KR20040012260A

KR20040012260A - 유전자변형농산물에 대한 유전자변형농산물 혼입률(%)의정량분석방법

Info

Publication number: KR20040012260A
Application number: KR1020020045752A
Authority: KR
Inventors: 박한오; 김현배; 이상주; 박수민
Original assignee: (주)바이오니아
Priority date: 2002-08-02
Filing date: 2002-08-02
Publication date: 2004-02-11
Also published as: KR100794700B1

Abstract

본 발명은 유전자변형농산물(GMO)에 대한 GMO 혼입률(%)을 분석하기 위한 새로운 유전자변형농산물 정량분석방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는 유전자변형농산물에 대한 재조합 유전자 검출용 프라이머와 내재유전자 검출용 프라이머의 각 5′말단을 형광표지로 라벨링하여 중합효소연쇄반응을 수행한 후, 각각의 표준시료에 대한 증폭산물 양을 기준으로 표준정량곡선을 작성하고 표준정량곡선 대비 미지시료에 대한 증폭산물의 양을 환산하여 미지시료의 GMO 혼입률(%)을 산출하는 단계로 이루어지는 유전자변형농산물에 대한 GMO 혼입률(%)의 정량분석방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법은 기존의 정량방법과는 달리 보다 정확한 유전자변형농산물의 GMO 혼입률(%)을 정량할 수 있고, 초기 설비투자의 비용이나 기기 유지비용에 있어서도 경제적으로 효율성이 높다.

Description

유전자변형농산물에 대한 유전자변형농산물 혼입률(%)의 정량 분석방법{Quantitative Analysis Method for Analyzing Mingled Ratio of Genetically Modified Organisms}

본 발명은 유전자변형농산물에 대한 GMO 혼입률(%)을 산출하기 위한 새로운 정량분석방법에 관한 것이다.

유전자변형농산물(Genetically Modified Organism: GMO 이하, GMO라 한다)이란 일반적으로 생산량 증대 또는 유통 가공상의 편의를 위하여 유전공학기술을 이용, 기존의 번식방법으로는 나타날 수 없는 형질이나 유전자를 지니도록 개발된 농산물을 말한다.

세계 유전자변형농산물의 작부면적이 2001년 5000만 헥타르를 돌파하였고(ISAAA, 국제아그리바이오기술사업단), 국내에서도 총 수요량의 89% 정도를 거의 전량 미국에서 수입하고 있는 가운데 수입콩의 GM 콩 혼입률이 30%를 훨씬 넘는 것으로 추정된다. 콩 뿐만 아니라, 많은 곡물을 미국에서 수입하고 있는우리나라도 GMO 표시문제는 커다란 문제가 아닐 수 없다. 이처럼 확산되는 유전자변형농산물의 동향과 GMO 검사의 관심이 증가하는 현실에 발맞추어 보다 효율적인 GMO 검사 시스템의 개발이 요구되고 있다.

이러한 GMO 표시문제는 1994년 칼진사의 GM 토마토 "Flavr Savr"가 상업화된 이래, EU에서 유전자 변형식품에 대한 표시 문제가 제기되어 1997년 표시 규정이 처음 제정되었으며 우리나라도 농산물의 경우, 농수산물품질관리법 개정(1999.1.21)과 유전자변형농산물표시요령 고시(2000.4.22)에 의거하여 콩, 옥수수, 콩나물에 대하여 표시제를 시행(2001.3.1)하게 되었고, 가공식품의 경우 식품위생법 개정(2000.1.21)과 유전자재조합 식품등의 표시기준 고시(2000.8.30)에 의거하여 "농림부에서 표시하도록 지정한 콩, 옥수수, 콩나물을 주요 원재료로 사용하여 제조 또는 가공한 27개 품목의 가공식품"에 대하여 표시제를 시행(2001.7.13)하도록 하여 비의도적 혼입 허용치(현재와 같은 관리체계 하에서 자연교잡, 수송 또는 보관 등의 과정에서 GMO가 섞일 수 있는 최대 허용량)를 농산물에서는 3% 이하로, 가공식품에 있어서는 최종제품에 대해서 허용치를 설정하지 않고 상기 농산물의 허용치(3%)를 준용하는 규정을 의무사항으로 두고 있다.

현재 GMO와 비유전자변형농산물(Non-Genetically Modified Organism, 이하, Non-GMO라 한다)에 대한 표시제 관리에 사용하는 검증방법으로는 도입 유전자를 직접 검출하여 확인하는 중합효소연쇄반응검사법(PCR-based test)과 도입 유전자가 만들어내는 특이 단백질을 검사하는 면역학적 분석법(Immunoassay test)이 있다.

