KR100474115B1

KR100474115B1 - 유전자변형식물에 대한 ｐｃｒ 검정용 프라이머

Info

Publication number: KR100474115B1
Application number: KR10-2001-0030885A
Authority: KR
Inventors: 김영미; 김태산; 박용환
Original assignee: 대한민국
Priority date: 2001-06-01
Filing date: 2001-06-01
Publication date: 2005-03-08
Also published as: KR20020092034A

Abstract

본 발명은 유전자변형식물에 대한 PCR 검정용 프라이머에 관한 것으로, 해충저항성 유전자변형식물 또는 제초제 저항성 유전자변형식물을 검사할 수 있는 특이적인 PCR 프라이머, Bt11 F625 프라이머/ Bt11 R1077 프라이머, PEPC F157 프라이머/ PEPC R608프라이머, CDPK F252 프라이머/ CDPK R552 프라이머, Monbt F95 프라이머/ Monbt R407 프라이머, AgrPAT F100 프라이머/ AgrPAT R410 프라이머 및 35S2A 프라이머/CTP5A 프라이머를 제공한다. 본 발명의 유전자변형식물 검정용 PCR 프라이머는 GMO 검사키트로 상업화할 수 있으며, 유통중인 유전자변형농산물 판별에 이용될 수 있다.

Description

유전자변형식물에 대한 ＰＣＲ 검정용 프라이머{PRIMER FOR DETECTION OF GENERALLY MODIFIED ORGANISM}

본 발명은 유전자변형식물에 대한 PCR 검정용 프라이머에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 Bt11, Event176, Mon810, T14, T25 및 RRS를 검출할 수 있는 PCR 프라이머에 관한 것이다.

유전자변형식물(Genetically Modified Organism : GMO)이란 통상적으로 유전공학기술로 기존의 번식방법으로는 나타날 수 없는 형질이나 유전자를 지니도록 개발된 식물을 통칭한다. 유전자변형식물 중 농작물의 유전자 변형은 주로 생산량을 증가시키는 형질, 병충해에 저항적인 형질, 고농도의 농약에 저항적인 형질, 긴 유통기간에도 쉽게 상하지 않는 형질 등으로, 이미 상용화되었거나, 준비중에 있다.

유전자변형식물의 상업화는 1994년 미국 칼젠(Calgene)사가 잘 물러지지 않는 토마토를 개발한 이후 빠르게 진행되었으며, 1996년 몬산톤사의 대두와 노바티스사의 옥수수가 본격적으로 상품화되었다. 초기 유전자변형식물 재배는 유전자변형식물을 개발한 회사가 일반종자 보다 비싸게 판매함에도 불구하고 농민의 입장에서는 농약과 비료의 비용이 크게 줄고 병충해가 감소해 그 사용이 급격하게 증가하였다. 1994년부터 1998년까지 FDA의 검증을 마치고 시판이 허용된 유전자재조합식물은 옥수수, 토마토, 감자, 대두 등을 중심으로 39종에 이르며, 6년 이내에 시판될 것으로 예상되는 제품도 30여종에 이른다.

현재 식물 또는 식품의 유전자변형여부를 확인하기 위한 방법은 유전자변형식물의 DNA를 검출하는 방법과 단백질을 검출하는 방법 두 가지이다.

(1) 단백질 검출에 의한 검정 기술

EPSPS 유전자가 도입된 콩 및 CryIA(b), Cry9C, PAT 유전자가 도입된 옥수수에 대하여 EPSPS 또는 CryIA(b), Cry9C, PAT 유전자가 발현하는 EPSPS 또는 Bt 단백질을 항체로 이용하여 검출하는 스트립(strip) 키트가 이미 상품화되어 있고, 효소면역학적 방법(Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay, ELISA)에 의한 EPSPS과 CryIA(b) 유전자 단백질 정량용 분석 킷트도 최근 상품화되었다. 그러나 단백질의 발현양은 유전자변형농산물에 따라 다르며, 개발회사에서 사용한 유전자 발현 조절부위(프로모터)에 따라 종자에서 발현되지 않는 경우도 있으며, 보관상태 또는 가공식품의 경우에 가공과정에서 분해되는 경우도 있어 검정에 한계가 있다.

(2) DNA 검출에 의한 검정기술

핵산중합효소 연쇄 반응법(polymerase chain reaction, PCR)에 의한 검정기술이다. 현재 유전자변형식물에 많이 사용되는 컬리플라워 모자이크 바이러스 프로모터(CaMV 35S promoter)에 대한 특이적인 PCR 프라이머로 유전자변형 여부를 확인할 수 있다. 특히 스위스, 독일 등 EU에서는 35S 프로모터 또는 Nos 터미네이터 특이적인 프라이머를 이용한 PCR 검정법이 유전자변형식품을 검정하는 공인기술로 이용되고 있다.(A. Jankiewicz 등, Eur. Food res. Technol. 209:77-82, 1999; Pietsch 등, DG JRC 보고서, 1999) 또한 현재 상품화되고 있는 PCR 검정킷트(kit)도 역시 35S 프로모터 또는 Nos 터미네이터 특이 프라이머를 이용한 것이다. 그러나 이들의 35S 프로모터 또는 Nos 터미네이터 특이 프라이머를 이용한 PCR 결과에서 의사양성(false positive) 또는 의사음성(false negative)가 나타날 가능성이 있으며(Lipp 등, J. AOAC International 82:923-928, 1999), 유전자변형농산물의 종류에 따라 이들 조절부위 유전자를 이용하고 있지 않는 경우도 있다. 따라서 스위스 등 EU에서는 이들 조절부위 특이적인 프라이머를 이용한 PCR은 유전자변형농산물의 1차적인 스크리닝에 이용하고 있으며, 유전자변형농산물의 품종 특이적인 프라이머를 이용한 PCR 검정을 2차 검정으로 확인하고 있다.(Huber 등, Nat. Biotechnol. 17:1137-1138, 1999) 그러나 개발회사에 따라 유전자변형농산물에 도입시킨 유전자의 염기서열이 변경되어 있으며 도입유전자의 발현방법도 다를 뿐만 아니라 상기한 유전정보를 개발회사의 비밀정보(confidential business information, CBI)로 하여 도입유전자에 대한 유전정보를 확보하기에 곤란한 점이 많다. 따라서 2차 검정에 이용하고 있는 프라이머의 정보도 공개하지 않고 있어 품종별 특이 프라이머 개발이 국내외적으로 시급한 실정이다.

