CN112771158A - 碱性磷酸酶组合物以及去磷酸化核酸和标记化核酸的制造方法 - Google Patents

碱性磷酸酶组合物以及去磷酸化核酸和标记化核酸的制造方法 Download PDF

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Abstract

本发明的目的在于提供含有碱性磷酸酶的高品质的组合物以及使用了该组合物的去磷酸化核酸的制造方法和标记化核酸的制造方法，为了实现该目的，本发明提供含有碱性磷酸酶、和第1～第6肽片段的组合物，所述第1～第6肽片段的含量相对于所述碱性磷酸酶的含量的比率分别满足下述式(1)～(6)：(X1/Y)×100≤0.6000···(1)；(X2/Y)×100≤0.1800···(2)；(X3/Y)×100≤0.2000···(3)；(X4/Y)×100≤0.8000···(4)；(X5/Y)×100≤1.6000···(5)；(X6/Y)×100≤0.3500···(6)。[式中，X1～X6分别表示由通过所述组合物的LC‑MS/MS分析而得的提取离子色谱利用自动积分法计算出的、所述第1～第6肽片段的峰面积值，Y表示由通过所述组合物的LC‑UV分析而得的色谱利用自动积分法计算出的、所述碱性磷酸酶的峰面积值]。

Description

碱性磷酸酶组合物以及去磷酸化核酸和标记化核酸的制造 方法
技术领域
本发明涉及含有碱性磷酸酶的组合物以及使用了该组合物的去磷酸化核酸的制造方法和标记化核酸的制造方法。
背景技术
碱性磷酸酶具有水解磷酸单酯的催化功能，在测定蛋白质、核酸等生物体物质的量的方法(例如，免疫染色法、ELISA、核酸微阵列法等)中被广泛使用。例如，在基因工程学的研究领域，为了DNA、RNA等核酸的标记化的前处理、防止载体的自身连接等，而使用碱性磷酸酶进行核酸的5’末端和/或3’末端的去磷酸化。
作为碱性磷酸酶的工业制法，由于其比活性高，因而主要以牛的小肠或大肠作为原料的制造方法被广泛采用。碱性磷酸酶的比活性的评价一般通过测定在对硝基苯基磷酸酯分解时产生的对硝基苯酚来源的405nm的吸光度来进行。
碱性磷酸酶的品质基于碱性磷酸酶比活性来评价。并且，为了获得比牛肠来源的碱性磷酸酶比活性高的碱性磷酸酶，一直以来通过纯化过程来分离高比活性的碱性磷酸酶，或者使用基因工程学的手法通过重组大肠菌来生产高比活性的碱性磷酸酶。
专利文献1中公开了使用导入了栗褐芽胞杆菌属来源的基因的重组大肠菌来制造具有高比活性的碱性磷酸酶的方法。另外，专利文献2中公开了使用导入了希瓦氏菌属来源的基因的重组大肠菌制造具有高比活性和耐热性的碱性磷酸酶的方法。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开平10-262674号
专利文献2：国际公开第2012/115023号
发明内容
发明所要解决的课题
含有碱性磷酸酶的去磷酸化试剂(例如，市售的碱性磷酸酶制品)是在含有碱性磷酸酶的同时，含有其他成分的组合物。含有碱性磷酸酶的去磷酸化试剂的品质基于碱性磷酸酶比活性进行评价。
然而，判明了即使是具有几乎相同的碱性磷酸酶比活性的去磷酸化试剂，使用该去磷酸化试剂制备的标记化核酸(通过该去磷酸化试剂将核酸的5’末端和/或3’末端去磷酸化，使去磷酸化后的核酸的5’末端和/或3’末端结合标记物质而得的标记化核酸)在核酸检测法中的检测灵敏度也产生较大的差异。即，判明了含有碱性磷酸酶的去磷酸化试剂的品质不能够以碱性磷酸酶比活性作为指标正确地评价。
于是，本发明的目的在于提供含有碱性磷酸酶的高品质的组合物以及使用了该组合物的去磷酸化核酸的制造方法和标记化核酸的制造方法。
用于解决课题的手段
本发明者们为了解决上述课题而进行了深入研究，结果发现，含有碱性磷酸酶的去磷酸化试剂(例如，市售的碱性磷酸酶制品)中能够混合存在以下的杂质。
·由序列号1所记载的氨基酸序列组成的第1肽片段
·由序列号2所记载的氨基酸序列组成的第2肽片段
·由序列号3所记载的氨基酸序列组成的第3肽片段
·由序列号4所记载的氨基酸序列组成的第4肽片段
·由序列号5所记载的氨基酸序列组成的第5肽片段
·由序列号6所记载的氨基酸序列组成的第6肽片段
·由序列号7所记载的氨基酸序列组成的第7肽片段
·由序列号8所记载的氨基酸序列组成的第8肽片段
·由序列号9所记载的氨基酸序列组成的第9肽片段
并且，本发明者们发现，通过降低第1～第6肽片段的含量(优选为第1～第6肽片段的含量、以及选自第7～第9肽片段中的1种、2种或3种肽片段的含量)，能够提高使用去磷酸化试剂制备的标记化核酸(通过该去磷酸化试剂将核酸的5’末端和/或3’末端去磷酸化，使去磷酸化后的核酸的5’末端和/或3’末端结合标记物质而得的标记化核酸)在核酸检测法中的检测灵敏度，从而完成了本发明。即，本发明包含以下发明。
[1]含有碱性磷酸酶、由序列号1所记载的氨基酸序列组成的第1肽片段、由序列号2所记载的氨基酸序列组成的第2肽片段、由序列号3所记载的氨基酸序列组成的第3肽片段、由序列号4所记载的氨基酸序列组成的第4肽片段、由序列号5所记载的氨基酸序列组成的第5肽片段、和由序列号6所记载的氨基酸序列组成的第6肽片段的组合物，
所述组合物中，所述第1～第6肽片段的含量相对于所述碱性磷酸酶的含量的比率分别满足下述式(1)～(6)：
(X1/Y)×100≤0.6000 ···(1)
(X2/V)×100≤0.1800 ···(2)
(X3Y)×100≤0.2000 ···(3)
(X4/Y)×100≤0.8000 ···(4)
(X5/Y)×100≤1.6000 ···(5)
(X6/Y)×100≤0.3500 ···(6)。
[式中，X1～X6分别表示由通过所述组合物的LC-MS/MS分析而得的提取离子色谱利用自动积分法计算出的、所述第1～第6肽片段的峰面积值，Y表示由通过所述组合物的LC-UV分析而得的色谱利用自动积分法计算出的、所述碱性磷酸酶的峰面积值。]
[2]根据[1]所述的组合物，
所述组合物进一步含有由序列号7所记载的氨基酸序列组成的第7肽片段，
相对于所述碱性磷酸酶的含量的所述第7肽片段的含量满足下述式(7)：
(X7/Y)×100≤1.0000···(7)。
[式中，X7表示由通过所述组合物的LC-MS/MS分析而得的提取离子色谱利用自动积分法计算出的、所述第7肽片段的峰面积值，Y与上述含义相同。]
[3]根据[1]或[2]所述的组合物，
所述组合物进一步含有由序列号8所记载的氨基酸序列组成的第8肽片段，
相对于所述碱性磷酸酶的含量的所述第8肽片段的含量满足下述式(8)：
(X8/Y)×100≤1.0000···(8)。
[式中，X8表示由通过所述组合物的LC-MS/MS分析而得的提取离子色谱利用自动积分法计算出的、所述第8肽片段的峰面积值，Y与上述含义相同。]
[4]根据[1]～[3]的任一项所述的组合物，
所述组合物进一步含有由序列号9所记载的氨基酸序列组成的第9肽片段，
相对于所述碱性磷酸酶的含量的所述第9肽片段的含量满足下述式(9)：
(X9/Y)×100≤2.3000···(9)。
[式中，X9表示由通过所述组合物的LC-MS/MS分析而得的提取离子色谱利用自动积分法计算出的、所述第9肽片段的峰面积值，Y与上述含义相同。]
[5]根据[1]～[4]的任一项所述的组合物，所述组合物具有2000U/mg以上的碱性磷酸酶比活性。
[6]根据[1]～[5]的任一项所述的组合物，
所述碱性磷酸酶选自下述(a)和(b)：
(a)具有由序列号10所记载的氨基酸序列组成的蛋白质分子的碱性磷酸酶；和
(b)具有由与序列号10所记载的氨基酸序列有70％以上的序列同一性、并且包含序列号10所记载的氨基酸序列的78～90位、177～187位、469～477位、516～528位和534～551位的氨基酸序列组成的蛋白质分子的碱性磷酸酶。
[7]根据[6]所述的组合物，所述(b)的碱性磷酸酶所具有的蛋白质分子的氨基酸序列进一步包含选自序列号10所记载的氨基酸序列的91～109位、93～105位和529～531位中的1种或2种以上。
[8]根据[6]所述的组合物，所述(b)的碱性磷酸酶所具有的蛋白质分子的氨基酸序列进一步包含序列号10所记载的氨基酸序列的91～109位和529～531位。
[9]根据[1]～[8]的任一项所述的组合物，所述组合物进一步含有核酸。
[10]根据[9]所述的组合物，所述组合物是用于将所述核酸去磷酸化的组合物。
[11]根据[1]～[8]的任一项所述的组合物，所述组合物进一步含有去磷酸化核酸。
[12]根据[11]所述的组合物，所述组合物是用于制备标记化核酸的组合物，所述标记化核酸包含所述去磷酸化核酸和结合于所述去磷酸化核酸的标记物质。
[13]根据[1]～[8]的任一项所述的组合物，所述组合物进一步含有标记化核酸，所述标记化核酸包含去磷酸化核酸和结合于所述去磷酸化核酸的标记物质。
[14]根据[13]所述的组合物，所述组合物是供于核酸检测法的核酸样品。
[15]根据[14]所述的组合物，所述核酸检测法是使用核酸微阵列的核酸检测法。
[16]去磷酸化核酸的制造方法，包括以下工序：
准备[1]～[8]的任一项所述的组合物的工序；
准备核酸的工序；和
用所述组合物处理所述核酸，将所述核酸去磷酸化的工序。
[17]标记化核酸的制造方法，包括以下工序：
准备[1]～[8]的任一项所述的组合物的工序；
准备核酸的工序；
准备标记物质的工序；
用所述组合物处理所述核酸，将所述核酸去磷酸化的工序；和
使所述去磷酸化核酸结合所述标记物质的工序。
发明的效果
通过本发明，提供含有碱性磷酸酶的高品质的组合物以及使用了该组合物的去磷酸化核酸的制造方法和标记化核酸的制造方法。
附图说明
