KR20170100206A

KR20170100206A - 대장암 진단용 조성물과 진단 마커 검출 방법

Info

Publication number: KR20170100206A
Application number: KR1020160022470A
Authority: KR
Inventors: 김성훈; 박민철; 찰스 고흐너 피터
Original assignee: 재단법인 의약바이오컨버젼스연구단
Priority date: 2016-02-25
Filing date: 2016-02-25
Publication date: 2017-09-04
Also published as: JP2019507594A; JP6847972B2; WO2017146529A1; EP3409790A1; KR101851003B1; US20190018015A1; CN109312405A; EP3409790A4; US11360093B2

Abstract

본 발명은 대장암 진단용 조성물과 진단 마커 검출 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는, KRS(lysyl-tRNA synthetase) 및 AIMP1(aminoacyl-tRNA synthetase complex-interacting multifunctional Protein 1)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 mRNA 또는 이의 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 대장암 진단용 조성물 및 대장암 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여 피검체로부터 수득한 시료로부터 상기 마커를 검출하는 방법에 관한 것이다.
KRS 및 AIMP1으로 이루어진 본 발명의 대장암 진단 마커는 대장암 환자의 혈청에서 정상 대조군과 비교해 그 발현수준이 증가해 있다. 따라서, KRS 및 AIMP1로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 마커의 발현 수준을 측정함으로써 대장암 유무를 정확하고 신속하게 판단할 수 있다.

Description

대장암 진단용 조성물과 진단 마커 검출 방법{Composition and method for detecting a diagnostic marker for renal cell carcinoma}

본 발명은 대장암 진단용 조성물과 진단 마커 검출 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는, KRS(lysyl-tRNA synthetase) 또는 AIMP1(aminoacyl-tRNA synthetase complex-interacting multifunctional Protein 1) mRNA 또는 이의 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 대장암 진단용 조성물 및 대장암 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여 피검체로부터 수득한 시료로부터 상기 마커를 검출하는 방법에 관한 것이다.

우리나라 암(악성신생물) 사망자 수는 2002년 우리나라 총 사망자 246,515명(조사망률 인구 10만 명당 512명) 가운데 25.5%(남성 사망자의 29.6%, 여성 사망자의 20.5%)인 62,887명으로 암으로 인한 사망(사망률 인구 10만명당 130.7명)이 사망원인 1위를 차지하고 있다. 암 사망순위는 폐암, 위암, 간암, 대장암 및 췌장암 순으로, 이들 5대 암에 의한 사망이 전체 암 사망의 약 70%를 차지하고 있다. 또한 남성에 있어 주요 암 사망원인은 폐암, 위암, 간암 및 대장암 등으로 이들 4대 암에 의한 사망자 수(28,147명)가 전체 남성 암 사망자 수(40,177명)의 70%를 차지하고 있으며, 여성에 있어 주요 암 사망원인은 위암, 폐암, 간암, 대장암 및 췌장암 등으로 이들 5대 암에 의한 사망자 수(13,630명)가 전체 여성 암 사망자 수(22,710명)의 60%를 차지하고 있다.

대장암은 결장과 직장에 생기는 악성 종양을 말하며, 세계적으로 2000년 발생률(945,000명 신규 발생, 세계 전체 암의 9.4%)과 사망률(492,000명 사망, 전체 암중 7.9%)이 모든 암 중 세 번째로 높고, 성별로 비교해보면 남자와 여자에게서 비슷한 비율로 발생한다(남:여 1.1:1). 다른 암들에 비해 상대적으로 예후가 좋기 때문에 유병률은 유방암에 이어 세계적으로 두 번째로 높은데, 과거 5년 이내에 대장암으로 진단되어 생존하고 있는 사람이 약 240만 명으로 추정된다(Parkin DM, Global cancer statistics in the year 2000, Lancet Oncol 2:533-543, 2001). 대장암 예후는 초기(1기) 환자의 경우 5년 생존율이 90% 이상인데 반해 전이된(4기) 환자의 5년 생존율은 5%에 불과하다(Cancer Facts and Figures 2004. American Cancer Society, 2004).

우리나라에서는 최근 식생활 문화의 서구화로 대장암의 발생률과 사망률이 현저히 증가하고 있다. 보건복지부와 한국중앙암등록본부에서 발간한 한국중앙암등록사업 연례 보고서(2002.1 ~ 2002. 12)에 따르면 2002년에 대장암 발생건수가 11,097건으로 전체 발생 암의 11.2%를 차지하는 네 번째로 많은 암이다. 성별로는 남성이 6,423명으로 여성(4,674명)보다 많으며 연령별로는 60대가 가장 많고(3,751명), 50대가 그 뒤를 잇고 있다(2,400명). 1999년부터 2002년까지 4년간 자료에 의하면 대장암의 발생률이 꾸준히 증가하고 있으며 조발생률(인구 100,000명당 새로 발생한 암환자수)을 보면 1999년에 비해 2002년에 남자의 경우 22.5에서 30.7로 36.4% 증가하였으며, 여자의 경우 18.8에서 23.1로 22.9% 증가하여 전체적으로 20.6에서 26.9로 30.6%나 크게 증가하였다(1993-2002년 암발생자의 생존율 및 1999-2002년 암 발생률, 보건복지부, 2007. 7.). 2006년에 대장암으로 사망한 사람은 총 6,277명으로 전체 암 사망의 4위(9.5%)이며 남자는 3,453명으로 4위(8.0%), 여자는 2,824명으로 3위(11.5%)를 차지하였다. 또한 대장암은 폐암 다음으로 지난 10년 동안 사망률이 가장 많이 증가한 암이다(2006년 사망 및 사망원인통계결과, 통계청, 2007. 9.).

