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Einleitung
Drei Jahre nach Einführung des ersten gentechnisch veränderten Organismus (GVO) in Lebensmitteln, welcher einer Bearbeitung, Weiterbehandlung od.dgl. unterworfen wurde, nämlich der "RoundUp Ready"-Sojabohne der Firma Monsanto & Co., ist die Diskussion bezüglich GVOs in Lebensmitteln noch immer nicht verstummt.
Die europäischen Konsumenten stehen, insbesondere im Hinblick auf die BSE-Knse, Transgenen in Lebensmitteln skeptisch gegenüber und sie verlan- gen eine strikte Regulierung der Vermarktung derartiger Produkte und deren eindeutige Kenn- zeichnung Dieser Ruf nach eindeutiger Kennzeichnung von Produkten aus GVOs hat zur Verord- nung über neuartige Lebensmittel und neuartige Lebensmittelzutaten geführt, welche im Mai 1997 in Kraft getreten ist und die Kennzeichnung von Lebensmitteln verlangt, die nicht mehr als im wesentlichen äquivalent zu den entsprechenden herkömmlichen Lebensmitteln zu bezeichnen sind.
In den letzten beiden Jahren wurde nun eine grössere Zahl von Produkten, die sich von GVOs ableiten, wie z. B. insekten-resistenter und herbizid-toleranter Mais und herbizid-toleranter Ölsaa- ten-Raps für eine Vermarktung in Europa angemeldet.
Im September 1998 ist eine Kennzeichnungsverordnung für Produkte, die GVOs enthalten oder daraus bestehen, in Kraft getreten. Produkte, welche "RoundUp Ready"-Sojabohnen (Padget- te et al., 1995) oder insekten-resistenten "Event 176"-Mais (Koziel et al., 1993) enthalten, sind davon ebenfalls betroffen, obwohl diese GVOs gemäss der Direktive 90/220/EWG, welche die Freisetzung von GVOs in die Umwelt regelt, schon für den Markt zugelassen worden sind, bevor die o. a. Verordnung über neuartige Lebensmittel und Lebensmittelzutaten in Kraft getreten ist. Laut dieser Verordnung soll der Nachweis der Unterschiede zwischen herkömmlichen Lebensmitteln und Lebensmitteln, welche GVOs enthalten oder daraus bestehen durch Anwendung geeigneter wissenschaftlicher Methoden erreicht werden.
Es wurde gefunden, dass die Polymerase-Ketten- Reaktion (polymerase chain reaction (PCR)) eine geeignete Analysenmethode für Lebensmittel darstellt (Meyer et al., 1996 ; Allmann et al., 1993) und es scheint tatsächlich, dass diese Methode die Methode der Wahl für den Nachweis von GVOs in Lebensmitteln darstellt (Schreiber und Bögl, 1997), obwohl auch immunologische Tests, wie z. B. die ELISA-Tests (enzyme linked immunosor- bent assays) für den Nachweis von Proteinen, welche durch GVOs exprimiert werden, zumindest für Roh- oder Ausgangsprodukte, in Betracht gezogen werden.
In den letzten Jahren wurden in ganz Europa Anstrengungen unternommen, um PCR- Methoden für den Nachweis verschiedener Variationen von GVOs, wie z. B. der FLAVR SAVR- Tomate (Meyer, 1995), der glyphosat-toleranten Sojabohne (Wurz und Willmund, 1997), des Bt- Maises (Hupfer et al., 1998) einer transgenen Kartoffel mit geänderter Stärke-Zusammensetzung (Hassan-Hauser et al., 1998) und weiters von Marker-Genen (Pietsch et al., 1997) zu entwickeln.
Weiters wurden, um die Basis für eine korrekte Kennzeichnung nach der geplanten Einführung von GVO-Gehalts-Obergrenzen (threshold-levels) in der Europäischen Union zu schaffen, die ersten quantitativen PCR-Methoden entwickelt (Studer et al., 1998). Eines der Projekte, welche sich mit dem Nachweis von GVOs beschäftigen, ist das europäische Projekt SMT4-CT96-2072, welches die Entwicklung von Methoden zum Gegenstand hat, Lebensmittel-Produkte, die durch Gentechnik verändert wurden, zu identifizieren. Als einer der Forschungs- und Entwicklungspartner in diesem Projekt haben die Erfinder Gensequenzen und Methoden für Screening-Zwecke (Tests bezüglich des allgemeinen Vorhandenseins von GVOs in Lebensmitteln) entwickelt sowie im speziellen für den Nachweis der RoundUp Ready-Sojabohne und von insekten-resistentem Event- 176-Mais der Firma Ciba-Saaten (jetzt Novartis).
Wie sich gezeigt hat, sind die entwickelten Sequenzen für Routineanalysen besonders gut geeignet. Die vorliegende Erfindung beruht auf der genanntenStudie und hat für die erwähnten Tests einsetzbare "Nachweis-Sonden", die Tests selber und Erstellung der entsprechenden Protokolle zum Gegenstand. Im wesentlichen wurden dieselben unter Einsatz von definiertem, standardisiertem Untersuchungsmaterial durchgeführt.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung:
Die vorliegende Erfindung hat es sich zur Aufgabe gemacht, Primerpaare zur PCR- Amplifizierung von für gentechnisch veränderte Organismen charakteristischen DNA-Fragmenten bzw. Basen-Sequenzen zu entwickeln, welche den sicheren und eindeutigen Nachweis geringer bzw. geringster Mengen solcher GVOs mit hoher Selektivität auch in pflanzlichen Roh- bzw.
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Grundmatenalien bzw. in derartige Materialien enthaltenden Zubereitungen, wie z. B. Saatgut, Futter- oder Lebensmittel, vorzugsweise in Lebensmitteln, besonders bevorzugt in solchen Le- bensmitteln ermöglichen, welche einer hohen Prozessierung unterworfen worden sind und bei welchen die darin enthaltenen von den pflanzlichen Grundmaterialien stammenden natürlichen DNAs, ebenso wie eventuell genmodifizierte DNA, hochgradig abgebaut sind und daher als DNA- Fragmente mit nur geringer Länge vorliegen.
Es wurde gefunden, dass sich Primerpaare, welche zur Generierung von besonders kurzen DNA-Fragmenten, also von solchen mit einer geringen Anzahl von Basenpaaren befähigt sind, in hohem Masse dazu eignen, aus den genannten Roh- bzw. Grundmaterialien und deren Zubereitun- gen, besonders bevorzugt auch aus prozessierten Lebensmitteln, besonders geringe Mengen an vorhandenen, relevanten DNA-Fragmenten bzw.-Kopien zu amplifizieren, sodass schliesslich genügend grosse Mengen an bezüglich GVOs relevantem Amplifikat für einen eindeutigen und kostengünstigen Nachweis des Vorliegens von GVOs oder von deren Nicht-Vorliegen in einem hoch-prozessierten Lebensmittel zur Verfügung stehen.
Es wurde gefunden, dass sich relevante Fragmente mit weniger als 250 Basenpaaren (bp), be- vorzugt mit weniger als 200 Basenpaaren (bp) für die Lösung der beschriebenen Aufgabe hervor- ragend eignen.
Gegenstand der Erfindung ist somit eine Gruppe von neuen Primerpaaren zur PCR (polymera- se chain reaction)-Amplifizierung von durch mindestens eine gentechnische Veränderung in die DNA von Soja und/oder Mais und/oder anderen Pflanzen eingebauten genetischen Elementen in pflanzlichen Roh- bzw. Grundmaterialien bzw. in derartige Materialien enthaltenden Zubereitungen, wie z. B. Saatgut, Futter- oder Lebensmittel, vorzugsweise in Lebensmitteln, besonders bevorzugt in, insbesondere stark, prozessierten und einem, insbesondere hohen, Abbau der DNA des ge- nannten, in ihnen enthaltenen pflanzlichen Grundmaterials unterworfenen bzw. unterlegenen Lebensmitteln, insbesondere für den Nachweis des Vorhandenseins von durch Gen-Manipulation verändertem, pflanzlichem Grundmaterial in derartigen Materialien bzw.
Zubereitungen, besonders bevorzugt in (hoch-)prozessierten Lebensmitteln, weiters für die Kontrolle der Amplifizierbarkeit der genannten genetischen Elemente sowie neue Gensonden zur Bestätigung positiver PCR-Resultate im Rahmen des Nachweises, wobei die einzelnen Primerpaare der genannten Gruppe bzw. die sie bildenden Basen-Sequenzen zur Erreichung möglichst hoher Annealing-Temperaturen und da- durch hoher Selektivität bei der Produktion der Amplifikate entworfen sind, und mittels derselben kurzkettige Fragmente bzw. Basen-Sequenzen der genannten eingebauten genetischen Elemente mit einer Länge von weniger als 250 Basenpaaren (250 bp), vorzugsweise von 80 bis maximal 200 Basenpaaren (80 bis max. 200 bp), generiert werden.
Die neuen Primerpaare und Gensonden gemäss der Erfindung sind in übersichtlich geordneter Form dem kennzeichnenden Teil des A n s p r u c h es 1 zu entnehmen.
Zu den einzelnen, diesem Teil des Anspruches 1 zu entnehmenden Primerpaaren wird im De- tail Folgendes ausgeführt:
Die geringe Länge der mit den erfindungsgemässen Primerpaaren generierbaren Amplifikate ermöglicht hohe Sensitivität auch in prozessierten Lebensmitteln.