면역학적 분석법은 작물에 도입된 유전자가 만들어내는 특이 단백질을 검출하는 방법으로 생체내의 면역계에서 볼 수 있는 항원항체 반응을 응용한 것으로서, ELISA(Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay)는 실험실 수준의 검사법으로서 상당히 숙련된 기술자를 요구하고 실제적으로 많은 시간이 소요된다. 그리고 결과의 신뢰성은 시료의 균일성, 단백질 추출조건, 항체 선택에 의해 결정된다. 일반적으로 단백질을 대상으로 하는 ELISA 법은 검출강도에 있어서 PCR법에 비해 떨어지며 열처리 등으로 단백질의 변성이 생길 수 있는 식품류에서의 검출에 대해서는 한계를 가지고 있다. Strip Test는 일종의 Dip-stick test로 비교적 비숙련자가 빠르고 쉽게 GMO 존재유무를 현장에서 확인할 수 있는 장점을 가지고 있으나 정량이 불가능하다는 점에서 불리하다. 한편, 중합효소연쇄반응검사법(PCR-based Test)은 도입유전자(35S 프로모터나 NOS 터미네이터)의 발현을 위한 유전자 조절부위로부터 유래된 프라이머를 중합효소연쇄반응으로 증폭시켜 검정하는 정성분석방법과 TaqMan chemistry법에 의하여 PCR 증폭과정 중에 발색되는 형광색소의 양을 실시간별로 측정하여 정량하는 정량분석방법이 있다.

현재 이용되는 유전자변형농산물에 대한 정량분석은 각 중합효소연쇄반응(이하, PCR이라 한다)의 대수 증식기(exponential phase) 범위 내에서 측정하고자 매 사이클의 진행상황을 모니터링하는, 젤에서의 분리방법이 아닌 반응 튜브 내 측정수단으로 형광측정방법을 통한 실시간 중합효소연쇄반응(Real Time PCR)을 이용하고 있다. 실시간 중합효소연쇄반응을 통한 정량분석방법에는 SYBRR Green I method, Taqman probe method, Molecular beacon method 그리고 Hybridization probe method의 4가지 방법이 사용되고 있다.

SYBRR Green I을 이용한 방법은 위에서 언급한 형광 라벨링된 올리고뉴클레오타이드 프로브를 사용하는 방법이 아닌 PCR반응에 의해 생성된 PCR 산물인 DNA의 이중나선의 minor groove에 결합하여 형광을 방출하며 이로 인해 발생하는 형광량을 측정하는 방법으로, 이때 검출된 형광량은 증폭된 DNA의 양에 비례하여 발생하므로 간접적인 정량측정 수단이 될 수 있다. Taqman probe method(5' Nuclease Assay)는 프로브의 5′말단에 리포터형광을 붙이고 3′말단에는 퀀처를 붙여, PCR이 진행될 때 5′ 말단의 리포터형광이 떨어지면서 내는 고유의 형광을 정량하는 방식으로, 이 프로브의 서열은 타겟의 고유한 염기서열로서, 특정 산물에만 붙으며, PCR 반응이 없으면 3′말단의 퀀처에 의해 형광이 억제되도록 디자인된 것이다. PCR 반응이 많으면 비례적으로 형광의 양도 누적 증가하므로 간접적인 정량 측정수단이 될 수 있다. Molecular beacon probe method는 특이한 헤어핀 (hair-pin)의 스템과 루프(stem-and-loop)구조로, 가운데의 루프부분은 타겟에 대해 상보적인 염기서열로 구성되고(10-40 염기) 양 말단은 각각 4-7염기쌍의 상보적인 염기서열로서 스템 구조를 형성한다. 5′말단에는 리포터형광이 붙어있고 3′말단에는 퀀처로 DABSYL이 붙어 있어, 이들 헤어핀 구조가 타겟에 붙어있지 않은 경우에는 구조적으로 리포터가 형광을 내지 못하는 반면, 타겟에 결합하게 되면 PCR의 진행에 따라 증가하는 특정산물에 molecular beacon probe의 루프부위가 붙게 되고 이들 헤어핀구조가 풀어지면서 퀀처의 영향권에서 벗어난 리포터가 발산하는 형광을 측정하여 정량하는 방법이다. Hybridization probe method는 타겟 서열내의 서로 인접한 2개의 프로브를 사용한다. 이 경우, 한 프로브의 3′말단에는 공여체형광이 붙어 있고 다른 프로브의 5′말단에는 수용체형광이 붙어 있어 이들 프로브가 서로 인접해야만 형광공명에너지전이(Fluorescence Resonance Energy Transfer;FRET)가 일어나서, 공여체의 방사광(emission light)이 수용체의 여기광(excitation light)으로 작용할 수 있다. 즉, 근접한 공여체형광에서 전달된 에너지에 의해 수용체 형광이 형광을 발하게 되며, 그 형광의 양은 PCR 산물에 붙은 프로브의 양에 비례 증대하여 간접적 정량측정 수단이 될 수 있다.

이에 본 발명의 목적은 유전자변형농산물에 대한 정량분석을 위하여 유전자변형농산물에 특이적인 재조합유전자 검출용 프라이머와 내재유전자 검출용 프라이머를 프라이머를 이용하여 중합효소연쇄반응(PCR)으로 타겟 유전자를 증폭하고 아크릴아마이드 젤 상에서 전기영동을 진행하여 재조합 유전자 밴드, 내재 유전자 밴드 및 외부표준검체 밴드를 확인한 다음, 정량 프로그램을 통하여 형광감도 값으로 수치화하여 GMO 혼입률에 따른 정량면적을 나타내고, 표준시료의 PCR 증폭산물에 대한 형광 밴드값으로 표준정량곡선을 작성하고, 이들 표준시료에 대한 표준정량곡선을 이용하여 GMO 혼입률(%)을 확인하고자 하는 미지시료의 GMO 혼입률(%)을 정확하게 정량할 수 있는 방법을 제공하는 것이다.