따라서, 본 발명은 유전자변형식물을 검정할 수 있는 PCR 프라이머를 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 해충저항성 유전자변형식물을 검정할 수 있는 서열번호 2의 Bt11 R1077 프라이머를 포함하는 PCR 프라이머를 제공한다.

또한 본 발명은 해충저항성 유전자변형식물을 검정할 수 있는 서열번호 4의 PEPC R608 프라이머를 포함하는 PCR 프라이머를 제공한다.

또한 본 발명은 해충저항성 유전자변형식물을 검정할 수 있는 서열번호 6의 CDPK R552 프라이머를 포함하는 PCR 프라이머를 제공한다.

또한 본 발명은 해충저항성 유전자변형식물을 검정할 수 있는 서열번호 7의 Monbt F95 프라이머를 제공한다.

또한 본 발명은 해충저항성 유전자변형식물을 검정할 수 있는 서열번호 8의 Monbt R407 프라이머를 제공한다.

또한 본 발명은 제초제저항성 유전자변형식물을 검정할 수 있는 서열번호 9의 AgrPAT F100 프라이머를 제공한다.

또한 본 발명은 제초제저항성 유전자변형식물을 검정할 수 있는 서열번호 10의 AgrPAT R410 프라이머를 제공한다.

또한 본 발명은 제초제저항성 유전자변형식물을 검정할 수 있는 서열번호 11의 35S2A 프라이머를 제공한다.

또한 본 발명은 제초제저항성 유전자변형식물을 검정할 수 있는 서열번호 12의 CTP5A 프라이머를 제공한다.

이하 본 발명을 상세하게 설명한다.

본 발명은 BT, PAT 또는 EPSPS 유전자변형식물을 검정할 수 있는 PCR 프라이머 및 검정방법을 제공한다.

상기 BT는 바실러스 투린지엔시스(Bacillus thuringiensis)의 cryIA(b) 유전자를 식물에 형질전환하여 해충에 내성을 가지게 한 유전자변형식물이다.

상기 PAT는 스트렙토마이스 비리도크로모진(Streptomyces viridoch romogenes)의 포스피노트리신 아세틸트랜스퍼레이즈(Phosphinotricin acetyl transferase)유전자와 스트렙토마이세스 하이그로스코피커스(Streptomyces hygros copicus)의 포스피노트리신 아세틸 하이드롤레이즈(Phosphinotricin acetyl hydrolase)유전자로 제초제 글리포세이트에 저항성을 가지는 유전자를 포함하는 유전자변형식물이다.

상기 EPSPS는 5-에놀피루빌쉬키마트-3-포스페이트 합성효소(enolpyru vylshikimate-3-phosphate synthase)단백질로 글리포세이트(glyphosate)라는 제초능을 가지는 화학물질에 내성을 갖는 유전자변형식물이다. 글리포세이트는 전세계에서 가장 많이 판매되는 라운드업(round-up)제초제의 핵심성분이다.

상기 Bt, PAT, EPSPS 유전자변형식물은 개발회사에 따라 도입유전자 염기서열 및 발현체제가 다르다. 따라서, 본 발명에서는 특정회사에서 판매하는 유전자변형식물에 대한 PCR 프라이머를 고안하였다. 하지만 본 발명의 유전자변형식물 검정용 PCR 프라이머는 동일한 염기서열 및 발현체체를 가지는 유전자변형식물에 사용될 수 있다.

한편, 본 발명은 노바티스사의 해충저항성 옥수수 Bt11를 검출할 수 있는 PCR 프라이머를 제공한다. 상기 Bt11은 CaMV 35S 프로모터(P35s) - 알코올 가수분해효소(alcohol dehydrogenase; 이하 'adh1라 함) 인터론6 - 합성 CryIA(b) - 노팔린 합성효소 전자종결인자(nopaline synthase terminator; 이하 'Tnos'라 함)의 구조를 가진다.

Bt11을 검정할 수 있는 본 발명의 프라이머는 서열번호 1의 Bt11 F625 프라이머와 서열번호 2의 Bt11 R1077 프라이머이다. Bt11 F625 플라이머는 adh1 인터론6을 특이적으로 인지하고, Bt11 R1077 프라이머는 합성 CryIA(b)를 특이적으로 인지한다.