Um nun grundsätzlich zu untersuchen und festzustellen, ob ganz allgemein GVOs in einem diesbezüglich verdächtigen pflanzlichen Roh- bzw. Grundmaterial, in einer ein solches enthalten- den Zubereitung, und besonders bevorzugt in einem diesbezüglich verdächtigen Lebensmittel ent- halten sind, haben sich neue Primerpaare mit Basen-Sequenzen aus bis etwa 100 Basen umfas- senden Sequenzen verschiedener Organismen gemäss einem der Abschnitte a1.1 a1.2 und a1.3 des Anspruches 1 und im speziellen Primerpaare gemäss einem der Abschnitte a1.1.1, a1.2.1 und a1.3.1 des Anspruches 1 als besonders effektiv erwiesen. Sie zielen auf für die gen- technische Veränderung von Pflanzenmatenal häufig zum Einsatz kommende Basen-Sequenzen ab, sind jedoch auf derartiges Pflanzenmaterial in einem pflanzlichen Roh- bzw.
Grundmaterial, in einer ein solches enthaltenden Zubereitung, und besonders bevorzugt in einem hoch-prozessierten Lebensmittel, gerichtet und können insbesondere dazu dienen, dass weitere spezielle und meist kostspielige Tests bei einem negativen Ergebnis dieses Screenings unterbleiben können.
Insbesondere im Hinblick auf einen globalen Nachweis des Vorliegens von, gegebenenfalls gen-technisch verändertem, Soja in pflanzlichem Roh- bzw. Grundmaterial, in einer ein solches enthaltenden Zubereitung, besonders bevorzugt in einem (hoch-)prozessierten Lebensmittel durch
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Kontrolle von dessen Amplifizierbarkeit sind die neuen Primerpaare gemäss dem Abschnitt t b2.1 und im speziellen gemäss dem Abschnitt b2.1.1 des Anspruches 1 ausgerichtet.
Die im A b s c h n i tt t b1.1 des Anspruches 1 und im speziellen im Abschn itt t b1.1.1 des An- spruches 1 geoffenbarten, neuen Primerpaare sind ganz gezielt auf den selektiven Nachweis von gen-manipuliertem Roundup-Ready (RR) -Soja und/oder anderen Pflanzen, welche dieselbe gen- technische Veränderung aufweisen, in pflanzlichem Roh- bzw. Grundmaterial, in einer ein solches enthaltenden Zubereitung, besonders bevorzugt in (hoch-)prozessierten Lebensmitteln abgestellt.
Schliesslich bilden die Gegenstände der Abschnitte b3. 1 und b3.1.1 des Anspruches 1 Gensonden zur Bestätigung eines positiven Ergebnisses bei der Amplifizierung von Sequenzen, die von Roundup Ready (RR) -Soja und/oder anderen Pflanzen, welche dieselbe gentechnische Veränderung aufweisen, in pflanzlichem Roh- bzw. Grundmaterial, in einer ein solches enthalten- den Zubereitung, besonders bevorzugt in einem hoch-prozessierten Lebensmittel stammen, durch Hybridisierung der von den neuen Primerpaaren generierten Amplifikate.
Für die Prüfung der grundsätzlich möglichen Amplifizierbarkeit von in pflanzlichem Roh- bzw.
Grundmaterial, in einer ein solches enthaltenden Zubereitung, besonders bevorzugt in einem prozessierten Lebensmittel, vorliegendem, gegebenenfalls gentechnisch verändertem Mais- Grundmaterial können in günstiger Weise die im Abschnitt t c2.1 des Anspruches 1 im allgemei- nen und im Abschnitt t c2.1.1 des Anspruches 1 ganz speziell geoffenbarten neuen Primerpaare herangezogen werden.
Die Primerpaare gemäss den Abschnitten n c1.1und c1.1.1des Anspruches 1 dienen der gezielten Amplifizierung von Sequenzen, welche speziell von einem "Event 176"-Maismaterial und/oder anderen Pflanzen, welche dieselbe gentechnische Veränderung aufweisen, stammen, sodass dessen Anwesenheit in pflanzlichem Roh- bzw. Grundmaterial, in einer ein solches enthal- tenden Zubereitung, besonders bevorzugt in einem hoch-prozessierten Lebensmittel eindeutig nachgewiesen werden kann.
Für die eindeutige Verifizierung und den konkreten Nachweis des Vorhandenseins von "Event 176"-Mais und/oder anderen Pflanzen, welche dieselbe gentechnische Veränderung aufweisen, wichtig sind weiters Gensonden für die Hybridisierung der mit den vorher genannten, neuen Prim- erpaaren generierten Amplifikate gemäss einem der Abschnitte c3. 1 und c3.1.1 des Anspru- ches 1.
Ein weiterer, wesentlicher Gegenstand der Erfindung ist das Verfahren zum Nachweis des Vor- handenseins von gentechnisch verändertem Pflanzenmaterial in pflanzlichen Roh- bzw. Grundma- terialien bzw. in derartige Materialien enthaltenden Zubereitungen, wie z. B. Saatgut, Futter- oder Lebensmittel, vorzugsweise in Lebensmitteln, besonders bevorzugt in, insbesondere stark, prozessierten und einem, insbesondere hohen, Abbau der DNA des genannten, in ihnen enthaltenen pflanzlichen Grundmaterials unterworfenen bzw. unterlegenen Lebensmitteln, durch PCR-Amplifizierung mittels Primerpaaren, dadurch gekennzeichnet, dass neue Primerpaare einer Gruppe eingesetzt werden, welche, bzw.
deren sie bildende Basen-Sequenzen zur Erreichung möglichst hoher Annealing-Temperaturen und dadurch hoher Selektivität bei der Produktion der Amplifikate entworfen sind, und mittels derselben kurzkettige Fragmente bzw. Basen-Sequenzen der genannten eingebauten genetischen Elemente mit einer Länge von weniger als 250 Basenpaa- ren (250 bp), vorzugsweise von 80 bis maximal 200 Basenpaaren (80 bis max. 200 bp), generiert werden, wie es in seinen Varianten k) bis q) im kennzeichnenden Teil des Anspruches s geoffenbart ist.
Vorsorglich sei hier darauf verwiesen, dass die Erfindung den Einsatz der neuen Primerpaare für den allgemeinen Nachweis von gentechnisch verändertem Pflanzenmaterial, insbesondere für den speziellen Nachweis des Vorhandenseins von "RoundUpReady"-Soja bzw. "Event176"-Mais und/oder anderen Pflanzen, welche dieselbe gentechnische Veränderung aufweisen, in Pflanzen- material und die neuen Gensonden in gezielten Kombinationen miteinander weitere wesentliche Elemente der vorliegenden Erfindung darstellen, da gerade derartige, letztlich für die jeweilige Aufgabe zugeschnittene "Paketlösungen" sich insbesondere für rasche und effektive Kontrollen im Rahmen von Routineuntersuchungen eignen.
Was die Umsetzung der Erfindung betrifft, so sei hiezu Folgendes ausgeführt:
Der Nachweis von 35S-Promotor-Sequenzen und Agrobacterium-spezifischen Sequenzen dient einem ersten, allgemeinen Screening. Verläuft dies positiv, wird in einer zweiten Stufe der
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Übergang zwischen dem 35S-Promotor und GVO-spezifischen Sequenzen nachgewiesen. Der Nachweis von Sojalektin ist ebenfalls nicht unabhängig von den anderen Analysen und wird im Zeitablauf der GVO-Analyse nicht zu einem willkürlichen Zeitpunkt durchgeführt, sondern dient zu Beginn eines Analysevorgangs zur Überprüfung der Amplifizierbarkeit der isolierten DNA und später als Referenz bei der Quantifizierung des Anteils an gentechnischer Veränderung des unter- suchten Nahrungsmittels.
Anhand des folgenden vereinfachten Analyseschemas werden der Einsatz und die zeitliche Abfolge des Einsatzes der einzelnen Primerpaare im Rahmen einer GVO-Analyse dargestellt, wobei hier fünf wesentliche Schritte angeführt sind:
1. DNA-Extraktion
2. Amplifikationstest durch Lektin bzw. Invertase-PCR
3. GVO-Screening durch 35S-Promotor oder Agrobacterium PCT
Für den Fall, dass das Screening unter 3. positiv verläuft: 4. spezifischer GVO-Nachweis : Soja mittels CAM/CTP und CTP-S1/2, für Mais mittels CRYFZ1/2 und CRY-S1/2
5. GVO-Anteilsbestimmung durch simultanen Nachweis von spezifischen GVO-Sequenzen und Lektin (Soja) bzw. Invertase (Mais) mittels quantitativer PCR.
Im folgenden wird die Erfindung durch einen ein mehrteiliges, beschreibendes Beispiel umfas- senden Beispielsteil näher erläutert:
Beispielsteil:
Material und Methoden:
Sojabohnen-Proben : RoundUp Ready (RR) -Sojabohnen und konventionelle Sojabohnen, wel- che als Positiv- oder Negativ-Kontrollen zum Einsatz gekommen sind, wurden von Christian Hertel, Universität Hohenheim, Stuttgart, Deutschland, und von Ilse Theuns, Universität Gent, Belgien, zur Verfügung gestellt.
Die verwendeten Soja-Mehl-Proben, welche verschiedene Prozentgehalte von GVO aufwiesen (2 %, 0,5 %, 0,1 % und 0 % zur Ermittlung der Empfindlichkeit der Tests), stammten aus Restbe- ständen eines Ring-Versuches aus dem Jahr 1998, welcher vom Joint Research Centre (JRC) in Ispra, Italien, koordiniert wurde, hergestellt waren sie vom Joint Research Centre in Geel, Belgien.
