CN109674797B - 一种小分子作为赖氨酰tRNA合成酶的抑制剂的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明属于药物化学领域，公开了一种小分子作为人赖氨酰tRNA合成酶(KRS)抑制剂的应用。本发明采用纯化后的人KRS蛋白作为实验对象，通过孔雀石绿定磷法来判断抑制赖氨酰tRNA合成酶酶活的能力，实验结果显示，在添加了小分子2‑[2‑溴‑6‑甲氧基‑4‑({[3‑(4‑吗啉基)丙基]氨基}甲基)苯氧]甲酰胺(MPA)的体系中，KRS蛋白活性明显下降。同时在使用MDA‑MB‑231细胞进行抗癌细胞实验时，添加了小分子MPA的实验组细胞活性明显降低。本发明为小分子MPA治疗癌症提供了一定的证据，同时也能为开发更多治疗与KRS相关疾病的小分子化合物药物提供宝贵经验。

Description

一种小分子作为赖氨酰tRNA合成酶的抑制剂的用途
技术领域
本发明属于药物化学领域，具体涉及一种化合物的新用途，尤其是2-[2-溴-6-甲氧基-4-({[3-(4-吗啉基)丙基]氨基}甲基)苯氧]甲酰胺作为赖氨酰tRNA合成酶的抑制剂的用途。
背景技术
氨基酰tRNA合成酶(aminoacyl-tRNAsynthetase，简称aaRS)亦称氨酰tRNA连接酶，氨基酸活化酶，是将氨基酸与其对应tRNA进行连接的酶。20种氨基酸，均有其相应的专一性的氨酰tRNA合成酶。一般认为氨基酰tRNA合成酶在ATP存在下使氨基酸活化，并与tRNA的-CCA-OH末端结合。
氨酰tRNA合成酶是生物体内的关键酶，主要作用于基因编码的蛋白翻译过程。它能专一性辨别氨基酸侧链及其对应tRNA，通过氨酰化反应将二者连接起来，作为蛋白翻译的活化的氨基酸供体，再由核糖体通过阅读mRNA信息将活化的氨基酸按顺序连接生成肽链。氨酰-tRNA合成酶参与的合成分两步进行：第一步是氨酰-tRNA合成酶识别它所催化的氨基酸以及另一底物ATP，在氨酰-tRNA合成酶的催化下，氨基酸的羧基与AMP上的磷酸之间形成一个酯键，同时释放出一分子PPi：氨基酸+ATP—AMP+PPi，这时氨酰-AMP仍然紧密地与酶分子结合。氨酰-tRNA合成酶催化的第二步反应是将氨酰-AMP连接到tRNA 3'端的核糖上，释放出AMP：氨酰-AMP+tRNA—氨酰-tRNA+AMP。不同氨酰-tRNA合成酶在识别tRNA的部位上有所不同。一些氨酰-tRNA合成酶能特异形成2'形式的酯，有的形成3'形式的酯，有的还可能形成混合物。氨酰tRNA合成酶是具有高专一性底物的酶，所以mRNA的遗传信息能准确无误地反映在蛋白质的氨基酸序列上。
由于氨酰tRNA合成酶在蛋白翻译上起着重要的作用，对其研究也日益广泛。近年来，人们发现氨酰tRNA合成酶因其在蛋白质翻译时的关键作用，可以作为抗寄生虫药、肿瘤药物和真菌药物的靶点。因为抑制这些酶的催化作用，蛋白质合成就会被抑制，生物体生长甚至生存就会受到抑制。
KRS是人体内20种氨酰tRNA合成酶之一，其主要作用是催化赖氨酸与其对应的tRNA结合，生成赖氨酰-tRNA，为蛋白质合成提供活化的赖氨酸原料，完成蛋白翻译过程。已发现的KRS抑制剂枝孢菌素因其对寄生虫强烈的抑制作用，而对人相关酶抑制作用较弱而被广泛研究。但研究表明枝孢菌素有着成药性等诸多因素的制约，因此开发新的KRS活性抑制小分子具有重要意义。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于通过药物筛选，提供一种针对赖氨酰tRNA合成酶的抑制剂，以可以用于抗肿瘤药物、抗真菌药物的制备。