대장암의 경우 제거할 수 있는 전암성 병변이나 치료할 수 있는 초기단계 암으로부터 발달이 느리기 때문에 대장암 스크리닝은 이 질병의 발생률과 사망률을 줄일 수 있는 가능성이 있다. 50세 이상의 성인 남녀 모두에 대한 대장암 스크리닝 검사를 통해 대장암으로 인한 사망률을 감소시킬 수 있다고 믿어진다(Walsh JM & Terdiman JP, JAMA 289:1288-96, 2003). 그러나 현재 가장 신뢰성 있는 스크리닝 방법인 대장내시경에 대한 순응도와 보급률이 낮다. 반대로 현재 가장 널리 시행되는 비침입성 스크리닝(noninvasive screening) 옵션인 분변 잠혈검사(fecal occult blood test, FOBT)는 무엇보다 민감도가 낮다는 문제를 포함하여 여러 중요한 한계점들이 있다. 미국의 경우 2002년에 50세 이상 성인 중 40%만 지난 5년 이내에 대장내시경 검사를 받았고, 12개월 이내에 분변 잠혈검사를 받은 사람은 22%에 불과했다(Behavior risk factor survey, National center for chronic disease prevention and health promotion. Centers for disease control and prevention, 2002). 대장암 스크리닝 검사에 대한 참여율이, 특히 유방암과 자궁경부암에 비해 낮은 이유는 환자의 불편함, 비용, 인지도 부족, 현재 스크리닝 방법에 대한 낮은 수용성 등을 포함하는 여러 요인들 때문이다.

따라서 정확하고 신속하게 대장암을 조기 진단하기 위한 새로운 마커의 개발이 매우 중요하다고 할 수 있다.

이에 본 발명자들은 대장암을 효과적으로 진단할 수 있는 바이오 마커를 개발하고자 예의 노력한 결과, 대장암 환자의 혈청에서 간단하고 신속하게 검출이 가능하고, 민감도 및 특이도가 높은 바이오 마커를 발견하고 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 KRS(lysyl-tRNA synthetase) 및 AIMP1(aminoacyl-tRNA synthetase complex-interacting multifunctional Protein 1)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 mRNA 또는 이의 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 대장암 진단용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 KRS 및 AIMP1으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 mRNA 또는 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 대장암 진단용 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 대장암 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여,

(a) 피검체로부터 시료를 제공하는 단계;

(b) 상기 시료에서 KRS 및 AIMP1으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 mRNA의 발현 수준 또는 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계; 및

(c) 상기 유전자 mRNA의 발현 수준 또는 단백질의 발현 수준을 정상 대조구 시료의 해당 유전자 mRNA의 발현 수준 또는 단백질 발현 수준과 비교하여 발현 수준이 증가한 피검체를 대장암에 걸린 것으로 판정하는 단계를 포함하는 대장암의 마커를 검출하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 대장암의 치료 후보물질의 투여 후, KRS 및 AIMP1으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 mRNA의 발현 수준 또는 단백질의 발현 수준을 측정하는 것을 포함하는, 대장암 치료제의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.

상기한 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 KRS(lysyl-tRNA synthetase) 및 AIMP1(aminoacyl-tRNA synthetase complex-interacting multifunctional Protein 1)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의의 mRNA 또는 이의 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 대장암 진단용 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 KRS 및 AIMP1으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 mRNA 또는 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 대장암 진단용 키트를 제공한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 대장암 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여,

(a) 피검체로부터 시료를 제공하는 단계;

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 대장암의 치료 후보물질의 투여 후, KRS 및 AIMP1으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 mRNA의 발현 수준 또는 단백질의 발현 수준을 측정하는 것을 포함하는, 대장암 치료제의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 KRS(lysyl-tRNA synthetase) 및 AIMP1(aminoacyl-tRNA synthetase complex-interacting multifunctional Protein 1)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 mRNA 또는 이의 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 대장암 진단용 조성물을 제공한다.

본 발명자들은 KRS(lysyl-tRNA synthetase) 및 AIMP1(aminoacyl-tRNA synthetase complex-interacting multifunctional Protein 1)가 대장암 환자에서 정상인 대조군보다 현저하게 증가함을 처음으로 확인하여, 새로운 대장암 진단 마커로서의 가치가 매우 높다는 것을 확인하였다.

본 발명의 다른 일실시예에서는 KRS(lysyl-tRNA synthetase) 및 AIMP1(aminoacyl-tRNA synthetase complex-interacting multifunctional Protein 1) 의 ROC curve 분석을 통하여 상기 각 마커들이 대장암을 진단함에 있어서 민감성(sensitivity)과 정확성(specificity)이 뛰어난 것을 확인하였다. 본 발명의 진단 마커들의 민감성과 정확성은 종래 대장암 진단 마커 중 하나인 CA19-9과 비교해도 현저히 우수하였다.

본 발명자들의 발견을 바탕으로 본 발명은 KRS(lysyl-tRNA synthetase) 및/또는 AIMP1(aminoacyl-tRNA synthetase complex-interacting multifunctional Protein 1)의 발현 수준, 즉 KRS(lysyl-tRNA synthetase) 및/또는 AIMP1(aminoacyl-tRNA synthetase complex-interacting multifunctional Protein 1) 단백질 또는 mRNA 수준을 측정하는 제제를 포함하는 대장암 진단용 조성물을 제공한다.