Mais-Proben : Mehl von transgenem insekten-resistentem "Event176"-Mais wurde als Positiv- Kontrolle eingesetzt, das Maismehl wurde von Hermann Rüggeberg, Hanse-Analytik, Bremen, BRD, zur Verfügung gestellt. Herkömmlicher Mais als Negativ-Kontrolle wurde in einem lokalen Geschäft zugekauft.
Die Maismehl-Proben wiesen verschiedene Gehalte des GVO auf (2 %, 0,5 %, 0,1 % und 0 %) und wurden für die Ermittlung der Empfindlichkeit der Nachweis-Methodik eingesetzt. Sie stamm- ten ebenfalls von dem vorher erwähnten Ring-Versuch.
Dieses Soja- und Maismehl ist übrigens nun auch als zertifiziertes Referenz-Material (Fa.
Fluka) erhältlich.
NPTII-Positiv-Kontrolle: Da kein geeignetes transgenes Referenzmaterial mit einem definierten Gehalt an NPTII-Gen verfügbar war, wurde das Plasmid pMOG402, welches von der Firma MOGEN, Inc., Leiden, Niederlande, zur Verfügung gestellt worden war, für die Bestimmung der Leistung der NPTFZ-Polymerase-Ketten-Reaktion (NPTFZ-PCR) eingesetzt. Verdünnungen mit unterschiedlicher Kopienzahl des Plasmids wurden in DNA von Soja-Bohnen (10 ng/uL) herge- stellt, um so eine Hintergrund-DNA zu simulieren.
DNA-Extraktion : Für die Extraktion der genomischen DNA aus Proben wurde der "DNeasy Plant Mini Kit (Fa. Qiagen) " eingesetzt. Die DNA-Konzentration wurde unter Einsatz eines Mini- Fluorometers (Fa. Hoefer Scientific Instruments, Modell TKO-100) gemessen. Für die Polymerase- Ketten-Reaktion (PCR) wurde die DNA-Konzentration auf 10 ng/pL in sterilem, destilliertem Was- ser eingestellt. Für die 0,01 %- und die 0,001 %-Proben wurde die DNA der 0,1 %-Probe entspre- chend in der DNA der Negativ-Kontrolle verdünnt.
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Ziel-Sequenzen und Primer-Oligonucleotide: Die DNA-Sequenzen des 35S-Promotors, des NOS-Terminators, des NPTII-Gens, des Sojabohnen-Lectin-Gens und des Mais-Invertase-Gens sind in der GenBank-Datenbank (Zugangsnummer: für den 35S Promoter und den NOS- Terminator: I 08076; für das NPTII-Gen: U 00004, für das Sojabohnen-Lectin-Gen : 00821 ; das Mais-Invertase-Gen: U 16123) beschrieben.
Die Sequenz des CTP, also des Chloroplasten-Transit-Peptids, das einen Teil des Petunia hybrida EPSPS (5-Enol-Pyruvylshikimat-3-Phosphat-Synthase)-Gens darstellt und in der RR Soja- bohne mit dem EPSPS-Gen aus Agrobacterium sp.CP4 verschmolzen wurde, wurde in der Gen- Bank-Datenbank (Zugangsnummer : M 21084) und in der Literatur (Gasser et al., 1988) publiziert.
Die modifizierte Sequenz des Bt-Toxin (CrylA(b))-Gens, ursprünglich isoliert aus Bacillus thuringi- ensis var. Kurstaki HD1, welches im transgenen "Event 176"-Mais enthalten ist, wurde von Christi- ne Hupfer, Technische Universität München, Freising-Weihenstephan, BRD, zur Verfügung ge- stellt.
Die Primer-Paare und-Sonden wurden unter Verwendung der "PC-Gene-Software" der Firma IntelliGenetics, Inc., entworfen und am Vienna Biocenter, Wien, Österreich, synthetisiert. Die Sequenzen der Oligonucleotid-Primer und-Sonden sind in der Tabelle 1 aufgelistet.
Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) : Die Amplifizierungs-Reaktionen wurden auf einem PTC- 100 Thermocycler der Firma MJ Research, Inc., Watertown, Mass., USA, in einem Gesamtvolu- men von 25 uL durchgeführt. Die End-Konzentration der PCR-Komponenten waren wie folgt: PCR-Puffer (Fa. Perkin Eimer): 1x; MgCI2: 2,5 mM ; jeweils 0,2 mM ; Primer : jeweils 1 uM; Amplitaq Gold Polymerase (Fa. Perkin Eimer); 2,5 Einheiten/Reaktion. Die PCR-Reaktionen wurden unter Einsatz von 5 uL (50 ng) DNA durchgeführt.
PCR-Bedingungen: Die Zyklusbedingungen für die verschiedenen PCR-Reaktionen sind in der Tabelle 2 aufgelistet. Die Anzahl der Zyklen betrug in allen Fällen 50
DNA-Molekulargewichtsmarker: Für die Kontrolle der Länge bzw. Grösse der amplifizierten Fragmente in 2 %igen-Agarosegelen wurde eine 100 bp-Leiter (Fa. Gibco BRL) verwendet. Für die Längen- bzw. Grössen-Kontrolle der Restriktionsfragmente wurde Molekulargewichtsmarker V (Fa.
Boehringer, Mannheim) in 4 %igen-Agarosegelen eingesetzt.
Southern Blot und Hybridisierung: Die DNA wurde mittels Standardmethoden (Sambrook et al.,
1989) von Agarose-Gelen auf positiv geladene Nylon-Membranen transferiert.
Für die Hybridisierung wurden Digoxigenin-markierte Oligonucleotid-Sonden verwendet.
Die Sequenzen der CTP-S-Sonde für RR-Soja und die CRY-S Sonde für Bt-Mais bzw. deren Komplementär-Sequenzen sind in der Tabelle 1 angegeben. Die Hybridisierungen wurden in einem Schüttelwasserbad in dicht versiegelten Plastikbeuteln durchgeführt, und zwar folgendermassen: Die Vor-Hybridisierung erfolgte in 5xSSC, enthaltend 1 g/L N-Lauroylsarcosin, 0,2 g/L SDS und
10 g/L Blocking-Reagens (Fa. Boehringer Mannheim) 1 Stunde lang bei 50 C (RR-Sojabohnen) bzw. bei 55 C (Bt-Mais). Die Hybridisierung erfolgte 3 Stunden lang in derselben Lösung mit 200 ng/mL der jeweiligen Gensonde, jeweils bei den gleichen Temperaturen. Das Waschen mit 2xSSC, 0,1 % SDS erfolgte zweimal, u. zw. 5 min lang bei Umgebungstemperatur, danach eben- falls zweimal mit 0,1xSSC, 0,1 % SDS, jeweils für 20 min bei der jeweils genannten Hybridisie- rungs-Temperatur.
Der immunologische Nachweis der an die Ziel-Sequenz gebundenen Sonden wurde gemäss den Instruktionen des DIG DNA-Labeling- und Detection-Kits (Fa. Boehringer, Mannheim) durchge- führt.
Restriktions-Analyse: Zu 15 uL des PCR-Fragments wurden 2 uL des entsprechenden Restrik- tionspuffers, 2 uL steriles Wasser und 1 uL (10 units) des jeweils entsprechenden Restriktionsen- zyms zugesetzt. Die Reaktion wurde mindestens drei Stunden lang bei 37 C inkubiert, bevor die
Fragmente auf einem 4 %igen Agarosegel analysiert wurden.
Was die Synthese der den erfindungsgemässen bzw. erfindungsgemäss einzusetzenden Pri- mern, Primerpaaren und Gensonden zugrundeliegenden Basensequenzen betrifft, so ist dazu
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auszuführen, dass diese gemäss der üblichen Methode auf diesem Gebiet erfolgt ist, wobei dazu insbesondere auf folgende Publikationen hingewiesen sei : SL and Caruthers MH, Deo- xynucleoside phosphoramidites - A new class of key intermediates for deoxypolynucleotide synthe- sis, Tetrahedron Letters 22,1859 - 1862 (1981) und Caruthers MH, Barone AD, Beaucage SL, Dodds DR, Fisher EF, McBride LJ, Matteucci M, Stabinsky Z., Tang JY, Chemical synthesis of deoxyoligonucleotides by the phosphoramidite method, Methods Enzymol 154, 287 - 313 (1987).
Ergebnisse :
DNA-Extraktion : Unter Verwendung des "DNeasy Plant Mini Kit" konnte aus den Proben eine DNA hoher Qualität extrahiert werden. Eine hohe Reinheit der extrahierten DNA stellt eine wesent- liche Voraussetzung für alle weiteren Untersuchungen dar, und es hat sich gezeigt, dass die kom- merziell erhältlichen DNA-Extraktions-Kits, diese Forderung am besten erfüllen (Zimmermann et al., 1998), wenn auch in manchen Fällen kostengünstigere Standardmethoden anwendbar sind.
Einer der Nachteile der handelsüblichen Kits - neben ihren hohen Kosten - besteht darin, dass sie bei Proben, welche sehr geringe Mengen DNA enthalten, nicht anwendbar sind, da in diesen Fällen ein Scaling-up in den meisten Fällen nicht möglich ist. Rohprodukte und Produkte, die einem nicht besonders hohen Verarbeitungs-Grad unterworfen sind, können jedoch mit dieser Methode bequem extrahiert werden. Dennoch stellen die Schwierigkeiten bei der Auffindung einer optimalen Extraktions-Methode für eine gegebene Lebensmittel-Matrix weiterhin ein gewichtiges Problem für die Routineanalytik dar.