또한 본 발명은 노바티스사의 Event176 해충저항성 유전자변형식물을 검정할 수 있는 두 쌍의 프라이머를 제공한다. Event176은 합성 CryIA(b) 유전자가 두 가지 발현구조로 도입되어있다. 그 중 하나의 발현구조는 포스포에놀피루베이트 카르복실레이즈 프로모터(phosphoenolpyruvate carboxylase promoter; 이하 'Ppepc'라 함) - 합성 CryIA(b) - PEPC 인터론9번 - CaMV 35S 전사종결인자(T35s) 구조이고, 상기 구조에 대한 검정용 프라이머는 서열번호 3의 PEPC F157 프라이머와 서열번호 4의 PEPC R608 프라이머이다. 상기 PEPC F157 프라이머는 Ppepc를 인지하고, 상기 PEPC R608은을 CryIA(b)를 인지한다.

노바티스사의 Event176 유전자의 또다른 발현구조는 옥수수 칼슘조절단백질 카이네이즈 프로모터(calcium-dependent protein kinase promoter; 이하 'Pcdpk'라 함) - 합성 CryIA(b) - PEPC인터론9번 - CaMV 35S 전사종결인자(T35s)이고, 검정용 프라이머는 서열번호 5의 CDPK F252 프라이머와 서열번호 6의 CDPK R552 프라이머이다. 상기 CDPK F252 프라이머는 Pcdpk를 특이적으로 인지하고, CDPK R552 프라이머는 합성 CryIA(b)를 특이적으로 인지한다.

또한 본 발명은 몬산토사의 Mon810 옥수수를 검정할 수 있는 프라이머를 제공한다. 몬산토사의 Mon810은 CaMV 35S 프로모터 - 옥수수 열충격 단백질(heat shock protein70; 이하 '(hsp70'라 함) 인터론1번 - 합성 CryIA(b) - Tnos을 포함한다. Mon810에 대한 PCR 프라이머는 서열번호 7의 Monbt F95 프라이머와 서열번호 8의 Monbt R407 프라이머이다. 상기 Monbt F95 프라이머는 hsp70 인터론1번을 인지하고, Monbt R407 프라이머는 합성 CryIA(b)를 인지한다.

또한 본 발명은 아벤티스사의 T14/T25 옥수수를 검정할 수 있는 프라이머를 제공한다. 아벤티스사의 T14/T25는 CaMV 35S 프로모터(P35S) - 합성 포스피노트리신 아세틸트랜스퍼레이즈(synthetic phosphinotricin acetyltransferase; 이하 'PAT'라 함) - CaMV 35S 전사종결인자(T35S)를 포함한다. T14 또는 T25 검정용 PCR 프라이머는 서열번호 9의 AgrPAT F100 프라이머와 서열번호 10의 AgrPAT R410 프라이머이다. 상기 AgrPAT F100 프라이머와 AgrPAT R410 프라이머는 합성 PAT를 인지한다.

또한 본 발명은 몬산토사의 RRS(Roundup Ready Soybean)를 검정할 수 있는 프라이머는 제공한다. RRS는 CaMV 35S 프로모터 - 페추니아 엽록체 운반 펩타이드 (Petunia chloroplast transit peptide; 이하 'CTP'라 함) - CP4 EPSPS (Agrobacterium CP4 strain EPSPS) - Tnos를 포함한다. RRS 검정용 PCR 프라이머는 서열번호 11의 35S2A 프라이머와 서열번호 12의 CTP5A 프라이머이다. 상기 35S2A 프라이머는 P35S를 인지하고, 상기 CTP5A 프라이머는 CTP를 인지한다.

또한 본 발명은 상기 유전자변형식물 검정용 PCR 프라이머를 이용한 유전자변형식물 검정방법을 제공한다. 본 발명의 유저자변형식물 검정방법은 통상의 PCR 방법으로 시료의 게놈 DNA에 대한 PCR 방법이다. 하기 표 1에 가장 바람직한 PCR 반응조건을 PCR 프라이머에 따라 나타내었다.

프라이머	반응조건
F625프라이머/ R1077 프라이머	94 ℃, 5분-> 94 ℃, 30초-> 55 ℃, 30초 -> 72 ℃, 30초, 35회 -> 72 ℃, 7분
F157 프라이머/ R608프라이머	94 ℃, 5분-> 94 ℃, 30초-> 63 ℃, 30초 -> 72 ℃, 30초, 35회 -> 72 ℃, 7분
F252 프라이머/ R552 프라이머	94 ℃, 5분-> 94 ℃, 30초-> 63 ℃, 30초 -> 72 ℃, 30초, 35회 -> 72 ℃, 7분
F95 프라이머/ R407 프라이머	94 ℃, 5분-> 94 ℃, 30초-> 63 ℃, 30초 -> 72 ℃, 30초, 35회 -> 72 ℃, 7분
F100 프라이머/ R410 프라이머	94 ℃, 5분-> 94 ℃, 30초-> 55 ℃, 30초 -> 72 ℃, 30초, 35회 -> 72 ℃, 7분
35S2A 프라이머/ CTP5A 프라이머	94 ℃, 5분-> 94 ℃, 30초-> 58 ℃, 30초 -> 72 ℃, 30초, 30회 -> 72 ℃, 7분

본 발명의 유전자변형식물 검정용 PCR 프라이머는 도입유전자 및 개발회사별 특이성품종 특이성을 가진다. 유전자변형식물인 Bt11, Event176, Mon810, T14, T25 및 RRS를 검출할 수 있고 GMO 검정키트로 활용할 수 있다.