图1显示比较例2中通过组合物C2的LC-MS/MS分析而得的、关于第1肽片段的提取离子色谱。
图2显示比较例2中通过组合物C2的LC-MS/MS分析而得的、关于第2肽片段的提取离子色谱。
图3显示比较例2中通过组合物C2的LC-MS/MS分析而得的、关于第3肽片段的提取离子色谱。
图4显示比较例2中通过组合物C2的LC-MS/MS分析而得的、关于第4肽片段的提取离子色谱。
图5显示比较例2中通过组合物C2的LC-MS/MS分析而得的、关于第5肽片段的提取离子色谱。
图6显示比较例2中通过组合物C2的LC-MS/MS分析而得的、关于第6肽片段的提取离子色谱。
图7显示比较例2中通过组合物C2的LC-MS/MS分析而得的、关于第7肽片段的提取离子色谱。
图8显示比较例2中通过组合物C2的LC-MS/MS分析而得的、关于第8肽片段的提取离子色谱。
图9显示比较例2中通过组合物C2的LC-MS/MS分析而得的、关于第9肽片段的提取离子色谱。
图10显示实施例1中通过组合物E1(组合物C2的纯化品)的LC-MS/MS分析而得的、关于第1肽片段的提取离子色谱。
图11显示实施例1中通过组合物E1(组合物C2的纯化品)的LC-MS/MS分析而得的、关于第2肽片段的提取离子色谱。
图12显示实施例1中通过组合物E1(组合物C2的纯化品)的LC-MS/MS分析而得的、关于第3肽片段的提取离子色谱。
图13显示实施例1中通过组合物E1(组合物C2的纯化品)的LC-MS/MS分析而得的、关于第4肽片段的提取离子色谱。
图14显示实施例1中通过组合物E1(组合物C2的纯化品)的LC-MS/MS分析而得的、关于第5肽片段的提取离子色谱。
图15显示实施例1中通过组合物E1(组合物C2的纯化品)的LC-MS/MS分析而得的、关于第6肽片段的提取离子色谱。
图16显示实施例1中通过组合物E1(组合物C2的纯化品)的LC-MS/MS分析而得的、关于第7肽片段的提取离子色谱。
图17显示实施例1中通过组合物E1(组合物C2的纯化品)的LC-MS/MS分析而得的、关于第8肽片段的提取离子色谱。
图18显示实施例1中通过组合物E1(组合物C2的纯化品)的LC-MS/MS分析而得的、关于第9肽片段的提取离子色谱。
图19显示实施例1中通过组合物E1(组合物C2的纯化品)的LC-UV分析而得的、关于碱性磷酸酶的色谱。
具体实施方式
以下，详细说明本发明。可以将以下说明的实施方式中的2种以上实施方式组合，这样的组合也包含在本发明中。此外，本说明书中使用的“数值M～数值N”这样的表述是指为数值M以上且为数值N以下的范围。
[碱性磷酸酶]
本发明的组合物含有碱性磷酸酶。本发明的组合物可以含有1种碱性磷酸酶，也可以含有2种以上的碱性磷酸酶。
本发明的组合物所含有的碱性磷酸酶只要具有碱性磷酸酶活性就不特别限定。碱性磷酸酶活性是在碱性(pH8～11、例如，pH8～10或pH9～11)下水解磷酸单酯键的活性，其反应形式分类为EC3.1.3.1。
本发明的组合物所含有的碱性磷酸酶的结构(例如，一级结构、二级结构、三级结构、四级结构等)不特别限定。例如，碱性磷酸酶可以具有糖链，也可以不具有糖链。另外，碱性磷酸酶可以是基于蛋白质分子的结构(例如，蛋白质分子的氨基酸序列)、糖链修饰等的差异而能够存在的任意同工酶。另外，碱性磷酸酶可以是由1个亚基形成的单体(monomer)，也可以是由2个以上的亚基形成的寡聚物(例如，2聚体、4聚体等)。寡聚物可以是同源寡聚物，也可以是异源寡聚物。
本发明的组合物所含有的碱性磷酸酶所来源的动物不特别限定。作为碱性磷酸酶所来源的动物，可列举例如，牛、虾、导入了编码碱性磷酸酶的基因的微生物等。因为牛来源的碱性磷酸酶的碱性磷酸酶活性高，所以碱性磷酸酶所来源的动物优选为牛。在碱性磷酸酶为牛来源的情况下，碱性磷酸酶所来源的脏器优选为小肠或大肠。
本发明的组合物所含有的碱性磷酸酶可以是野生型，也可以是突变型。突变型碱性磷酸酶具有例如，由在野生型碱性磷酸酶所具有的蛋白质分子的氨基酸序列中缺失、替换、插入或添加了1个以上氨基酸的氨基酸序列组成的蛋白质分子。突变型碱性磷酸酶所具有蛋白质分子的氨基酸序列，相对于野生型碱性磷酸酶所具有的蛋白质分子的氨基酸序列，具有优选为70％以上、更优选为75％以上、更进一步优选为80％以上、更进一步优选为85％以上、更进一步优选为90％以上、更进一步优选为95％以上的序列同一性。
在优选的实施方式中，碱性磷酸酶选自下述(a)和(b)：
(a)具有由序列号10所记载的氨基酸序列组成的蛋白质分子的碱性磷酸酶；和
(b)具有由与序列号10所记载的氨基酸序列有70％以上的序列同一性、并且包含序列号10所记载的氨基酸序列的78～90位(相当于第4肽片段)、177～187位(相当于第1肽片段)、469～477位(相当于第2肽片段)、516～528位(相当于第5肽片段)和534～551位(相当于第3肽片段)的氨基酸序列组成的蛋白质分子的碱性磷酸酶。
该实施方式中，本发明的组合物可以含有选自上述(a)和(b)的1种碱性磷酸酶，也可以含有选自上述(a)和(b)的2种以上的碱性磷酸酶。上述(b)的碱性磷酸酶包含序列号10所记载的氨基酸序列的534～545位(相当于第6肽片段)。
上述(a)的碱性磷酸酶所具有的蛋白质分子的氨基酸序列(即，序列号10所记载的氨基酸序列)相当于牛来源的碱性磷酸酶所具有的蛋白质分子的氨基酸序列。因此，上述(a)的碱性磷酸酶中包含牛来源的碱性磷酸酶。
上述(b)的碱性磷酸酶所具有的蛋白质分子的氨基酸序列与序列号10所记载的氨基酸序列具有优选为70％以上、更优选为75％以上、更进一步优选为80％以上、更进一步优选为85％以上、更进一步优选为90％以上、更进一步优选为95％以上的序列同一性。
上述(b)的碱性磷酸酶包含野生型碱性磷酸酶(例如，牛以外的动物来源的碱性磷酸酶、具有多态性的牛来源的碱性磷酸酶等)和突变型碱性磷酸酶两者。序列号10所记载的氨基酸序列中缺失、替换、插入或添加1个以上的氨基酸的位置是序列号10所记载的氨基酸序列的除了78～90位、177～187位、469～477位、516～528位和534～551位以外的位置。
上述(a)和(b)的碱性磷酸酶通过其分解而可以生成第1～第6肽片段等。
在优选的实施方式中，上述(b)的碱性磷酸酶所具有的蛋白质分子的氨基酸序列包含选自序列号10所记载的氨基酸序列的91～109位、93～105位和529～531位中的1种或2种以上。在该实施方式中，上述(b)的碱性磷酸酶通过其分解而可以生成第7～第9肽片段的1种或2种以上。在该实施方式中，上述(b)的碱性磷酸酶包含选自序列号10所记载的氨基酸序列的86～109位(相当于第7肽片段)、93～105位(相当于第9肽片段)和516～531位(相当于第8肽片段)中的1种或2种以上。
在优选的实施方式中，上述(b)的碱性磷酸酶包含序列号10所记载的氨基酸序列的91～109位和529～531位。在该实施方式中，上述(b)的碱性磷酸酶通过其分解而可以生成第7～第9肽片段。在该实施方式中，上述(b)的碱性磷酸酶包含序列号10所记载的氨基酸序列的86～109位(相当于第7肽片段)、93～105位(相当于第9肽片段)和516～531位(相当于第8肽片段)。
[肽片段]
本发明的组合物含有由序列号1所记载的氨基酸序列组成的第1肽片段、由序列号2所记载的氨基酸序列组成的第2肽片段、由序列号3所记载的氨基酸序列组成的第3肽片段、由序列号4所记载的氨基酸序列组成的第4肽片段、由序列号5所记载的氨基酸序列组成的第5肽片段、和由序列号6所记载的氨基酸序列组成的第6肽片段。
序列号1所记载的氨基酸序列(DRQVPDSAGTA)相当于序列号10所记载的氨基酸序列的177～187位。序列号2所记载的氨基酸序列(APGKALDSK)相当于序列号10所记载的氨基酸序列的469～477位。序列号3所记载的氨基酸序列(GPQAHLVHGVQEETFVAH)相当于序列号10所记载的氨基酸序列的534～551位。序列号4所记载的氨基酸序列(EGVSLEKREAEAE)相当于序列号10所记载的氨基酸序列的78～90位。序列号5所记载的氨基酸序列(VPLASETHGGEDV)相当于序列号10所记载的氨基酸序列的516～528位。序列号6所记载的氨基酸序列(GPQAHLVHGVQE)相当于序列号10所记载的氨基酸序列的534～545位。
第1～第6肽片段的氨基酸序列分别相当于序列号10所记载的氨基酸序列的177～187位、469～477位、534～551位、78～90位、516～528位和534～545位。即，第1～第6肽片段分别可以通过序列号10所记载的氨基酸序列的177～187位、469～477位、534～551位、78～90位、516～528位和534～545位的分解而生成。这并不意味着本发明的组合物所含有的碱性磷酸酶必须包含序列号10所记载的氨基酸序列的177～187位、469～477位、534～551位、78～90位、516～528位和534～545位。本发明的组合物所含有的碱性磷酸酶可以不包含序列号10所记载的氨基酸序列的177～187位、469～477位、534～551位、78～90位、516～528位和534～545位的1种或2种以上。但是，本发明的组合物所含有的碱性磷酸酶优选包含序列号10所记载的氨基酸序列的177～187位、469～477位、534～551位、78～90位、516～528位和534～545位。
第1～第6肽片段可以是通过本发明的组合物中不含有的碱性磷酸酶的分解而生成的，但通常是通过本发明的组合物所含有的碱性磷酸酶的分解而生成的。因此，在优选的实施方式中，本发明的组合物所含有的碱性磷酸酶是可以生成第1～第6肽片段的碱性磷酸酶。在优选的实施方式中，可以生成第1～第6肽片段的碱性磷酸酶选自上述(a)和(b)的碱性磷酸酶。在该实施方式中，本发明的组合物含有选自上述(a)和(b)的碱性磷酸酶中的1种或2种以上的碱性磷酸酶。