Amplifizierbarkeit der DNA : Ergebnisse betreffend die Amplifizierbarkeit sind aus den Abbildungen ersichtlich : Fig. 1 und 2 zeigen die Ergebnisse der LEC-PCR für Soja und der INV- PCR für Mais. Beide PCR-Protokolle sind für die allgemeine Kontrolle der Amplifizierbarkeit von DNA aus Soja-Proben und Mais-Proben geeignet. Die Primer wurden mit anderen Sequenzen, welche in der GenBank-Datenbank publiziert sind, auf das Vorhandensein von Homologien über- prüft, und zwar unter Verwendung eines BLAST-Search, um, so weit wie möglich die eventuelle Bildung von PCR-Produkten mit Proben von Pflanzen, die weder Soja-Bohne noch Mais sind, auszuschliessen. Es wurden hierbei keine wesentlichen Ähnlichkeiten zu anderen Sequenzen aufgefunden.
Es bleibt jedoch immer noch zu bedenken, dass Sequenz-Homologien mit Genen verschiedener Pflanzenspezies existieren können, eine Tatsache, welche immer dann Probleme bringen kann, wenn quantitative PCR-Protokolle auf komplexe Lebensmittelmatrizes angewendet werden und wenn der Prozentgehalt an GVOs, also z. B. an transgenem Mais, in einer Probe nach der Quantifizierung der Mais-DNA in der gesamten Proben-DNA berechnet werden muss.
Die Verfügbarkeit einer Basensequenz, welche für eine bestimmte Pflanzenart einzigartig ist, stellt also eine wesentliche Voraussetzung für verlässliche, quantitative Protokolle für komplexe Lebensmittelmatrizes dar.
Kein Problem bei der Quantifizierbarkeit tritt auf, wenn die Probe insgesamt aus der Pflanzen- spezies besteht, welche gerade untersucht wird, oder wenn, wie im vorliegenden Fall, nur die Amplifizierbarkeit der DNA vor dem Nachweis von genmodifizierten Organismen zu überprüfen ist.
PCR-Hybridisierung und Restriktionsanalyse: Einen kurzen Überblick über die Resultate dieser Analysen zeigt die Tabelle 3.
35SP-PCR: Die Fig. 3 und 4 zeigen die Ergebnisse einer 35SP-PCR unter Einsatz von Soja- und Mais-Mehl-Proben mit verschiedenen Prozent-Gehalten an GVOs.
Für Soja lag unter den oben beschriebenen Bedingungen die Nachweisgrenze bei 0,01 % GVO und für Mais bei 0,1 % GVO. Unter der Annahme einer Genomgrösse (1 C) bei Soja, von etwa 1,134 pg (Greilhuber und Obermayer, 1997), bedeutet dies, dass etwa vier Kopien des 35S- Promotors in den Soja-Proben aufgefunden werden konnten. Bei den gewählten Bedingungen wurden keine unspezifischen Fragemente amplifiziert.
Die 35SP-PCR führte zu einer Amplifikation des vorausgesagten 162 bp-Fragments, welches durch Restriktionsverdau mit EcoR V in zwei Fragmente geschnitten wurde, und zwar in eines mit 98 bp und eines mit 64 bp Länge, wie Fig. 5 zeigt.
NOSFZ-PCR : Diese PCR ergab die Bildung eines 146 bp-Fragments, siehe dazu Fig. 6. Die
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Identität des Amplicons konnte durch Restriktions-Verdau mit Afllll, gezeigt in Fig. 7, bestätigt werden.
Die beiden Fragmente erscheinen auf dem Gel nur als eines, und zwar deswegen, weil sie fast gleiche Längen, nämlich 72 bp und 74 bp aufweisen. Es konnten 0,01 % GMO nachgewiesen werden.
NPTFZ-PCR: Die Ergebnisse der NPTFZ-PCR zeigt Fig. 8. Unter den gewählten Bedingungen konnten 500 Kopien des Plasmids in einem Hintergrund von 50 ng Soja-Bohnen-DNA nachgewie- sen werden, ein Ergebnis, das eine weniger hohe Empfindlichkeit zeigt, als die anderen PCR- Tests. Jedoch kann diesbezüglich eine definitive Aussage erst nach Analyse eines geeigneten GVO-Referenzmaterials in einem realistischeren Versuchsansatz gemacht werden.
Die erwartete Länge des PCR-Produktes beträgt 195 bp. Das Fragment wurde mit dem Re- stnktionsenzym Pvull gespalten, wobei zwei Fragmente mit 114 bp und 81 bp Länge erhalten wurden, siehe dazu Fig. 7.
SOJA1-PCR : SOJA 1-PCR für RoundUp Ready-Soja:
In Fig. 9 sind die Ergebnisse der SOJA1-PCR dargestellt. Die Identität des erwarteten 109(-bp-)PCR-Fragments konnte durch Hybridisierung mit der spezifischen CTP-S-Gensonde, siehe Fig. 10, bestätigt werden.
Hierbei konnten 0,01 % GVO nachgewiesen werden. Der Restriktionsverdau des Amplicons mit Bglll ergab zwei Fragmente mit jeweils 66 bp und 43 bp Länge, wie in Fig. 11gezeigt.
Mit dem PCR-Hybndisierungs-Protokoll konnte das Vorliegen von RoundUp Ready-Soja- DNA in verarbeiteten Lebensmitteln, wie z. B. in Bäckerei-Produkten, Nudeln, Haselnusscreme oder Instant-Lebensmitteln erfolgreich nachgewiesen werden (Vollenhofer et al., unveröffentlichte Er- gebnisse).
CRYFZ-PCR für modifiziertes Bt-Toxin-Gen : % GVO konnten mittels CRYFZ-PCR nach- gewiesen werden, wie in Fig. 12 gezeigt. Auch dieses Ergebnis lag knapp an der theoretischen Nachweisgrenze, wenn man bedenkt, dass vom Mais-Genom berichtet wurde, dass es eine annä- hernde Grösse (1 C) von 2,685 pg aufweist (Michaelson et al., 1991) und dass einige wenige Kopien des CrylA(b) Gens im "Event176"-Mais (Koziel et al., 1993) vorhanden sind.
Eine Bestätigung der Ergebnisse wurde durch Hybndisierung unter Einsatz der Gensonde CRY-S ermöglicht, siehe dazu Fig. 13.
Der Restriktions-Verdau des 147-bp-Fragments mit dem Restnktionsenzym Pvull, ergab zwei Fragmente von jeweils 78 bp bzw. 69 bp Länge, analog zu Fig. 11.
Es ist hiezu zu bemerken, dass die Polymerase-Kettenreaktion nicht nur zum Nachweis von "Event176" Mais, sondern auch von anderen Transformations-Events dienen kann, welche die gleiche modifizierte Bt-Toxin-Sequenz enthalten.
Wesentliche Vorteile der Erfindung:
Die Empfindlichkeit der PCR-Protokolle gemäss der Erfindung ist sehr hoch und erlaubt den Nachweis einer äusserst kleinen Anzahl von Kopien. Infolge ihrer hohen Annealing-Temperaturen zeigen die erfindungsgemässen Primerpaare in der PCR eine hohe Spezifizität, was die Bestäti- gung durch Restriktionsverdau-Analyse wesentlich erleichtert, bei welcher unspezifische Frage- mente teilweise durchaus stören.
Die Erfindung richtet sich weiters auf ausgewählte Primerpaare, welche einen Restriktions- Enzym-Verdau des PCR-Produkts unter Einsatz einesder kostengünstigeren Restriktions-Enzyme erlauben, was verständlicherweise die Kosten der Analysen senkt.
Ganz wesentlich ist es, dass keines der amplifizierten Fragemente länger ist als 250 bp, insbe- sondere jedoch nicht länger ist als 200 bp. Auf diese Weise stellen die auf der Erfindung basieren- den Analysen auch beim Nachweis abgebauter DNA selbst aus hoch-prozessierten Produkten kein ernsthaftes Problem mehr dar.
Die gemäss der Erfindung erstellbaren PCR-Hybridisierungs- und Restriktionsverdau-Protokolle stellen ein sehr wertvolles Werkzeug für GVO-Routineanalysen, insbesondere von Nahrungs- und Lebensmitteln dar.