또한 본 발명의 목적은 상기 방법에 사용될 수 있는 프라이머를 제공하는 것이다.

도 1은 GMO 콩과 Non-GMO 콩에서 추출한 게놈 DNA를 아가로즈 젤 전기영동한 결과를 나타낸 도.

도 2는 외부표준검체시료에 대한 PCR 반응 후 아크릴아마이드 젤 전기영동으로 농도별 DNA 밴드를 나타낸 도.

도 3은 GMO 콩과 Non-GMO 콩에서 추출한 게놈 DNA에 대한 PCR 반응 후 아가로즈 젤 전기영동한 결과를 나타낸 도.

도 4는 정량분석을 위한 PCR 반응 후 아크릴아마이드 젤 전기영동 후 GMO 정량 프로그램을 적용하여 GMO 혼입률(%)에 따른 밴드를 나타낸 도.

도 5는 정량분석을 위한 PCR 반응 후 아크릴아마이드 젤 전기영동 후 GMO 정량 프로그램을 적용하여 GMO 혼입률(%)에 따른 밴드를 나타낸 도.

도 6은 정량분석을 위한 PCR 반응 후 시퀀서를 이용하여 아크릴아마이드 젤 전기영동한 후 시퀀서의 콜렉터 (collector)상에서 노스 (NOS) 재조합유전자 밴드를 나타낸 도.

도 7은 정량분석을 위한 PCR 반응 후 시퀀서를 이용하여 아크릴아마이드 젤전기영동을 하고 GMO 정량 프로그램을 이용하여 각 시료에 대한 레인 트랙킹(tracking)과 분석범위를 선정하여 추출한 이미지 밴드를 나타낸 도.

도 8은 도 7의 각각의 밴드 값을 GMO 정량 프로그램을 이용하여 형광감도 값으로 수치화하여 GMO 혼입률(%)에 따른 정량면적을 나타낸 도.

도 9는 GMO 정량 프로그램을 이용하여 표준시료에 대한 표준정량곡선을 표시하고 표준정량곡선 대비 GMO 혼입률(%)을 정량하고자 하는 시료에 대한 GMO 혼입률을 %로 계산한 것을 나타낸 도이다.

본 발명은 유전자변형농산물(GMO)에 대한 GMO 혼입률(%)을 분석하기 위한 새로운 유전자변형농산물의 정량분석방법에 관한 것이다.

본 발명은 일정한 GMO 혼입률을 갖는 표준시료, 정량하고자하는 미지시료의 게놈 DNA를 주형으로 하여 유전자변형농산물(GMO)에 특이적으로 나타나는 재조합 유전자 검출용 프라이머와 내재유전자 검출용 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하는 단계; 외부표준검체시료의 PCR을 수행하는 단계; 상기 a)와 b)로부터 증폭된 PCR 산물을 혼합하여 아크릴아마이드 젤 상에서 전기영동하는 단계; 및 외부표준검체로부터 나타나는 형광값을 이용하여 웰사이의 형광값을 보정하고, 표준시료의 증폭산물 양으로 표준정량곡선을 작성하고, 표준정량곡선 대비 미지시료에 대한 증폭산물을 환산하여 미지시료의 유전자변형농산물의 혼입률을 산출하는 단계로 이루어지는 유전자변형농산물에 대한 혼입률을 정량적으로 분석하는 방법을 제공한다.

또한 본 발명은 유전자변형농산물에 특이적인 재조합유전자 검출용 프라이머, 내재유전자 검출용 프라이머, 외부표준검체 검출용 프라이머를 제공한다.

상기 재조합 유전자 검출용 프라이머는 아그로박테리움 튜머파시엔스 CP4 유래의 NOS 터미네이터 부위에 특이적인 프라이머로서 서열 번호 3 내지 서열번호 6으로 제시되는 프라이머가 바람직하게 사용된다.

상기 외부표준검체 검출용 프라이머는 pUC19 플라스미드 유래 프라이머로서, 서열번호 1 내지 2로 제시되는 프라이머가 바람직하게 사용된다.

상기 내재유전자 검출용 프라이머는 렉틴(Lectin) 유전자 유래 프라이머로서, 서열번호 7 내지 10으로 제시되는 프라이머가 바람직하게 사용된다.

본 발명에서 외부표준검체란 아크릴아마이드 젤상에서 전기영동시 발생되는시료 전개 시작 웰과 마지막 웰 사이에 발생되는 형광값의 차이를 보정하기 위해 GMO 정량 프로그램 상에서 형광값 차이를 같은 형광값으로 맞추기 위해 사용되는 시료로서, 본 발명의 실시예에서는 pUC19 플라스미드가 사용되고 있다. 상기 외부표준검체로서 사용되는 pUC19 프라스미드를 증폭하기 위한 프라이머로서는 PUC-FP(서열번호1)와 5′말단이 TAMRA로 라벨링된 PUC-RP(서열번호 2)를 사용한다.

본 발명에서 GMO 혼입률(%)이란 미지 시료의 전체 양 대비 유전자변형농산물이 차지하는 양의 비율을 백분율(%)로 환산하여 나타낸 값을 의미한다.

본 발명에서 표준시료라 함은 유전자변형농산물(GMO) DNA 혼입률(%)이 각각 일정조건으로 조성된 시료들을 말하는데, 본 실시예에서는 6.0%, 4.5%, 3.0%, 2.25%, 1.5% GMO 혼입율을 갖는 시료들을 의미한다.