在优选的实施方式中，本发明的组合物进一步含有选自由序列号7所记载的氨基酸序列组成的第7肽片段、由序列号8所记载的氨基酸序列组成的第8肽片段、和由序列号9所记载的氨基酸序列组成的第9肽片段中的1种或2种以上的肽片段。
在优选的实施方式中，本发明的组合物含有第7～第9肽片段的全部。
序列号7所记载的氨基酸序列(EAEAEFLIPAEEENPAFWNRQAAQ)相当于序列号10所记载的氨基酸序列的86～109位。序列号8所记载的氨基酸序列(VPLASETHGGEDVAVF)相当于序列号10所记载的氨基酸序列的516～531位。序列号9所记载的氨基酸序列(IPAEEENPAFWNR)相当于序列号10所记载的氨基酸序列的93～105位。
第7～第9肽片段分别相当于序列号10所记载的氨基酸序列的86～109位、516～531位和93～105位。即，第1～第6肽片段分别可以通过序列号10所记载的氨基酸序列的86～109位、516～531位和93～105位的分解而生成。这并不意味着本发明的组合物所含有的碱性磷酸酶必须包含序列号10所记载的氨基酸序列的86～109位、516～531位和93～105位。本发明的组合物所含有的碱性磷酸酶可以不包含序列号10所记载的氨基酸序列的86～109位、516～531位和93～105位的1种或2种以上。但是，本发明的组合物所含有的碱性磷酸酶优选包含序列号10所记载的氨基酸序列的86～109位、516～531位和93～105位。
第7～第9肽片段可以是通过本发明的组合物中不含有的碱性磷酸酶的分解而生成的，但通常是通过本发明的组合物所含有的碱性磷酸酶的分解而生成的。因此，在优选的实施方式中，本发明的组合物所含有的碱性磷酸酶是可以生成第7～第9肽片段的碱性磷酸酶。在优选的实施方式中，可以生成第7～第9肽片段的碱性磷酸酶选自上述(a)和(b)的碱性磷酸酶。在该实施方式中，本发明的组合物含有选自上述(a)和(b)的碱性磷酸酶中的1种或2种以上的碱性磷酸酶。
本发明的组合物可以含有除了第1～第9肽片段以外的肽片段。除了第1～第9肽片段以外的肽片段例如，是通过本发明的组合物所含有的碱性磷酸酶的分解而生成的。
[含量的比率]
本发明的组合物中，第1～第6肽片段的含量相对于碱性磷酸酶的含量的比分别满足下述式(1)～(6)：
(X1/Y)×100≤0.6000···(1)
(X2/Y)×100≤0.1800···(2)
(X3/Y)×100≤0.2000···(3)
(X4/Y)×100≤0.8000···(4)
(X5/Y)×100≤1.6000···(5)
(X6/Y)×100≤0.3500···(6)。
在上述式(1)～(6)中，X1～X6分别表示由通过本发明的组合物的LC-MS/MS分析而得的提取离子色谱利用自动积分法计算出的、第1～第6肽片段的峰面积值，Y表示由通过本发明的组合物的LC-UV分析而得的色谱利用自动积分法计算出的、碱性磷酸酶的峰面积值。
在本发明的组合物进一步含有第7肽片段的实施方式中，优选第7肽片段的含量相对于碱性磷酸酶的含量的比率满足下述式(7)：
(X7/Y)×100≤1.0000···(7)。
上述式(7)中，X7表示由通过本发明的组合物的LC-MS/MS分析而得的提取离子色谱利用自动积分法计算出的、第7～9肽片段的峰面积值，Y与上述含义相同。
在本发明的组合物进一步含有第8肽片段的实施方式中，优选第8肽片段的含量相对于碱性磷酸酶的含量的比率满足下述式(8)：
(X8/Y)×100≤1.0000···(8)。
上述式(8)中，X8表示由通过本发明的组合物的LC-MS/MS分析而得的提取离子色谱利用自动积分法计算出的、第8肽片段的峰面积值，Y与上述含义相同。
在本发明的组合物进一步含有第9肽片段的实施方式中，优选第9肽片段的含量相对于碱性磷酸酶的含量的比率满足下述式(9)：
(X9/Y)×100≤2.3000···(9)。
上述式(9)中，X9表示由通过本发明的组合物的LC-MS/MS分析而得的提取离子色谱利用自动积分法计算出的、第9肽片段的峰面积值，Y与上述含义相同。
LC-MS/MS分析和LC-UV分析使用第1肽片段的含量相对于碱性磷酸酶的含量的比率((X1/Y)×100)、第2肽片段的含量相对于碱性磷酸酶的含量的比率((X2/Y)×100)、第3肽片段的含量相对于碱性磷酸酶的含量的比率((X3/Y)×100)、第4肽片段的含量相对于碱性磷酸酶的含量的比率((X4/Y)×100)、第5肽片段的含量相对于碱性磷酸酶的含量的比率((X5/Y)×100)、和第6肽片段的含量相对于碱性磷酸酶的含量的比率((X6/Y)×100)与本发明的组合物相同的样品来实施。LC-MS/MS分析和LC-UV分析可以使用例如，由本发明的组合物制备的、碱性磷酸酶浓度为10重量％的水溶液来实施。
LC-MS/MS分析是联用法的一种。联用法是将气相色谱、液相色谱等色谱与质量分析装置接续而进行分析的手法。LC-MS/MS分析是将液相色谱(LC)与串联质量分析装置(MS/MS)接续而进行分析的手法。在LC-MS/MS分析中，被液相色谱分离出的分析对象成分被离子化，生成的离子被串联质量分析装置分离，特定的质量离子片段化而被检测出。
提取离子色谱是在联用法中，以一定的时间间隔测定质谱，使其存储在计算机中，然后读取特定的(不限于1种)m/z值中的相对强度，作为时间的函数而表示的色谱。为了检测第1～第9肽片段的峰而使用的离子的m/z优选为50～2200、更优选为200～1500、更进一步优选为300～1200。第1～第9肽片段的提取离子色谱可以基于m/z值而制成。第1肽片段的m/z值为558.7676、第2肽片段的m/z值为443.7533、第3肽片段的m/z值为652.6623、第4肽片段的m/z值为723.8572、第5肽片段的m/z值为655.8148、第6肽片段的m/z值为636.3282、第7肽片段的m/z值为920.7682、第8肽片段的m/z值为814.4018、第9肽片段的m/z值为786.8757。对于m/z值未被特定的肽片段，可以通过显示某峰的规定的肽片段的氨基酸序列分析进行确认，然后基于该峰的m/z值制成肽片段的提取离子色谱。
LC-UV分析是将液相色谱(LC)与紫外线检测器(UV检测器)接续而进行分析的手法。在LC-UV分析中，碱性磷酸酶作为在214nm具有吸收的成分被检测出。
LC-MS/MS分析和LC-UV分析的条件如下。
《LC-MS/MS分析的条件》
<装置构成>
质量分析计：maXis impact(Bruker Daltnics，InC.制)
<质量分析条件>
离子化方式：ESI
测定离子：正离子
毛细管电压：4500V
雾化器：2.0巴
干气：8.0L/分钟
检测器电压：1823V
测定范围(MS)：m/z 50～2200
<MS/MS条件>
测定范围(MS)：m/z 50～2200
碰撞气：氮气
《LC-UV分析的条件》
<装置构成>
液相色谱：LC-30A系统(岛津制作所制)
检测器：UV-Vis(190～900nm、岛津制作所制)
<液相色谱条件>
柱：Acquity BEH C18 1.7μm(Waters Corporation制)柱尺寸：2.1mm×100mm
柱温度：50℃
移动相流速：0.2mL/分钟
移动相A：水/甲酸混液(1000：1)
移动相B：乙腈/水/甲酸混液(900：100：1)
注入量：20μL
梯度程序：
表1
时间(分钟) 移动相A(体积％) 移动相B(体积％)
0 100 0
10 100 0
40 35 65
40.1 0 100
50 0 100
50.1 100 0
60 100 0
(X1/Y)×100的值只要为0.6000以下就不特别限定，越小越优选。(X1/Y)×100的值优选为0.5000以下、更优选为0.3000以下、更进一步优选为0.2000以下。(X1/Y)×100的下限值为检出限值。但是，从获得与用于减小(X1/Y)×100的值的劳动力(例如，利用纯化的第1肽片段的分离除去)相符合的效果的观点考虑，(X1/Y)×100的值优选为0.0500以上、更优选为0.0600以上、更进一步优选为0.0700以上。
(X2/Y)×100的值只要为0.1800以下就不特别限定，越小越优选。(X2/Y)×100的值优选为0.1500以下、更优选为0.1200以下、更进一步优选为0.1000以下。(X2/Y)×100的下限值为检出限值。但是，从获得与用于减小(X2/Y)×100的值的劳动力(例如，利用纯化的第2肽片段的分离除去)相符合的效果的观点考虑，(X2/Y)×100的值优选为0.0500以上、更优选为0.0600以上、更进一步优选为0.0700以上。
(X3/Y)×100的值只要为0.2000以下就不特别限定，越小越优选。(X3/Y)×100的值优选为0.1800以下、更优选为0.1700以下、更进一步优选为0.1500以下。(X3/Y)×100的下限值为检出限值。但是，从获得与用于减小(X3/Y)×100的值的劳动力(例如，利用纯化的第3肽片段的分离除去)相符合的效果的观点考虑，(X3/Y)×100的值优选为0.0500以上、更优选为0.0600以上、更进一步优选为0.0700以上。
(X4/Y)×100的值只要为0.8000以下就不特别限定，越小越优选。(X4/Y)×100的值优选为0.7000以下、更优选为0.6000以下、更进一步优选为03000以下。(X4/Y)×100的下限值为检出限值。但是，从获得与用于减小(X4/Y)×100的值的劳动力(例如，利用纯化的第4肽片段的分离除去)相符合的效果的观点考虑，(X4/Y)×100的值优选为0.0500以上、更优选为0.0600以上、更进一步优选为0.0700以上。