또한 본 발명의 유전자변형식물 검정용 PCR 프라이머는 CryIA(b) 유전자, PAT 유전자 또는 ESPSP 유전자를 포함하는 식물 또는 식품에 대하여 검정프라이머로 사용할 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐 본 발명이 하기의 실시예에 한정되는 것은 아니다.

[실시예 1] Bt11에 대한 프라이머 제작

Bt11 옥수수는 노바티스(Novartis) 회사에서 개발하여 맥시마이저 (Maximizer)란 상품명으로 상품화한 해충저항성옥수수이다. 해충저항성 유전자는 CryIA(b) 유전자를 변형시킨 합성 CryIA(b) 유전자이고, 도 1에 나타난 바와 같이, CaMV 35S 프로모터(Sanders 등, 1987)와 옥수수의 알콜분해효소(alcohol dehydrogenase) 유전자(adh1)의 인트론 6번(Gene Bank accession No. X04049) 부위가 발현조절인자로 연결되어있다.

Bt11의 특이프라이머로 서열번호 1의 F625 프라이머(5'-GCACTGGCACTTGGTCTAA TA-3')와 서열번호 2의 R1077 프라이머(5'-GGACCAAAGATACCCCAGATG-3)를 제조하였다. 상기 F625 프라이머는 adh1의 인터론6에 특이적으로 작용하고, 상기 프라이머 R1077 프라이머는 합성 CryIA(b)를 특이적으로 인지한다. F625 프라이머와 R1077 프라이머는 GC 함량이 49.4 %이며 Tm 차이가 0.4 ℃로 적정 어닐(anneal) 온도가 55 ℃이며 이들 프라이머를 이용한 Bt11의 PCR 산물의 크기는 493 bp로 예상된다.

[실시예 2] Event176 특이 프라이머 제작

Event176는 노바티스(Novartis) 회사에서 개발하여 상품(NatureGard Knock Out)화한 해충저항성 옥수수이며, 해충저항성 유전자는 CryIA(b) 유전자를 변형시킨 합성 CryIA(b) 유전자이다. Event176의 합성 CryIA(b) 유전자는 두 가지 형태로 발현되고 있다. 도 2에 합성CryIA(b) 유전자의 발현조절형을 나타내었다. 도2의 A는 합성 CryIA(b) 유전자에 옥수수 유래의 포르스포에놀파이브레이드 카르복실레이즈(phosphoenolpyruvate carboxyl ase; 이하 'PEPC'라 함) 프로모터와 PEPC 인터론9(GeneBank accession No. X04049)가 연결되어있는 형태를 나타낸 것이고, 도2의 B는 합성 CryIA(b) 유전자에 칼슘 조절 단백질 카이네이즈(calcium-dependent protein kinase; 이하 'CDPK'라 함) 프로모터와 PEPC 인터론9(GeneBank accession No. X04049)가 연결되어있는 형태를 나타낸 것이다.

따라서, Event176 옥수수를 검정하기 위하여 4개의 프라이머를 제작하였다.

프로모터	프라이머	프라이머 결합부위	서열번호 및 서열
PEPC	F157	PEPC	서열번호 3 : 5'-CAAGAAGGCAGGTGAGCAGTG-3'
PEPC	R608	합성 CryIA(b)	서열번호 4 : 5'-GCACTCGTTGATGTTGGGGTT-3'
CDPK	F252	CDPK	서열번호 5 : 5'-TTGACTTGTAGCCCTGACCTT-3'
CDPK	R552	합성 CryIA(b)	서열번호 6 : 5'-GTTGATGTTGGGGTTGTTGTC-3'

F157 프라이머와 R608 프라이머는 GC 함량이 62.54 %이며 Tm 차이가 1.0 ℃로 적정 어닐온도가 63 ℃이며, 이들 프라이머를 이용한 Event176의 PCR 산물의 크기는 472 bp로 예상된다. F252 프라이머와 R552 프라이머는 GC 함량이 53 %, Tm 차이가 0.9 ℃, 적정 어닐온도가 55.8 ℃이며 이 프라이머를 이용한 Event176의 PCR 산물의 크기는 321 bp로 예상된다.

[실시예 3] Mon810 특이 프라이머 제작

Mon810는 몬산토(Monsanto, YieldGard) 회사의 해충저항성 옥수수로, CryIA(b) 유전자의 코든 이용도(codon usage)를 단자엽 식물체 발현용으로 변경시킨 합성 CryIA(b) 유전자(US patent 5689052)가 도입된 것이다. 발현조절은 도 3에 도시한 바와 같이, CaMV 35S 프로모터(Sanders 등, 1987)와 옥수수의 열충격단백질(Heat Shock Protein; 이하 'HSP70'라 함) 유전자 인트론 1번 부위가 연결되어 있다.

Mon810의 특이프라이머는 서열번호7의 Monbt F95 프라이머(5'-GACATCTCCCTCTCCCTCACGCAG-3')와 서열번호 8의 Monbt R407 프라이머(5'-GAAGAGTGGGATGGCGGTGGTCAG-3')이다. Monbt F95 프라이머와 Monbt R407 프라이머는 합성 CryIA(b) 유전자를 인지한다. Monbt F95와 R407은 GC 함량이 61.9 %, 적정 어닐온도가 63 ℃이며 이 프라이머를 이용한 Mon810의 PCR 산물의 크기는 336 bp로 예상된다.