为实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案。
申请人通过原核表达和亲和纯化技术获得赖氨酰tRNA合成酶蛋白。
进一步，申请人利用计算机模拟分子与KRS的结合，以枝孢菌素为模板，对与其具有较大相似性的92种分子进行酶活性检测的筛选，最终找出一种抑制KRS酶活性的小分子化合物2-[2-溴-6-甲氧基-4-({[3-(4-吗啉基)丙基]氨基}甲基)苯氧]甲酰胺(2-[2-bromo-6-methoxy-4-({[3-(4-morpholinyl)propyl]amino}methyl)phenoxy]acetamide)(简称MPA)。
本发明所述小分子化合物MPA购自specs公司，结构式如式Ⅰ所示，
Figure GDA0002809980410000021
本发明通过孔雀石绿定磷法来判断所述小分子化合物MPA抑制赖氨酰tRNA合成酶活性的能力。结果显示在添加了小分子化合物MPA的体系中，KRS蛋白活性明显下降，对比未加小分子化合物MPA的酶反应组，其抑制率达到了68.66％。
因此本发明提供所述式Ⅰ所示小分子化合物MPA作为赖氨酰-tRNA合成酶抑制剂的用途。
进一步的，本发明在肿瘤细胞中验证了小分子化合物MPA对赖氨酰-tRNA合成酶的抑制能力。结果显示，添加了小分子化合物MPA的实验组细胞活性明显降低，对比加入了5％DMSO的组别，降低了18.35％。
因此本发明还提供了所述小分子化合物MPA在预防或治疗以赖氨酰-tRNA合成酶为靶点的疾病的药物中的用途。
其中，所述以赖氨酰-tRNA合成酶为靶点的疾病为癌症、寄生虫病和真菌感染性疾病。
进一步的，所述癌症为乳腺癌、淋巴癌、肺癌、肝癌、胰腺癌、宫颈癌、子宫内膜癌或大肠癌。
所述真菌感染性疾病为真菌感染为真菌性皮肤病。
所述寄生虫病为疟原虫感染的寄生虫病。
由上述技术方案可知，本发明提供了一种小分子化合物MPA作为人赖氨酰tRNA合成酶(KRS)抑制剂的应用。本发明采用纯化后的人KRS蛋白作为实验对象，通过孔雀石绿定磷法来判断抑制赖氨酰tRNA合成酶酶活的能力，实验结果显示，在添加了小分子MPA的体系中，KRS活性明显下降。同时在使用人乳腺癌MDA-MB-231细胞进行抗癌细胞实验时，添加了小分子MPA的实验组细胞活性明显降低。本发明为小分子MPA治疗癌症提供了一定的证据，同时也能为开发更多治疗与KRS相关疾病的小分子提供宝贵经验。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为KRS蛋白镍柱纯化后的电泳图；
图2为1mL去离子水中分别加入60、70、80、90μL钼酸铵后，静置10分钟，再加入100μL孔雀石绿溶液，静置20min后在紫外分光光度计下测得550～700nm的紫外吸收曲线；
图3为20μM磷酸条件下分别加入60、70、80、90μL钼酸铵后，静置10分钟，再加入100μL孔雀石绿溶液，静置20min后在紫外分光光度计下测得550～700nm的紫外吸收曲线；
图4为磷酸根离子浓度为5、10、15、20、25、30μM条件下以A640吸光度所作的标准曲线；
图5为通过计算机模拟筛选并进行实验验证有抑制性的小分子结构图及其与KRS结合的模拟图；
图6为细胞实验中小分子的抑制效果柱状图。
具体实施方式
本发明公开了2-[2-溴-6-甲氧基-4-({[3-(4-吗啉基)丙基]氨基}甲基)苯氧]甲酰胺(简称MPA)作为赖氨酰tRNA合成酶的抑制剂的用途。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及产品已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