Aminoacyl-tRNA synthetase(ARS)는 특정 아미노산을 그 해당하는 tRNA에 붙여주는 역할을 하는 효소이며. 고등생물의 경우 아미노산 종류에 따른 20 개의 효소외에 AIMP1(p43), (AIMP2)p38, (AIMP3)p18 등 multisynthetase complex 형성에 관여하는 3종류를 포함하여 23종의 효소로 구성되어 있으며 multisynthetase complex에 참여하는 효소외에 몇몇은 free form 형태로도 존재한다. 그러나 최근에 들어 기본적인 기능외에 특정 환경에서 다양한 다른 활성기능을 가지고 있음이 보고 되었는데 KRS 및 AIMP1이 그 중의 하나이다.

KRS는 macrophage활성화를 통해 면역반응을 유도하는 것으로 밝혀졌는데 TNF-α에 의하여 세포 밖으로 분비 촉진된 KRS는 p38 mitogen activivated kinase 등에 의한 신호전달에 의하여 macrophage 세포의 TNF-α에 의한 활성을 증가시키거나 세포의 migration을 촉진시키는 것으로 보고되었다. KRS는 또한 다양한 질환에서 관여하는 것으로 최근 밝혀지고 있다. 염증성 근육질환환자에서 KRS에 대한 자가항체가 존재함이 보고되었고, 루게릭병의 원인이 되는 SOD1 유전자 변이환자에서 KRS가 이 효소에 결합하여 관여함이 보고된 바 있다. 그러나, KRS가 대장암 환자의 혈청에서 정상인 환자군과 비교해 단백질 수치가 현저히 높아 대장암 진단용 마커로서 사용될 수 있다는 점에 대해서는 알려진 바가 없으며, 본 발명에서 최초로 공개하는 것이다.

AIMP1(ARS-interacting multi-functional protein 1)은 종래에 p43 단백질로 알려진 것으로서 최근 AIMP1으로 재명명된 단백질이다(Sang Gyu Park, et al., Trends in Biochemical Sciences, 30:569-574, 2005). 상기 AIMP1은 312개의 아미노산으로 이루어진 단백질로서, 다중 tRNA 합성효소 복합체(multi-tRNA synthetase complex)에 결합하여(Deutscher, M. P., Method Enzymol, 29, 577-583, 1974; Dang C. V. et al., Int. J. Biochem. 14, 539-543, 1982; Mirande, M. et al., EMBO J. 1, 733-736, 1982; Yang D. C. et al., Curr. Top Cell. Regul. 26, 325-335, 1985) 상기 다중-tRNA 합성효소의 촉매적 활성(catalytic activity)을 증진시키는 단백질이다(Park S. G. et al., J. Biol. Chem. 274, 16673-16676, 1999). 분비된 AIMP1은 단핵구/마크로파지, 내피세포 및 섬유아세포와 같은 다양한 표적세포에 작용하는 것으로 알려져 있다. 그러나, AIMP1이 대장암 환자의 혈청에서 정상인 환자군과 비교해 단백질 수치가 현저히 높아 대장암 진단용 마커로서 사용될 수 있다는 점에 대해서는 알려진 바가 없으며, 본 발명에서 최초로 공개하는 것이다.

본 발명에서 용어, "진단용 마커, 진단하기 위한 마커 또는 진단 마커(diagnosis marker)"란 대장암 환자를 정상 대조군과 구분하여 진단할 수 있는 물질로, 정상 대조군에 비하여 대장암을 가진 환자에서 증가 또는 감소를 보이는 폴리펩타이드 또는 핵산(예: mRNA 등), 지질, 당지질, 당단백질 또는 당(단당류, 이당류, 올리고당류 등) 등과 같은 유기 생체 분자 등을 포함한다. 본 발명의 목적상, 본 발명의 대장암 진단 마커는 정상 위 조직의 세포에 비하여, 암 세포에서 특이적으로 높은 수준의 발현을 보이는 KRS(lysyl-tRNA synthetase) 및 AIMP1(aminoacyl-tRNA synthetase complex-interacting multifunctional Protein 1) 유전자 및 이에 의해 코딩되는 단백질이다.

본 발명에서 '발현(expression)'은 세포에서 단백질 또는 핵산이 생성되는 것을 의미한다. '단백'은 '폴리펩타이드(polypeptide)' 또는 '펩타이드(peptide)'와 호환성 있게 사용되며, 예컨대, 자연 상태의 단백질에서 일반적으로 발견되는 바와 같이 아미노산 잔기의 중합체를 말한다. '폴리뉴클레오티드(polynucleotide)' 또는 '핵산'은 단일-또는 이중-가닥의 형태로 된 데옥시리보뉴클레오티드(DNA) 또는 리보뉴클레오티드(RNA)를 말한다. 다른 제한이 없는 한, 자연적으로 생성되는 뉴클레오티드와 비슷한 방법으로 핵산에 혼성화되는 자연적 뉴클레오티드의 공지된 아날로그도 포함된다. 'mRNA'는 단백질 합성 과정에서 특정 유전자로부터 아미노산 서열을 특정하게 되는 리보솜으로 유전 정보(유전자 특이적 염기 서열)를 전달하는 RNA이다.

'진단'은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 발명에서의 진단은 KRS 및/또는 AIMP1의 발현 수준, 즉 상기 마커들 중 하나 이상의 단백질 또는 mRNA의 수준을 측정하여 대장암의 병리 존재 또는 발병 여부를 확인하는 것이다.

한편 본 발명의 진단용 조성물이 mRNA의 발현 수준을 측정하기 위한 것일 때에는 mRNA 발현 수준을 측정하는 제제는 KRS 및/또는 AIMP1의 mRNA에 특이적으로 결합하는 프로브 또는 프라이머 세트일 수 있다.