따라서, 본 발명의 방법에 의하면 더욱 정확하고 효과적으로 유전자변형농산물의 혼입률(%)을 산출할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예를 들어 더욱 상세히 설명하고자 하지만 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 외부표준검체 DNA의 추출 및 정제

외부표준검체라 함은 하기 실시예 7에서 전기영동시 발생되는 시료 전개가 시작되는 웰(well)과 마지막 웰(well)사이에서 전기영동시 발생하는 웰간의 형광값의 차이를 보정하기 위해 아크릴아마이드 젤 전기영동시 각 웰 마다 동일량을 첨가하여, GMO 정량 프로그램 상에서 확인되는 웰사이의 형광값 차이를 같은 형광값으로 보정하기 위해 넣어주는 시료를 의미한다. 본 실시예에서 외부표준검체로는 pUC19 플라스미드 DNA를 이용하였다. pUC19 플라스미드가 형질전환된 E, coli 균주 DH5α를AccuPrep ^TMPlasmid Extraction Kit (바이오니아사 제품)를 이용하여 다음과 같이 추출 및 정제하였다. 먼저 상기 세포를 LB 액체배지 10㎖에 접종한 후 37℃에서 300 rpm으로 진탕배양기에서 16시간 배양한 후 2.0㎖ 튜브에 세포배양액 1.5ml를 넣고 8,000 rpm에서 1분 동안 원심분리한 후, 상등액을 버리고 다시 세포배양액 1.5㎖을 넣고 8,000 rpm에서 1분동안 원심분리하여 다시 상등액을 버리고, 여기에 현탁완충액(Resuspension buffer; 1M Tris-HCl, 0.5M EDTA, pH8.0) 250㎕를 넣고 강하게 섞어주어 침전된 세포들을 풀어주었다. 여기에 다시 용해완충액(Lysis buffer; 10M NaOH, 10% SDS) 250㎕를 넣고 약하게 흔들어 준 후, 상온에서 5분 동안 방치한 후, 중화완충액(Neutralization buffer; potassium acetate, glacial acetic acid, Guanidine HCl) 350㎕를 넣고 약하게 흔들어 준 후, 4℃에서 5분 동안 방치하였다. 그 후 12,000 rpm에서 5분 동안 원심분리하여, 상층액을 바인딩 칼럼이 끼워진 2.0㎖ 튜브의 바인딩 칼럼 내에 옮겨 놓고, 12,000 rpm에서 1분간 원심분리하였다. 바인딩 칼럼을 새로운 2.0㎖ 튜브 상에 올려 놓고, 바인딩 칼럼 내에 80% 에탄올을 700㎕ 넣어주고 12,000 rpm에서 1분 동안 원심분리하여 바인딩 칼럼을 씻어주었다. 그리고 바인딩 칼럼 내에 남겨진 에탄올을 제거하기 위해 12,000 rpm에서 1분 동안 원심분리 하였다. 다시 바인딩 칼럼을 새로운 1.5㎖ 튜브 상에 옮겨 놓고, 바인딩 칼럼 내에 용리완충액(Elution buffer:10mM Tris-HCl, pH 8.5)을 200㎕ 넣고 12,000 rpm에서 1분 동안 원심분리하였다. 200㎕의 추출된 플라스미드 DNA가 포함된 용리완충액을 회수하여 흡광광도계로 정량하여 실시예 3에서 사용하였다.

실시예 2 : 유전자변형농산물 혼입률(%) 분석을 위한 특이적 프라이머 설계

유전자변형농산물 혼입률(%) 분석을 위해 프라이머를 제조하는데 있어서, 아그로박테리움 튜머파시엔스 CP4(Agrobacterium tumefaciens CP4)유래의 NOS 터미네이터 부위(Nophaline synthase gene terminator)를 (주)바이오니아의 한국특허출원 2000-0013464 내용에 근거하여 조작된 유전자 및 조작된 터미네이터에 대한 서열을 확보하였다. 그 후, 상기 조작된 유전자 및 조작된 터미네이터 염기서열을 바탕으로 하여 조작/변형된 재조합 유전자를 검출할 수 있는 특이적 프라이머를 Primer3이라는 프라이머 디자인 프로그램을 사용하여 설계하였다.(서열번호 3 내지 6) 그리고 내부 유전자인 렉틴(Lectin) 유전자 유래의 프라이머는 BioTechniques 31: 426-429 내용에 근거하여 상기와 같은 방법으로 설계 및 제작하였다.(서열번호 7 내지 10) 이의 결과는 표1에 제시되어 있다.