为了进一步理解本发明，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
如无特殊说明，本发明实施例中所涉及的试剂均为市售产品，均可以通过商业渠道购买获得。
其中钼酸铵溶液的配制方法为：量取5.6mL浓H2SO4溶液，用玻璃棒缓慢加入去离子水20mL，搅拌均匀并冷却。称取2.58g钼酸铵，加入之前稀释的硫酸溶液中，搅拌至完全溶解，定容至50mL。
孔雀石绿溶液的配制方法为：称取0.7g聚乙烯醇(PVA，1750±50)，加入50mL水中，室温放置半小时。95℃水浴并不停搅拌，至PVA完全溶解。称取0.077g孔雀石绿粉末，碾磨成粉末状。待PVA溶液冷却，将称量好的孔雀石绿粉末加入其中。量取1mL浓硫酸，加入5mL水稀释。用移液枪吸取40μL稀释后的硫酸，加入PVA孔雀石绿溶液中促进孔雀石绿溶解。
不同浓度梯度磷酸溶液的配制方法为：称取0.13609g KH2PO4，加入1L去离子水，此时溶液PO4 3-浓度为100μM。用此溶液配制PO4 3-浓度分别为5、10、15、20、25、30μM的溶液备用。
实施例1：KRS的大量表达与收集
将人KRS基因连接到PET-28b载体上，转化至大肠杆菌BL21细胞中，挑选阳性菌株摇菌至OD值为0.6后，使用IPTG进行诱导表达，经超声波破碎细胞后离心，收集上清液，上清液采用镍柱进行纯化，使用SDS电泳确定纯化结果。(图1)。其中第一泳道为蛋白Marker；第二泳道为诱导前的菌液；第三泳道为IPTG诱导后破碎的菌液，第四泳道为IPTG诱导后，细胞进行压力破碎，并在15000r/min离心后的上清；第五泳道为IPTG诱导后，细胞进行压力破碎，并在15000r/min离心后的沉淀通过缓冲液进行重悬的溶液；第六泳道为将细胞破碎离心后的上清经过镍柱后未被镍柱吸附的穿透液；第七泳道为空白；第八至第十五泳道为使用250mM咪唑洗脱下的收集管(每管1.5mL)。蛋白约为65kD。之后将收集管中溶液选用50kD超滤浓缩管进行浓缩，并添加30％甘油置于-80℃进行保存。
实施例2：抑制剂筛选：
应用药效团模型和分子对接技术相结合的虚拟筛选技术，首先在specs小分子数据库中查找符合类药化合物性质的小分子，将其整理为一个集合。再通过PDB蛋白质结构数据库找到人赖氨酰tRNA合成酶(LysRS)蛋白的PDB数据。在maestro9.0中将人LysRS蛋白与specs中找到的小分子进行对接，找出打分较好的分子，导入Discovery Studio与已知抑制剂枝孢菌素进行比对，筛选出最优的106个小分子，从specs中购得其中92个小分子，进行体外测活实验检验抑制效果。
测活方法如下：
使用水和磷酸二氢钾溶液各1mL，加入60、70、80、90μL钼酸铵溶液，10分钟后再分别加入100μL孔雀石绿溶液，紫外分光光度计先设置全波长扫描，波长区段为300nm～800nm，60nm/min。确定钼酸铵溶液加入量为70μL，紫外吸收波长为640nm。
标准曲线的制作：先取磷酸溶液各1mL，加入70μL钼酸铵溶液，30℃水浴反应10min。再各加入孔雀石绿试剂100μL，避光反应20min。每个试剂三组重复，测定A640处紫外吸收光值，作出标准曲线。主要操方法为，配置5、10、15、20、25、30μM的磷酸二氢钾溶液，各取1mL，分别加入70μL钼酸铵溶液，10分钟后再分别加入100μL孔雀石绿溶液，静置20分钟后在紫外分光光度计测定A640，然后作出磷酸根浓度与640nm下吸光值关系的标准曲线。
