭液 （3%BSA)、 洗涤缓冲液 （TBS , 即含 有 154mM NaCl的 pH7.5、 10mM Tris-HCl)。
2、 试剂盒的使用方法
用 5mg/ml Cystatin SN 包被 ELISA 平板， 再用 3%BSA 封闭平板， 血清样品与抗 Cystatin SN单克隆抗体 （1 :2000) 于 37°C温育 1小时， 用 TBS洗涤， 再加入 0.08ug/ml HRP 标记的山羊抗兔 IgG于 37°C温育 1 小时， 用 TBS洗涤， 再加入 0.4mg/ml邻苯二胺 （溶于 pH5、 500mM磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液中） 反应， 用酶联仪定量。
实施例 28.基于双抗夹心 ELISA法的 Cystatin SN定量检测试剂盒
1、 试剂盒的组成
至少包括以下组分： Cystatin SN标准品， 临用前用含有 1%BSA的 PBST溶解或稀释制 成一系列梯度溶液， 如浓度分别为 10、 5、 2.5、 1、 0.5、 0.25ng/ml ; 包被抗体 （鼠抗人 Cystatin SN单克隆抗体）； 生物素标记二抗 （生物素标记的兔抗 Cystatin SN多克隆抗体）； 亲合素-过氧化物酶复合物； 过氧化物酶作用底物 （TMB过氧化物酶底物）。
还可以包括以下组分中的任一种或多种： 包被抗体稀释液 （pH9、 0.05M的 NaHC03)、 封闭液 （含有 3%BSA 的 PBST )、 二抗稀释液 （含有 1%BSA 的 PBST )、 洗涤缓冲液 (PBST, 即含有 0.05% Tween-20的 PBS)、 终止液 （2N H2S04)。
2、 试剂盒的使用方法
用包被抗体缓冲液将包被抗体稀释至蛋白含量为 5 g/ml， 加至 ELISA平板中， 每孔 0.1ml, 4°C孵育过夜， 弃去孔内液体， 用洗涤缓冲液洗涤 3 次， 每次 3 分钟。 再每孔加入 200ul封闭液， 37°C温育 1 小时或 4°C孵育过夜， 弃去孔内液体， 用洗涤缓冲液洗涤 3次， 每次 3 分钟。 分别设空白孔、 标准品孔、 样品孔， 空白孔每孔加样品稀释溶剂即 pH7.0〜7.2、 0.1M 的 PBS ΙΟΟμΙ, 标准品孔每孔加 Cystatin SN标准品溶液 100μ1， 样品孔每 孔加血清或血浆样品 100μ1， 37°C温育 2小时， 弃去孔内液体， 甩干。 再每孔加入生物素标 记二抗 ΙΟΟμΙ (使用前用二抗稀释液进行 1 :200稀释）， 37°C温育 1小时， 弃去孔内液体， 用 洗涤缓冲液洗涤 3次， 每次 1〜2分钟。 再每孔加入亲合素 -过氧化物酶复合物 100μ1， 37°C温 育 1小时， 弃去孔内液体， 用洗涤缓冲液洗涤 5次， 每次 1〜2分钟。 再每孔加入过氧化物酶 作用底物 50μ1， 37°C避光显色 （15分钟内， 待肉眼可见标准品前 4-5孔有明显的梯度兰色、 后 4-5孔梯度不明显时即可终止）。 再每孔加入终止液 50μ1终止反应 （蓝色立转黄色）。 用酶 联仪于 405nm波长处测量各孔光密度 （OD值）。 根据标准品浓度和对应的 OD值绘制散点 曲线， 计算 R2和曲线方程式， 如 R2 0.95， 则将样品 OD值代入曲线方程式中， 即可算出 血清或血浆样品中的 Cystatin SN浓度。
实施例 29. Cystatin SN表达水平用于乳腺癌 pTNM分期
采用实施例 28所述试剂盒及其使用方法检测经病理确诊的乳腺癌 T期患者 20人、 N期 患者 30人和 M期患者 30人血清中的 Cystatin SN表达水平， 结果如表 4所示， 可见随着病 程的进展， Cystatin SN 表达水平亦随之提高， 提示 Cystatin SN 表达水平可用于乳腺癌 pTNM分期。
表 4 不同病理分期的乳腺癌患者 Cystatin SN表达水平
实施例 30. Cystatin SN表达水平用于评估乳腺癌是否转移
采用实施例 28所述试剂盒及其使用方法检测经病理确诊的乳腺癌未转移患者 20人和转 移患者 30 人血清中的 Cystatin SN 表达水平， 结果如表 5 所示， 可见乳腺癌转移患者的 Cystatin SN 表达水平高于未转移者， 提示 Cystatin SN 表达水平可用于评估乳腺癌是否转 移。
表 5 转移与未转移乳腺癌患者 Cystatin SN表达水平
实施例 31. Cystatin SN表达水平用于评估乳腺癌化疗联合内分泌治疗的效果