프라이머 염기서열

서열번호	프라이머	서 열	비 고
1	PUC-FP	5'-GCC TTT TTA CGG TTC CTG GC-3'
2	PUC-RP	5'-TTC CGC TTC CTC GCT CAC T-3'	5'-TAMRA labeled
3	NOS-FP1	5'-GAA TCC TGT TGC CGG TCT TG-3'
4	NOS-RP1	5'-TTA TCC TAG TTT GCG CGC TA-3'
5	NOS-FP2	5'-GAA TCC TGT TGC CGG TCT TG-3'	5'-TAMRA labeled
6	NOS-RP2	5'-TTA TCC TAG TTT GCG CGC TA-3'
7	Lectin-FP1	5'-ACC AAA TCC ACA CAT CGG AAT-3'
8	Lectin-RP1	5'-GAA GCA AAA GAC CAA GAA AGC A-3'
9	Lectin-FP2	5'-GCC AAC AAT AAA GTA GCC AAG G-3'
10	Lectin-RP2	5'-AGA ACC CTA TCC TCA CCC ACT C-3'	5'-TAMRA labeled

실시예 3 : 외부표준검체시료의 PCR 반응

AccuPowerPCR PreMix((주)바이오니아사 제품)튜브에 상기 실시예 1에서 정제된 pUC19 DNA를 각각 1ng(/20㎕/1회 PCR 반응 부피/1 튜브반응시) 넣어준 후, 표1에 제시된 PUC-FP(5′-GCCTTTTTACGGTTCCTGGC-3′) 프라이머와 5′말단이 TAMRA로 라벨링된 PUC-RP(5'-TTCCGCTTCCTCGCTCACT-3′) 프라이머를 각각 10pmol씩 넣고 각 튜브의 20㎕ 반응부피에 대한 나머지 잔량으로 멸균 증류수를 넣어주었다. 이들을 잘 섞은 후 PCR 반응을 다음과 같이 수행하였다. 증폭조건은 초기변성을 94도에서 5분간 한 후, 94℃에서 50초간 변성(denaturation), 57℃에서 50초간 어닐링(annealing), 72℃에서 50초간 익스텐션(extension)을 30 사이클 실시하고 후기 익스텐션(extension)을 72℃에서 5분간 실시하였다. 반응종료 후 PCR 반응물에 대해 아크릴아마이드 젤 전기영동을 수행하여 크기(165bp)를 확인하였다.

도 2는 외부표준검체를 PCR 반응시킨 후 아크릴아마이드 젤 전기영동으로 DNA 농도별 밴드양상을 나타내고 있는데, 레인1은 1,470pg, 레인 2는 735pg, 레인 3은 368 pg, 레인 4는 184pg, 레인 5는 92pg, 레인 6은 46pg, 레인 7은 23pg의 외부표준검체를 나타낸다.

실시예 4: 유전자변형콩, 비유전자변형콩 및 GMO 혼입률(%)을 확인하고자 하는 미지검체로부터 게놈 DNA 추출

유전자변형콩, 비유전자변형콩(재래콩) 및 유전자변형여부를 알고자하는 검체로부터 게놈 DNA를AccuPrepGMO DNA Extraction kit((주)바이오니아사 제품)를 사용하여 다음과 같이 추출하였는데 이 추출 키트는 분리 정제를 위한 필요한 모든 시약을 함유하고 있고, 칼럼 타입의 정제 시스템을 사용하여 빠른 시간 내에 간편하게 고순도의 DNA를 분리 정제할 수 있는 제품이다. 우선, 상기 시료들을 파쇄하여 튜브에 약 50mg씩 넣어준 후 여기에 식물용해완충액(Plant Lysis buffer; 100mM Tris-HCl, 150mM NaCl, 50mM EDTA, 2% SDS) 400㎕와 Proteinase K(10㎎/㎖)10㎕를 첨가하여 60℃에서 10분간 반응시키고 여기에 결합완충액(Binding buffer; 7M Guanidine-HCl, 100mM Tris-HCl, 20mM Urea, 10% Triton X-100, pH4.5) 400㎕를 넣고 섞어준 후, 60℃에서 10분간 반응시켰다. 그 다음 12,000rpm에서 10 분간 원심분리하고 상층액을 새로운 collection tube에 장착된 spin-column 튜브로 옮겨 놓고, 이소프로판올 100㎕을 넣고 섞어준 후, 이를 다시 10초 동안 원심분리하여, 상층액을 바인딩 칼럼에 넣고 8,000 rpm에서 1분 동안 원심분리하였다. 그 후, 바인딩칼럼을 새로운 2.0㎖튜브 상에 올려놓고, 바인딩 칼럼 내에 세척완충액1(Washing buffer 1; 5M Guanidine-HCl, 20mM Tris-HCl, 1% Triton X-100, pH 6.6, 44% EtOH)을 500㎕ 넣고 8,000 rpm에서 1분 동안 원심분리하여 바인딩 칼럼을 씻어주고 다시 바인딩 칼럼을 새로운 2.0㎖ 튜브 상에 옮겨 놓고, 바인딩 칼럼 내로 세척완충액 2 (20mM NaCl, 2mM Tris-HCl, 80% EtOH)를 넣고 8,000 rpm에서 1분 동안 원심분리하여 바인딩 칼럼을 씻어주었다. 이를 다시 새로운 1.5㎖ 튜브상에 옮겨 놓고, 바인딩 칼럼 내로 용리완충액(Elution buffer; 10mM Tris-HCl, pH 8.5) 200㎕를 넣고 8,000 rpm에서 1분 동안 원심분리하여 게놈 DNA를 회수하였다. 200㎕의 정제된 게놈 DNA를 1% 아가로스 젤 상에서 전기영동하였는데, 먼저 유리병에 1g 아가로스((주)바이오니아사 제품)를 넣고, 100㎖ 되게 TBE 전기영동용 완충액을 넣은 다음, 완전히 용해되도록 가열, 교반시켰다. 60℃정도로 식힌 후, 4㎕ 에티듐 브로마이드 염색시약(EtBr, 10㎎/㎖)를 넣은 후, 콤(comb)이 삽입된 캐스팅 트레이에 젤을 붓고 30분간 실온에서 방치하여 젤을 굳힌 후, 굳힌 젤을 AgaroPowerTM 전기영동 챔버((주)바이오니아사 제품)에 넣고, 0.5X TBE 전기영동용 완충액을 젤이 잠기도록 넣어주었다. PCR 반응물 5㎕에 로딩 완충액 (loading buffer) 1㎕를 섞어준 후 피펫을 이용하여 아가로스 젤의 웰에 넣어주었다. 그 다음 AgaroPower^TM전기영동 챔버((주) 바이오니아사 제품)에 전압을 걸어 전기영동을 한 후 UV 투사기(UV transilluminator)에 전기영동한 젤을 올려 놓고 Imager III^TM디지털 카메라((주) 바이오니아사 제품)로 결과를 촬영하였다.