酶抑制剂筛选方法：
各分子反应体系为：HEPES 100mM，2μL；KCl 20mM，2μL；MgCl2 10mM，2μL；DTT 4mM，2μL；L-Lysine 1mM，2μL；ATP 2mM，2μL；PPi 35U/mL，2μL；KRS 325U/mL，2μL总反应体系20μL。反应体系过夜，体系加热至98℃使反应终止。吸取反应体系10μL反应液至990μL去离子水，作为测活样品。再使用上述测活样品体系在紫外分光光度计下进行测活，波长为640nm。最终找出一种新的酶活性抑制小分子MPA。该分子的测活及抑制结果如表1所示。
其中对照组体系为：HEPES 100mM，2μL；KCl 20mM，2μL；MgCl2 10mM，2μL；DTT 4mM，2μL；L-Lysine 1mM，2μL；ATP 2mM，2μL；PPi 35U/mL，2μL；去离子水4μL。
酶反应组体系为：HEPES 100mM，2μL；KCl 20mM，2μL；MgCl2 10mM，2μL；DTT 4mM，2μL；L-Lysine 1mM，2μL；ATP 2mM，2μL；PPi 35U/mL，2μL；KRS 325U/mL,2μL；去离子水2μL。
抑制剂组反应体系为：：HEPES 100mM，2μL；KCl 20mM，2μL；MgCl210mM，2μL；DTT4mM，2μL；L-Lysine 1mM，2μL；ATP 2mM，2μL；PPi 35U/mL，2μL；KRS 325U/mL,2μL；小分子化合物1mM，2μL。
DMSO组反应体系为：HEPES 100mM，2μL；KCl 20mM，2μL；MgCl210mM，2μL；DTT 4mM，2μL；L-Lysine 1mM，2μL；ATP 2mM，2μL；PPi 35U/mL，2μL；KRS 325U/mL，2μL；5％DMSO，2μL。
表1测活及抑制结果：
对照组 酶反应组 抑制剂组 DMSO组
1 0.221 0.252 0.213 0.296
2 0.189 0.254 0.215 0.294
3 0.171 0.276 0.217 0.294
平均 0.194 0.261 0.215 0.295
结果显示，对照组磷酸含量为13.43μM，酶反应组磷酸含量为18.12μM，抑制剂(MPA)组磷酸含量为14.9μM，抑制率为68.66％。
实施例3：细胞实验：
实验材料：人乳腺腺癌细胞MDA-MB-231细胞系(MDA-MB-231 Cell Line)，96孔板，每孔100μL。
具体操作步骤为：细胞移植至96孔板培养一天后，培养基组不变，DMSO组吸弃50μL培养基后加入50μL的5％DMSO，抑制剂组则是吸弃50μL培养基后加入50μL 1mM的小分子MPA，每组3个重复。因为小分子溶解时加入了5％DMSO，因此进行此种对照实验。分别培养24、48、72h后加入20μL MTT，培养4h后吸弃孔内液体，加入150μL DMSO后摇床震荡10min，在酶标仪上测定吸光度，结果如表2和图6所示。
表2各组吸光度结果
Figure GDA0002809980410000071
结果显示，小分子MPA可以抑制人KRS蛋白活性，并对MDA-MB-231细胞生长有明显的抑制作用。

Claims (1)

1.2-[2-溴-6-甲氧基-4-({[3-(4-吗啉基)丙基]氨基}甲基)苯氧]甲酰胺在制备预防或治疗乳腺癌的药物中的用途。
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