상기 KRS 및 AIMP1 mRNA는 인간을 포함하는 포유류에서 유래한 것일 수 있으며, 바람직하게는 상기 KRS의 mRNA는 서열번호 1 및 AIMP1의 mRNA는 서열번호 2로 표시되는 염기 서열을 포함하는 것일 수 있다. 상기 KRS 및 AIMP1로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 mRNA 특이적인 프로브 또는 프라이머 세트를 KRS 및 AIMP1로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 발현 수준을 측정하는 제제로 포함하는 본 발명의 진단용 조성물은 공지된 RNA를 감지하는 방법에 필요한 제제를 추가로 포함할 수 있다. 본 조성물을 이용하여 공지된 RNA를 감지하는 방법을 제한없이 사용하여 피검체에서 상기 마커들의 mRNA의 수준을 측정할 수 있다.

'프라이머(primer)'는 DNA 합성의 개시점(starting point)으로 작용하는 짧은 단일가닥 올리고뉴클레오티드(single strand oligonucleotide)이다. 프라이머는 적합한 완충액(buffer)와 온도 조건에서 주형(template)인 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 결합하고, DNA 중합효소가 프라이머에 주형 DNA에 상보적인 염기를 갖는 뉴클레오사이드 트리포스페이트를 추가하여 연결함으로써 DNA가 합성된다. 프라이머는 일반적으로 15 내지 30개의 염기서열로 이루어져 있으며, 염기 구성과 길이에 따라 주형 가닥에 결합하는 온도(melting temperature, Tm)가 달라진다.

프라이머의 서열은 주형의 일부 염기 서열과 완전하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 주형과 혼성화되어 프라이머 고유의 작용을 할 수 있는 범위 내에서의 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 따라서 본 발명에서 상기 각 마커들의 mRNA의 발현 수준을 측정하기 위한 프라이머는 각 유전자 서열에 완벽하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, DNA 합성을 통해 mRNA 또는 cDNA의 특정 구간을 증폭하여 mRNA의 양을 측정하려는 목적에 맞는 길이와 상보성을 갖는 것이면 충분하다. 상기 증폭 반응을 위한 프라이머는 증폭하고자 하는 mRNA의 특정 구간의 양쪽 끝부분의 주형(또는 센스, sense)과 반대편(안티센스, antisense)에 각각 상보적으로 결합하는 한 세트(쌍)으로 구성된다. 프라이머는 당업자라면 KRS 또는 AIMP1의 mRNA 또는 cDNA 염기서열을 참조하여 용이하게 디자인할 수 있다.

본 발명의 프라이머는 바람직하게는 서열번호 1로 표시되는 KRS mRNA 염기서열, 서열번호 2로 표시되는 AIMP1 mRNA 염기서열에 특이적으로 결합하는 한 세트, 한 쌍 또는 이들의 조합일 수 있으며 ,가장 바람직하게는 서열번호 5 및 6으로 이루어진 군에서 선택되는 정방향 프라이머 및 서열번호 7 및 8로 이루어진 군에서 선택되는 역방향 프라이머에서 각각 하나 이상씩 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명에서 상기 서열번호 5 및 7은 KRS mRNA 염기서열에 특이적인 프라이머, 서열번호 6 및 8은 AIMP1 mRNA 염기서열에 특이적인 프라이머이다.

'프로브(probe)'는 특정 유전자의 mRNA나 cDNA(complementary DNA)에 특이적으로 결합할 수 있는 짧게는 수개 내지 길게는 수백 개의 염기(base pair) 길이의 RNA 또는 DNA 등 폴리뉴클레오티드의 단편을 의미하며, 표지(labeling)되어 있어서 결합하는 대상 mRNA나 cDNA의 존재 유무, 발현양 등을 확인할 수 있다. 본 발명의 목적을 위해서는 KRS 또는 AIMP1 mRNA에 상보적인 프로브를 피검체의 시료와 혼성화 반응(hybridization)을 수행하여 KRS 또는 AIMP1 mRNA의 발현양을 측정함으로써 대장암의 진단에 이용할 수 있다. 프로브의 선택 및 혼성화 조건은 당업계에 공지된 기술에 따라 적절하게 선택할 수 있다.

본 발명의 프라이머 또는 프로브는 포스포아미다이트(phosphoramidite) 고체지지체 합성법이나 기타 널리 공지 된 방법을 이용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 또한 프라이머 또는 프로브는 KRS 또는 AIMP1 mRNA와의 혼성화를 방해하지 않는 범위에서 당해 기술분야에 공지된 방법에 따라 다양하게 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오티드 하나 이상의 동족체로의 치환 및 뉴클레오티드 간의 변형, 예를 들면 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등), 그리고 형광 또는 효소를 이용한 표지물질(labeling material)의 결합 등이 있다.

본 발명의 진단용 조성물이 단백질의 발현 수준을 측정하기 위한 것일 때에는 단백질 발현 수준을 측정하는 제제는 KRS 또는 AIMP1 단백질에 각각 특이적으로 결합하는 항체일 수 있다.

상기 KRS 및 AIMP1 단백질은 인간을 포함하는 포유류에서 유래한 것일 수 있으며, 바람직하게는 KRS 단백질은 서열번호 3 및 AIMP1 단백질은 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다.