2885例 N0-1期乳腺癌患者， 行 4个周期的 AC (多柔比星 +环磷酰胺） 或 AT (多柔比 星 +紫杉醇） 方案化疗， 再根据激素受体 （HR) 状况选择是否行辅助内分泌治疗， 采用实施 例 28所述试剂盒及其使用方法检测治疗周期结束后患者血清中的 Cystatin SN表达水平， 有 效数据 776例， Cystatin SN表达中位数为 4.06ng/ml， 之后随访 76个月， 记录患者的无病生 存情况。 结果如图 22所示， 高于上述 Cystatin SN表达中位数的患者无病生存率为 20%， 低于上述 Cystatin SN表达中位数的患者的无病生存率为 60%， 提示 Cystatin SN表达水平可 用于评估乳腺癌化疗联合内分泌治疗的效果。
虽然通过上述具体实施例对本发明进行了比较详细的描述， 但可以理解的是， 本发明为 了清楚而在各个实施例中描述的技术特征也可按需要重新组合应用， 所有技术特征的等同替 换、 修饰和改变对本领域技术人员来说都是显而易见的， 因此， 这些等同替换、 修饰和改变 也包括在本发明范围之内。

Claims (21)

  1. 权利要求书
    1. CST1基因剪切子、 CST1基因编码蛋白 Cystatin SN及其表位肽作为乳腺癌诊断和预示 标志物的应用， 所述 CST1 基因剪切子的核苷酸序列如 SEQ ID No.48 所示， 所述 Cystatin SN的氨基酸序列如 SEQ ID No.52所示。
  2. 2. 根据权利要求 1 所述的应用， 其特征在于， 所述 Cystatin SN 表位肽的氨基酸序列如 SEQ ID No.54所示。
  3. 3. 根据权利要求 1或 2所述的应用， 其特征在于， 所述乳腺癌诊断和预示包括乳腺癌或乳 腺癌组织转移的鉴别诊断和 /或易感性分析， 乳腺癌或乳腺癌组织转移治疗药物、 治疗方 法、 治疗疗效及预后的评估， 以及相关人群乳腺癌或乳腺癌组织转移患病风险的评估。
    4. CST1基因剪切子的捕获剂和 CST1基因编码蛋白 Cystatin SN的捕获剂在制备乳腺癌诊 断和预示试剂、 试剂盒及芯片中的应用， 所述 CST1 基因剪切子的捕获剂为特异性识别 CST1基因剪切子或其 cDNA的引物和 /或探针， 所述 Cystatin SN的捕获剂为抗 Cystatin SN的抗体， 所述 CST1基因剪切子的核苷酸序列如 SEQ ID No.48所示， 所述 Cystatin SN的氨基酸序列如 SEQ ID No.52所示。
  4. 5. 根据权利要求 4所述的应用， 其特征在于， 所述引物为核苷酸序列如 SEQ ID No.l~2、 4~21、 34和 39~42所示的至少一种， 所述探针为核苷酸序列如 SEQ ID No.3、 35~38和 43所示的至少一种。
  5. 6. 根据权利要求 5所述的应用， 其特征在于， 所述引物的核苷酸序列如 SEQ ID N<sub>0</sub>.l~2所 示， 所述探针的核苷酸序列如 SEQ ID No.3所示。
  6. 7. 包含 CST1基因剪切子的捕获剂或 CST1基因编码蛋白 Cystatin SN的捕获剂的试剂盒在 制备乳腺癌诊断和预示试剂盒中的应用， 所述 CST1 基因剪切子的捕获剂为特异性识别 CST1基因剪切子或其 cDNA的引物和 /或探针， 所述 Cystatin SN的捕获剂为抗 Cystatin SN的抗体， 所述 CST1基因剪切子的核苷酸序列如 SEQ ID No.48所示， 所述 Cystatin SN的氨基酸序列如 SEQ ID No.52所示。
  7. 8. 根据权利要求 7所述的应用， 其特征在于， 所述引物为核苷酸序列如 SEQ ID No.l~2、 4~21、 34和 39~42所示的至少一种， 所述探针为核苷酸序列如 SEQ ID No.3、 35~38和 43所示的至少一种。
  8. 9. 根据权利要求 8所述的应用， 其特征在于， 所述引物的核苷酸序列如 SEQ ID N<sub>0</sub>.l~2所 示， 所述探针的核苷酸序列如 SEQ ID No.3所示。
  9. 10. 表面固定有 CST1 基因剪切子的捕获剂的芯片在制备乳腺癌诊断和预示芯片中的应用， 所述 CST1基因剪切子的捕获剂为特异性识别 CST1基因剪切子或其 cDNA的探针， 所 述 CST1基因剪切子的核苷酸序列如 SEQ ID No.48所示。
  10. 11. 根据权利要求 10 所述的应用， 其特征在于， 所述探针为核苷酸序列如 SEQ ID No.3、 35-38和 43所示的至少一种。
  11. 12. 根据权利要求 11所述的应用， 其特征在于， 所述探针的核苷酸序列如 SEQ ID No.3所 示。