[실시예 3] T14/T25 옥수수 특이 프라이머제작

T14와 T25 옥수수는 아벤티스(Aventis, 구 아그레보(AgrEvo), LibertyLink) 회사에서 개발한 제초제 저항성옥수수이며, 도입 유전자 및 유전자운반체의 구조는 T14와 T25에서 동일하다. 제초제저항성 유전자는 스트렙토마이세스 비리도크로모젠(Streptomycetes viridochromogenes) 유래의 PAT 유전자를 식물체에서 유전자 발현이 용이하도록 유전자의 염기를 변경한 합성 PAT 유전자이다.(USDA/APHIS petition 94-357-01) 도 4에 PAT 유전자 발현조절부위를 도시하였고, T14와 T25 특이 프라이머는 합성 PAT 유전자에 특이적으로 제작되었다. T14 또는 T25 유전자 검정용 프라이머는 서열번호 9의 F100 프라이머(5'-GTGAACTTTAGGACAGAGCCA-3')와 서열번호 10의 R410 프라이머(5'-CTGTGTATCCCAAAGCCTCAT-3')이다. AgrPAT F100과 R410 프라이머의 GC 함량은 47.4 %,어닐 적정온도는 55 ℃이며 PCR산물의 크기는 331 bp로 예상된다.

[실험예 1]

상기 실시예 1, 실시예 2, 실시예 3 및 실시예 4에서 제작한 프라이머의 특이성을 해충저항성옥수수인 Bt11, Event176, Mon810과 제초제저항성 옥수수인 T14/T25, 비유전자변형 옥수수, 벼에 대하여 확인하였다.

식물의 게놈 DNA 분리

Bt11, Event176, Mon810, T14/T25, 비유전자변형 옥수수, 벼의 게놈 DNA를 분리하였다. 종자 또는 잎을 액체질소를 이용하여 미세하게 마쇄한 후 200 mg을 2 ml 튜브에 넣고, 800 ul mCTAB 추출용액(2 %(w/v) CTAB, 1.4 M NaCl, 100 mM Tris-HCl(pH 8.0), 50 mM EDTA(pH 8.0), 1 %(w/v) PVP-40, 0.5 %(w/v) sodium sulfite, 1 %(v/v) β-mercaptoethanol)을 넣고 잘 혼합하여 65 ℃ 항온조에서 30분에서 1시간 정도 방치한 다음 상온에서 12,000 rpm으로 원심분리하여 상등액을 취하였다. 상등액을 새 튜브에 넣고 동량의 클로로포름(chloroform:isoamylalcohol=24:1)으로 추출한 다음 원심분리(12,000rpm, 5분간)하여 상등액을 취하고 1.7 ml의 새 튜브로 옮겼다.(Hwang 등, J. Biochem. Mol. Biol. 33: 537-540, 2000) 동량의 이소프로판올을 넣고 실온에서 혼합하여 5분간 방치한 후 가볍게 스핀다운(spin down)하여 생긴 DNA 침전물을 50 ug/ml RNase 함유 50 ul 0.1×TE 완충액(1 mM Tris-HCl, 0.1mM EDTA, pH 8.0)으로 녹인 다음, 자외선 흡광도 분석기(UV spectrophotometer)를 이용하여 A₂₆₀/A₂₈₀를 측정하여 정량하였다.

PCR 분석

상기에서 수득한 7종의 게놈 DNA 100 ng를 주형으로 하여 총 5세트의 프라이머(F625프라이머/ R1077 프라이머, F157 프라이머/ R608프라이머, F252 프라이머/ R552 프라이머, F95 프라이머/ R407 프라이머, F100 프라이머/ R410 프라이머)로 PCR을 실시하였다. 또한 대조군으로 프라이머를 넣지 않거나 DNA를 넣지 않고 PCR을 실시하였다. 각 프라이머에 대한 PCR 조건은 하기 표 3에 나타내었다.

프라이머	반응조건
F625프라이머/ R1077 프라이머	94 ℃, 5분-> 94 ℃, 30초-> 55 ℃, 30초 -> 72 ℃, 30초, 35회 -> 72 ℃, 7분
F157 프라이머/ R608프라이머	94 ℃, 5분-> 94 ℃, 30초-> 63 ℃, 30초 -> 72 ℃, 30초, 35회 -> 72 ℃, 7분
F252 프라이머/ R552 프라이머	94 ℃, 5분-> 94 ℃, 30초-> 63 ℃, 30초 -> 72 ℃, 30초, 35회 -> 72 ℃, 7분
F95 프라이머/ R407 프라이머	94 ℃, 5분-> 94 ℃, 30초-> 63 ℃, 30초 -> 72 ℃, 30초, 35회 -> 72 ℃, 7분
F100 프라이머/ R410 프라이머	94 ℃, 5분-> 94 ℃, 30초-> 55 ℃, 30초 -> 72 ℃, 30초, 35회 -> 72 ℃, 7분

PCR 산물은 EDTA를 포함한 2 % 아가로즈 젤로 전기영동하여 분석하였다.

도 5는 PCR 산물들에 대한 전기영동사진을 나타낸 것이다. A는 F625프라이머/ R1077 프라이머로 실시한 PCR 산물, B는 F157 프라이머/ R608프라이머로 실시한 PCR 산물, C는 F252 프라이머/ R552 프라이머로 실시한 PCR 산물, D는 F95 프라이머/ R407 프라이머로 실시한 PCR 산물, E는 F100 프라이머/ R410 프라이머로 실시한 PCR 산물이다. 또한 레인1과 레인 11은 사이즈마커이고, 레인2와 레인 3은 음성대조군, 레인4는 천연형 옥수수 DNA, 레인 5는 Bt11 옥수수, 레인 6은 Event176 옥수수, 레인 7은 Mon810 옥수수, 레인 8은 T25 옥수수, 레인 9는 GA21옥수수, 레인 10은 벼 DNA이다.