도 1은 유전자변형콩과 비유전자변형콩에서 추출한 게놈 DNA를 아가로스 젤전기영동한 결과를 나타내는데, M은 마커를, 레인 1과 2는 유전자변형콩의 게놈 DNA를, 레인 3과 4는 비유전자변형콩의 게놈 DNA를 나타낸다.

실시예 5: 정성분석을 위한 유전자변형농산물의 PCR

실시예 4에서 추출한 유전자변형콩과 비유전자변형콩(재래콩)의 게놈 DNA를 정성분석 하기 위해 PCR 반응을 수행하였다.AccuPowerPCR PreMix((주)바이오니아사 제품)튜브에 상기 실시예 4에서 정량된 게놈 DNA 100ng(/20㎕/1회 PCR 반응부피/1 튜브반응시)를 넣어준 후, 재조합유전자 검출용 NOS-FP1(5′-GAATCCTGTTGCCGG TCTTG-3′)프라이머와 NOS-RP1(5′-TTATCCTAGTTTGCGCGCTA-3′)프라이머를 20pmol씩, 내재유전자 검출용 Lectin-FP1(5′-ACCAAATCCACACATCGGAAT-3′)프라이머와 Lectin-RP1(5′-GAAGCAAAAGACCAAGAAAGCA-3′)프라이머를 20pmol씩 넣은 후 20㎕ 반응부피에 대한 나머지 잔량으로 멸균수를 넣어주었다. 이를 잘 섞은 후, PCR 반응을 수행하였다. 증폭조건은 초기변성을 94℃에서 5분간 한 후, 94℃에서 50초간 변성, 55℃에서 50초간 어닐링, 72℃에서 50초간 익스텐션을 35사이클 실시하고 후기 익스텐션을 72℃에서 5분간 실시하였다. 그 후 실시예 4에 제시된 방법으로 제조된 아가로스 젤 상에서 PCR산물의 전기영동을 수행하여 그 결과를 도 3에 나타내었다. 도 3에 나타낸 바와 같이 유전자변형콩의 경우에는 내재 유전자인 렉틴 유전자 밴드(318bp)와 재조합 유전자인 NOS 터미네이터 유전자밴드(180bp)가 확인되었고, 비유전자변형콩의 경우에는 내재유전자인 렉틴 유전자밴드(318bp)만을 확인할 수 있었다. 도 3은 GMO 콩과 Non-GMO 콩(재래 콩)에서 추출한 게놈 DNA에 대한 PCR 수행 후, 아가로스 젤 상에서 전기영동한 결과를 나타낸 것으로, M은 마커를, 레인 1은GMO 콩을, 레인 2는 Non-GMO 콩(재래 콩)을, 밴드 a는 내재유전자 PCR 증폭 밴드 (318bp)를, 밴드 b는 재조합유전자 PCR 증폭 밴드 (180bp)를 나타낸다.

실시예 6: 정량분석을 위한 유전자변형농산물의 PCR

유전자변형농산물을 정량분석하기 위해 표준시료와 GMO 혼입률(%)을 정량하고자 하는 미지시료의 PCR 반응을 수행하였다.

본 발명에서 표준시료라 함은 유전자변형농산물(GMO) DNA 혼입률(%)이 각각 일정조건으로 조성된 시료들을 말하는데, 예를들면, 6.0%, 4.5%, 3.0%, 2.25%, 1.5% GMO 혼입율을 갖는 시료들을 말하는데 실시예 5에서 정성분석을 통하여 확인하였다.