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TABELLE 1 Oligonucleotid-Primer und -Sonden
EMI8.1
<tb> Primer/Sonde <SEP> Sequenz <SEP> Gen <SEP> Position
<tb>
EMI8.2
EMI8.3
<tb> INV <SEP> A <SEP> 5' <SEP> ggc <SEP> egg <SEP> atc <SEP> gtc <SEP> atg <SEP> ctc <SEP> tac <SEP> a <SEP> - <SEP> 3' <SEP> Mais-invenrtase <SEP> 984 <SEP> 1005 <SEP> von <SEP> CDS
<tb> INV <SEP> B <SEP> 5'-ttg <SEP> gcg <SEP> tcc <SEP> gac <SEP> ttg <SEP> acc <SEP> cat <SEP> t-3' <SEP> 3' <SEP> 1084 <SEP> - <SEP> 1105 <SEP> von <SEP> CDS <SEP>
<tb> 35SFZ1 <SEP> 5' <SEP> - <SEP> ccg <SEP> aca <SEP> gtg <SEP> gtc <SEP> cca <SEP> aag <SEP> atg <SEP> gac- <SEP> 3' <SEP> CaMV <SEP> 35S-Promotor <SEP> 115 <SEP> - <SEP> 138 <SEP> von <SEP> AN**
<tb> 35SFZ2 <SEP> 5' <SEP> - <SEP> ata <SEP> tag <SEP> agg <SEP> aag <SEP> ggt <SEP> ctt <SEP> gcg <SEP> aag <SEP> g <SEP> - <SEP> 3' <SEP> 252 <SEP> - <SEP> 276 <SEP> von <SEP>
AN
<tb> NOSFZ1 <SEP> 5' <SEP> - <SEP> gaa <SEP> tcc <SEP> tgt <SEP> tgc <SEP> egg <SEP> tct <SEP> tgc <SEP> gat <SEP> g <SEP> - <SEP> 3' <SEP> Agrobacterium <SEP> tumefaciens <SEP> NOS <SEP> 406 <SEP> 430 <SEP> von <SEP> AN
<tb> NOSFZ2 <SEP> 5' <SEP> - <SEP> tcg <SEP> cgt <SEP> att <SEP> aaa <SEP> tgt <SEP> ata <SEP> att <SEP> gcg <SEP> gga <SEP> ctc- <SEP> 3- <SEP> Terminator <SEP> 522 <SEP> 551 <SEP> von <SEP> AN
<tb> NPTFZ1 <SEP> 5'- <SEP> acc <SEP> tgt <SEP> egg <SEP> gtg <SEP> ccc <SEP> tga <SEP> atg <SEP> aac <SEP> tgc <SEP> - <SEP> 3' <SEP> NPTII <SEP> 155 <SEP> 181 <SEP> von <SEP> CDS
<tb> NPTFZ2 <SEP> 5' <SEP> - <SEP> gcc <SEP> atg <SEP> atg <SEP> gat <SEP> act <SEP> ttc <SEP> tcg <SEP> gca <SEP> gga <SEP> gc <SEP> - <SEP> 3' <SEP> 322 <SEP> 350 <SEP> von <SEP> CDS <SEP>
<tb> CAM <SEP> 5' <SEP> - <SEP> tca <SEP> ttt <SEP> cat <SEP> ttg <SEP> gag <SEP> agg <SEP> aca <SEP>
cg- <SEP> 3' <SEP> CaMV <SEP> 35S-Promotor <SEP> 285- <SEP> 307 <SEP> von <SEP> AN
<tb> CTP <SEP> 5' <SEP> - <SEP> gga <SEP> att <SEP> ggg <SEP> att <SEP> aag <SEP> ggt <SEP> ttg <SEP> tat <SEP> c <SEP> - <SEP> 3' <SEP> Petunia <SEP> hybnda <SEP> EPSPS <SEP> (CTP-Teil) <SEP> 30- <SEP> 54 <SEP> von <SEP> CDS
<tb> CRYFZ1 <SEP> 5'- <SEP> ctg <SEP> gtg <SEP> gac <SEP> atc <SEP> ate <SEP> tgg <SEP> ggc <SEP> atc <SEP> ttc <SEP> g <SEP> - <SEP> 3' <SEP> modifizierte <SEP> Bacillus <SEP> thuringiensis <SEP> CrylA(b) <SEP> 178 <SEP> - <SEP> 205 <SEP> von <SEP> CDS
<tb> CRYFZ2 <SEP> 5' <SEP> - <SEP> ttg <SEP> gta <SEP> cag <SEP> gtt <SEP> gct <SEP> cag <SEP> gcc <SEP> cte <SEP> c <SEP> - <SEP> 3' <SEP> Sequenz <SEP> 300 <SEP> 324 <SEP> von <SEP> CDS
<tb> CTP-S1 <SEP> (RR <SEP> Soja-Sonde)
<SEP> 5' <SEP> - <SEP> cct <SEP> tga <SEP> gcc <SEP> atg <SEP> ttg <SEP> tta <SEP> att <SEP> tgt <SEP> gcc <SEP> at <SEP> - <SEP> 3' <SEP> Petunia <SEP> hybrida <SEP> EPSPS <SEP> (CTP-Teil) <SEP> 1 <SEP> 29 <SEP> von <SEP> CDS
<tb> CTP-S2 <SEP> (RR <SEP> Soja-Sonde, <SEP> kompl.) <SEP> T'- <SEP> atg <SEP> gca <SEP> caa <SEP> att <SEP> aac <SEP> aac <SEP> atg <SEP> gct <SEP> caa <SEP> gg <SEP> - <SEP> 3' <SEP> Petunie <SEP> hybride <SEP> EPSPS <SEP> (CTP-Teil) <SEP> 1 <SEP> 29 <SEP> von <SEP> CDS
<tb> CRY-S1 <SEP> (bt <SEP> Mais-Sonde) <SEP> 5' <SEP> - <SEP> cag <SEP> tgg <SEP> gac <SEP> gcc <SEP> ttc <SEP> ctg <SEP> gtg <SEP> cag <SEP> atc <SEP> - <SEP> 3' <SEP> modifizierte <SEP> Bacillus <SEP> thuringiensis <SEP> CrylA(b) <SEP> 214 <SEP> 240 <SEP> von <SEP> CDS
<tb> CRY-S2 <SEP> (bt <SEP> Mais-Sonde)
<SEP> 5' <SEP> - <SEP> gat <SEP> ctg <SEP> cac <SEP> cag <SEP> gaa <SEP> ggc <SEP> gtc <SEP> cca <SEP> ctg <SEP> - <SEP> 3' <SEP> Sequenz <SEP> 214 <SEP> . <SEP> 240 <SEP> von <SEP> CDS
<tb>
. kodierende-Sequenz " jeweilige Zugangs-Nr.. im Text erwähnt
<Desc/Clms Page number 9>
TABELLE 2 PCR-Bedingungen
EMI9.1
<tb> 35SP-PCR
<tb> Schritt <SEP> NPTFZ-PCR <SEP> NOSFZ-PCR <SEP> INV-PCR <SEP> SOJA1-PCR <SEP> CRYFZ-PCR
<tb> LEC-PCR
<tb> Initial-Denaturierung <SEP> 12 <SEP> min <SEP> + <SEP> 95 C <SEP> 12 <SEP> min <SEP> + <SEP> 95"C <SEP> 12 <SEP> min <SEP> + <SEP> 95 C <SEP> 12 <SEP> min <SEP> + <SEP> 95 C <SEP> 12 <SEP> min <SEP> + <SEP> 95 C
<tb> Denaturierung <SEP> 1 <SEP> min <SEP> + <SEP> 95 C <SEP> 1 <SEP> min <SEP> + <SEP> 95 C <SEP> 1 <SEP> min <SEP> + <SEP> 95 C <SEP> 1 <SEP> min <SEP> + <SEP> 95 C <SEP> 1 <SEP> min
<SEP> + <SEP> 95 C
<tb> Annealing <SEP> . <SEP> ¯.¯.¯¯. <SEP> ¯¯¯¯ <SEP> 30 <SEP> s <SEP> + <SEP> 72 C <SEP> 30 <SEP> s <SEP> + <SEP> 68 C <SEP> 30 <SEP> s <SEP> + <SEP> 66 C <SEP> 30 <SEP> s <SEP> + <SEP> 62"C <SEP> 30 <SEP> s <SEP> + <SEP> 70 C
<tb> Extension <SEP> 30s <SEP> +72 C <SEP> 30 <SEP> + <SEP> 72 C <SEP> 30 <SEP> + <SEP> 72 C <SEP> 30s <SEP> +72 C <SEP> 30 <SEP> + <SEP> 72 C
<tb>
EMI9.2
<Desc/Clms Page number 10>
TABELLE 3 PCR-Hybridisierung und Restriktions-Analyse
EMI10.1
<tb> PCR <SEP> Fragment-Länge <SEP> Sensitivität <SEP> Hybridisierung <SEP> Restriktions- <SEP> Restriktions-
<tb>
EMI10.2
EMI10.3
<tb> LEC <SEP> 164 <SEP> bp- <SEP> Enzym <SEP> ¯ <SEP> Fragment-Länge
<tb> INV <SEP> 122 <SEP> bp
<tb> 35SP <SEP> 162 <SEP> bp <SEP> 0,1 <SEP> % <SEP> - <SEP> 0,
01 <SEP> % <SEP> GMO <SEP> nein <SEP> EcoRV <SEP> 98 <SEP> bp <SEP> + <SEP> 64 <SEP> bp
<tb> NOSFZ <SEP> 146 <SEP> bp <SEP> 0,01% <SEP> GMO <SEP> nein <SEP> ¯ <SEP> ¯ <SEP> Afilll <SEP> 74 <SEP> bp <SEP> + <SEP> 72 <SEP> bp <SEP>
<tb> NPTFZ <SEP> 195 <SEP> bp <SEP> 500 <SEP> Kopien <SEP> (Plasmid) <SEP> nein <SEP> Pvull <SEP> 114 <SEP> bp <SEP> + <SEP> 81 <SEP> bp
<tb> SOJA1 <SEP> 109 <SEP> bp <SEP> 0,01% <SEP> GMO <SEP> ja <SEP> Bglll <SEP> 66 <SEP> bp <SEP> + <SEP> 43 <SEP> bp <SEP>
<tb> CRYFZ <SEP> 147 <SEP> bp <SEP> 0,01 <SEP> GMO <SEP> ja <SEP> Pvull <SEP> 78 <SEP> bp <SEP> + <SEP> 69 <SEP> bp
<tb>
<Desc/Clms Page number 11>
Legende zu den Figuren 1 bis 13 Fig.1 : Soja, LEC-PCR.