??항체(antibody)??는 항원성 부위에 특이적으로 결합하는 면역글로불린(immunoglobulin)을 의미한다. 본 발명에서의 항체는 KRS 또는 AIMP1 이외에는 다른 종류의 아미노아실 티알엔에이 합성효소를 포함하는 다른 단백질에는 반응하지 않고, KRS 또는 AIMP1 단백질에만 특이적으로 결합하는 항체이다. KRS 또는 AIMP1 항체는 각 유전자를 발현벡터에 클로닝하여 상기 유전자에 의해 암호화되는 단백질을 수득하고, 수득한 단백질로부터 당해 기술분야의 통상적인 방법에 따라 제조할 수 있다. KRS 또는 AIMP1 항원성 부위를 포함하는 KRS 또는 AIMP1 단백질의 단편을 이용하여 각각의 단백질 특이적인 항체를 제조할 수도 있다. 본 발명의 항체의 형태는 특별히 제한되지 않으며, 다클론항체(polyclonal antibody) 또는 단일클론항체(monoclonal antibody)를 포함한다. 또한 항원-항체 결합성을 갖는 것이면 전체 항체의 일부도 본 발명의 항체에 포함되며, KRS 또는 AIMP1에 특이적으로 결합하는 모든 종류의 면역글로불린 항체가 포함된다. 예를 들어 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 갖는 완전한 형태의 항체 뿐 아니라 항체 분자의 기능적인 단편, 즉 항원 결합 기능을 갖는 Fab, F(ab'), F(ab')2 및 Fv 등을 포함한다. 나아가 본 발명의 항체에는 KRS 또는 AIMP1 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 것이라면 인간화 항체, 키메릭 항체 등의 특수 항체와 재조합 항체도 포함된다.

상기 각 마커 단백질 특이적인 항체를 KRS 또는 AIMP1의 발현 수준을 측정하는 제제로 포함하는 본 발명의 진단용 조성물은 공지된 단백질을 감지하는 방법에 필요한 제제를 추가적으로 포함할 수 있으며, 본 조성물을 이용하여 공지된 단백질을 감지하는 방법을 제한없이 사용하여 피검체에서 KRS 또는 AIMP1로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 단백질의 수준을 측정할 수 있다.

또한 본 발명은 KRS 및 AIMP1 으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 mRNA 또는 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 대장암 진단용 키트를 제공한다.

본 발명의 진단용 키트에는 KRS 및 AIMP1 으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 단백질을 마커로 인식하는 항체 또는 KRS 및 AIMP1 으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 mRNA를 마커로 인식하는 프라이머, 프로브뿐만 아니라 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치가 포함될 수 있다.

구체적인 양태로서 상기 진단 키트는 역전사 중합효소반응을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 진단용 키트일 수 있다. 역전사 중합효소반응 키트는 마커 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍을 포함한다. 프라이머는 각 마커 유전자의 핵산서열에 특이적인 서열을 가지는 뉴클레오타이드로서, 약 7bp 내지 50bp의 길이, 보다 바람직하게는 약 10bp 내지 30bp의 길이이다. 또한 대조군 유전자의 핵산 서열에 특이적인 프라이머를 포함할 수 있다. 그 외 역전사 중합효소반응 키트는 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사효소와 같은 효소, DNAse, RNAse 억제제 DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다.

또 다른 양태로는 DNA 칩을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 진단 키트일 수 있다. DNA 칩 키트는 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA 또는 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)가 부착되어 있는 기판, 및 형광표식 프로브를 제작하기 위한 시약, 제제, 효소 등을 포함할 수 있다. 또한 기판은 대조군 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA 또는 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다.

가장 바람직하게는, ELISA를 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 진단 키트일 수 있다. ELISA 키트는 마커 단백질에 대한 특이적인 항체를 포함한다. 항체는 각 마커 단백질에 대한 특이성 및 친화성이 높고 다른 단백질에 대한 교차 반응성이 거의 없는 항체로, 단클론 항체, 다클론 항체 또는 재조합 항체이다. 또한 ELISA 키트는 대조군 단백질에 특이적인 항체를 포함할 수 있다. 그 외 ELISA 키트는 결합된 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면, 표지된 2차 항체, 발색단(chromophores), 효소(항체와 컨주게이트된 형태로서) 및 그의 기질 또는 항체와 결합할 수 있는 다른 물질 등을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 키트는 효소와 발색 반응할 기질 및 결합되지 않은 단백질 등은 제거하고 결합된 단백질 마커 만을 보유할 수 있는 세척액 또는 용리액을 포함할 수 있다.

분석을 위해 사용되는 시료는 혈액, 혈청, 소변, 누액, 타액 등 정상적인 상태와 구별될 수 있는 감염성 염증 질환 특이적 단백질을 확인할 수 있는 생체 시료를 포함한다. 바람직하게는 생물학적 액체 시료, 예를 들어 혈액, 혈청, 혈장으로부터 측정될 수 있다. 시료는 단백질 마커의 탐지 감도를 증가시키도록 준비될 수 있는데 예를 들어 환자로부터 수득한 혈청 시료는 음이온 교환 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피, 크기별 배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography), 액체 크로마토그래피, 연속추출(sequential extraction) 또는 젤 전기영동 등의 방법을 이용하여 전처리될 수 있다.

대장암 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여,

(a) 피검체로부터 시료를 제공하는 단계;

(b) 상기 시료에서 KRS 및 AIMP1 으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 mRNA의 발현 수준 또는 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계; 및

(c) 상기 각 유전자 mRNA의 발현 수준 또는 단백질의 발현 수준을 정상 대조구 시료의 해당 유전자 mRNA의 발현 수준 또는 단백질 발현 수준과 비교하여 발현 수준이 증가한 피검체를 대장암에 걸린 것으로 판정하는 단계를 포함하는 대장암의 마커를 검출하는 방법을 제공한다.

본 발명자들은 KRS 및 AIMP1가 대장암의 신규한 마커로서 기능할 수 있음을 처음 발견하여 상기 각 마커들의 발현 수준을 측정하여 대장암의 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다. 이하 본 발명의 방법을 단계에 따라 설명한다.

본 발명의 방법의 (a) 단계는 피검체의 시료를 제공하는 단계이다.