(X5/Y)×100的值只要为1.6000以下就不特别限定，越小越优选。(X5/Y)×100的值优选为1.5000以下、更优选为1.2000以下、更进一步优选为1.0000以下。(X5/Y)×100的下限值为检出限值。但是，从获得与用于减小(X5/Y)×100的值的劳动力(例如，利用纯化的第5肽片段的分离除去)相符合的效果的观点考虑，(X5/Y)×100的值优选为0.0500以上、更优选为0.0600以上、更进一步优选为0.0700以上。
(X6/Y)×100的值只要为0.3500以下就不特别限定，越小越优选。(X6/Y)×100的值优选为0.3200以下、更优选为0.3000以下、更进一步优选为0.2800以下。(X6/Y)×100的下限值为检出限值。但.是，从获得与用于减小(X6/Y)×100的值的劳动力(例如，利用纯化的第6肽片段的分离除去)相符合的效果的观点考虑，(X6/Y)×100的值优选为0.0800以上、更优选为0.1000以上、更进一步优选为0.1500以上。
(X7/Y)×100的值只要为1.0000以下就不特别限定，越小越优选。(X7/Y)×100的值优选为0.9000以下、更优选为0.8000以下、更进一步优选为0.7000以下。(X7/Y)×100的下限值为检出限值。但是，从获得与用于减小(X7/Y)×100的值的劳动力(例如，利用纯化的第7肽片段的分离除去)相符合的效果的观点考虑，(X7/Y)×100的值优选为0.0500以上、更优选为0.0600以上、更进一步优选为0.0700以上。
(X8/Y)×100的值只要为1.0000以下就不特别限定，越小越优选。(X8/Y)×100的值优选为0.9000以下、更优选为0.8000以下、更进一步优选为0.7000以下。(X8/Y)×100的下限值为检出限值。但是，从获得与用于减小(X8/Y)×100的值的劳动力(例如，利用纯化的第8肽片段的分离除去)相符合的效果的观点考虑，(X8/Y)×100的值优选为0.0500以上、更优选为0.0600以上、更进一步优选为0.0700以上。
(X9/Y)×100的值只要为2.3000以下就不特别限定，越小越优选。(X9/Y)×100的值优选为2.0000以下、更优选为1.5000以下、更进一步优选为1.0000以下。(X9/Y)×100的下限值为检出限值。但是，从获得与用于减小(X9/Y)×100的值的劳动力(例如，利用纯化的第9肽片段的分离除去)相符合的效果的观点考虑，(X9/Y)×100的值优选为0.0500以上、更优选为0.0600以上、更进一步优选为0.0700以上。
由通过使用由本发明的组合物制备的、碱性磷酸酶浓度为10重量％的水溶液的LC-MS/MS分析而得的提取离子色谱利用自动积分法计算出的、第1肽片段的峰面积值为越小越优选。第1肽片段的峰面积优选为1500以下、更优选为1200以下、更进一步优选为1000以下。第1肽片段的峰面积值的下限值为检出限值。但是，从获得与用于减小第1肽片段的峰面积值的劳动力(例如，利用纯化的第1肽片段的分离除去)相符合的效果的观点考虑，第1肽片段的峰面积优选为100以上、更优选为150以上、更进一步优选为200以上。
由通过使用由本发明的组合物制备的、碱性磷酸酶浓度为10重量％的水溶液的LC-MS/MS分析而得的提取离子色谱利用自动积分法计算出的、第2肽片段的峰面积值为越小越优选。第2肽片段的峰面积优选为400以下、更优选为380以下、更进一步优选为350以下。第2肽片段的峰面积值的下限值为检出限值。但是，从获得与用于减小第2肽片段的峰面积值的劳动力(例如，利用纯化的第2肽片段的分离除去)相符合的效果的观点考虑，第2肽片段的峰面积优选为100以上、更优选为130以上、更进一步优选为150以上。
由通过使用由本发明的组合物制备的、碱性磷酸酶浓度为10重量％的水溶液的LC-MS/MS分析而得的提取离子色谱利用自动积分法计算出的、第3肽片段的峰面积值为越小越优选。第3肽片段的峰面积优选为500以下、更优选为450以下、更进一步优选为400以下。第3肽片段的峰面积值的下限值为检出限值。但是，从获得与用于减小第3肽片段的峰面积值的劳动力(例如，利用纯化的第3肽片段的分离除去)相符合的效果的观点考虑，第3肽片段的峰面积优选为100以上、更优选为150以上、更进一步优选为200以上。
由通过使用由本发明的组合物制备的、碱性磷酸酶浓度为10重量％的水溶液的LC-MS/MS分析而得的提取离子色谱利用自动积分法计算出的、第4肽片段的峰面积值为越小越优选。第4肽片段的峰面积优选为2000以下、更优选为1800以下、更进一步优选为1500以下。第4肽片段的峰面积值的下限值为检出限值。但是，从获得与用于减小第4肽片段的峰面积值的劳动力(例如，利用纯化的第4肽片段的分离除去)相符合的效果的观点考虑，第4肽片段的峰面积优选为100以上、更优选为150以上、更进一步优选为200以上。
由通过使用由本发明的组合物制备的、碱性磷酸酶浓度为10重量％的水溶液的LC-MS/MS分析而得的提取离子色谱利用自动积分法计算出的、第5肽片段的峰面积值为越小越优选。第5肽片段的峰面积优选为4500以下、更优选为3000以下、更进一步优选为2500以下。第5肽片段的峰面积值的下限值为检出限值。但是，从获得与用于减小第5肽片段的峰面积值的劳动力(例如，利用纯化的第5肽片段的分离除去)相符合的效果的观点考虑，第5肽片段的峰面积优选为100以上、更优选为150以上、更进一步优选为200以上。
由通过使用由本发明的组合物制备的、碱性磷酸酶浓度为10重量％的水溶液的LC-MS/MS分析而得的提取离子色谱利用自动积分法计算出的、第6肽片段的峰面积值为越小越优选。第6肽片段的峰面积优选为1000以下、更优选为900以下、更进一步优选为800以下。第6肽片段的峰面积值的下限值为检出限值。但是，从获得与用于减小第6肽片段的峰面积值的劳动力(例如，利用纯化的第6肽片段的分离除去)相符合的效果的观点考虑，第6肽片段的峰面积优选为100以上、更优选为150以上、更进一步优选为200以上。
由通过使用由本发明的组合物制备的、碱性磷酸酶浓度为10重量％的水溶液的LC-MS/MS分析而得的提取离子色谱利用自动积分法计算出的、第7肽片段的峰面积值为越小越优选。第7肽片段的峰面积优选为3000以下、更优选为2500以下、更进一步优选为2000以下。第7肽片段的峰面积值的下限值为检出限值。但.是，从获得与用于减小的第7肽片段的峰面积值劳动力(例如，利用纯化的第7肽片段的分离除去)相符合的效果的观点考虑，第7肽片段的峰面积优选为100以上、更优选为150以上、更进一步优选为200以上。
由通过使用由本发明的组合物制备的、碱性磷酸酶浓度为10重量％的水溶液的LC-MS/MS分析而得的提取离子色谱利用自动积分法计算出的、第8肽片段的峰面积值为越小越优选。第8肽片段的峰面积优选为3000以下、更优选为2500以下、更进一步优选为2000以下。第8肽片段的峰面积值的下限值为检出限值。但是，从获得与用于减小第8肽片段的峰面积值的劳动力(例如，利用纯化的第8肽片段的分离除去)相符合的效果的观点考虑，第8肽片段的峰面积优选为100以上、更优选为150以上、更进一步优选为200以上。
由通过使用由本发明的组合物制备的、碱性磷酸酶浓度为10重量％的水溶液的LC-MS/MS分析而得的提取离子色谱利用自动积分法计算出的、第9肽片段的峰面积值为越小越优选。第9肽片段的峰面积优选为6000以下、更优选为3000以下、更进一步优选为1000以下。第9肽片段的峰面积值的下限值为检出限值。但是，从获得与用于减小第9肽片段的峰面积值的劳动力(例如，利用纯化的第9肽片段的分离除去)相符合的效果的观点考虑，第9肽片段的峰面积优选为100以上、更优选为150以上、更进一步优选为200以上。
由通过使用由本发明的组合物制备的、碱性磷酸酶浓度为10重量％的水溶液的LC-UV分析而得的色谱利用自动积分法计算出的、碱性磷酸酶的峰面积优选为200000以上、更优选为220000以上、更进一步优选为240000以上。碱性磷酸酶的峰面积值的上限值不特别限定。碱性磷酸酶的峰面积优选为500000以下、更优选为400000以下、更进一步优选为350000以下。
[碱性磷酸酶比活性]
本发明的组合物优选具有2000U/mg以上的碱性磷酸酶比活性。本发明的组合物所具有的碱性磷酸酶比活性更优选为2500U/mg以上、更进一步优选为3000U/mg以上。本发明的组合物所具有的碱性磷酸酶比活性如下测定。通过测定通过在对硝基苯基磷酸酯水溶液中添加碱性磷酸酶而生成的对硝基苯酚来源的405nm的吸光度，可以计算出碱性磷酸酶的比活性。
[其他成分]
本发明的组合物可以含有1种或2种以上的其他成分。作为其他成分，可列举例如，水等水性介质、镁盐、钠盐等金属盐、表面活性剂、有机酸、甘油等。
本发明的组合物可以在要求碱性磷酸酶活性的各种用途中使用，可以含有根据用途而选择的1种或2种以上的其他成分。
在一个实施方式中，本发明的组合物含有抗原、抗体等蛋白质。在该实施方式中，本发明的组合物可以用于将抗原、抗体等蛋白质用碱性磷酸酶标记化。即，在一个实施方式中，本发明的组合物是用于将蛋白质用碱性磷酸酶标记化的组合物。利用碱性磷酸酶的蛋白质的标记化可以通过将碱性磷酸酶的羧基用琥珀酰亚胺酯化，使得到的碱性磷酸酶琥珀酰亚胺酯体与蛋白质的氨基反应，从而进行。
在一个实施方式中，本发明的组合物含有碱性磷酸酶的底物。在该实施方式中，本发明的组合物用于将碱性磷酸酶的底物去磷酸化。即，在一个实施方式中，本发明的组合物是用于将碱性磷酸酶的底物去磷酸化的组合物。碱性磷酸酶的底物只要是具有磷酸单酯键的化合物就不特别限定。作为碱性磷酸酶的底物，可列举例如，核酸、磷脂、焦磷酸等。将碱性磷酸酶的底物用本发明的组合物处理，则碱性磷酸酶的底物的磷酸单酯键被碱性磷酸酶水解，发生碱性磷酸酶的底物的去磷酸化。