(1) F625프라이머/ R1077 프라이머

PCR 결과 Bt11 옥수수의 게놈 DNA를 주형으로 한 경우에만 특이적인 PCR 산물이 나타났으며 PCR 산물의 크기도 493 bp로 확인되었다. 상기 도 5의 A 패널에 나타난 PCR 산물이 Bt11임을 재확인하기 위하여 염기서열분석을 수행하였다.

도 6은 본 발명의 F625프라이머/ R1077 프라이머에 의한 PCR 산물의 염기서열을 나타낸 것으로, PCR 산물은 493개의 염기로 구성되었으며, 1부터 21번까지의 염기는 F625 프라이머 염기서열과 일치하였으며 472부터 493번까지의 염기는 R1077 프라이머와 상보적인 염기서열을 가지고 있음이 확인되었다. 또한 265번 위치의 ATG부터는 CryIA(b) 단백질의 아미노산을 코드함을 확인할 수 있었다.

또한 도 7에 나타난 바와 같이, 1부터 244개의 염기서열은 옥수수 adh1 인터론6의 염기서열(GeneBank accession No. X04049)과 완전히 일치하였으며, 265번 위치의 ATG부터 493번까지의 염기는 합성 CryIA(b) 유전자의 염기서열(GeneBank accession No. M60856)과 완전히 일치하였다.

(2) F157 프라이머/ R608프라이머

PCR 결과 Event176 옥수수의 게놈 DNA를 주형으로 한 경우에만 특이적인 PCR 산물이 나타났으며 PCR 산물의 크기도 472 bp로 확인되었다. 상기 도 5의 B 패널에 나타난 PCR 산물이 Event176 특이적임을 재확인하기 위하여 염기서열분석을 수행하였다.

도 8은 본 발명의 F157 프라이머/ R608 프라이머에 의한 PCR 산물의 염기서열을 나타낸 것으로, PCR 산물은 473개의 염기로 구성되었으며, 1부터 21번까지의 염기는 F175 프라이머 염기서열과 일치하였으며 453부터 473번까지의 염기는 R608 프라이머와 상보적인 염기서열을 가지고 있음이 확인되었다. 또한 453번 위치의 ATG부터는 CryIA(b) 단백질의 아미노산을 코드함을 확인할 수 있었다.

또한 도 9에 나타난 바와 같이, 1부터 433번까지의 염기서열은 옥수수 PEPC의 염기서열(GeneBank accession No. X15642)과 98 %의 상동성을 보였고(도9A), 453번 위치의 ATG부터 493번까지의 염기는 합성 CryIA(b) 유전자의 염기서열(GeneBank accession No. M60856)과 95 %의 상동성을 나타내었다(도9B).

(3) F252 프라이머/ R552 프라이머

PCR 결과 Event176 옥수수의 게놈 DNA를 주형으로 한 경우에만 특이적인 PCR 산물이 나타났으며 PCR 산물의 크기도 321 bp로 확인되었다. 상기 도 5의 C 패널에 나타난 PCR 산물이 Event176 특이적임을 재확인하기 위하여 염기서열분석을 수행하였다.

도 10은 본 발명의 F252 프라이머/ R552 프라이머에 의한 PCR 산물의 염기서열을 나타낸 것으로, PCR 산물은 321개의 염기로 구성되었으며, 1부터 21번까지의 염기는 F252 프라이머 염기서열과 일치하였으며 301부터 321번까지의 염기는 R552 프라이머와 상보적인 염기서열을 가지고 있음이 확인되었다. 또한 298번부터 CryIA(b)유전자의 단백질의 아미노산을 코드함을 확인할 수 있었다.

또한 도 11에 나타난 바와 같이, 1부터 287번까지의 염기서열은 옥수수 CDPK의 염기서열(GeneBank accession No. L27484.1)과 96 %의 상동성을 보였고 (도11A), 298번부터는 합성 CryIA(b) 유전자의 염기서열과 95 %을 상동성을 보였고(도11B), F157 프라이머/ R608프라이머를 이용한 PCR 산물의 서열과 완전히 일치하였다(도11C).

(4) F95 프라이머/ R407 프라이머

PCR 결과 Mon810 옥수수의 게놈 DNA를 주형으로 한 경우에만 특이적인 PCR 산물이 나타났으며 PCR 산물의 크기도 336 bp로 확인되었다. 상기 도 5의 D 패널에 나타난 PCR 산물이 Mon810 특이적임을 재확인하기 위하여 염기서열분석을 수행하였다.

도 12는 본 발명의 F95 프라이머/ R407 프라이머에 의한 PCR 산물의 염기서열을 나타낸 것으로, PCR 산물은 336개의 염기로 구성되었으며, 1부터 24번까지의 염기는 F95 프라이머 염기서열과 일치하였으며 313부터 336번까지의 염기는 R407 프라이머와 상보적인 염기서열을 가지고 있음이 확인되었다.