상기 시료는 대장암 여부를 진단하고자 하는 피검체에서 채취된 것이면 제한없이 사용할 수 있으며, 예를 들어 생검 등으로 얻어진 세포나 조직, 혈액, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 뇌척수액, 각종 분비물, 소변, 대변 등일 수 있다. 바람직하게는 혈액, 혈장, 혈청, 타액, 비액, 객담, 관절낭액, 양수, 복수, 자궁경부 또는 질 분비물, 소변 및 뇌척수액일 수 있다. 가장 바람직하게는 혈액, 혈장, 또는 혈청일 수 있다.

본 발명의 방법의 (b) 단계는 (a) 단계에서 제공한 시료에서 KRS 및 AIMP1로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 발현 수준을 측정하는 단계이다. 상기 발현 수준은 KRS 및 AIMP1로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 mRNA 또는 단백질의 발현 수준일 수 있다.

각 단백질의 발현 수준은 각 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 검출하거나 측정할 수 있다. 단백질 특이적인 항체는 본 발명의 진단용 조성물에 서술한 바와 같다. 단백질의 발현 수준을 측정하는 방법은 당업계에서 공지되어 있는 방법은 제한 없이 사용할 수 있으며, 그 예로 웨스턴 블랏팅(western blotting), 닷 블랏팅(dot blotting), 효소면역분석법(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA), 방사능 면역분석법(RIA), 방사면역확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역 전기영동, 면역조직화학염색, 면역침전법(immunoprecipitation), 보체 고정 분석법, 유세포 분석법(FACS) 또는 단백질 칩(chip) 방법 등이 있으나, 이들에 한정되는 것은 아니다. 바람직하게는 ELISA 방법을 이용할 수 있다.

각 마커들의 mRNA 수준은 mRNA에 특이적으로 결합하는 프라이머 세트나 프로브를 이용하여 피검체의 시료로부터 각 마커들의 mRNA나 cDNA를 증폭하거나, 프로브와 혼성화 반응(hybridization)을 이용하여 피검체 시료 내 각 마커들의 mRNA의 존재와 발현량을 측정할 수 있다. 프라이머와 프로브는 본 발명의 진단용 조성물에서 서술한 바와 같다. mRNA 발현 수준의 측정은 당업계에서 통상적인 발현 수준 확인 방법을 제한 없이 사용할 수 있으며, 분석 방법의 예로 역전사중합체연쇄반응(reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR), 경쟁적 RT-PCR(competitive RT-PCR), 실시간 RT-PCR(real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA:RNase protection assay), 노던 블랏팅(northern blotting), DNA 마이크로어레이 칩(microarray chip), RNA 염기서열분석(RNA sequencing), 나노스트링(nanostring)을 이용한 혼성화 방법, 조직 절편의 인시투 혼성화 방법(in situ hybridization) 등이 있으나, 이들에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 방법의 (c) 단계는 (b) 단계에서 측정한 피검체 시료의 KRS 및 AIMP1 으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 mRNA 또는 단백질의 수준을 정상인과 비교하고 정상인에 비해 그 발현 수준이 증가한 피검체를 대장암에 걸린 것으로 판정하는 단계이다.

상술한 (b) 단계의 방법으로 측정한 피검체의 각 마커들의 발현 수준을, 동일한 방법으로 측정한 정상인의 마커 수준과 비교한다. 각 마커들의 발현 수준이 건강한 정상인에 비하여 증가한 피검체를 대장암에 걸린 것으로 판정한다.

본 발명은 또한 대장암 치료 후보물질의 투여 후, KRS 및 AIMP1으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 유전자 mRNA의 발현 수준 또는 단백질의 발현 수준을 측정하는 것을 포함하는, 대장암 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다.

구체적으로, 대장암 치료 후보 물질의 존재 및 부존재 하에서 KRS 및 AIMP1으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 mRNA 또는 단백질 발현의 증가 또는 감소를 비교하는 방법으로 대장암 치료제를 스크리닝하는데 유용하게 사용할 수 있다. KRS 및 AIMP1으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 mRNA 또는 단백질의 발현 수준을 간접적으로 또는 직접적으로 감소시키는 물질은 대장암의 치료제로서 선택할 수 있다. 즉, 대장암 치료 후보 물질의 부존재 하에 대장암 세포에서의 본 발명의 마커의 발현 수준을 측정하고, 또한 대장암 치료 후보 물질의 존재 하에서 본 발명의 마커의 발현 수준을 측정하여 양자를 비교한 후, 대장암 치료 후보 물질이 존재할 때의 본 발명의 마커의 발현 수준이 대장암 치료 후보 물질의 부재 하에서의 마커 발현 수준보다 감소시키는 물질을 대장암의 치료제로 선택할 수 있는 것이다.

KRS 및 AIMP1으로 이루어진 본 발명의 대장암 진단 마커는 대장암 환자의 혈청에서 정상 대조군과 비교해 그 발현수준이 증가해 있다. 따라서, KRS 및 AIMP1로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 마커의 발현 수준을 측정함으로써 대장암 유무를 정확하고 신속하게 판단할 수 있다.

도 1은 정상인군과 대장암 환자군의 혈청 단백질 수치를 dot blot으로 나타낸 결과이다(A: GRS, B: KRS, C: AIMP1, D: HRS, E: WRS, F: CA-19-9, G: TNF-α, H: IL-10)
도 2는 혈청 단백질 수치의 ROC 커브를 나타낸 도면이다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실험방법>

1. 실험시료의 입수

대장암 환자의 혈청을 삼성의료원(서울,대한민국)에서 임상시험심사위원회의 규정에 따라 입수하였다. 정상환자군은 32명, 대장암 환자군은 총 164명의 샘플을 입수하여 분석하였다.