Bande 1: 2% GVO ; Bande 2 : GVO ; 3: 0,1% GVO ; Bande 4: 0,01% GVO ; Bande 5: 0,001% GVO ; Bande 6 : GVO ; Bande7: Sojabohnen-
Negativ-Kontrolle; Bande 8: Sojabohnen-Positiv-Kontrolle, Bande 9: Wasser-Kontrolle;
Bande 10:100 bp Skala Fig.2: Mais, INV-PCR. Bande 1 : GVO ; Bande2: 0,5% GVO ; Bande 3 : GVO ; 4: 0,01% GVO ; Bande 5: 0,001% GVO, Bande 6 : GVO, Bande 7 : Mais-Negativ-Kontrolle; Bande 8: Mais-Positiv-Kontrolle; Bande 9: Wasser-Kontrolle; Bande 10:
100 bp Skala Fig.3: Soja, 35SP-PCR. Bande 1 : GVO ; 2 : GVO, Bande 3: 0,1% GVO, Bande 4: 0,01 % GVO ; Bande 5: 0,001 % GVO ; Bande 6 : GVO, Bande 7 : Sojabohnen-Negativ-Kontrolle; Bande 8: Sojabohnen-Positiv-Kontrolle, Bande 9 : WasserKontrolle,
Bande 10: 100 bp Skala Fig.4 : Mais, 35SP-PCR.
Bande 1: 2% GVO, Bande 2 : GVO ; 3: 0,1% GVO ; Bande 4: 0,01 % GVO, Bande 5: 0,001 % GVO ; Bande 6 : GVO, Bande 7: Mais-Negativ-
Kontrolle; Bande 8' Mais-Positiv-Kontrolle, Bande 9: Wasser-Kontrolle; Bande 10:
100 bp Skala Fig.5. EcoRV Restriktions Verdau von 35SP-PCR Fragmente. Banden 1-3 : Proben ; Bande4: Mais-Poitiv-Kontrolle, Bande 5 : Gew. -Marker V ; 6-9 : Bande 10: Sojabohnen-Positiv-Kontrolle Fig.6: Soja, NOSFZ-PCR.
Bande 1 : GVO ; 2 : GVO ; 3 : GVO;
Bande 4: 0,01% GVO ; Bande 5. 0,001% GVO ; Bande 6: 0% GVO, Bande 7: Sojaboh- nen-Negativ-Kontrolle; Bande 8: Sojabohnen-Positiv-Kontrolle, Bande 9 : Wasser-Kontrolle, Bande 10: 100 bp Skala Fig.7: Afllll Restriktions-Verdau von NOSFZ-PCR Fragmenten und Pvull Restriktions-Verdau von NPTFZ-PCR Fragmenten. Banden 1-4 : Bande 5 : Sojaboh-nen-Positiv-Kontrolle, Bande 6 : -Marker V ; Banden 7-9 : PositivpMOG402 Proben ; Bande 10: Plasmid-Positiv-Kontrolle Fig.8: Plasmid pMOG402 in Sojabohnen-DNA, NPTFZ-PCR. Bande 1 : fg Plasmid; Bande 2 : fg Plasmid; Bande 3 : fg Plasmid; Bande 4 : ag Plasmid; Bande 5 : ag Plasmid; Bande 6 : ag Plasmid; Bande 7: Sojabohnen DNA, Bande 8 : PositivKontrolle (50 pg Plasmid); Bande 9: Wasser-Kontrolle; Bande 10 : bp Skala Fig.9 : Soja, SOJA1-PCR.
Bande 1 : GVO, Bande 2 : GVO ; 3 : GVO; Bande 4: 0,01 % GVO, Bande 5: 0,001 % GVO, Bande 6 : GVO, Bande 7 : Sojaboh-nen-Negativ-Kontrolle; Bande 8: Sojabohnen-Positiv-Kontrolle; Banden 9 und 10 : Was-ser-Kontrollen; Banden 11 und 12 : bp Skala Fig.10: Southern Blot und Hybridisierung von SOJA1-PCR-Produkten. Banden 1-10 entspre- chend Banden 1-10 in Fig. 9 Fig.11: Pvull Restriktions-Verdau von CRYFZ-PCR Fragmenten und Bglll-Restriktions-Verdau von SOJA1-PCR Fragmenten. Banden 1-4 : Bande 5 : Mais-Positiv-Kontrolle; Bande 6: Molekular-Gew.-Marker V ; Banden 7-10: Positiv-Soja-
Proben ; Bande 11: Sojabohnen-Positiv-Kontrolle Fig.12: Mais, CRYFZ-PCR.
Bande 1 : GVO ; 2 : GVO ; 3: 0,1% GVO ; Bande 4: 0,01% GVO ; Bande5: 0,001% GVO ; Bande6: 0% GVO, Bande 7 : Mais-Negativ-Kontrolle; Bande 8: Mais Positiv-Kontrolle, Bande 9: Wasser-Kontrolle, Bande 10: 100 bp Skala Fig.13: Southern Blot und Hybridisierung von CRYFZ-PCR-Gel. Banden 1-9 entsprechend
Banden 1 bis 9 in Fig. 12
PATENTANSPRÜCHE:
1. Gruppe von neuen Primerpaaren zur PCR (polymerase chain reaction)-Amplifizierung von durch mindestens eine gentechnische Veränderung in die DNA von Soja und/oder Mais
<Desc/Clms Page number 12>
und/oder anderen Pflanzen eingebauten genetischen Elementen in pflanzlichen Roh- bzw. Grundmaterialien bzw. in derartige Materialien enthaltenden Zubereitungen, wie z. B.
Saatgut, Futter- oder Lebensmittel, vorzugsweise in Lebensmitteln, besonders bevorzugt in, insbesondere stark, prozessierten und einem, insbesondere hohen, Abbau der DNA des genannten, in ihnen enthaltenen pflanzlichen Grundmaterials unterworfenen bzw. unterlegenen Lebensmitteln, insbesondere für den Nachweis des Vorhandenseins von durch Gen-Manipulation verändertem, pflanzlichem Grundmaterial in derartigen Materialien bzw.
Zubereitungen, besonders bevorzugt in (hoch-)prozessierten Lebensmitteln, weiters für die Kontrolle der Amplifizierbarkeit der genannten genetischen Elemente sowie neue Gensonden zur Bestätigung positiver PCR-Resultate im Rahmen des Nachweises, wobei die einzelnen Primerpaare der genannten Gruppe bzw. die sie bildenden Basen-Sequenzen zur Erreichung möglichst hoher Annealing-Temperaturen und dadurch hoher Selektivität bei der Produktion der Amplifikate entworfen sind, und mittels derselben kurzkettige Fragmente bzw.
Basen-Sequenzen der genannten eingebauten genetischen Elemente mit einer Länge von weniger als 250 Basenpaaren (250 bp), vorzugsweise von 80 bis maximal 200 Basenpaaren (80 bis max. 200 bp), generiert werden, dadurch h g e k e n n z e i c h - n e t , dass die genannte Gruppe von Primerpaaren und Sequenz a1 für einen - zur Orientierung dienenden allgemeinen Nachweis des Vorhandenseins von mindestens einem gentechnisch veränderten Pflanzenmaterial in einem pflanzli- chen Roh- bzw.