또한 도 13에 나타난 바와 같이, 몬산토사에서 개발한 단자엽 식물 발현용 합성 CryIA(b) 유전자와는 100 % 일치하였고, 노바티스사의 Bt11에 도입된 합성 CryIA(b) 유전자와는 83.5 % 상동성을 보였다. 따라서 본 발명에서 개발된 Mon810 특이 프라이머는 옥수수 내재 유전자로서 운반체에 삽입된 HSP 부위 특이 프라이머를 이용하지 않아도 품종 특이성을 나타냄을 알 수 있었다.

(5) F100 프라이머/ R410 프라이머

PCR 결과 T25 게놈 DNA를 주형으로 한 경우와 합성 PAT유전자를 마커유전자로 활용하고 있는 Bt11(Matsuoka 등, 2000)에 대하여 특이적인 PCR 산물이 나타났으며 PCR 산물의 크기도 331bp로 일치함을 확인하였다(도5E). 상기 T25 옥수수 유래의 PCR 산물에 대한 염기서열분석을 수행하였다.

도 14는 본 발명의 F100 프라이머/ R410 프라이머에 의한 PCR 산물의 염기서열을 나타낸 것으로, PCR 산물은 331개의 염기로 구성되었으며, 1부터 21번까지의 염기는 F100 프라이머 염기서열과 일치하였으며 311부터 331번까지의 염기는 R410 프라이머와 상보적인 염기서열을 가지고 있음이 확인되었다.

또한 도 13에 나타난 바와 같이, 아벤티스사에서 개발한 식물 발현용 합성 PAT 유전자와는 100 % 일치하였고, 변경전의 PAT 유전자와는 70.7 % 상동성을 보였다. 따라서 본 발명에서 개발된 T14/T25 특이 프라이머는 합성 PAT 유전자가 도입된 리버러티린크( LibertyLink) 옥수수에 대하여 특이성을 나타냄을 확인하였다.

[실시예 5] RRS에 대한 프라이머

몬산토사의 RRS에 대한 PCR 프라이머를 제작하였다. RRS는 도 16에 도시한 바와 같이, P35S - CTP - CP4 EPSPS - Tnos를 포함한다. RRS에 대한 검정용 PCR 프라이머는 서열번호 11의 35S2A 프라이머(5'-ATGACGCACAATCCCACTATC-3')와 서열번호 12의 CTP5A 프라이머(5'-GGCTGTAGCCACTGATGCTGA-3')이다. 상기 35S2A 프라이머는 P35S에 특이적으로 작용하고, 상기 CTP5A 프라이머는 CTP를 인지한다. 35S2A 프라이머와 CTP5A 프라이머는 GC 함량이 52.4 %이며, 적정 어닐(anneal) 온도가 58 ℃이며 이들 프라이머를 이용한 RRS의 PCR 산물의 크기는 321 bp로 예상된다.

[실험예 2]

RRS 10개와 국내 재배콩 9개에서 게놈 DNA를 분리하였고, 상기 실시예 5의 35S2A 프라이머/CTP5A 프라이머로 PCR(94 ℃, 5분-> 94 ℃, 30초-> 58 ℃, 30초 -> 72 ℃, 30초, 30회 -> 72 ℃, 7분 )을 실시하였다.

도 17은 본 발명의 35S2A 프라이머/CTP5A 프라이머로 증폭된 PCR 산물을 전기영동으로 확인한 것으로, 레인 1에서 레인 10은 RRS에 대한 PCR 산물이고, 레인 12에서 레인 20은 국산콩에 대한 PCR 산물이다. 레인 11은 사이즈 마커로 RRS에 대한 PCR에서 321 bp의 PCR산물을 확인할 수 있었다.

상기 35S2A 프라이머/CTP5A 프라이머로 증폭된 PCR에 대한 염기서열을 분석하여 도 17에 나타난 PCR산물이 RRS 특이적임을 확인하였다.

도 18은 본 발명의 35S2A 프라이머/ CTP5A 프라이머에 의한 PCR 산물의 염기서열을 나타낸 것으로, PCR 산물은 321개의 염기로 구성되었으며, 1부터 21번까지의 염기는 35S2A 프라이머 염기서열과 일치하였으며 301부터 321번까지의 염기는 CTP5A 프라이머와 상보적인 염기서열을 가지고 있음이 확인되었다.

또한, 도 19에 나타난 바와 같이 몬산토에서 개발한 CaMV35S 유전자의 프로모터 영역 및 페추니아 EPSPS 유전자의 엽록체 운반 펩타이드 부위(US patent 5633435)와 각각 100 % 상동성을 보였다. 따라서 본 발명에서 개발된 RRS 특이 프라이머는 EPSPS 유전자가 도입된 라운드업 레디(Roundup Ready) 콩에 대하여 특이성을 나타냄을 확인하였다.

상기에 언급한 바와 같이, 본 발명의 유전자변형식물 검정용 PCR 프라이머는 각 유전자변형식물 품종을 특이적으로 검출할 수 있어, 현재 유통 중이거나 수입되는 농산물 및 식품 중의 유전자변형농산물 또는 식품을 판별하는 GMO 검정으로 이용할 수 있다.