在优选的实施方式中，本发明的组合物含有核酸。在该实施方式中，本发明的组合物可以用于将核酸去磷酸化。即，在优选的实施方式中，本发明的组合物是用于将核酸去磷酸化的组合物。混合存在于碱性磷酸酶中的第1～第6肽片段可能在用碱性磷酸酶将核酸去磷酸化时带来坏影响。这一点，在本发明的组合物中，第1～第6肽片段的含量相对于碱性磷酸酶的含量的比率分别满足上述式(1)～(6)。即，在本发明的组合物中，第1～第6肽片段的相对含量降低了。因此，通过使用本发明的组合物，能够降低在用碱性磷酸酶将核酸去磷酸化时可能生成的第1～第6肽片段的坏影响，能够提高核酸的去磷酸化效率。通过用本发明的组合物处理核酸，能够将核酸的5’末端和/或3’末端去磷酸化。通过将核酸的5’末端和/或3’末端去磷酸化，能够提高将核酸的5’末端和/或3’末端用标记物质进行标记化时的标记化效率。特别是在作为标记物质使用32P时，该效果显著。另外，通过将DNA克隆中使用的载体的5’末端和/或3’末端去磷酸化，能够防止载体的自连接，由此能够降低转化细胞的背景。
核酸可以是例如，DNA、RNA、PNA(肽核酸)、LNA(锁核酸，Locked Nucleic Acid)等核酸或核酸衍生物。作为核酸衍生物，可列举例如，包括修饰核苷酸(例如，包含卤素、甲基等烷基、甲氧基等烷氧基、硫代、羧甲基等基团的核苷酸、和受到碱基的再构成、双键的饱和、脱氨基化、氧分子向硫分子的置换等的核苷酸等)在内的核酸衍生物。核酸可以是单链，也可以是双链。作为DNA，可列举例如，染色体DNA，病毒的DNA、细菌、霉等的DNA、cDNA、它们的片段等。作为RNA，可列举例如，mRNA，rRNA，小RNA、它们的片段等。核酸也可以是化学合成的DNA、RNA等。作为核酸的具体例，可列举病原菌、病毒等的基因或其一部分、遗传病的致病基因或其一部分等。
核酸可以通过例如，由生物体材料、病毒、细菌、霉、饮食物等利用常规方法进行提取，从而制备。作为生物体材料，可列举例如，血液、血清、血浆、尿、粪便、脑脊液、唾液、拭子液、组织液等体液、细胞、组织等。生物体材料可以是动物来源的，也可以是植物来源的。
本发明的组合物所包含的核酸的量可以根据本发明的组合物的使用目的(例如，目标核酸的检测)等而适当调整。例如，在以本发明的组合物所包含的核酸中的某核酸(目标核酸)的检测为目的情况下，可以通过以本发明的组合物所包含的核酸作为模板实施PCR等的核酸扩增法，从而扩增目标核酸。由此，能够提高目标核酸的检测灵敏度。
核酸的长度(碱基数)可以根据本发明的组合物的使用目的(例如，目标核酸的检测)等而适当调整。例如，在以核酸的检测作为目的情况下，核酸的长度通常为10～300碱基、优选为10～100碱基、更优选为15～50碱基。核酸的长度可以通过片段化处理来适当调整。核酸的长度可以是例如，能够与探针杂交的长度。在核酸较长的情况(例如1500碱基以上、特别是4000碱基以上)下，优选将核酸进行片段化处理，将核酸的长度调整为适当的长度。在进行片段化处理时，不必从生成的核酸片段中选择特定的核酸片段，可以直接使用片段化处理物。
作为为了片段化而切断核酸的方法，可列举例如，照射超声波而切断的方法、用酶切断的方法、用限制性酶切断的方法、使用雾化器的方法、用酸或碱切断的方法等。在用超声波切断的方法的情况下，通过控制对核酸照射的超声波的输出强度和照射时间，能够将核酸切断成所期望的长度。
在优选的实施方式中，本发明的组合物含有去磷酸化核酸。关于核酸的说明与上述同样。去磷酸化核酸具有被碱性磷酸酶去磷酸化而得的5’末端和/或3’末端。在该实施方式中，本发明的组合物可以为了制备包含去磷酸化核酸和结合于该去磷酸化核酸的标记物质的标记化核酸而使用。即，在优选的实施方式中，本发明的组合物是用于制备包含去磷酸化核酸和结合于该去磷酸化核酸的标记物质的标记化核酸的组合物。混合存在于碱性磷酸酶中的第1～第6肽片段可能在用碱性磷酸酶将核酸去磷酸化时、和/或使去磷酸化后的核酸结合标记物质时带来坏影响。这一点，在本发明的组合物中，第1～第6肽片段的含量相对于碱性磷酸酶的含量的比率分别满足上述式(1)～(6)。即，在本发明的组合物中，第1～第6肽片段的相对含量降低了。因此，通过使用本发明的组合物，能够降低用碱性磷酸酶将核酸去磷酸化时、和/或使去磷酸化后的核酸结合标记物质时可能生成的第1～第6肽片段的坏影响，能够提高核酸的去磷酸化效率、和/或去磷酸化后的核酸的标记化效率。
在优选的实施方式中，本发明的组合物含有包含去磷酸化核酸和结合于该去磷酸化核酸的标记物质的标记化核酸。关于核酸的说明与上述同样。去磷酸化核酸具有被碱性磷酸酶去磷酸化而得的5’末端和/或3’末端。标记物质与去磷酸化核酸的5’末端和/或3’末端结合。
作为标记物质，可以使用例如，荧光色素、荧光蛋白、化学发光体、金属络合物、金属微粒子、生物素、放射性同位素等。将目标核酸标记化时的反应条件可以根据标记物质的种类而适当调节。在标记物质是荧光色素的情况下，荧光色素的检测可以使用荧光显微镜、荧光扫描仪等来进行。
作为作为荧光色素，可列举例如，荧光素系色素、罗丹明系色素、Alexa Fluor(インビトロジエン社制)系色素、BODIPY(インビトロジエン社制)系色素、Cascade系色素、香豆素系色素、伊红系色素、NBD系色素、芘系色素、Texas Red系色素、酞菁系色素等有机荧光色素。
作为有机荧光色素的具体例，可列举5-羧基荧光素、6-羧基荧光素、5，6-二羧基荧光素、6-羧基-2’，4，4’，5’，7，7’-六氯荧光素、6-羧基-2’，4，7，7’-四氯荧光素、6-羧基-4’，5'-二氯-2’，7’-二甲氧基荧光素、萘并荧光素、5-羧基罗丹明、6-羧基罗丹明、5，6-二羧基罗丹明、罗丹明6G、四甲基罗丹明、X-罗丹明、Alexa Fluor 350、Alexa Fluor 405、AlexaFluor 430、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 500、Alexa Fluor 514、Alexa Fluor 532、Alexa Fluor546、Alexa Fluor 555、Alexa Fluor 568、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor610、Alexa Fluor 633、Alexa Fluor 635、Alexa Fluor 647、Alexa Fluor 660、AlexaFluor 680、Alexa Fluor 700、Alexa Fluor 750、BODIPY FL、BODIPY TMR、BODIPY493/503、BODIPY 530/550、BODIPY 558/568、BODIPY 564/570、BODIPY 576/589、BODIPY581/591、BODIPY 630/650、BODIPY 650/665(以上インビトロジエン社制)、甲氧基香豆素、伊红、NBD、芘、Cy5、Cy5.5、Cy7等。
本发明的组合物在含有包含去磷酸化核酸和结合于该去磷酸化核酸的标记物质的标记化核酸的实施方式中，本发明的组合物可以作为供于核酸检测法的核酸样品使用。即，在优选的实施方式中，本发明的组合物可以是供于核酸检测法的核酸样品。标记化核酸可以含有要检测的目标核酸、和除了目标核酸以外的核酸。在核酸检测法中，可以将核酸样品所含有的目标核酸，以目标核酸所具有的标记物质作为指标进行检测。核酸检测法不特别限定，可以从公知的核酸检测法中适当选择。目标核酸例如，可以使用杂交法进行检测。在杂交法的一个实施方式中，可以使用能够与目标核酸杂交的探针来检测目标核酸。在使用探针的核酸检测法的一个实施方式中，使探针、与含有目标核酸的核酸样品接触，使探针与目标核酸杂交，以目标核酸所具有的标记物质作为指标检测与探针杂交的目标核酸。在样品中包含除了目标核酸以外的核酸的情况下，优选使目标核酸与探针接触，然后通过洗涤等除去不与探针杂交的核酸。
使目标核酸与探针杂交时的反应条件可以根据目标核酸的链长、探针的链长等而适当调整。反应时间通常为30～1200分钟、优选为60～360分钟。反应温度通常为25～60℃、优选为30～40℃。反应通常在水等水性介质中进行。
目标核酸和探针的使用量只要能够进行目标核酸与探针的杂交、能够检测结合于目标核酸的标记物质，就不特别限定，可以根据目标核酸的链长、探针的链长、标记物质的种类等而适当调整。
作为探针，可以使用例如，DNA、RNA、PNA(肽核酸)、LNA(锁核酸，Locked NucleicAcid)等核酸或核酸衍生物。作为核酸衍生物，可列举例如，包括修饰核苷酸(例如，包含卤素、甲基等烷基、甲氧基等烷氧基、硫代、羧甲基等基团的核苷酸、和受到碱基的再构成、双键的饱和、脱氨基化、氧分子向硫分子的置换等的核苷酸等)在内的核酸衍生物。
探针具有与目标核酸的碱基序列的至少一部分互补的碱基序列，能够与目标核酸杂交。在目标核酸是双链的情况下，探针可以与正义链杂交，也可以与反义链杂交。探针的碱基序列可以与目标核酸的碱基序列中的任何部分互补，但优选与目标核酸的碱基序列中的特异性高的部分互补。即，探针的碱基序列优选与目标核酸的碱基序列中的、样品含有但其他核酸中不包含的碱基序列互补。
探针的碱基序列中的与目标核酸的碱基序列互补的部分的长度(碱基数)不特别限定，通常为10～150碱基、优选为20～100碱基、更优选为20～70碱基。探针可以由与目标核酸的碱基序列互补的碱基序列构成，也可以包含与目标核酸的碱基序列不互补的碱基序列。探针的全长(总碱基数)通常为10～300碱基、优选为20～200碱基、更优选为15～100碱基。