Grundmaterial oder in einer ein solches enthaltenden Zubereitung, besonders bevorzugt in einem prozessierten Lebensmittel - folgende Primerpaare umfasst : a1.1. ein Primerpaar, dessen Forward-Primer mit einem Fragment mit 20 bis 45
Basen, bevorzugt mit 24 bis 35 Basen, aus der folgenden DNA-Sequenz aus dem Cauliflower Mosaic Virus-35S-Promoter
5' - agg cta tcg ttc aag atg cct ctg ccg aca gtg gtc cca aag atg gac ccc cac cca cga gga gca tcg tgg - 3' ,"BS35/1" und dessen Reverse-Primer mit einem Fragment mit 20 bis 45 Basen, bevor- zugt mit 24 bis 35 Basen, aus der folgenden DNA-Sequenz aus dem oben- genannten Promoter
5' - tct cca aat gaa atg aac ttc ctt ata tag agg aag ggt ctt gcg aag gat agt ggg att - 3' ,"BS 35/2" gebildet sind,
wobei eine Relativ-Positionierung der beiden Einzel-Primer innerhalb der genannten Sequenzen "BS 35/1" und "BS 35/2" der beiden
Stränge für eine amplifizierende Generierung genetischer Elemente mit einer
Länge von weniger als 250 bp, insbesondere von 80 bis 200 bp, vorgesehen ist, und insbesondere a1.1.1 ein Primerpaar aus der unter a1.1 genannten Gruppe, welches für die PCR-
Amplifizierung eines 162 Basenpaare langen DNA-Fragments aus dem Cauli- flower Mosaic Virus-35S-Promoter vorgesehen ist, und die beiden Basen-
Sequenzen
Primer 35SFZ1: 5' - ccg aca gtg gtc cca aag atg gac - 3', Primer 35SFZ2 : ata tag agg aag ggt ctt gcg aag g - 3' aufweist ;
weiters a1.2 ein Primerpaar, dessen Forward-Primer mit einem Fragment mit 20 bis 45
Basen, bevorzugt mit 24 bis 35 Basen, aus der folgenden DNA-Sequenz aus dem Nopalinsynthase-Terminator aus 'Agrobacterium tumefaciens"
<Desc/Clms Page number 13>
5 - ttg gca ata aag ttt ctt aag att gaa tcc tgt tgc cgg tct tgc gat gat tat cat ata att tct gtt gaa tta - 3' ,"BS NO/1" und dessen Reverse-Primer mit einem Fragment mit 20 bis 45 Basen, bevor- zugt mit 24 bis 35 Basen, aus der folgenden DNA-Sequenz aus dem soeben genannten Terminator
5' - ttt gcg cgc tat att ttg ttt tct atc gcg tat taa atg tat aat tgc ggg act cta atc ata aaa acc cat ctc ata aat aac - 3' ,"BS NO/2" gebildet sind,
wobei eine Relativ-Positionierung der beiden Einzel-Primer innerhalb der genannten Basen-Sequenzen "BS NO/1" und "BS NO/2" der beiden Stränge für eine amplifizierende Generierung genetischer Elemente mit einer Länge von weniger als 250 bp, insbesondere von 80 bis 200 bp, vorgesehen ist, und insbesondere a1.2.1 ein Primerpaar aus der unter a1.2 genannten Gruppe, welches für die PCR-
Amplifizierung eines 146 Basenpaare langen DNA-Fragments aus dem No- palinsynthase-Terminator aus 'Agrobacterium tumefaciens", vorgesehen ist und die beiden Basen-Sequenzen
Primer NOSFZ1: 5' - gaa tcc tgt tgc cgg tct tgc gat g - 3'
Primer NOSFZ2: 5' - tcg cgt att aaa tgt ata att gcg gga ctc - 3' aufweist ;
und schliesslich a1.3 ein Primerpaar, dessen Forward-Primer mit einem Fragment mit 20 bis 45
Basen, bevorzugt mit 24 bis 35 Basen, aus der folgenden DNA-Sequenz aus dem Neomycinphosphotransferase-Gen 11
5' - ggg cgc ccg gtt ctt ttt gtc aag acc g ac ctg tcg ggt gcc ctg aat gaa ctg cag gac gag gca gcg cgg cta tcg tgg - 3' ,"BS NP/1 und dessen Reverse-Primer mit einem Fragment aus 20 bis 45 Basen, be- vorzugt mit 24 bis 35 Basen, aus der folgenden DNA-Sequenz aus dem so- eben genannten Gen
5' - atc aag cgt atg cag ccg ccg cat tgc atc agc cat gat gga tac ttt ctc ggc agg agc-3' ,"BS NP/2" gebildet sind, wobei eine Relativ-Positionierung der beiden Einzel-Primer in- nerhalb der genannten Basen-Sequenzen "BS NP/1" und "BS NP/2" der bei- den Stränge für eine amplifizierende Generierung genetischer Elemente mit einer Länge von weniger als 250 bp, insbesondere von 80 bis 200 bp,
vorge- sehen ist, und insbesondere a1.3.1 ein Primerpaar aus der unter a1.3 genannten Gruppe, für die PCR-
Amplifizierung eines 195 Basenpaare langen DNA-Fragments aus dem Neo- mycinphosphotransferase-Gen 11, welches die beiden Basen-Sequenzen
Primer NPTFZ1: 5' - acc tgt cgg gtg ccc tga atg aac tgc - 3' Primer NPTFZ2 : 5' - gcc atg atg gat act ttc tcg gca gga gc - 3' aufweist ; dass die eingangs genannte Gruppe von Primerpaaren und Sequenzen weiters b2 für die Kontrolle der Amplifizierbarkeit von aus, gegebenenfalls gentechnisch verän- derter Soja stammender DNA in einem pflanzlichen Roh- bzw.
Grundmaterial oder in einer ein solches enthaltenden Zubereitung, besonders bevorzugt in einem prozes-
<Desc/Clms Page number 14>
sierten Lebensmittel b2. 1 ein Primerpaar umfasst, dessen Forward-Primer mit einem Fragment mit 20 bis 45 Basen, bevorzugt mit 24 bis 35 Basen, aus der folgenden DNA-
Sequenz aus dem Sojalektin-Gen LE 1
5' - tct ctc tcc cta acc tta acc ttg gta ctg gtg cta ctg acc agc aag gca aac tca gcg gaa act gtt tct ttc agc tgg aac aag ttc gtg - 3' ,"BS LE/1" und dessen Reverse-Primer mit einem Fragment aus 20 bis 45 Basen, be- vorzugt mit 24 bis 35 Basen, aus der folgenden DNA-Sequenz aus dem schon obengenannten Gen
5' - ggg ggt gga gta gag ggc gcg acc aag aga cga ggg ttt tgg ggt gcc gtt ttc gtc aac ctt att gag ttg taa ctt tcc cga gga ggt - 3', ,"BS LE/2" gebildet sind,
wobei eine Relativ-Positionierung der beiden Einzel-Primer in-nerhalb der genannten Basen-Sequenzen "BS LE/1" und "BS LE/2" der beiden Stränge für eine amplifizierende Generierung genetischer Elemente mit einer Länge von weniger als 250 bp, insbesondere von 80 bis 200 bp, vorgesehen ist ; insbesondere b2.1.1 ein Primerpaar, aus der unter b2. 1 genannten Gruppe beinhaltet, welches für die PCR-Amplifizierung eines 164 Basenpaare langen DNA-Fragments aus dem Soja-Lektin-Gen LE 1, vorgesehen ist und die beiden Basen-Sequenzen
Primer LEC 1: 5' - gtg cta ctg acc agc aag gca aac tca gcg - 3' Primer LEC 2 : gag ggt ttt ggg gtg ccg ttt tcg tca ac - 3' aufweist ;
dass die eingangs genannte Gruppe von Primerpaaren und Sequenzen weiters b1 für den Nachweis des Vorhandenseins und/oder für die Quantifizierung von durch
Gen-Manipulation verändertem Soja-Grundmaterial, nämlich "RoundUp Ready" (RR)
Soja, und/oder anderen Pflanzen, welche dieselbe gentechnische Veränderung auf- weisen, in einem pflanzlichen Roh- bzw.
Grundmaterial oder in einer ein solches ent- haltenden Zubereitung, besonders bevorzugt in einem prozessierten Lebensmittel, b1.1 ein Primerpaar umfasst, dessen Forward-Primer mit einem Fragment aus 20 bis 45 Basen, bevorzugt mit 24 bis 35 Basen, aus der folgenden DNA-
Sequenz des Cauliflower Mosaic Virus-35S-Promotors
5' - acc ctt cct cta tat aag gaa gtt cat ttc att tgg aga gga cac g-3' ,"BS CA/1" gebildet ist und dessen Reverse-Pnmer aus der DNA-Sequenz des Chloro- plasten-Transit-Peptids des 5-Enolpyruvylshikimat-3-phosphat-Synthase-
Gens aus "Petunia hybrida" Primer CTP :
gga att ggg att aag ggt ttg tat c - 3' gebildet sind, wobei die obengenannte DNA-Sequenz BS CA/1 eine Position im DNA-Strang aufweist, dass dieselbe mit dem genannten Primer CTP ge- netische Elemente mit einer Länge von weniger als 250 bp, insbesondere von
80 bis 200 bp, generiert, und insbesondere b1.1.1 ein Primerpaar aus der unter b1.1 genannten Gruppe umfasst, welches für die PCR-Amplifizierung eines 109 Basenpaare langen DNA-Fragments des
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Transits zwischen dem Cauliflower Mosaic Virus-35S-Promoter und dem
Chloroplasten-Transit-Peptid des 5-Enolpyruvylshikimat-3-phosphat-Syntha- se-Gens aus "Petunia hybrida", vorgesehen ist und die beiden Basen-
Sequenzen
Primer CAM : 5' - tca ttt cat ttg gag agg aca cg - 3'
Primer CTP : 5' - gga att ggg att aag ggt ttg tat c - 3' aufweist ;
dass die eingangs genannte Gruppe weiters b3 für die Bestätigung eines positiven PCR-Ergebnisses bei der Amplifizierung mittels des mit dem Forward-Primer aus der Sequenz BS CA/1 und mit dem Reverse-Primer
CTP gebildeten Primerpaares gemäss b1.1 bzw. mittels des Primerpaares CAM/CTP gemäss b1.1.1, mittels Hybridisierung und/oder zur dort genannten Quantifizierung eine b3. 1 eine Gensonde umfasst, welche mit einer 25 bis 35 bp umfassenden Se- quenz aus der DNA-Sequenz des Chloroplasten-Transit-Peptids des 5-Enol- pyruvylshikimat-3-phosphat-Synthase-Gens aus "Petunia hybrida"
5' - ggt ttg tat ccc ttg agc cat gtt gtt aat ttg tgc cat - 3 ,"GS CT1" oder deren Komplementär-Sequenz
5' - atg gca caa att aac aac atg gct caa ggg ata caa acc - 3' , "GS CT2" gebildet ist, und insbesondere b3. 1 1 eine Gensonde gemäss b5.
1 beinhaltet, welche die Basen-Sequenz
CTP-S1: 5'- cct tga gcc atg ttg tta att tgt gcc at - 3' oder deren Komplementär-Sequenz
CTP-S2 : 5' - atg gca caa att aac aac atg gct caa gg - 3' aufweist, dass die eingangs genannte Gruppe des weiteren c2 für die Kontrolle der Amplifizierbarkeit von DNA aus, gegebenenfalls gentechnisch verändertem, Mais in einem pflanzlichen Roh- bzw.