  12. 13. 包含 CST1 基因剪切子的捕获剂的乳腺癌诊断和预示试剂盒， 其特征在于， 所述 CST1 基因剪切子的捕获剂为特异性识别 CST1基因剪切子的 cDNA的引物和探针， 所述引物 的核苷酸序列如 SEQ ID No.l~2所示， 所述探针的核苷酸序列如 SEQ ID No.3所示， 探 针的 5'端用荧光基团标记， 3'端用淬灭基团标记。
  13. 14. 根据权利要求 13 所述的乳腺癌诊断和预示试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒中还包括 含有 CST1 第一种剪切子扩增子的重组质粒标准品， 所述 CST1第一种剪切子扩增子的 核苷酸序列如 SEQ ID No.51所示。
  14. 15. 根据权利要求 14 所述的乳腺癌诊断和预示试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒中还包含 阳性对照乳腺癌细胞株 HCC1937和阴性对照人正常乳腺细胞株 Hs578Bst。
  15. 16. 包含 CST1 基因剪切子的捕获剂的乳腺癌诊断和预示试剂盒， 其特征在于， 所述 CST1 基因剪切子的捕获剂为特异性识别 CST1基因剪切子的 cDNA的引物和探针， 所述引物 的核苷酸序列如 SEQ ID No.34和 SEQ ID No.2所示， 所述探针的核苷酸序列如 SEQ ID No.3所示， 探针的 5'端用荧光基团标记， 3'端用淬灭基团标记。
  16. 17. 包含 CST1 基因剪切子的捕获剂的乳腺癌诊断和预示试剂盒， 其特征在于， 所述 CST1 基因剪切子的捕获剂为特异性识别 CST1基因剪切子的 cDNA的引物和探针， 所述引物 的核苷酸序列如 SEQ ID No.39-44所示， 所述探针的核苷酸序列如 SEQ ID No.43所示， 探针的 5'端用放射性同位素标记。
  17. 18. 包含 CST1 基因剪切子的捕获剂的乳腺癌诊断和预示试剂盒， 其特征在于， 所述 CST1 基因剪切子的捕获剂为特异性识别 CST1基因剪切子的 cDNA的引物， 所述引物的核苷 酸序列如 SEQ ID No.l~2所示， 或者如 SEQ ID No.4~5所示， 或者如 SEQ ID No.6~7所 示， 或者如 SEQ ID No.8~9 所示， 或者如 SEQ ID Νο.10~11 所示， 或者如 SEQ ID Νο.12~13所示， 或者如 SEQ ID Νο.14~15所示， 或者如 SEQ ID Νο.16~17所示， 或者如 SEQ ID No.18-19所示， 或者如 SEQ ID No.20~21所示。
  18. 19. 包含 CST1 基因剪切子的捕获剂的乳腺癌诊断和预示试剂盒， 其特征在于， 所述 CST1 基因剪切子的捕获剂为特异性识别 CST1基因剪切子的 cDNA的探针， 所述探针的核苷 酸序列如 SEQ ID No. 35-38所示， 每条探针的 5'端用半抗原标记。
  19. 20. 包含 CST1 基因编码蛋白 Cystatin SN 的捕获剂的乳腺癌诊断和预示试剂盒， 其特征在 于， 所述 CST1基因编码蛋白 Cystatin SN的捕获剂为抗 Cystatin SN单克隆抗体， 所述 试剂盒中还包含 Cystatin SN抗原、 酶标第二抗体和酶作用底物。
  20. 21. 包含 CST1 基因编码蛋白 Cystatin SN 的捕获剂的乳腺癌诊断和预示试剂盒， 其特征在 于， 所述 CST1基因编码蛋白 Cystatin SN的捕获剂为抗 Cystatin SN单克隆抗体和生物 素标记的抗 Cystatin SN多克隆抗体， 所述试剂盒中还包含 Cystatin SN标准品、 亲合素- 酶复合物和酶作用底物。
  21. 22. 运用权利要求 13~21任一项所述的乳腺癌诊断和预示试剂盒诊断或预示乳腺癌的方法， 其特征在于， 用所述试剂盒检测待测样品中 CST1 基因剪切子或 CST1 基因编码蛋白 Cystatin SN的含量或表达水平， 将检测结果与阈值进行比较， 如果超过阈值则判定为阳 性； 所述阈值是通过对比正常人与乳腺癌患者体液或组织中 CST1 基因剪切子或 CST1 基因编码蛋白 Cystatin SN的含量或表达水平统计得到； 所述待测样品为手术组织、 穿刺 组织、 淋巴结组织、 骨髓、 血清样品、 血浆样品、 全血样品、 血液级分样品或尿样。
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