실험에 사용된 환자의 임상학적 정보는 표 1에 기재한 바와 같다.

2. 효소면역분석법(ELISA assay)

정상인 또는 대장암 환자의 혈청으로 분비된 GRS(glycyl-tRNA synthetase ), KRS(lysyl-tRNA synthetase), HRS(histidyl-tRNA synthetase), WRS(tryptophanyl-tRNA synthetase), AIMP-1(aminoacyl-tRNA synthetase complex-interacting multifunctional Protein 1), TNF-α, IL-10 및 CA-19-9의 수치를 제조사의 지시에 따라 효소면역분석 키트를 이용하여 분석하였다. 단백질의 분비량은 마이크로플레이트 리더(TECAN)을 이용하여 측정하였다. 각각의 혈청 단백질 분석 키트의 제조사는 다음과 같다:

GRS, HRS, WRS ELISA kit(Cusabio, China)

AIMP1 ELISA kit(Elab science, China)

KRS ELISA kit(Mybiosource, USA)

TNF-a, IL-10 (BD science, USA)

CA 19-9 (Abnova, Taiwan)

3. 통계학적 분석

정상인과 대장암 환자의 혈정으로 분비된 단백질 사이의 P value는 Mann-Whitney test/ Two-tailed test로 XLASTAT 소프트웨어를 이용하여 분석하였다. Dotblot plot, ROC curve, AUC, 표준편차는 Graphpad Prism 6 소프트웨어를 이용하여 분서하였다.

<실험결과>

<실시예 1>

정상인과 대장암 환자 혈청 분석결과

대장암에 특이적인 마커를 검색하기 위하여, 정상인 32명 및 대장암 환자 164명의 혈청 단백질을 효소면역분석법(ELISA)으로 분석하였다.

이에 대한 결과를 하기 표 2 및 도 1에 나타내었다.

상기 표 2 및 도 1에서 볼 수 있는 바와 같이, 대장암 환자의 혈청에서 KRS(lysyl-tRNA synthetase) 및 AIMP1(aminoacyl-tRNA synthetase complex-interacting multifunctional Protein 1)의 단백질 수치가 정상인군과 비교해 현저하게 증가되어 있는 것을 확인할 수 있었다. 특히, KRS의 경우에는 기존의 대장암 진단 마커 중 하나인 CA 19-9 보다도 현저히 우수한 것으로 확인되었다.

<실시예 2>

ROC 커브 분석

도 2에 나타낸 바와 같이, KRS, AIMP1의 ROC의 AUC가 0.6보다 크게 나오고 p value 값이 0.01 보다 작게 나와 통계학적으로 KRS, AIMP1의 양이 대장암 환자의 혈청 내의 수치가 정상인의 수치보다 유의미하게 크기 때문에 좋은 바이오 마커임을 알 수 있었다. 또한 KRS, AIMP1이 기존의 대장암의 바이오마커인 CA-19-9보다도 더 좋은 것을 확인하였다.

KRS 및 AIMP1으로 이루어진 본 발명의 대장암 진단 마커는 대장암 환자의 혈청에서 정상 대조군과 비교해 그 발현수준이 증가해 있다. 따라서, KRS 및 AIMP1로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 마커의 발현 수준을 측정함으로써 대장암 유무를 정확하고 신속하게 판단할 수 있어 산업상 이용가능성이 매우 우수하다.