探针可以是市售品、合成品、来自生物体的制备物等的任一者。被称为寡核酸的长度为200碱基以内的核酸可以用合成仪容易地人工合成。
探针优选固定化于支撑体。即，在优选的实施方式中，核酸检测法是使用核酸微阵列的核酸检测法。核酸微阵列具有支撑体、和固定于支撑体的表面的多个探针。在使用核酸微阵列的核酸检测法中，可以使被标记化的目标核酸、和具备能与目标核酸杂交的探针的核酸微阵列接触，以结合于目标核酸的标记物质作为指标，检测与探针杂交的目标核酸。在样品包含除了目标核酸以外的核酸的情况下，优选使目标核酸与核酸微阵列接触，然后通过洗涤等除去核酸微阵列上的不与探针杂交的核酸。通过使用具备多个探针的核酸微阵列，能够同时检测2种以上的目标核酸。
支撑体只要能够固定化探针就不特别限定。作为支撑体，可列举例如，载玻片、膜、珠等。作为支撑体的材质，可列举例如，玻璃、陶瓷、硅等无机材料、聚对苯二甲酸乙二酯、醋酸纤维素、聚碳酸酯、聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯、硅橡胶等聚合物等。
探针向支撑体的固定化可以按照常规方法进行。作为在支撑体上固定化探针的方法，在支撑体上面部合成寡核酸的方法、将预先合成好的寡核酸向支撑体上面部滴加并固定的方法等是公知的。作为前者的方法，可列举例如，Ronald等的方法(美国专利第5705610号说明书)、Michel等的方法(美国专利第6142266号说明书)、Francesco等的方法(美国专利第7037659号说明书)等。这些方法中在DNA合成反应时使用有机溶剂，因而支撑体期望是对有机溶剂具有耐性的材质。例如，可以使用利用日本特表平10-503841号公报所述的方法制作的具有凹凸结构的玻璃制支撑体。特别是在Francesco等的方法中，由于从支撑体的背面照射光，控制DNA合成，因此支撑体优选是具有透光性的材质。作为后者的方法，可列举例如，广田等的方法(日本特许第3922454号)、使用玻璃毛细管的方法等。作为玻璃毛细管的一例，可以使用自制的玻璃毛细管、マイクロピペツト((株)マイクロサポート社制；MP-005)等市售制品。
作为目标核酸的检测方法，可以使用夹心杂交法。在夹心杂交法中，使用固定于支撑体的第1探针(捕捉探针)、和未固定于支撑体的第2探针(检测探针)。捕捉探针和检测探针分别具有与目标核酸的不同部分互补的碱基序列，能够与目标核酸的不同部分杂交。通过检测探针和捕捉探针与目标核酸杂交而形成复合物。通过检测该复合物所包含的标记物质，能够检测目标核酸。
检测探针的碱基序列与捕捉探针的碱基序列的序列同一性优选较低。序列同一性优选为20％以下，更优选为10％以下。这里，2条碱基序列的同一性是以碱基尽可能多地一致的方式将2条序列排列(根据需要加入间隙)，将一致的碱基数除以总碱基数(在2条碱基序列的碱基数不同的情况下为较大一方的碱基数)而得的数值，通过FASTA、BLAST等市售的软件(在互联网上也提供)能够容易地计算出。
目标核酸的检测方法中检测到的信号(例如，检测到的标记物质的强度)与周围噪声进行比较。具体地，将由固定有探针的支撑体上的位置得到的信号值、与由未固定探针的支撑体上的位置得到的信号值(噪声值)进行比较，将前者的数值与噪声值的比作为S/N比。检测准确度可以通过S/N比表示。即，S/N比越大，则检测准确度越高，S/N比越小，则检测准确度越低。
本发明的组合物在包含去磷酸化核酸和结合于该去磷酸化核酸的标记物质的标记化核酸的实施方式中，通过在核酸检测法使用本发明的组合物作为核酸样品，能够提高目标核酸的检测灵敏度。该效果在使用微量(优选为5～1000μL、更优选为5～500μL)的核酸样品的核酸检测法中显著。在使用微量的核酸样品的核酸检测法中，核酸样品所包含的第1～第6肽片段能给检测灵敏度带来坏影响。这一点，在本发明的组合物中，第1～第6肽片段相对于碱性磷酸酶的含量的比率分别满足上述式(1)～(6)。即，在本发明的组合物中，第1～第6肽片段的相对含量降低了。因此，在使用微量的核酸样品的核酸检测法中，通过使用本发明的组合物作为核酸样品，能够降低第1～第6肽片段的坏影响，能够显著提高目标核酸的检测灵敏度。
在优选的实施方式中，核酸检测法是使用核酸微阵列的核酸检测法。在使用核酸微阵列的核酸检测法中，使用微量(优选为5～1000μL、更优选为5～500μL)的核酸样品。因此，在使用核酸微阵列的核酸检测法中，通过使用本发明的组合物作为核酸样品，能够降低第1～第6肽片段的坏影响，能够显著提高目标核酸的检测灵敏度。
[制造方法]
本发明的组合物可以通过从来自牛、虾等的脏器的碱性磷酸酶提取物、来自导入了编码碱性磷酸酶的基因的微生物的碱性磷酸酶提取物、导入了编码碱性磷酸酶的基因的微生物的菌体破碎物、市售的碱性磷酸酶制品等，分离第1～第6肽片段，从而制造。作为第1～第6肽片段的分离方法，可列举例如，透析、盐析、凝胶过滤、超滤、膜分离、离子交换、柱色谱、电泳等。第1～第6肽片段的分离方法可以单独使用1种，也可以2种以上组合使用。例如，通过将市售的碱性磷酸酶制品用柱色谱等纯化，可以使相对于碱性磷酸酶的含量的第1～第6肽片段的含量为所期望的范围。柱色谱例如为液相色谱。液相色谱中使用的柱和移动相只要能够分离第1～第6肽片段就不特别限定，优选使用担持了C18的反相柱。第7～第9肽片段也可以与第1～第6肽片段同样地分离。
[使用方法]
本发明的组合物可以在要求碱性磷酸酶活性的各种方法中使用。
在一个实施方式中，本发明的组合物可以在包括以下工序的去磷酸化核酸的制造方法中使用，
准备本发明的组合物的工序；
准备核酸的工序；和
用上述组合物处理上述核酸，将上述核酸去磷酸化的工序。
混合存在于碱性磷酸酶中的第1～第6肽片段可能在用碱性磷酸酶将核酸去磷酸化时带来坏影响。这一点，在本发明的组合物中，第1～第6肽片段的含量相对于碱性磷酸酶的含量的比率分别满足上述式(1)～(6)。即，在本发明的组合物中，第1～第6肽片段的相对含量降低了。因此，通过用本发明的组合物处理核酸，能够提高核酸的去磷酸化效率。
在一个实施方式中，本发明的组合物在包括以下工序的标记化核酸的制造方法中使用，
准备本发明的组合物的工序；
准备核酸的工序；
准备标记物质的工序；
用上述组合物处理上述核酸，将上述核酸去磷酸化的工序；和
使上述去磷酸化核酸结合上述标记物质的工序。
混合存在于碱性磷酸酶中的第1～第6肽片段可能在用碱性磷酸酶将核酸去磷酸化时、和/或使去磷酸化后的核酸结合标记物质时带来坏影响。这一点，在本发明的组合物中，第1～第6肽片段的含量相对于碱性磷酸酶的含量的比率分别满足上述式(1)～(6)。即，在本发明的组合物中，第1～第6肽片段的相对含量降低了。因此，通过用本发明的组合物处理核酸，能够提高核酸的去磷酸化效率、和/或去磷酸化后的核酸的标记化效率。
在用本发明的组合物处理核酸、将核酸去磷酸化的工序中，反应条件可以适当调节。反应时间通常为10～60分钟、优选为20～50分钟。反应温度通常为20～60℃、优选为25～45℃。反应通常在水等水性介质中进行。核酸例如为DNA、RNA等。将核酸用本发明的组合物处理，则核酸的5’末端和/或3’末端被去磷酸化。
在使去磷酸化核酸结合标记物质的工序中，作为标记物质，可以使用例如，荧光色素、荧光蛋白、化学发光体、金属络合物、金属微粒子、生物素、放射性同位素等。反应条件可以根据标记物质的种类适当调节。去磷酸化核酸具有被碱性磷酸酶去磷酸化而得的5’末端和/或3’末端，标记物质可以与被去磷酸化而得的5’末端和/或3’末端结合。
实施例
以下，通过实施例详细地说明本发明，但本发明不限于以下实施例。
《LC-MS/MS分析的条件》
实施例和比较例中使用的LC-MS/MS分析的条件如下。
<装置构成>
质量分析计：maXis impact(Bruker Daltnics，InC.制)
<质量分析条件>
离子化方式：ESI
测定离子：正离子
毛细管电压：4500V
雾化器：2.0巴
干气：8.0L/分钟
检测器电压：1823V
测定范围(MS)：m/z 50～2200
<MS/MS条件>
测定范围(MS)：m/z 50～2200
碰撞气：氮气
《LC-UV分析的条件》
实施例和比较例中使用的LC-UV分析的条件如下。
<装置构成>
液相色谱：LC-30A系统(岛津制作所制)
检测器：UV-Vis(190～900nm、岛津制作所制)
<液相色谱条件>
柱：Acquity BEH C18 1.7μm(Waters Corporation制)柱尺寸：2.1mm×100mm
柱温度：50℃
移动相流速：0.2mL/分钟
移动相A：水/甲酸混液(1000∶1)
移动相B：乙腈/水/甲酸混液(900：100∶1)
注入量：20μL
梯度程序：
表2
时间(分钟) 移动相A(体积％) 移动相B(体积％)
0 100 0
10 100 0
40 35 65
40.1 0 100
50 0 100
50.1 100 0
60 100 0
《核酸检测法》
实施例和比较例中使用的核酸检测法如下。
核酸检测法使用DNA芯片(DNA微阵列)进行。具体地，使用東レ株式会社制的“3D-Gene”human miRNA oligo Chip(对用于miRBAse release21)来进行。
[比较例1～8]
使用从5个公司购买的8种碱性磷酸酶制品(以下称为“组合物C1”～“组合物C8”)作为比较例1～8的碱性磷酸酶组合物。组合物C1～C8各自所包含的碱性磷酸酶是牛的肠道来源的碱性磷酸酶。测定组合物C1～C8各自的碱性磷酸酶比活性，结果组合物C1为2238U/mg、组合物C2为2492U/mg、组合物C3为2431U/mg、组合物C4为2519U/mg、组合物C5为2411U/mg、组合物C6为2552U/mg、组合物C7为2448U/mg、组合物C8为2490U/mg。此外，碱性磷酸酶比活性通过使用对硝基苯基磷酸酯的方法测定。具体如下。