도 1은 노바티스사의 해충저항성 옥수수 Bt11에 도입된 cryIA(b) 유전자 및 발현조절부를 나타낸 모식도이고,

도 2는 노바티스사의 Event176 옥수수에 도입된 cryIA(b) 유전자 및 발현조절부를 나타낸 모식도이고,

도 3은 몬산토사의 Mon810 옥수수에 도입된 cryIA(b) 유전자 및 발현조절부를 나타낸 모식도이고,

도 4는 아벤티스사의 T25 옥수수에 도입된 PAT 유전자 및 발현조절부를 나타낸 모식도이고,

도 5는 유전자변형 옥수수 및 천연형 옥수수에 대한 프라이머의 특이성을 확인한 전기영동사진이고,

도 6은 Bt11 F625 프라이머 및 Bt11 R1077 프라이머로 증폭된 PCR 산물의 염기서열을 나타낸 것이고,

도 7은 Bt11 F625 프라이머 및 Bt11 R1077 프라이머로 증폭된 PCR 산물의 염기서열에 대한 DNA 상동성(homology) 분석을 나타낸 것이고,

도 8은 PEPC F157 프라이머 및 PEPC R608 프라이머로 증폭된 PCR 산물의 염기서열을 나타낸 것이고,

도 9는 PEPC F157 프라이머 및 PEPC R608 프라이머로 증폭된 PCR 산물의 염기서열에 대한 DNA 상동성(homology) 분석을 나타낸 것이고,

도 10은 CDPK F252 프라이머 및 CDPF R552 프라이머로 증폭된 PCR 산물의 염기서열을 나타낸 것이고,

도 11은 CDPK F252 프라이머 및 CDPF R552 프라이머로 증폭된 PCR 산물의 염기서열에 대한 DNA 상동성(homology) 분석을 나타낸 것이고,

도 12는 Monbt F95 프라이머 및 Monbt R407 프라이머로 증폭된 PCR 산물의 염기서열을 나타낸 것이고,

도 13은 Monbt F95 프라이머 및 Monbt R407 프라이머로 증폭된 PCR 산물의 염기서열에 대한 DNA 상동성(homology) 분석을 나타낸 것이고,

도 14는 AgrPAT F100 프라이머 및 AgrPAT R410 프라이머로 증폭된 PCR 산물의 염기서열을 나타낸 것이고,

도 15는 AgrPAT F100 프라이머 및 AgrPAT R410 프라이머로 증폭된 PCR 산물의 염기서열에 대한 DNA 상동성(homology) 분석을 나타낸 것이고,

도 16은 몬산토사의 RRS에 도입된 EPSPS의 발현조절부를 나타낸 것이고,

도 17은 35S2A 프라이머/CTP5A 프라이머로 증폭된 PCR 산물을 전기영동으로 확인한 것이고,

도 18은 35S2A 프라이머/CTP5A 프라이머로 증폭된 PCR 산물의 염기서열을 나타낸 것이고,

도 19는 35S2A 프라이머/CTP5A 프라이머로 증폭된 PCR 산물의 염기서열에 대한 DNA 상동성(homology) 분석을 나타낸 것이다.

<110> National Institute of agricultural science & Technology <120> Primer for detection of generally modified organism <160> 12 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Bt11 F625 primer <400> 1 gcactggcac ttggtctaat a 21 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Bt11 R1077 primer <400> 2 ggaccaaaga taccccagat g 21 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PEPC F157 primer <400> 3 caagaaggca ggtgagcagt g 21 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PEPC R608 primer <400> 4 gcactcgttg atgttggggt t 21 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CDPK F252 primer <400> 5 ttgacttgta gccctgacct t 21 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CDPK R552 primer <400> 6 gttgatgttg gggttgttgt c 21 <210> 7 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Monbt F95 primer <400> 7 gacatctccc tctccctcac gcag 24 <210> 8 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Monbt R407 primer <400> 8 gaagagtggg atggcggtgg tcag 24 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AgrPAT F100 primer <400> 9 gtgaacttta ggacagagcc a 21 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AgrPAT R410 primer <400> 10 ctgtgtatcc caaagcctca t 21 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 35S2A primer <400> 11 atgacgcaca atcccactat c 21 <210> 12 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CTP5A primer <400> 12 ggctgtagcc actgatgctg a 21

Claims

해충저항성 유전자변형식물을 검정할 수 있는 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 PCR 프라이머.
제 1항에 있어서, 상기 PCR 프라이머는 서열번호 1의 프라이머를 더욱 포함하는 프라이머 세트인 것을 특징으로 하는 PCR 프라이머.
해충저항성 유전자변형식물을 검정할 수 있는 서열번호 4의 염기서열을 포함하는 PCR 프라이머.
제 3항에 있어서, 상기 PCR 프라이머는 서열번호 3의 프라이머를 더욱 포함하는 프라이머 세트인 것을 특징으로 하는 PCR 프라이머.
해충저항성 유전자변형식물을 검정할 수 있는 서열번호 6의 염기서열을 포함하는 PCR 프라이머.
제 5항에 있어서, 상기 PCR 프라이머는 서열번호 5의 프라이머를 더욱 포함하는 프라이머 세트인 것을 특징으로 하는 PCR 프라이머.
해충저항성 유전자변형식물을 검정할 수 있는 서열번호 7의 염기서열을 포함하는 프라이머.
해충저항성 유전자변형식물을 검정할 수 있는 서열번호 8의 염기서열을 포함하는 프라이머.
제초제저항성 유전자변형식물을 검정할 수 있는 서열번호 9의 염기서열을 포함하는 프라이머.
제초제저항성 유전자변형식물을 검정할 수 있는 서열번호 10의 염기서열을 포함하는 프라이머.
제초제저항성 유전자변형식물을 검정할 수 있는 서열번호 11의 염기서열을 포함하는 프라이머.
제초제저항성 유전자변형식물을 검정할 수 있는 서열번호 12의 염기서열을 포함하는 프라이머.