<110> Medicinal Bioconvergence Research Center <120> Composition and method for detecting a diagnostic marker for renal cell carcinoma <130> NP16-0017 <160> 8 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1794 <212> RNA <213> Human lysyl-tRNA synthetase(KRS) mRNA <400> 1 auggcggccg ugcaggcggc cgaggugaaa guggauggca gcgagccgaa acugagcaag 60 aaugagcuga agagacgccu gaaagcugag aagaaaguag cagagaagga ggccaaacag 120 aaagagcuca gugagaaaca gcuaagccaa gccacugcug cugccaccaa ccacaccacu 180 gauaauggug uggguccuga ggaagagagc guggacccaa aucaauacua caaaauccgc 240 agucaagcaa uucaucagcu gaaggucaau ggggaagacc cauacccaca caaguuccau 300 guagacaucu cacucacuga cuucauccaa aaauauaguc accugcagcc uggggaucac 360 cugacugaca ucaccuuaaa gguggcaggu aggauccaug ccaaaagagc uucuggggga 420 aagcucaucu ucuaugaucu ucgaggagag ggggugaagu ugcaagucau ggccaauucc 480 agaaauuaua aaucagaaga agaauuuauu cauauuaaua acaaacugcg ucggggagac 540 auaauuggag uucaggggaa uccugguaaa accaagaagg gugagcugag caucauuccg 600 uaugagauca cacugcuguc ucccuguuug 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Asn 275 280 285 Glu Leu Asp Met Asn Leu Tyr Met Arg Ile Ala Pro Glu Leu Tyr His 290 295 300 Lys Met Leu Val Val Gly Gly Ile Asp Arg Val Tyr Glu Ile Gly Arg 305 310 315 320 Gln Phe Arg Asn Glu Gly Ile Asp Leu Thr His Asn Pro Glu Phe Thr 325 330 335 Thr Cys Glu Phe Tyr Met Ala Tyr Ala Asp Tyr His Asp Leu Met Glu 340 345 350 Ile Thr Glu Lys Met Val Ser Gly Met Val Lys His Ile Thr Gly Ser 355 360 365 Tyr Lys Val Thr Tyr His Pro Asp Gly Pro Glu Gly Gln Ala Tyr Asp 370 375 380 Val Asp Phe Thr Pro Pro Phe Arg Arg Ile Asn Met Val Glu Glu Leu 385 390 395 400 Glu Lys Ala Leu Gly Met Lys Leu Pro Glu Thr Asn Leu Phe Glu Thr 405 410 415 Glu Glu Thr Arg Lys Ile Leu Asp Asp Ile Cys Val Ala Lys Ala Val 420 425 430 Glu Cys Pro Pro Pro Arg Thr Thr Ala Arg Leu Leu Asp Lys Leu Val 435 440 445 Gly Glu Phe Leu Glu Val Thr Cys Ile Asn Pro Thr Phe Ile Cys Asp 450 455 460 His Pro Gln Ile Met Ser Pro Leu Ala Lys Trp His Arg Ser Lys Glu 465 470 475 480 Gly Leu Thr Glu Arg Phe Glu Leu Phe Val Met Lys Lys Glu Ile Cys 485 490 495 Asn Ala Tyr Thr Glu Leu Asn Asp Pro Met Arg Gln Arg Gln Leu Phe 500 505 510 Glu Glu Gln Ala Lys Ala Lys Ala Ala Gly Asp Asp Glu Ala Met Phe 515 520 525 Ile Asp Glu Asn Phe Cys Thr Ala Leu Glu Tyr Gly Leu Pro Pro Thr 530 535 540 Ala Gly Trp Gly Met Gly Ile Asp Arg Val Ala Met Phe Leu Thr Asp 545 550 555 560 Ser Asn Asn Ile Lys Glu Val Leu Leu Phe Pro Ala Met Lys Pro Glu 565 570 575 Asp Lys Lys Glu Asn Val Ala Thr Thr Asp Thr Leu Glu Ser Thr Thr 580 585 590 Val Gly Thr Ser Val 595 <210> 4 <211> 312 <212> PRT <213> Human AIMP1 protein <400> 4 Met Ala Asn Asn Asp Ala Val Leu Lys Arg Leu Glu Gln Lys Gly Ala 1 5 10 15 Glu Ala Asp Gln Ile Ile Glu Tyr Leu Lys Gln Gln Val Ser Leu Leu 20 25 30 Lys Glu Lys Ala Ile Leu Gln Ala Thr Leu Arg Glu Glu Lys Lys Leu 35 40 45 Arg Val Glu Asn Ala Lys Leu Lys Lys Glu Ile Glu Glu Leu Lys Gln 50 55 60 Glu Leu Ile Gln Ala Glu Ile Gln Asn Gly Val Lys Gln Ile Pro Phe 65 70 75 80 Pro Ser Gly Thr Pro Leu His Ala Asn Ser Met Val Ser Glu Asn Val 85 90 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Thr Met Ser Asn Ser Gly Ile Lys 305 310 <210> 5 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human KRS forward primer <400> 5 aggaaacaag guaucgccag a 21 <210> 6 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human AIMP1 forward primer <400> 6 cuggugaauc auguuccucu ug 22 <210> 7 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human KRS reverse primer <400> 7 cagcucguug ugauaaguga uga 23 <210> 8 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human AIMP1 reverse primer <400> 8 ggaaagcauc aaaaguaauu cuguc 25

Claims

KRS(lysyl-tRNA synthetase) 및 AIMP1(aminoacyl-tRNA synthetase complex-interacting multifunctional Protein 1)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 mRNA 또는 이의 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 대장암 진단용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 유전자의 mRNA 발현 수준을 측정하는 제제는 KRS 또는 AIMP1의 mRNA에 특이적으로 결합하는 프로브 또는 프라이머 세트인 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항에 있어서, 상기 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제는 KRS 또는 AIMP1의 단백질에 특이적인 항체인 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항에 있어서, KRS의 mRNA는 서열번호 1 및 AIMP1의 mRNA는 서열번호 2로 표시되는 염기 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항에 있어서, 상기 KRS 단백질은 서열번호 3 및 AIMP1 단백질은 서열번호 4으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
KRS 및 AIMP1으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 mRNA 또는 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 대장암 진단용 키트.
제6항에 있어서, 상기 키트는 RT-PCR키트, DNA 칩 키트 또는 단백질 칩 키트인 것을 특징으로 하는 키트.
대장암 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여,
(a) 피검체로부터 시료를 제공하는 단계;
(b) 상기 시료에서 KRS 및 AIMP1으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 mRNA 발현 수준 또는 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
(c) 상기 유전자 mRNA의 발현 수준 또는 단백질의 발현 수준을 정상 대조구 시료의 해당 유전자 mRNA의 발현 수준 또는 단백질 발현 수준과 비교하여 발현 수준이 증가한 피검체를 대장암에 걸린 것으로 판정하는 단계를 포함하는 대장암의 마커를 검출하는 방법.
제8항에 있어서, 상기 시료는 혈액, 혈장, 혈청, 타액, 비액, 객담, 관절낭액, 양수, 복수, 자궁경부 또는 질 분비물, 소변 및 뇌척수액으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제8항에 있어서, 상기 mRNA의 발현 수준을 측정하는 방법은 역전사효소 중합효소반응, 경쟁적 역전사효소 중합효소반응, 실시간 역전사효소 중합효소반응, RNase 보호 분석법, 노던 블랏팅 및 DNA 칩으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나를 이용하는 것인 방법.
제8항에 있어서, 상기 단백질 발현 수준을 측정하기 위한 방법은 웨스턴 블랏, ELISA, 방사선면역분석, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법, 보체 고정 분석법, FACS 및 단백질 칩 방법으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나를 이용하는 것인 방법.
대장암의 치료 후보물질의 투여 후, KRS 및 AIMP1로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 mRNA의 발현 수준 또는 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 대장암 치료제의 스크리닝 방법.