准备下述溶液A和B。
溶液A：1M二乙醇胺缓冲液(pH9.8)
溶液B：0.67M对硝基苯酚磷酸水溶液
在Cubette(光路长＝1Cm)中调制溶液A 2.9mL和溶液B 0.1mL，在7℃加温5分钟。接着，添加碱性磷酸酶水溶液0.1mL，用分光光度计测定405nm(37℃)的吸光度变化3～5分钟，求出每单位时间的吸光度变化(ΔOD)。作为对照用添加了水的样品代替碱性磷酸酶水溶液求出吸光度变化(AOD空白)。通过下述式计算出碱性磷酸酶活性(U/mL)。
碱性磷酸酶活性(U/mL)＝(ΔOD-ΔOD空白)×3.1/(18.2×0.1×1.0)
碱性磷酸酶水溶液中的碱性磷酸酶的浓度通过测定214nm的吸光度而计算出。将碱性磷酸酶水溶液用蒸馏水稀释使得214nm的吸光度为0.1～1.0，以1ABs＝1mg/mL近似而将乘以稀释倍率而得的值作为碱性磷酸酶的浓度。本发明中的比活性是指每1mg碱性磷酸酶的活性(U/mg)，通过上述测定法计算出。
由组合物C1～C8分别制备10重量％碱性磷酸酶水溶液，使用该水溶液进行LC-UV分析和LC-MS/MS分析。基于通过LC-MS/MS分析而得的提取离子色谱，通过自动积分法计算出由序列号1所记载的氨基酸序列组成的第1肽片段、由序列号2所记载的氨基酸序列组成的第2肽片段、由序列号3所记载的氨基酸序列组成的第3肽片段、由序列号4所记载的氨基酸序列组成的第4肽片段、由序列号5所记载的氨基酸序列组成的第5肽片段、由序列号6所记载的氨基酸序列组成的第6肽片段、由序列号7所记载的氨基酸序列组成的第7肽片段、由序列号8所记载的氨基酸序列组成的第8肽片段、和由序列号9所记载的氨基酸序列组成的第9肽片段各自的峰面积值。另外，基于通过LC-UV分析而得的色谱，通过自动积分法计算出碱性磷酸酶的峰面积值。在LC-UV分析中，碱性磷酸酶作为在214nm具有吸收的成分而检测到。
图1是比较例2中通过组合物C2的LC-MS/MS分析而得的、关于第1肽片段的提取离子色谱。
图2是比较例2中通过组合物C2的LC-MS/MS分析而得的、关于第2肽片段的提取离子色谱。
图3是比较例2中通过组合物C2的LC-MS/MS分析而得的、关于第3肽片段的提取离子色谱。
图4是比较例2中通过组合物C2的LC-MS/MS分析而得的、关于第4肽片段的提取离子色谱。
图5是比较例2中通过组合物C2的LC-MS/MS分析而得的、关于第5肽片段的提取离子色谱。
图6是比较例2中通过组合物C2的LC-MS/MS分析而得的、关于第6肽片段的提取离子色谱。
图7是比较例2中通过组合物C2的LC-MS/MS分析而得的、关于第7肽片段的提取离子色谱。
图8是比较例2中通过组合物C2的LC-MS/MS分析而得的、关于第8肽片段的提取离子色谱。
图9是比较例2中通过组合物C2的LC-MS/MS分析而得的、关于第9肽片段的提取离子色谱。
使用比较例1～8的碱性磷酸酶组合物将核酸去磷酸化，将所得的去磷酸化核酸用酞菁系有机荧光色素标记化。具体地，如下进行去磷酸化反应和标记化反应。
将由健常人采血的全血进行离心分离而获得血清1mL。从血清中使用“3D-Gene”RNA extraction reagent from liquid sample kit(東レ(株)制)提取微RNA。以所得的提取微RNA作为母液，使用“3D-Gene”miRNA labeling kit(東レ(株)制)进行标记。将所得的提取微RNA 5μL添加到上述试剂盒的AP Buffer 0.4μL和Spike Control 1.0μL的混合液中，进一步添加组合物C1 0.4μL，从而制备溶液。接着，在37℃孵育40分钟，然后在冰上静置2分钟。接着，添加LE Buffer 1.2μL、3D-Gene Fluorescent Label3.0μL、Nuclease freewater 2.5μL、Labeling enzyme 1.0μL，在16℃孵育1小时，然后在65℃孵育15分钟，获得标记化核酸。使用了组合物C2～C8的去磷酸化反应和标记化反应也使用同一提取微RNA母液，通过与上述同样的方法进行。
使用所得的标记化核酸进行核酸的检测。对于标记了的样本RNA，使用DNA芯片(“3D-Gene”miRNA Chip，東レ(株)制)，按照其标准方案进行杂交。杂交后的DNA芯片供于微阵列扫描仪(東レ(株)制)测定荧光强度。扫描仪的设定为激光输出100％、光电倍增管的电压设定为AUTO设定。核酸的检测如上所述使用DNA芯片(DNA微阵列)进行。求出DNA芯片中的有效斑点数，计算出检出率(％)。以DNA芯片上的全部2588个斑点中检测信号值减去噪声(无斑点的位置的信号值)而得的值为100以上的作为有效斑点，将有效斑点数除以总斑点数并乘以100而得的值作为检出率。结果示于表4-2。
[实施例1～4]
将比较例2～4和8的碱性磷酸酶组合物(组合物C2～C4和C8)通过以下方法纯化，得到实施例1～4的碱性磷酸酶组合物(以下称为“组合物E1”～“组合物E4”)。纯化方法如下。
(透析工序)
将组合物C2(30μL)使用透析杯(截留分子量3.5K)，用透析缓冲液(1mL，50mMTris-HCl，2mM MgCl2，0.2mM ZnCl2)进行3次透析处理，回收浓缩液。
(凝胶过滤工序)
将透析处理后的浓缩液使用凝胶过滤柱，用缓冲液(2.5mL，10mM Tris-HCl，1mMMgCl2，0.1mM ZnCl2，50mM KCl，55重量％甘油)进行过滤回收。
(疏水柱工序)
由凝胶过滤后的回收液使用疏水柱，在下述条件下回收碱性磷酸酶级分。
移动相流速：1.0mL/分钟
移动相A：20mM磷酸氢二钠、3M硫酸铵(50/50)
移动相B：20mM磷酸氢二钠
梯度程序：
表3
时间(分钟) 移动相A(体积％) 移动相B(体积％)
0 100 0
3 100 0
40 0 100
50 0 100
55 100 0
65 100 0
检测器：UV214nm
(透析工序)
将回收的碱性磷酸酶级分在与上述透析相同的条件下进行3次透析处理，回收浓缩液。
(超滤工序)
将回收的浓缩液使用超滤柱(截留分子量10K)，用缓冲液(2.5mL，10mM Tris-HCl，1mM MgCl2，0.1mM ZnCl2，50mM KCl，55重量％甘油)进行过滤回收，得到组合物E1。
组合物E2、组合物E3和组合物E4也同样地使用与上述同样的方法，分别由组合物C3、组合物C4和组合物C8得到。
测定实施例1～4的碱性磷酸酶组合物的碱性磷酸酶比活性，结果组合物E1为2490U/mg、组合物E2为2420U/mg、组合物E3为2522U/mg、组合物E4为2470U/mg。此外，碱性磷酸酶比活性与上述同样地测定。
由组合物E1～E4分别制备10重量％碱性磷酸酶水溶液，使用该水溶液进行LC-UV分析和LC-MS/MS分析。基于通过LC-MS/MS分析而得的提取离子色谱，通过自动积分法计算出由序列号1所记载的氨基酸序列组成的第1肽片段、由序列号2所记载的氨基酸序列组成的第2肽片段、由序列号3所记载的氨基酸序列组成的第3肽片段、由序列号4所记载的氨基酸序列组成的第4肽片段、由序列号5所记载的氨基酸序列组成的第5肽片段、由序列号6所记载的氨基酸序列组成的第6肽片段、由序列号7所记载的氨基酸序列组成的第7肽片段、由序列号8所记载的氨基酸序列组成的第8肽片段、和由序列号9所记载的氨基酸序列组成的第9肽片段各自的峰面积值。另外，基于通过LC-UV分析而得的色谱，通过自动积分法计算出碱性磷酸酶的峰面积值。在LC-UV分析，碱性磷酸酶作为在214nm具有吸收的成分检测出。
图10是实施例1中通过组合物E1(组合物C2的纯化品)的LC-MS/MS分析而得的、关于第1肽片段的提取离子色谱。
图11是实施例1中通过组合物E1(组合物C2的纯化品)的LC-MS/MS分析而得的、关于第2肽片段的提取离子色谱。
图12是实施例1中通过组合物E1(组合物C2的纯化品)的LC-MS/MS分析而得的、关于第3肽片段的提取离子色谱。
图13是实施例1中通过组合物E1(组合物C2的纯化品)的LC-MS/MS分析而得的、关于第4肽片段的提取离子色谱。
图14是实施例1中通过组合物E1(组合物C2的纯化品)的LC-MS/MS分析而得的、关于第5肽片段的提取离子色谱。
图15是实施例1中通过组合物E1(组合物C2的纯化品)的LC-MS/MS分析而得的、关于第6肽片段的提取离子色谱。
图16是实施例1中通过组合物E1(组合物C2的纯化品)的LC-MS/MS分析而得的、关于第7肽片段的提取离子色谱。
图17是实施例1中通过组合物E1(组合物C2的纯化品)的LC-MS/MS分析而得的、关于第8肽片段的提取离子色谱。
图18是实施例1中通过组合物E1(组合物C2的纯化品)的LC-MS/MS分析而得的、关于第9肽片段的提取离子色谱。
图19是实施例1中通过组合物E1(组合物C2的纯化品)的LC-UV分析而得的、关于碱性磷酸酶的色谱。此外，实施例2～4和比较例1～8中通过各组合物的LC-UV分析而得的、关于碱性磷酸酶的色谱与图19是同样的。
使用实施例1～4的碱性磷酸酶组合物将核酸去磷酸化，将所得的去磷酸化核酸用酞菁系有机荧光色素标记化。去磷酸化反应和标记化反应与上述同样地进行。
使用所得的标记化核酸进行核酸的检测。核酸的检测如上所述使用DNA芯片(DNA微阵列)进行。求出DNA芯片中的有效斑点数，计算出检出率(％)。结果示于表4-1和表5-1。
Figure BDA0002990095680000371
Figure BDA0002990095680000381
Figure BDA0002990095680000391