Grundmaterial oder in einer ein solches enthaltenden Zubereitung, besonders bevorzugt in einem prozessierten
Lebensmittel, c2. 1 ein Primerpaar umfasst, dessen Forward-Primer mit einem Fragment mit 20 bis 45 Basen, bevorzugt mit 24 bis 35 Basen, aus der folgenden DNA-
Sequenz aus dem Invertase-Gen von "Zea mays"
5 - ggg tcg gcg acg cgc ctg ccc gac ggc cgg atc gtc atg ctc tac acg ggc tcc acg gcg gag tcg tcg gcg - 3' ,"BS IN/1 und dessen Reverse-Primer mit einem Fragment aus 20 bis 45 Basen, be- vorzugt mit 24 bis 35 Basen, aus der folgenden DNA-Sequenz aus dem obengenannten Invertase-Gen
5' - gcc cgg cgg cgg cac cag cac cgg gtt ggc gtc cga ctt gac cca ctc ccg cag cag cgg gtc gga cgc gtc - 3' ,"BS IN/2" gebildet sind,
wobei eine Relativ-Positionierung der beiden Einzel-Primer
<Desc/Clms Page number 16>
innerhalb der genannten Basen-Sequenzen "BS IN/1" und "BS IN/2" der bei- den Stränge für eine amplifizierende Generierung genetischer Elemente mit einer Länge von weniger als 250 bp, insbesondere von 80 bis 200 bp, vorge- sehen ist, und insbesondere weiters c2.1.1 ein Primerpaar gemäss c2.1 beinhaltet, welches für die PCR-Amplifizierung eines 122 Basenpaare langen DNA-Fragments aus dem Invertase-Gen von "Zea mays"vorgesehen ist und die beiden Basen-Sequenzen
Primer INV A : 5' - ggc cgg atc gtc atg ctc tac a - 3'
Primer INV B : 5' - ttg gcg tcc gac ttg acc cac t - 3' aufweist ;
dass die eingangs genannte Gruppe weiters c1 für den Nachweis des Vorhandenseins und/oder die Quantifizierung von durch Gen-
Manipulation verändertem Mais, nämlich "Event 176" und/oder anderen Pflanzen, welche dieselbe gentechnische Veränderung aufweisen, in einem pflanzlichen Roh- bzw.
Grundmaterial oder in einer ein solches enthaltenden Zubereitung, besonders bevorzugt in einem prozessierten Lebensmittel, c1.1 ein Primerpaar umfasst, dessen Forward-Primer mit einem Fragment mit 20 bis 45 Basen, bevorzugt mit 24 bis 35 Basen, aus der folgenden DNA-
Sequenz aus einem modifizierten CrylA(b)-Gen aus "Bacillus thuringiensis"
5' - ttc gtg ccc ggc gcc ggc ttc gtg ctg ggc ctg gtg gac atc atc tgg ggc atc ttc ggc ccc agc - 3', ,"BS CR/1" und dessen Reverse-Primer mit einem Fragment aus 20 bis 45 Basen, be- vorzugt mit 24 bis 35 Basen, aus der folgenden DNA-Sequenz aus dem obengenannten Gen
5 '- cca ctc gcg gaa gct ctc ggc gta gat ttg gta cag gtt gct cag gcc ctc cag gcg gct gat ggc ctg gtt gcg ggc - 3' ,"BS CR/2" gebildet sind,
wobei eine Relativ-Positionierung der beiden Einzel-Primer in- nerhalb der genannten Basen-Sequenzen "BS CR/1" und "BS CR/2" der bei- den Stränge für eine amplifizierende Generierung genetischer Elemente mit einer Länge von weniger als 250 bp, insbesondere von 80 bis 200 bp, vorge- sehen ist, und insbesondere c1.1.1 ein Pnmerpaar gemäss c1.1 beinhaltet, welches für die PCR-Amplifikation eines 147 Basenpaare langen DNA-Fragments aus einem modifizierten
CrylA(b)-Gen aus "Bacillus thuringiensis" vorgesehen ist und die beiden Ba- sen-Sequenzen
Primer CRYFZ1: 5' - ctg gtg gac atc atc tgg ggc atc ttc g - 3'
Primer CRYFZ2: 5' - ttg gta cag gtt gct cag gcc ctc c - 3' aufweist ;
und dass die eingangs genannte Gruppe von Primerpaaren und Sequenzen schliesslich c3 für die Bestätigung eines positiven Ergebnisses bei der PCR-Amplifizierung mittels des mit den Primern aus den beiden Sequenzen "BS CR/1" und "BS CR/2" gebilde- ten Primerpaares gemäss c1.1 bzw. des Primerpaares CRYFZ1 und CRYFZ2 gemäss c1.1.1 mittels Hybridisierung c3. 1 eine Gensonde mitumfasst, welche mit einer 25-35 bp umfassenden Sequenz aus dem modifizierten CrylA(b)-Gen aus "Bacillus thuringiensis"
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5'- atc ttc ggc ccc agc cag tgg gac gcc ttc ctg gtg cag atc gag cag ctg atc aac cag cgc atc - 3' ,"GS CR/1" oder mit deren Komplementär-Sequenz
5'- gat gcg ctg gtt gat cag ctg ctc gat ctg cac cag gaa ggc gtc cca ctg gct ggg gcc gaa gat - 3' ,"GS CR/2" gebildet ist, und insbesondere c3.1.1eine Gensonde beinhaltet, welche die Basen-Sequenz
CRY-S1:
5' - cag tgg gac gcc ttc ctg gtg cag atc - 3' oder deren Komplementär-Sequenz
CRY-S2 : 5' - gat ctg cac cag gaa ggc gtc cca ctg - 3' aufweist.
2. Verfahren zum Nachweis des Vorhandenseins von gentechnisch verändertem Pflanzen- material in pflanzlichen Roh- bzw. Grundmaterialien bzw. in derartige Materialien enthal- tenden Zubereitungen, wie z. B. Saatgut, Futter- oder Lebensmittel, vorzugsweise in Le- bensmitteln, besonders bevorzugt in, insbesondere stark, prozessierten und einem, insbe- sondere hohen, Abbau der DNA des genannten, in ihnen enthaltenen pflanzlichen Grund- materials unterworfenen bzw. unterlegenen Lebensmitteln, durch PCR-Amplifizierung mit- tels Primerpaaren, dadurch gekennzeichnet, dass neue Primerpaare einer Gruppe einge- setzt werden, welche, bzw. deren sie bildende Basen-Sequenzen zur Erreichung möglichst hoher Annealing-Temperaturen und dadurch hoher Selektivität bei der Produktion der
Amplifikate entworfen sind, und mittels derselben kurzkettige Fragmente bzw.
Basen-
Sequenzen der genannten eingebauten genetischen Elemente mit einer Länge von weni- ger als 250 Basenpaaren (250 bp), vorzugsweise von 80 bis maximal 200 Basenpaaren (80 bis max. 200 bp), generiert werden, dadurch gekennzeichnet, k) dass - für den allgemeinen Nachweis des Vorhandenseins von mindestens einem durch Gen-Manipulation veränderten Pflanzenmaterial in einem pflanzlichen Roh- bzw. Grundmaterial oder in einer ein solches enthaltenden Zubereitung, besonders bevorzugt in einem prozessierten Lebensmittel - ein Primerpaar gemäss einer der
Varianten a1.1, a1.1.1, a1.2, a1.2.1, a1.3 und a1.3.1 des Anspruches 1 eingesetzt wird,
I) dass weiters - für die Kontrolle der Amplifizierbarkeit von aus Soja stammender DNA in einem pflanzlichen Roh- bzw.
Grundmaterial oder in einer ein solches enthaltenden
Zubereitung, besonders bevorzugt in einem prozessierten Lebensmittel - ein Primer- paar gemäss einer der Varianten b2.1, b2.1.1 des Anspruches 1 eingesetzt wird, m) dass weiters für den Nachweis des Vorhandenseins von gentechnisch verändertem
Soja ("RoundUp Ready" (RR) Soja) und/oder anderen Pflanzen, welche die gleiche gentechnische Veränderung aufweisen, in einem pflanzlichen Roh- bzw.
Grundmate- rial oder in einer ein solches enthaltenden Zubereitung, besonders bevorzugt in einem prozessierten Lebensmittel - ein Primerpaar gemäss einer der Varianten b1.1, b1 1, des Anspruches 1 eingesetzt wird, n) dass zur Bestätigung eines positiven Ergebnisses bei der Amplifizierung mittels eines
Primerpaars gemäss Variante b1.1 oder b1.1.1 des Anspruches 1 im Rahmen eines
Verfahrens gemäss m) eine Gensonde gemäss Variante b3. 1 oder b3. 1.1 des Anspru- ches 1 eingesetzt wird, o) dass - für die Kontrolle der Amplifizierbarkeit von DNA aus Mais in einem pflanzlichen
Roh- bzw.
Grundmaterial oder in einer ein solches enthaltenden Zubereitung, beson- ders bevorzugt in einem prozessierten Lebensmittel - ein Primerpaar gemäss Variante c2. 1 oder c2.1.1 des Anspruches 1 eingesetzt wird,
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p) dass für den Nachweis des Vorhandenseins von durch Gen-Manipulation veränder- tem Mais ("Event 176") und/oder anderen Pflanzen, welche dieselbe gentechnische
Veränderung aufweisen, in einem pflanzlichen Roh- bzw.
Grundmaterial oder in einer ein solches enthaltenden Zubereitung, besonders bevorzugt in einem prozessierten
Lebensmittel, ein Primerpaar gemäss Variante c1.1 oder c, 1.1.1 des Anspruches 1 eingesetzt wird, und q) dass schliesslich für die Bestätigung eines positiven Ergebnisses bei der Amplifizie- rung mittels eines Primerpaares gemäss Variante c1.1 oder c. 1.1.1 des Anspruches 1 im Rahmen eines Verfahrens gemäss Variante p) eine Gensonde gemäss Variante c3. 1 oder c3.1.1 des Anspruches 1 eingesetzt wird.
HIEZU 5 BLATT ZEICHNUNGEN