표준시료를 위한 AccuPowerPCR PreMix((주)바이오니아사 제품) 튜브 5개에 6.0%, 4.5%, 3.0%, 2.25%, 1.5%의 GMO 혼입율을 갖는 유전자변형콩 DNA를 각각 10㎕ (/20ul/PCR 반응 부피/1 튜브), GMO혼입률(%)을 정량하고자 하는 튜브에 GMO 혼입률(%)을 정량하고자 하는 시료로부터 추출한 게놈 DNA 50ng( /20ul/PCR 반응 부피/1 튜브)을 넣어주었다. 이어서 각각의 반응 튜브에 준비된 프라이머 혼합물을 10㎕ ( /튜브)씩 분주하였다. 여기서 프라이머 혼합물은 재조합유전자 검출용 프라이머로 5′말단이 TAMRA로 라벨링된 프라이머 NOS-FP2(5′-GAATCCTGTTGCCGGTCTTG-3′)와 프라이머 NOS-RP2(5′-TTATCCTAGTTTGCGCGCTA-3′)이 15pmol 씩, 내재유전자 검출용 프라이머로 Lectin-FP2(5′-GCCAACAATAAAGTAGCCAAGG-3′)와 5′이 TAMRA로 라벨링된 프라이머 Lectin-RP2(5′-AGAACCCTATCCTCACCCACTC-3′)이 각 2.5pmol 씩 혼합되어 있는 조성물이다. 그 후 잘 섞어준 후, 상기 실시예 5와 같은 PCR 증폭조건으로 PCR을 25 사이클을 실시하였다. 그리고 상기 PCR 반응에 대한 음성대조군으로는 게놈 DNA 대신에 10㎕의 멸균수를 넣어준 후 동일하게 PCR 반응을 수행하였다. PCR 수행후, 반응산물을 아크릴아마이드 젤상에서 전기영동하였다.

도 4 및 5 는 PCR 반응 후 아크릴아마이드 젤 전기영동을 통하여 GMO 혼입률(%)에 따른 밴드를 타나내는데, 도 4의 레인1은 GMO 혼입률(%) 100%, 레인2는 50%, 레인3은 25%, 레인4는 12.5%, 레인5는 6.3%, 레인6은 3.15%, 레인7은 1.58%, 레인8은 0.79%, 레인9는 0% 를 나타낸 것이고, 도 5의 레인1은 6.0%, 레인 2는 4.5%, 레인3은 3.0%, 레인4는 2.25%, 레인5는 1.5%를 나타내고, a는 NOS 터미네이터 재조합 유전자밴드, b는 외부표준검체 DNA 밴드, c는 렉틴 내재유전자 밴드를 나타낸 것이다.

실시예 7: 유전자변형농산물에 대한 혼입률(%) 분석

유전자변형콩에 대해 정량분석하기 위해 상기 실시예3에서 증폭된 외부표준검체(820pg/㎕) 2㎕와 염색시약 Auto dye10.9㎕를 0.2㎖튜브에 넣어 혼합하고 여기에 실시예 6에서의 PCR 반응산물 2.1㎕를 넣어준 다음 이를 섞은 후, 튜브를 94℃에서 2분 동안 변성시키고 5초간 8,000 rpm에서 원심분리하였다. 그 후 아크릴아마이드 젤 전기영동을 다음과 같이 수행하였다. 먼저 유리판 1(시료 전개를 위한 요철부분을 만든 유리판)과 유리판 2(직사각형의 일반 유리판)를 준비하고 이들 유리판 1과 2사이에 스페이서 1(길이가 짧은 것)과 2(길이가 긴 것)를 끼워 넣어주는데 이때, 유리판 1은 위쪽으로, 유리판 2는 유리판 1의 아래쪽으로 향하게 맞추어 놓은 상태에서 스페이서 1을 정면에서 보았을 때 왼쪽 위쪽으로, 스페이서 2는 오른쪽 아래쪽으로 향하도록 끼워 넣은 다음, 유리 커플러는 왼쪽 아래쪽에 끼워 넣었다. 그 다음에는 유리판을 4 등분하여 좌측과 우측에 각각 4개의 집게를 끼워서 고정시킨 후, Accu-UV gel Mix 29.4㎖와 광개시제((주)바이오니아사 제품) 0.6㎖를 스퀴즈 병(squeeze bottle)에 넣어 섞어주고, 혼합된 젤 용액을 캐스팅된 유리판에 부어준 후, 콤(comb)을 유리판에 5㎜정도로 꽂아주었다. UV gel Maker((주)바이오니아사 제품)에 아크릴아마이드 젤이 담긴 유리판을 수평이 되도록 장착한 후, 30분 동안 젤을 굳히고, 굳힌 젤에서 콤(comb)을 조심스럽게 빼내고는 HT-GeneAnalyzer^TM시퀀서((주)바이오니아사 제품)를 이용하여 전기영동을 진행하였다. 먼저 준비된 아크릴아마이드 젤에 한 웰당 2㎕씩 로딩 (loading)하고 HT-GeneAnalyzer^TM시퀀서((주)바이오니아사 제품)를 이용하여 전기영동 하였는데, 운용조작(Engineerimg setting) 조건은 sampling time 2000ms와 shutter time 1200ms로 진행하였고, Running 조건은 1350V와 42℃에서 1시간 40분 동안 전기영동하였다. 그 결과, 165bp의 외부표준검체 밴드, 157bp의 렉틴 내재성 유전자 밴드, 및 180bp의 노스 (NOS terminator) 재조합 유전자 밴드를 전기영동 상에서 육안으로 확인할 수 있었다. 이어서 GMO 정량 프로그램((주)바이오니아사 제품)을 이용하여 각 시료밴드에 대한 레인 트랙킹 (lane tracking)을 실시하고 최소/최대 분석범위를 선정하고 나서, 선정된 범위를 추출하였다. 각각의 웰(well)에서의 외부표준검체 DNA 형광값에 대한 보정(normalization)을 진행하고 상기 표준시료 조건에 대한 정보를 입력한 다음, 이에 대한 노스 (Nos terminator) 재조합유전자 밴드들의 형광측정 면적에 대한 표준정량곡선을 작성하고 표준정량곡선 대비, 미지시료의 측정면적 값에 대한 혼입률(%)을 정량하였다.