Figure BDA0002990095680000401
如表4-1、表4-2、表5-1和表5-2所示，将使用比较例1～8的碱性磷酸酶组合物制备的核酸样品在核酸检测法中使用的情况下，有效斑点数小于1500；与此相对，将使用实施例1～4的碱性磷酸酶组合物制备的核酸样品在核酸检测法中使用的情况下，有效斑点数为1500以上。另外，比较例1～8中，尽管碱性磷酸酶组合物所具有的碱性磷酸酶比活性几乎相同，但检出率产生差异；与此相对，实施例1～4中的检出率几乎相同，并且高于比较例1～8的检出率。
如表4-1、表4-2、表5-1和表5-2所示，作为第1肽片段的含量相对于碱性磷酸酶的含量的比率的指标的(X1/Y)×100的值，在比较例1～8的碱性磷酸酶组合物中超过0.6000(最小值为比较例5的碱性磷酸酶组合物中的0.6646)，与此相对，在实施例1～4的碱性磷酸酶组合物中为0.6000以下。考虑这是在实施例1～4与比较例1～8之间产生上述效果的差异的主要原因之一。
如表4-1、表4-2、表5-1和表5-2所示，作为第2肽片段的含量相对于碱性磷酸酶的含量的比率的指标的(X2/Y)×100的值，在比较例1～8的碱性磷酸酶组合物中超过0.1800(最小值为比较例4的碱性磷酸酶组合物中的0.1810)，与此相对，在实施例1～4的碱性磷酸酶组合物中为0.1800以下。考虑这是在实施例1～4与比较例1～8之间产生上述效果的差异的主要原因之一。
如表4-1、表4-2、表5-1和表5-2所示，作为第3肽片段的含量相对于碱性磷酸酶的含量的比率的指标的(X3/Y)×100的值，在比较例1～8的碱性磷酸酶组合物中超过0.2000(最小值为比较例6的碱性磷酸酶组合物中的0.2073)，与此相对，在实施例1～4的碱性磷酸酶组合物中为0.2000以下。考虑这是在实施例1～4与比较例1～8之间产生上述效果的差异的主要原因之一。
如表4-1、表4-2、表5-1和表5-2所示，作为第4肽片段的含量相对于碱性磷酸酶的含量的比率的指标的(X4/Y)×100的值，在比较例1～8的碱性磷酸酶组合物中超过0.8000(最小值为比较例1的碱性磷酸酶组合物中的0.8497)，与此相对，在实施例1～4的碱性磷酸酶组合物中为0.8000以下。考虑这是在实施例1～4与比较例1～8之间产生上述效果的差异的主要原因之一。
如表4-1、表4-2、表5-1和表5-2所示，作为第5肽片段的含量相对于碱性磷酸酶的含量的比率的指标的(X5/Y)×100的值，在比较例1～8的碱性磷酸酶组合物中超过1.6000(最小值为比较例1的碱性磷酸酶组合物中的1.6913)，与此相对，在实施例1～4的碱性磷酸酶组合物中为1.6000以下。考虑这是在实施例1～4与比较例1～8之间产生上述效果的差异的主要原因之一。
如表4-1、表4-2、表5-1和表5-2所示，作为第6肽片段的含量相对于碱性磷酸酶的含量的比率的指标的(X6/Y)×100的值，在比较例1～8的碱性磷酸酶组合物中超过0.3500(最小值为比较例1的碱性磷酸酶组合物中的0.3915)，与此相对，在实施例1～4的碱性磷酸酶组合物中为0.3500以下。考虑这是在实施例1～4与比较例1～8之间产生上述效果的差异的主要原因之一。
如表4-1、表4-2、表5-1和表5-2所示，作为第7肽片段的含量相对于碱性磷酸酶的含量的比率的指标的(X7/Y)×100的值，在比较例1、2和4～8的碱性磷酸酶组合物中超过1.0000(但是，在比较例3为1.0000以下)，与此相对，在实施例1～4的碱性磷酸酶组合物中为1.0000以下。考虑这是在实施例1～4与1、2和4～8之间产生上述效果的差异的次要原因之一。
如表4-1、表4-2、表5-1和表5-2所示，作为第8肽片段的含量相对于碱性磷酸酶的含量的比率的指标的(X8/Y)×100的值，在比较例1～3、5、7和8的碱性磷酸酶组合物中超过1.0000(但是，在比较例4和6中为1.0000以下)，与此相对，在实施例1～4的碱性磷酸酶组合物中为1.0000以下。考虑这是在实施例1～4与1～3、5、7和8之间产生上述效果的差异的次要原因之一。
如表4-1、表4-2、表5-1和表5-2所示，作为第9肽片段的含量相对于碱性磷酸酶的含量的比率的指标的(X9/Y)×100的值，在比较例2～4、7和8的碱性磷酸酶组合物中超过2.3000(但是，在比较例1、5和6中为2.3000以下)，与此相对，在实施例1～4的碱性磷酸酶组合物中为2.3000以下。考虑这是在实施例1～4与比较例2～4、7和8之间产生上述效果的差异的次要原因之一。
Figure IDA0002990095730000011
Figure IDA0002990095730000021
Figure IDA0002990095730000031
Figure IDA0002990095730000041
Figure IDA0002990095730000051
Figure IDA0002990095730000061

Claims (14)

1.含有碱性磷酸酶、由序列号1所记载的氨基酸序列组成的第1肽片段、由序列号2所记载的氨基酸序列组成的第2肽片段、由序列号3所记载的氨基酸序列组成的第3肽片段、由序列号4所记载的氨基酸序列组成的第4肽片段、由序列号5所记载的氨基酸序列组成的第5肽片段、和由序列号6所记载的氨基酸序列组成的第6肽片段的组合物，
所述组合物中，所述第1～第6肽片段的含量相对于所述碱性磷酸酶的含量的比率分别满足下述式(1)～(6)：
(X1/Y)×100≤0.6000···(1)
(X2/Y)×100≤0.1800···(2)
(X3/Y)×100≤0.2000···(3)
(X4/Y)×100≤0.8000···(4)
(X5/Y)×100≤1.6000···(5)
(X6/Y)×100≤0.3500···(6)
式中，X1～X6分别表示由提取离子色谱利用自动积分法计算出的、所述第1～第6肽片段的峰面积值，所述提取离子色谱是通过所述组合物的LC-MS/MS分析而得的，
Y表示由色谱利用自动积分法计算出的、所述碱性磷酸酶的峰面积值，所述色谱是通过所述组合物的LC-UV分析而得的。
2.根据权利要求1所述的组合物，
所述组合物进一步含有由序列号7所记载的氨基酸序列组成的第7肽片段，
相对于所述碱性磷酸酶的含量的所述第7肽片段的含量满足下述式(7)：
(X7/Y)×100≤1.0000···(7)
式中，X7表示由提取离子色谱利用自动积分法计算出的、所述第7肽片段的峰面积值，所述提取离子色谱是通过所述组合物的LC-MS/MS分析而得的，
Y与上述含义相同。
3.根据权利要求1或2所述的组合物，
所述组合物进一步含有由序列号8所记载的氨基酸序列组成的第8肽片段，
相对于所述碱性磷酸酶的含量的所述第8肽片段的含量满足下述式(8)：
(X8/Y)×100≤1.0000···(8)
式中，X8表示由提取离子色谱利用自动积分法计算出的、所述第8肽片段的峰面积值，所述提取离子色谱是通过所述组合物的LC-MS/MS分析而得的，
Y与上述含义相同。
4.根据权利要求1～3的任一项所述的组合物，
所述组合物进一步含有由序列号9所记载的氨基酸序列组成的第9肽片段，
相对于所述碱性磷酸酶的含量的所述第9肽片段的含量满足下述式(9)：
(X9/Y)×100≤2.3000···(9)
式中，X9表示由提取离子色谱利用自动积分法计算出的、所述第9肽片段的峰面积值，所述提取离子色谱是通过所述组合物的LC-MS/MS分析而得的，
Y与上述含义相同。
5.根据权利要求1～4的任一项所述的组合物，所述组合物具有2000U/mg以上的碱性磷酸酶比活性。
6.根据权利要求1～5的任一项所述的组合物，
所述碱性磷酸酶选自下述(a)和(b)：
(a)具有由序列号10所记载的氨基酸序列组成的蛋白质分子的碱性磷酸酶；和
(b)具有由与序列号10所记载的氨基酸序列有70％以上的序列同一性、并且包含序列号10所记载的氨基酸序列的78～90位、177～187位、469～477位、516～528位和534～551位的氨基酸序列组成的蛋白质分子的碱性磷酸酶。
7.根据权利要求6所述的组合物，所述(b)的碱性磷酸酶所具有的蛋白质分子的氨基酸序列进一步包含选自序列号10所记载的氨基酸序列的91～109位、93～105位和529～531位中的1种或2种以上。
8.根据权利要求6所述的组合物，所述(b)的碱性磷酸酶所具有的蛋白质分子的氨基酸序列进一步包含序列号10所记载的氨基酸序列的91～109位和529～531位。
9.根据权利要求1～8的任一项所述的组合物，所述组合物进一步含有核酸，并且所述组合物是用于将所述核酸去磷酸化的组合物。
10.根据权利要求1～8的任一项所述的组合物，所述组合物进一步含有去磷酸化核酸，并且所述组合物是用于制备标记化核酸的组合物，所述标记化核酸包含所述去磷酸化核酸和结合于所述去磷酸化核酸的标记物质。
11.根据权利要求1～8的任一项所述的组合物，所述组合物进一步含有标记化核酸，所述标记化核酸包含去磷酸化核酸和结合于所述去磷酸化核酸的标记物质，并且所述组合物是供于核酸检测法的核酸样品。
12.根据权利要求11所述的组合物，所述核酸检测法是使用核酸微阵列的核酸检测法。
13.去磷酸化核酸的制造方法，包括以下工序：
准备权利要求1～8的任一项所述的组合物的工序；
准备核酸的工序；和
用所述组合物处理所述核酸，将所述核酸去磷酸化的工序。
14.标记化核酸的制造方法，包括以下工序：
准备权利要求1～8的任一项所述的组合物的工序；
准备核酸的工序；
准备标记物质的工序；
用所述组合物处理所述核酸，将所述核酸去磷酸化的工序；和
使所述去磷酸化核酸结合所述标记物质的工序。
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