도 6은 PCR 반응후 HT-GeneAnalyzer^TM시퀀서((주)바이오니아사 제품)를 이용하여 아크릴아마이드 젤 전기영동 후 HT-GeneAnalyzer^TM시퀀서((주)바이오니아사 제품) 콜렉터(collector)상에서의 NOS 재조합유전자 밴드를 나타내는데 레인1은 12.0%, 레인2는 6.0%, 레인3은 3.0%, 레인4는 1.5% GMO 혼입률의 시료 밴드를 나타낸다.

도 7은 PCR 반응 후 HT-GeneAnalyzer^TM시퀀서((주)바이오니아사 제품))를 이용하여 아크릴아마이드 젤 전기영동 후 GMO 정량 프로그램((주)바이오니아사 제품)을 이용한 각 시료에 대한 레인 트랙킹(lane tracking)과 분석범위를 선정한 후 추출한 이미지 밴드 양상을 나타낸다. 레인1부터 레인6은 순서대로 6.0%, 4.5%, 3.0%, 2.25%, 1.5%, 0% GMO 혼입률을 함유한 표준시료, 레인 7, 8, 9는 GMO 혼입률(%)을 정량하고자하는 미지시료를 나타내고, 밴드 a는 NOS 재조합 유전자 밴드, 밴드 b는 외부표준검체 DNA 밴드, 밴드 c는 렉틴 내재유전자 밴드를 나타낸다.

도 8은 도 7의 각각의 밴드 값을 GMO 정량 프로그램((주)바이오니아사 제품)을 이용하여 형광감도 값으로 수치화하여 GMO 혼입률(%)에 따른 정량면적으로서 나타낸 것으로 표준시료로 이용된 조건들 중 6.0%와 2.25%는 정량 프로그램 적용에서 배제하였고, 레인 1,2,3은 4.5%, 3.0%, 1.5% GMO 혼입률에 대한 피크 값을 나타내고, 레인 4, 5, 6은 GMO 혼입률(%)을 정량하고자 하는 미지시료들에 대한 피크 값을 나타내며, 피크 a는 NOS 재조합 유전자 밴드에 대한 피크 값, 피크 b는 외부표준검체 DNA 밴드에 대한 피크 값, 피크 c는 렉틴 내재유전자 밴드에 대한 피크 값을 나타낸 것이다.

도 9는 GMO 정량 프로그램((주)바이오니아사 제품)을 이용하여 표준시료들에 대한 표준정량곡선을 작성하고 표준정량곡선 대비 GMO 혼입률(%)을 정량하고자 하는 미지시료에 대한 GMO 혼입률을 %로 계산한 것을 나타낸 것이다.

상기한 바와 같이, 본 발명의 방법을 사용함으로써 기존의 실시간(Real time) PCR을 이용한 GMO 정량분석방법에 비하여 재조합 유전자 밴드와 내재 유전자 밴드를 보다 정확하고 높은 효율성의 결과로 정량적으로 확인할 수 있으며, 육안으로 직접 확인하여 정량할 수 있는 장점이 있다. 초기 설비투자 비용이나 기기 유지비용 및 경제성에 있어서도 더욱 더 효율성을 기대할 수 있게 되었다.

Claims

a) 일정한 유전자변형농산물 혼입률을 갖는 표준시료, 정량하고자하는 미지시료의 게놈 DNA를 주형으로 하여 유전자변형농산물에 특이적으로 나타나는 재조합 유전자 검출용 프라이머와 내재유전자 검출용 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하는 단계;

b) 상기 단계 a)와는 별도로 외부표준검체시료의 PCR을 수행하는 단계;

c) 상기 a)와 b)로부터 증폭된 PCR 산물을 혼합하여 아크릴아마이드 젤 상에서 전기영동하는 단계;

d) 외부표준검체로부터 나타나는 형광값을 이용하여 웰 사이의 형광값을 보정하고, 표준시료의 증폭산물 양으로 표준정량곡선을 작성하고, 표준정량곡선 대비 미지시료에 대한 증폭산물을 환산하여 미지시료의 유전자변형농산물의 혼입률을 산출하는 단계로 이루어지는 유전자변형농산물에 대한 혼입률을 정량적으로 분석하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 재조합 검출용 프라이머는 아그로박테리움 튜머파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) CP4 유래의 NOS 터미네이터(nophaline synthase terminator) 유전자로부터 유래하는 것을 특징으로 하는 유전자변형농산물에 대한 혼입률을 정량적으로 분석하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 내재유전자 검출용 프라이머는 렉틴 유전자로부터 유래되는 것을 특징으로 하는 유전자변형농산물에 대한 혼입률을 정량적으로 분석하는 방법.
제 2 항에 있어서, 상기 재조합 유전자 검출용 프라이머는 서열번호 5(NOS-FP2) 와 6(NOS-RP2)인 것을 특징으로 하는 유전자변형농산물에 대한 혼입률을 정량적으로 분석하는 방법.
제 3 항에 있어서, 상기 내재 유전자 검출용 프라이머는 서열번호 9(Lectin-FP2)와 10(Lectin-RP2)인 것을 특징으로 하는 유전자변형농산물에 대한 혼입률을 정량적으로 분석하는 방법.